Em formação

GPCRs: Gi e Gs


GPCR = receptor acoplado à proteína G

Gi = subunidade alfa inibitória G

Gs = G subunidade alfa estimuladora

Existem diferenças estruturais entre as subunidades Gi e Gs (estrutura secundária)? Ou é apenas categorização por efeito no nível de cAMP? (Gi inibe a produção de cAMP, enquanto Gs estimula a produção de cAMP)


Gi e Gs têm uma subunidade estruturalmente diferente em sua cadeia alfa.

Os receptores para PGE1 e adenosina interagem com Gi inibitória, que contém as mesmas subunidades β e γ que Gs estimuladores, mas uma subunidade α diferente (Giα). Em resposta à ligação de um ligante inibitório ao seu receptor, a proteína Gi associada libera seu GDP ligado e se liga ao GTP; o complexo Giα · GTP ativo então se dissocia do Gβγ e inibe (ao invés de estimular) a adenilil ciclase.

Ambos os receptores adrenérgicos β1 e β2 são acoplados às proteínas G (Gs), que ativam a adenilil ciclase. Em contraste, os receptores α1 e α2 são acoplados a duas outras proteínas G, Gq e Gi, respectivamente. Gi inibe a adenilil ciclase e Gq estimula a fosfolipase C para gerar IP3 e DAG como segundos mensageiros.

Além disso,

Uma comparação do receptor quimérico 1, que interage com Gs, e do receptor quimérico 3, que interage com Gi, mostra que a especificidade da proteína G é determinada principalmente pela fonte da alça voltada para o citosol entre as hélices α 5 e 6. Uma comparação de as quimeras 1 e 2 indicam que a hélice 7 desempenha um papel na determinação da ligação ao ligando. B. Kobilka et al., Science 240: 1310, 1988; W. A. ​​Catterall, 1989, Science 243: 236.

Eu recomendo ler isto: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21718/


Comunicação cruzada entre Geu e Gs em um heterotetrâmero de receptor acoplado a proteína G guiado por um domínio C-terminal de receptor

Os complexos heteroméricos do receptor acoplado à proteína G (GPCR) têm propriedades distintas dos GPCRs homoméricos, dando origem a novas funcionalidades do receptor. Receptores de adenosina (A1R ou A2AR) pode formar A1R-A2AHeterômeros R (A1-UMA2AHet), e sua ativação leva à sinalização canônica dependente da proteína G (mediada pela adenilato ciclase) e independente (mediada pela β-arrestina). A adenosina tem diferentes afinidades para A1R e A2AR, permitindo que o receptor heteromérico detecte sua concentração integrando o G a jusanteeu- e Gssinais -dependentes. Ensaios de acumulação de cAMP e recrutamento de β-arrestina mostraram que, dentro do complexo, a ativação de A2AR impede a sinalização via A1R.

Resultados

Examinamos o mecanismo pelo qual A1-UMA2AHet integra Geu- e Gssinais -dependentes. UMA1Bloqueio de R por A2AR no A1-UMA2AHet não é observado na ausência de A2AAtivação de R por agonistas, na ausência do domínio C-terminal de A2AR, ou na presença de peptídeos sintéticos que interrompem a interface de heterômero de A1-UMA2AHet, indicando que a sinalização mediada por A1R e A2AR é controlado por Geu e Gs proteínas.

Conclusões

Identificamos um novo mecanismo de transdução de sinal que implica uma comunicação cruzada entre Geu e Gs proteínas guiadas pela cauda C-terminal do A2AR. Este mecanismo fornece a base molecular para a operação do A1-UMA2AHet como um dispositivo de detecção de concentração de adenosina que modula os sinais originados em ambos1R e A2AR.


Artigo MINI REVIEW

Xinming Wang 1,2, Abishek Iyer 3, A. Bruce Lyons 4, Heinrich K & # x000F6rner 1,5 & # x0002A & # x02020 e Wei Wei 1 & # x0002A & # x02020
  • 1 Laboratório de Medicina Antiinflamatória e Imune, Centro de Inovação Colaborativa Anhui de Medicina Antiinflamatória e Imune, Instituto de Farmacologia Clínica, Ministério da Educação, Universidade Médica de Anhui, Hefei, China
  • 2 Departamento de Farmácia, Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Anhui, Hefei, China
  • 3 Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, QLD, Austrália
  • 4 Escola de Medicina, Universidade da Tasmânia, Hobart, TAS, Austrália
  • 5 Menzies Institute for Medical Research, University of Tasmania, Hobart, TAS, Austrália

Os macrófagos surgiram como um componente-chave do sistema imunológico inato que emigra para os tecidos periféricos durante a gestação e no organismo adulto. Seu caminho complexo para a maturidade, sua plasticidade única e seus vários papéis como células efetoras e reguladoras durante uma resposta imune têm sido o foco de intensa pesquisa. Uma classe de moléculas de superfície, os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) desempenham papéis importantes em muitos processos imunológicos. Eles têm chamado a atenção em relação a essas funções e ao potencial de alvos terapêuticos que podem modular a resposta das células do sistema imunológico em patologias como diabetes, aterosclerose e doenças inflamatórias crônicas. Dos mais de 800 GPCRs identificados, & # x0007E100 são atualmente alvos de drogas cuja atividade foi investigada na Vivo. Os macrófagos expressam uma série de GPCRs que têm papéis centrais durante a diferenciação celular e na regulação de suas funções. Embora alguns GPCRs de macrófagos, como os receptores de quimiocinas, tenham sido estudados em grande detalhe, os papéis de outros receptores desta grande família ainda não são bem compreendidos. Esta revisão resume novos insights sobre a biologia de macrófagos, diferenças de macrófagos humanos e de camundongo e dá detalhes de alguns dos GPCRs expressos por este tipo de célula.


C6. Receptores acoplados à proteína G (GPCR) e proteínas G

  • Contribuição de Henry Jakubowski
  • Professor (Química) no College of St. Benedict / St. John's University

Os receptores que interagem com as proteínas G (receptores acoplados à proteína G ou GPCRs) têm características comuns. Os GPCRs são polipeptídeos únicos que têm 7 hélices alfa e que abrangem a membrana. Mais de 800 genes do receptor GPCR semelhantes são encontrados em humanos, cada um codificando uma proteína de topologia semelhante, mas que se ligam a diferentes ligantes. Muitos dos receptores se ligam a ligantes desconhecidos e, portanto, são chamados receptores órfãos.

O receptor beta-adrenérgico é um GPCR prototípico. Encontrado no músculo, fígado e células de gordura, ele se liga à epinefrina e à adrenalina, o que leva à mobilização de energia e ativação muscular (ou seja, fuga ou resposta de luta). O mecanismo de ativação de um GPCR é ilustrado usando o receptor beta adrenérgico como exemplo. O receptor adrenérgico não ocupado está associado a uma proteína G heterotrimérica, que contém uma subunidade alfa, beta e gama. O PIB geralmente está vinculado à subunidade & alfas. Quando o hormônio está ligado ao receptor, as interações do receptor com a proteína G (provavelmente através das subunidades & beta e & gama levam a mudanças conformacionais na proteína G, levando à substituição de GDP por GTP. Isso promove a dissociação da subunidade & alfa (com GTP ligado), que está livre para se ligar e modular a atividade de uma proteína de membrana adjacente, a adenilato ciclase. A subunidade alfa é mantida na membrana por meio de uma âncora lipídica fixada por meio de uma modificação pós-tradução. Enquanto o GTP permanecer ligado à subunidade G&alfa, ele irá continuar a modular a atividade da adenilato ciclase. Existe um mecanismo regulador embutido na proteína, uma vez que a subunidade G&alfa tem atividade GTPase. O GTP irá eventualmente hidrolisar, a subunidade GDP-G&alfa perderá afinidade para seu parceiro ligado (ciclase adenilada), e retorno à proteína G heterotrimérica associada ao receptor não ligado.

Os GPCRs parecem se ligar ao ligante em uma cavidade de ligação localizada na face extracelular e entre quatro das hélices transmembrana. Após a ligação de um ligante natural, ocorre uma mudança conformacional no arranjo das hélices, permitindo o acesso da subunidade G & alfa ao GPCR. No complexo ternário de GPCR: Ligante: proteína G, a afinidade do GPCR para o agonista e da subunidade G & alfa para GTP (sobre GDP) é aumentada.

A atividade e estrutura dos GPCRs foram estudadas usando ligantes naturais (hormônios e neurotransmissores), bem como agonistas, agonistas parciais, agonistas inversos e antagonistas. Conforme discutido anteriormente, os agonistas se ligam ao local de ligação natural do ligante e induzem a mesma ou uma resposta parcial (agonista parcial). Os agonistas inversos ligam-se e diminuem a resposta do receptor constituitivamente ativo, e os antagonistas ligam-se e evitam a resposta normal de um agonista. A figura abaixo mostra uma estrutura cristalina do complexo beta-andrenérgico: Gs com o agonista ligado.

Figura: Beta-andrenérgico: complexo Gs (imagem feita com VMD)

Receptor beta andrenérgico Jmol14 (Java) atualizado | JSMol (HTML5)

Receptor beta andrenérgico atualizado: Gs Complex Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Modelos atualizados do receptor GPCR- Melancortina 4 Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Algumas toxinas bacterianas atuam inativando a atividade GTPase da subunidade G & alfa, mantendo-a na posição "travada". Por exemplo, a toxina da cólera, uma enzima liberada pelo Vibrio cholerae, catalisa a ribosilação ADP de um Arg na subunidade G & alfa, transferindo tudo, exceto a nicotinamida de NAD + para o resíduo Arg.

Em contraste com o receptor beta-adrenérgico, algumas subunidades G & alfa realmente inibem a adenilato ciclase quando ligadas. Essas subunidades G & alfa são chamadas de G a i / o em contraste com as subunidades estimuladoras G a s. As subunidades G & alfa interagem com outras proteínas além da adenilato ciclase. Já vimos um exemplo com a ativação PKC da fosfolipase C que é ativada pelo G a q11. Existem muitas subunidades semelhantes a G e alfa expressas em diferentes tecidos. Quatro classes estruturais e pelo menos vinte variantes de G a foram encontradas.

Exemplos de diferentes sinais, receptores, subunidades do tipo G e alfa, alterações de segundo mensageiro e enzimas intracelulares afetadas
sinal vasopressina epinefrina luz odorante odorante saboroso doce
receptor VR & beta-adrenérgico rodopsina recepção odorante. 1 receptor de odor. 2 doce receptor
Ga like- subunidade Gi Gs transducina Golfactory Golfactory Gustativo
enzima acoplada adenilato-ciclase adenilato-ciclase fosfodiesterase fosfolipase C adenilato-ciclase adenilato-ciclase
2º mensageiro diminuir cAMP aumentar cAMP diminuir cGMP aumentar IP3 aumentar cAMP aumentar cAMP
proteína afetada diminuir PrK-A aumentar PrK-A dez. Ca, Na perm. inc. Ca perm inc.Ca, Na perm dez. K perm

Outra variante de uma proteína de ligação de GDP / GTP é ras. As células de mamíferos contêm 3 variantes de ras: H, K e N. Todas se ligam a GDP / GTP e têm atividade GTPase, e são membros de uma grande família de pequenas proteínas GTPase. Esta proteína é direcionada para a membrana celular através da adição pós-tradução de um grupo farnesil hidrofóbico. Quando ativado pela ligação ao GTP, ele pode se transformar em uma proteína chamada Raf-1, que é ativada para se tornar uma tirosina quinase.


Estrutura de GPCRs

Os membros da superfamília GPCR compartilham a mesma arquitetura básica de 7TM & # x003b1-hélices, um segmento extracelular amino-terminal e uma cauda carboxi-terminal intracelular. Esses receptores ligados à membrana plasmática evoluíram para reconhecer uma diversidade de sinais físicos e químicos extracelulares, como nucleotídeos, peptídeos, aminas, Ca 2+ e fótons. No reconhecimento de tais sinais, os GPCRs atuam como evento proximal em vias de sinalização que influenciam uma ampla variedade de funções metabólicas e diferenciadas. 10, 11 Uma análise extensiva de cerca de 200 sequências GPCR revelou que o comprimento total dos GPCRs pode variar entre 311 e & # x0223c1,490 resíduos de aminoácidos. As maiores variações de comprimento são encontradas nos terminais N e C com tamanhos de até 879 e 371 resíduos de aminoácidos, respectivamente. 18 Os GPCRs não são apenas codificados por genes eucarióticos, mas também por genes virais. Os genes genômicos de GPCRs humanos são predominantemente sem íntron. 18

As hélices 7TM & # x003b1 conectadas por três alças intracelulares e três extracelulares. As alças extracelulares do GPCR podem ser glicosiladas e conter dois resíduos de cisteína altamente conservados, que constroem ligações dissulfeto para estabilizar a estrutura do receptor. Os GPCRs contêm domínios extracelulares do terminal N (ECL1, ECL2 e ECL3) de tamanho variável, variando de 154 resíduos (receptor de calcitonina) a 36 resíduos (receptor de rodopsina). Este domínio contém resíduos de asparaginas e motivos para N-glicosilação, que influencia o tráfego intracelular de receptores para a membrana plasmática, e resíduos de cisteína em alças ECL1 e ECL2 que podem influenciar o dobramento de proteínas crítico para o tráfego de um receptor de função para a superfície celular. 19 O terminal N de alguns GPCRs está envolvido na ligação, ativação e regulação negativa do ligante. As hélices 7TM & # x003b1-hélices de GPCRs são organizadas para formar um núcleo central em forma de anel apertado que é altamente hidrofóbico por natureza. Semelhante à maioria das proteínas TM, os resíduos de aminoácidos hidrofóbicos estão presumivelmente dispostos de frente para a bicamada lipídica, enquanto os resíduos de aminoácidos mais hidrofílicos estão voltados para o núcleo. Além disso, a interação hélice-hélice contribui para a estrutura terciária funcional dos GPCRs necessários para o dobramento e estabilidade do receptor, ligação do ligante e mudanças conformacionais induzidas pelo ligante para o acoplamento da proteína G. Assim, as mutações no domínio da TM podem ter uma série de efeitos deletérios.

GPCRs contém domínios de terminal carboxila intracelulares (ICL1, ICL2 e ICL3) que estão envolvidos em vários aspectos da sinalização de GPCR. Este domínio contém resíduos Ser e / ou Tyr que servem como locais para fosforilação mediada por receptor de proteína G cinase e dessensibilização de receptor. Alguns GPCRs contêm um resíduo de cisteína no domínio C-terminal, que pode servir como local para palmitoilação. Isso pode criar uma quarta IL (alças intracelulares) devido à capacidade da cisteína palmitoilada de se inserir na membrana plasmática. Além disso, o terminal C pode estar envolvido nas interações com outras proteínas que medeiam a sinalização de GPCR, como o calcyon, proteínas contendo o domínio PDZ e proteínas Homer / Vesl. 19 O GPCR varia não apenas na sequência, mas também no comprimento dos aminoácidos e terminais carboxi (especialmente a alça C3). O resíduo de serina na região do terminal carboxi de GPCRs fica fosforilado por quinases receptoras acopladas à proteína G (GRKs). GRKs constituem seis proteínas quinase Ser / Thr de mamífero que fosforilam o GPCR ligado ao agonista, ou ativado, como seus substratos primários, a fosforilação do receptor mediada por GRK inicia rapidamente o comprometimento profundo da sinalização do receptor ou dessensibilização. 20 Embora as estruturas de cristal de raios-X de vários GRKs tenham sido resolvidas, o mecanismo de interação de GRK com GPCRs não era conhecido. Recentemente, Pao et al. (2009) 21 propôs um mecanismo pelo qual o N-terminal da proteína GRK2 forma uma interação intramolecular que aumenta seletivamente a atividade catalítica da quinase em relação aos substratos GPCR.

Recentemente, Sheerer et al. (2008) 22 relataram a estrutura cristalina de 3,2 angstrom (A & # x000b0) do GPCR bovino (opsina) em sua conformação de interação com a proteína G. (Complexo de peptídeo Ops-GalphaCT). Perk et al. (2008) 23 relataram a estrutura cristalina de GPCR nativo livre de ligante (opsina) de células de bastonete retinal bovino com resolução de 2,9 A & # x000b0. Em comparação com a rodopsina GPCR, a opsina mostrou algumas mudanças estruturais nas regiões conservadas E (D) RY e NPxxY (x) 5,6F e em TM5 & # x02013TM7. No lado citoplasmático, o TM6 foi encontrado inclinado para fora em 6 & # x020137 A & # x000b0, enquanto a estrutura da hélice do TM5 era mais alongada e próxima do TM6. Os autores sugeriram que a estrutura da opsina lança uma nova luz sobre a ligação do ligante aos GPCRs e sobre a ativação do GPCR. 23


Aulas animadas incluídas

/> Visão geral e relação de estrutura / função GPCR | Uma introdução aos GPCRs e um exame de sua relação estrutura / função. /> Relação Heterotrimérica Estrutura / Função da Proteína G | As três subunidades, alfa, beta e gama são introduzidas e a relação estrutura / função da proteína G heterotrimérica é discutida. /> Alvos de proteína G heterotrimérica | Os dois principais alvos das proteínas G heterotriméricas são a adenilato ciclase e a fosfolipase C (PLC). /> Adenilato ciclase e proteína quinase A (PKA) | Estrutura da adenilato ciclase, produção de cAMP e relação estrutura / função da proteína quinase A (PKA). /> Fosfolipase C (PLC), IP3 e DAG | Parte 1 | Uma comparação das estruturas moleculares dos diferentes tipos de fosfolipídios usados ​​nas vias de sinalização de PLC. /> Fosfolipase C (PLC), IP3 e DAG | Parte 2 | PLC-beta cliva PIP2 em IP3 e DAG. O IP3 liga-se ao receptor IP3 na membrana do RE liso, resultando na liberação de cálcio no citosol e no recrutamento de PKC para a membrana. /> Exemplo: Regulação da glicose no sangue | Parte 1 | Esta lição coloca em contexto todos os principais participantes apresentados ao longo deste módulo, examinando um exemplo de caminho em detalhes: Regulação da concentração de glicose no sangue pelo hormônio glucagon. /> Exemplo: Regulação da glicose no sangue | Parte 2 | Esta continuação da Parte 1 apresenta a fosforilase quinase, a glicogênio sintase e a glicogênio fosforilase.

Os GPCRs (proteína G [proteína de ligação do nucleotídeo guanina] - receptores acoplados) desempenham um papel fisiológico central na regulação da função cardíaca tanto na saúde quanto na doença e, portanto, representam uma das maiores classes de receptores de superfície direcionados por drogas. Vários antagonistas de GPCRs, como os receptores βARs (receptores β-adrenérgicos) e Ang II (angiotensina II), são agora considerados padrão de terapia para uma ampla gama de doenças cardiovasculares, como hipertensão, doença arterial coronariana e insuficiência cardíaca. Embora o mecanismo de ação dos GPCRs tenha sido pensado para ser amplamente desenvolvido nos anos 80 e 90, descobertas recentes trouxeram à tona mecanismos novos e anteriormente não avaliados para a ativação do GPCR e subsequente sinalização downstream. Nesta revisão, enfocamos os GPCRs mais relevantes para o sistema cardiovascular e discutimos os componentes tradicionais da sinalização GPCR e destacamos os conceitos em evolução no campo, como tendência de ligante, sinalização mediada por β-arrestina e heterogeneidade conformacional.

A insuficiência cardíaca (IC) - uma condição clínica resultante da incapacidade do coração de bombear sangue o suficiente para atender às necessidades do corpo - é uma doença prevalente que causa alta morbidade e mortalidade. Afeta ≈6,5 milhões de adultos americanos e leva a 30 bilhões de dólares em gastos com saúde por ano.1 É importante ressaltar que a taxa de mortalidade em 1 e 5 anos após hospitalização por IC se aproxima de 20% e 40%, 1 e, portanto, é imprescindível compreender os mecanismos fundamentais para o desenvolvimento da IC.

A IC é mais comumente causada por doenças, como hipertensão crônica, infarto do miocárdio devido a doença arterial coronariana, processos cardiomiopáticos, valvopatia ou miocardite viral. 2 Esses estímulos levam à ejeção de sangue prejudicada ou enchimento ventricular. 3 Do ponto de vista do desempenho cardíaco, a IC é caracterizada como IC com fração de ejeção reduzida (também conhecida como IC sistólica) e causada por uma falha na contração cardíaca ou IC com fração de ejeção preservada (também conhecida como IC diastólica) com contração cardíaca normal, mas prejudicada o preenchimento. 3 Ambos os tipos de IC estão associados a anormalidades estruturais ou funcionais do ventrículo esquerdo que são primariamente induzidas pelo aumento dos cardiomiócitos como um aumento no comprimento ou largura das células, ou ambos, referido como crescimento hipertrófico. A hipertrofia dos cardiomiócitos é iniciada por uma variedade de estímulos intrínsecos e extrínsecos, como estresse mecânico, hormônios, citocinas e fatores de crescimento que são detectados pelos cardiomiócitos por meio de uma ampla gama de receptores na membrana celular. 4 Entre os vários receptores de superfície, uma classe de considerável importância é a família dos GPCRs (proteína G [proteína de ligação do nucleotídeo da guanina] - receptores acoplados), também conhecidos como 7TMRs (receptores 7-transmembrana), que representam os maiores e os família mais versátil de receptores de superfície celular. 5 Os GPCRs desempenham papéis importantes em uma ampla variedade de processos fisiológicos e, não surpreendentemente, são comumente direcionados para terapêuticas medicinais. Por exemplo, a ativação crônica de βARs (receptores β-adrenérgicos) e AT1Rs (receptores de Ang II [angiotensina II] tipo 1) por seus ligantes endógenos, norepinefrina e Ang II, respectivamente, aumenta a carga de trabalho do coração, levando a efeitos prejudiciais, como morte de miócitos e remodelação cardíaca inadequada. 6 Portanto, drogas que bloqueiam a ativação desses receptores, como β-bloqueadores, bloqueadores do receptor de Ang II e inibidores da ECA (enzima conversora de angiotensina), são amplamente utilizadas no tratamento da IC. Neste artigo, forneceremos uma visão geral da sinalização GPCR, destacaremos a função dos GPCRs cardíacos nos tipos de células cardiovasculares mais importantes e forneceremos insights sobre nossa nova apreciação da complexidade da sinalização GPCR que tem implicações importantes quando se considera o desenvolvimento do futuro Terapêutica HF.

Visão geral da sinalização GPCR

Sinalização GPCR mediada por proteína G

No paradigma clássico, os GPCRs transduzem a sinalização por meio de proteínas G. As proteínas G são nomeadas por sua capacidade de ligar os nucleotídeos GTP e GDP. Eles atuam como interruptores moleculares na transdução da sinalização intracelular: quando as proteínas G estão ligadas ao GTP, elas são ativas (ligadas) e, quando ligadas ao GDP, são inativas (desligadas). 7 As proteínas G heterotriméricas são compostas pelas subunidades α, β e γ. Quando uma molécula de sinalização externa se liga a um GPCR, ela causa (ou estabiliza) uma mudança conformacional do receptor, desencadeando o recrutamento de proteínas G na membrana plasmática para trocar GDP por GTP na subunidade Gα levando à sua ativação. A troca de GDP-GTP leva à dissociação da proteína G heterotrimérica em 2 unidades: a subunidade Gα ligada ao GTP e o complexo dimérico Gβγ. Ambos podem interagir com uma variedade de efetores de sinalização, como enzimas que produzem segundos mensageiros e canais iônicos. A subunidade Gα catalítica irá hidrolisar o GTP ligado ao GDP, levando à sua reassociação com as subunidades Gβγ e término do ciclo de ativação da proteína G (Figura 1).

Figura 1. Esquema de sinalização GPCR (receptor acoplado à proteína G). Na ligação do ligante agonista, os GPCRs interagem com as proteínas G heterotriméricas (proteínas de ligação do nucleotídeo guanina). As proteínas G sofrem uma troca de GDP-GTP na subunidade α, levando à dissociação das subunidades α e βγ e subsequente ativação de efetores de sinalização a jusante. PKC ativado pela proteína G (proteína quinase C) e PKA (proteína quinase A), por sua vez, fosforila o receptor e desliga a sinalização da proteína G (dessensibilização heteróloga, linha vermelha e fosfato). A fosforilação de GPCR mediada por GRK (GPCR quinase) leva ao recrutamento de β-arrestinas, resultando em dessensibilização por interditar estericamente a interação da proteína G (dessensibilização homóloga, linha roxa e fosfato) e subsequente internalização e ubiquitinação do receptor. O envolvimento da β-arrestina com o receptor também inicia a ativação da sinalização mediada pela β-arrestina. AC indica adenilato ciclase AKT, uma serina / treonina quinase também conhecida como proteína quinase B DAG, diacilglicerol EGFR, receptor de fator de crescimento epidérmico IP3, inositol-1,4,5-trisfosfato MAPK, proteína quinase ativada por mitogênio PI3K, fosfoinositídeo 3-quinase PIP2, 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol e PLC, fosfolipase C.

Atualmente, existem 21 subunidades Gα, 6 subunidades Gβ e 12 subunidades Gγ. 7 As proteínas G heterotriméricas são normalmente referidas por suas subunidades Gα e divididas em 4 classes principais: Gαestimulante (Gαs), Gαinibitório (Gαeu), Gαq, e Gα12/13. 7 Essa diversidade em subfamílias de proteína G permite sua função regulatória distinta na transdução de sinalização. O Gαs estimula a enzima efetora, adenilil ciclase, a produzir o segundo mensageiro cAMP, levando à ativação de PKA (proteína quinase A) e fosforilação de uma ampla variedade de proteínas intracelulares que regulam as respostas celulares. 8 Em contraste, Gαeu tem um efeito inibitório sobre a adenilil ciclase, portanto, atenuando o AMPc intracelular. 9 Gαq ativa o PLC (fosfolipase C) levando à clivagem do fosfatidilinositol 4,5-bifosfato ligado à membrana para os segundos mensageiros inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol. Inositol 1,4,5-trifosfato promove a liberação de Ca 2+ do retículo endoplasmático. O aumento do Ca 2+ intracelular e do diacilglicerol difundido da membrana plasmática ativará a sinalização celular estimulando a PKC (proteína quinase C). 9,10 As proteínas G Gα12/13 são conhecidos por ativar o pequeno GTPase Rho. 11

Além de receptores de superfície celular, GPCRs localizados em outros compartimentos celulares para ativar a sinalização a jusante. Por exemplo, o β2AR (β2receptor -adrenérgico) ativa Gαs para promover a produção de cAMP nos endossomos iniciais 12 o β1AR (β1-adrenérgico) na membrana nuclear dos cardiomiócitos atua para ativar a adenilil ciclase 13 ET (endotelina) estimula os receptores de ET localizados no núcleo a modular a concentração nuclear de Ca 2+ 14 e o α nuclear1AR (α1-adrenérgico receptor) estimula a sinalização de dentro para fora para ativar ERK (quinase regulada por sinal extracelular) localizada nas caveolas da membrana plasmática. 15

Dessensibilização GPCR

Embora a sinalização GPCR seja essencial para a função celular normal, a sinalização sustentada pode ter efeitos prejudiciais na sobrevivência celular e consequências mal adaptativas, como insuficiência cardíaca ou tumorigênese. 16,17 Assim, a terminação rigidamente regulada da sinalização GPCR é crítica para manter a fisiologia normal. Vários mecanismos estão envolvidos na terminação da sinalização do receptor, incluindo a inativação da proteína G mencionada acima, bem como a dessensibilização do receptor que desacopla o receptor da sinalização mesmo na presença de um ligante. O processo de dessensibilização do receptor envolve a fosforilação do GPCR em certos resíduos de serina e treonina no terceiro ICL (alça intracelular) e na cauda do terminal carboxi (terminal C) e é denominado dessensibilização heteróloga e homóloga, respectivamente. 18 A dessensibilização heteróloga é mediada por quinases ativadas por sinalização de segundo mensageiro desencadeada por receptor, como PKA e PKC, que por sua vez fosforilam resíduos de aminoácidos localizados principalmente dentro do terceiro ICL e terminal C proximal, para desacoplar suas proteínas G associadas e, assim, encerrar a sinalização . A fosforilação mediada por 18 PKA também pode mudar o acoplamento do receptor a um subtipo distinto de proteínas G. Por exemplo, a fosforilação mediada por PKA do β2AR diminui a afinidade do receptor para Gαs, enquanto promove o acoplamento do receptor ao Gαeu, 19 desencadeando assim Gαeu- vias mediadas e desligando Gαs-produção de cAMP ativada. Além da inibição da produção de cAMP, a fosforilação mediada por PKA ou PKC de βARs cardíacos também promove a degradação de cAMP induzindo o recrutamento da proteína adaptadora β-arrestina e PDE4 (fosfodiesterase 4). 20 PDE4 é uma importante enzima que regula a dessensibilização de βAR através da hidrólise de cAMP para manter o equilíbrio da produção e degradação de cAMP sob estimulação prolongada do receptor 21 e através do aumento da fosforilação βAR mediada por PKA e subsequente Gs-Geu comutação. 22 Em contraste, a dessensibilização homóloga refere-se a outro mecanismo chave pelo qual ocorre a dessensibilização de GPCR e envolve a fosforilação do receptor através de uma família de quinases conhecidas como GRKs (GPCR quinases). 23 Existem 7 membros na família GRK. Entre eles, GRK1 e GRK7 são expressos especificamente na retina. GRK4 mostra expressão localizada em espermatozóides e células germinativas, enquanto os outros 4 membros (GRK 2, 3, 5 e 6) são expressos de forma ubíqua. 23 GRKs medeiam a fosforilação de resíduos de serina e treonina principalmente dentro da cauda carboxila de GPCRs ativados por agonista e promovem a translocação de β-arrestina para o receptor. Além da formação do complexo GPCR-β-arrestina dependente da fosforilação da cauda do receptor, a β-arrestina também pode ser ativada por seu envolvimento transitório com o núcleo transmembranar GPCR. 24

A ligação da β-arrestina estericamente interdita o acoplamento adicional da proteína G ao receptor, ao mesmo tempo que promove a internalização do receptor ativado. As 25 β-arrestinas interagem com a própria clatrina e a proteína adaptadora de clatrina AP2 (proteína adaptadora 2), portanto, direcionam o receptor anexado às fossas revestidas de clatrina e levam à internalização do receptor. 26 Os receptores internalizados nos endossomos iniciais são rapidamente reciclados para a membrana plasmática ou sofrem internalização prolongada em endossomos tardios, de onde podem ser reciclados lentamente para a superfície da célula ou prosseguir para os lisossomos para degradação. 9 Curiosamente, estudos recentes sugerem que os GPCRs internalizados podem continuar a ativar as vias a jusante nos endossomos, levando à sinalização sustentada. 12,27

As β-arrestinas também podem regular a internalização e degradação do receptor, regulando a ubiquitinação dos receptores. As β-arrestinas podem interagir diretamente com uma matriz de ubiquitina ligase e desubiquitinases, permitindo uma regulação bem ajustada da dinâmica de ubiquitinação / desubiquitinação que determina o destino do tráfego dos receptores internalizados. 28

Sinalização GPCR mediada por β-arrestina e o conceito de agonismo tendencioso

β-arrestinas são membros da família arrestin (arrestin 1–4). Arrestin1 e arrestin4 são expressos na retina, enquanto arrestin2 (também denominado β-arrestin1) e arrestin3 (β-arrestin2) são amplamente expressos em outros tecidos. 29 As 4 proteínas arrestinas compartilham uma alta sequência e homologia estrutural consistindo de domínios N- e C-terminais construídos de fitas β antiparalelas e loops intervenientes. 30,31 Apesar de sua estrutura altamente conservada, parece que as 2 isoformas de β-arrestina são suficientes para regular a diversidade de GPCRs ativados por agonista. 29

β-arrestinas são reguladores críticos da sinalização GPCR que não apenas medeiam a dessensibilização e internalização de receptores ativados, mas também funcionam como transdutores de sinal por meio de sua função como proteínas adaptadoras / esqueleto para ativar uma ampla gama de vias de sinalização intracelular. Por exemplo, as β-arrestinas podem interagir diretamente com a tirosina quinase c-Src, levando à formação de complexos receptor-Src e desencadeando a ativação de ERK. 32 Eles medeiam a transativação do EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) por β1 AR e AT1Rs, que também levam à ativação de ERK. 33,34 A ativação de ERK β-arrestina-dependente pode regular a síntese de proteínas através de MAPK (proteína quinase ativada por mitogênio) interagindo com MNK1 (serina / treonina quinase 1), 35 bem como mediar a sinalização antiapoptótica pela regulação da fosforilação de BAD (BCL2- agonista associado de morte celular). 36 β-arrestinas também estão envolvidas em processos celulares que iniciam a sinalização de PI3K (fosfoinositídeo 3-quinase) e AKT para levar a várias respostas celulares e fisiológicas no contexto de GPCRs distintos. 37–39 Eles inibem a expressão do gene direcionado NF-κB (fator nuclear-κB) através da ligação e estabilização de IκBα - o inibidor de NF-κB. 40

A sinalização mediada por β-arrestina parece ser cinética e funcionalmente divergente daquela mediada pelas proteínas G. Enquanto a sinalização da proteína G é rápida e transitória, a sinalização da β-arrestina é mais lenta e persistente. 41 Por exemplo, a ativação de ERK mediada pela proteína G leva à sua translocação para o núcleo da célula, onde fosforila e ativa uma variedade de fatores de transcrição. Em contraste, o ERK ativado por meio de β-arrestina é retido no citosol, fosforilando um conjunto distinto de substratos e levando a diferentes respostas celulares. 41,42

A capacidade das β-arrestinas de transduzirem independentemente a sinalização celular levou ao conceito emergente conhecido como agonismo tendencioso, que descreve a capacidade de diferentes ligantes para um GPCR de ativar subconjuntos distintos de eventos de sinalização a jusante. 43 Quando a β-arrestina foi originalmente identificada como um mediador de sinalização, o conceito prevalecente na época era que a ligação de ligantes ao sítio ortostérico de um GPCR sinalizará igualmente através das vias dependentes de proteína G e β-arrestina, que ou seja, têm eficácia equilibrada em relação a essas duas cascatas de sinalização. Sob essa noção, os ligantes são classificados em agonistas completos, agonistas parciais, agonistas inversos e antagonistas neutros para ambas as vias. 44 No entanto, o acúmulo de evidências agora levou a um refinamento dessa estrutura conceitual por meio do qual um determinado ligante pode potencialmente ativar um receptor para engajar seletivamente uma proteína G ou β-arrestina como seu transdutor e estimular apenas um subconjunto de sinalização a jusante. 44 De fato, um ligante tendencioso pode ativar preferencialmente a sinalização de β-arrestina sem ativar, ou mesmo bloquear, a via da proteína G ou vice-versa. 44 Esses ligantes são, portanto, denominados agonistas tendenciosos (Figura 2).

Figura 2. Modos de sinalização GPCR (receptor acoplado à proteína G). A, Agonismo tendencioso de GPCRs e potenciais implicações clínicas. Os agonistas tendenciosos ativam seletivamente as vias de sinalização mediadas pela proteína G ou β-arrestina. Os moduladores alostéricos ligam-se a locais distintos no receptor e modulam a atividade dos ligantes ortostéricos de várias maneiras. Estudos anteriores sugerem que a sinalização sustentada da proteína G ativada por β1ARs (β1-adrenérgicos) ou AT1Rs (angiotensina II tipo 1 receptor) está associado a efeitos cardíacos deletérios, enquanto a sinalização β-arrestina pode ser benéfica para a função cardíaca. Portanto, β1Agonistas e moduladores alostéricos tendenciosos para β-arrestina AR e AT1R podem bloquear a ativação prejudicial da proteína G enquanto aumentam os efeitos cardioprotetores. B, Esquema das principais características da estrutura GPCR envolvida na sinalização a jusante. Estudos biofísicos de vários GPCRs mostram como, por meio da estimulação, certas regiões do receptor são mais propensas a se moverem, permitindo a ligação dos efetores. Em particular, a liberação do bloqueio iônico entre TM (domínio transmembrana) 3 e TM6 é crítica para a ativação do receptor ICL (alça intracelular) 2, ICL3, TM5 e TM6 parecem principalmente envolvidos na iniciação de sinalização da proteína G. A β-arrestina se liga ao receptor em 2 configurações: (1) interagindo com a cauda do receptor para mediar a internalização do receptor e a sinalização de β-arrestina ou (2) interagindo com o núcleo transmembranar do receptor para dessensibilizar a sinalização da proteína G.

Em contraste com os ligantes que se ligam ao sítio ortostérico no receptor (o sítio primário onde os ligantes endógenos se ligam), os ligantes alostéricos se ligam a sítios topograficamente distintos e modulam os efeitos dos ligantes ortostéricos. 45,46 Os moduladores alostéricos podem modular a atividade dos ligantes ortostéricos de maneiras distintas: aumentar (modulador alostérico positivo), diminuir (modulador alostérico negativo), simplesmente ligar sem qualquer efeito (modulador alostérico silencioso) ou regular seletivamente subconjuntos de sinalização a jusante (enviesado modulador alostérico) 47 (Figura 2A).

O conceito de agonismo tendencioso no nível do receptor e a descoberta de moduladores alostéricos adicionam dimensões importantes à nossa compreensão da farmacologia de GPCR e fornecem uma estrutura para o desenvolvimento de drogas que pode render um direcionamento terapêutico melhorado de GPCRs com base em perfis de sinalização seletiva dirigida por ligante. Cada vez mais, agonistas tendenciosos estão sendo identificados para muitos GPCRs, e muitos deles demonstraram ter consequências fisiológicas distintas de agonistas equilibrados. 48 Por exemplo, os ligantes polarizados de β-arrestina para AT1R, TRV120023 e TRV120027 mostraram aumentar a contratilidade dos cardiomiócitos, promover a sinalização de sobrevivência celular, antagonizar o aumento da pressão arterial induzida por Ang II e hipertrofia cardíaca e melhorar o desempenho cardíaco. 49–52 No entanto, 2 estudos recentes questionaram a noção de sinalização enviesada por β-arrestina. 53,54 Embora os métodos de derrubada de siRNA de β-arrestina tenham sido usados ​​em vários estudos para documentar a sinalização mediada por β-arrestina, estudos recentes usando CRISPR / Cas9 (agrupamento de repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas / agrupamento de repetições palíndrômicas curtas regularmente espaçadas - associado 9) edição de genes para abolir a expressão de β-arrestina1 / 2 em células HEK293 mostrou que β-arrestinas são dispensáveis ​​para β2Ativação de ERK mediada por AR. 53 Além disso, vários agonistas polarizados com β-arrestina previamente identificados foram incapazes de induzir a sinalização ERK em células G de função zero, onde as proteínas G foram deletadas pela edição do gene ou bloqueadas por um inibidor. 54 Coletivamente, os autores desses 2 estudos concluíram que as proteínas G são os drivers genuínos da sinalização de GPCR, enquanto as β-arrestinas desempenham um papel desprezível. 53,54 Para abordar essas descobertas aparentemente contraditórias entre os estudos usando CRISPR / Cas9 edição de genes e 15 anos de literatura anterior estabelecendo a sinalização GPCR mediada por β-arrestina in vitro e in vivo, um consórcio internacional de laboratórios de sinalização GPCR determinou de forma abrangente o papel da β-arrestina na ativação ERK a jusante de vários GPCRs. 55 Uma variedade de abordagens foi usada: múltipla CRISPR / Cas9 linhas celulares editadas por genes, silenciamento de siRNA, superexpressão e estimulação agonista tendenciosa. De forma rigorosa, os dados mostraram que o knockdown de β-arrestina mediado por siRNA atenua a ativação de ERK, enquanto o knockout de β-arrestina mediado por CRISPR / Cas9 tem efeitos distintos dependendo das linhas celulares e receptores testados. 55 Este estudo demonstrou claramente que o efeito líquido da β-arrestina na ativação de ERK é determinado pelo equilíbrio do efeito inibitório na sinalização da proteína G através da dessensibilização do receptor e o efeito potencializador através das vias mediadas pela β-arrestina, que pode variar entre as células linhas e configurações fisiológicas. 55 É importante ressaltar que a deleção prolongada e completa de β-arrestinas por CRISPR / Cas9 leva a uma reconfiguração celular em que o crescimento e a sobrevivência celular dependem da mudança em direção à ativação de processos celulares mediados pela proteína G. 55

Base Estrutural da Sinalização GPCR

Apesar do grande número de membros da família e da incrível variedade de moléculas de sinalização que eles se ligam, os GPCRs compartilhavam motivos estruturais comuns. Eles consistem em 7 TMs α-helicoidais (domínios transmembrana), daí seu nome 7TMR, regiões intracelulares e extracelulares de alça intermediárias, um terminal N extracelular e um terminal C intracelular. 56

Progresso notável foi feito na última década no entendimento da estrutura biofísica dos GPCRs, revelando a conformação tridimensional dos GPCRs e seus complexos de sinalização. Um dos mais bem caracterizados é o β2AR. Em 2011, uma conformação ativa de β2AR em complexo com o agonista BI-167107 e o G heterotriméricos a proteína foi resolvida. 57 Esta estrutura mostrou que o lado intracelular do β2AR interage com as hélices α N- e C-terminais de Gαs. Comparado com o estado inativo, o β2AR sofre mudanças conformacionais significativas na ativação do agonista: o deslocamento para fora do terminal C de TM5, TM6 e o ​​ICL 3, que forma uma interface com o terminal C de Gαs a formação de uma hélice curta em ICL 2, a segunda interface para Gαs ligação do deslocamento para dentro do terminal C de TM7 e do terminal N da hélice 8, que pode estar associado à fosforilação do receptor e recrutamento de β-arrestina 57 (Figura 2B). Um estudo estrutural recente do receptor de calcitonina com microscopia crioeletrônica revelou uma interface semelhante do lado citoplasmático dos domínios do receptor TM com o Gαs, sugerindo uma interface conservada da proteína G do receptor entre os GPCRs. 58

Estudos estruturais também lançaram luz sobre a interação de GPCRs com β-arrestina. A estrutura cristalina da rodopsina constitutivamente ativa em complexo com β-arrestina pré-ativada sugere que a β-arrestina interage primeiro com a cauda do terminal C da rodopsina e interrompe a interação intramolecular do domínio N e C da β-arrestina. 59 Isso promove a interação total da β-arrestina com a bolsa intracelular do receptor formada pelo lado citoplasmático dos domínios da rodopsina TM. Estudos de β2Os complexos AR-β-arrestina revelam que a interação da β-arrestina com o receptor provavelmente ocorre em um processo de 2 etapas. 25,60 Este estudo usou um receptor quimérico, o β2AR com terminal C substituído pela cauda C do receptor de vasopressina tipo 2, que mantém o β2Propriedades farmacológicas de AR, mas com uma afinidade muito maior para β-arrestina. 25 A análise de imagens EM e reconstruções 3-D revelou que a β-arrestina foi ligada ao receptor em 2 configurações: uma interação mais fraca envolvendo o terminal C fosforilado em ≈60% dos complexos e uma interação mais estreita com a região dedo-loop de β -arrestina envolvida no núcleo transmembranar do β2AR (Figura 2B). 25 Curiosamente, essas 2 conformações do receptor-β-arrestina parecem realizar funções distintas, com a interação da cauda sendo capaz de mediar a internalização do receptor e a sinalização da β-arrestina, enquanto o envolvimento com a conformação do núcleo é provavelmente necessário para interditar a ativação da proteína G, que ou seja, dessensibilização (Figura 2B). 61

A descoberta do agonismo tendencioso implica que os receptores podem adotar múltiplas conformações ativas. Conceitualmente, os GPCRs podem ser considerados oscilantes entre uma variedade de estados conformacionais intermediários. 62 Essa heterogeneidade conformacional permite que o receptor interaja diferencialmente com ligantes e transdutores distintos e, subsequentemente, sinalize por meio de um conjunto diversificado de vias. A ligação de ligantes ao receptor muda o equilíbrio de conformações distintas do receptor, cada ligante preferencialmente estabilizando estados conformacionais únicos que recrutam transdutores de sinalização seletivos. 43 O acúmulo de evidências apóia a ideia de que diferentes ligantes estabilizam distintas conformações de receptores. Usando espectroscopia de fluorescência, foi demonstrado que ligantes com eficácia diferente têm efeitos distintos na mudança conformacional de β2AR, representado pela interrupção de 2 interruptores moleculares: bloqueio iônico que liga as extremidades citoplasmáticas de TM3 e TM6 e cuja interrupção é uma característica fundamental da ativação do receptor e um interruptor rotativo no TM6 que leva ao movimento do TM6 e ativação do receptor. 63 Usando movimento de imagem de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única de TM6 no β2AR foi monitorado na presença de diferentes ligantes ortostéricos com eficácias variadas (agonistas parciais ou totais) e mostrou que diferentes agonistas afetam distintamente o movimento TM6 de Gs-coupled β2ARs destacando que um β2AR em complexo com Gs é estruturalmente único daquele do β livre de nucleotídeos2ARs-Gs complexo. 64 O conceito de conformações de receptor específico de ligante também foi estudado usando marcação química e espectrometria de massa e identificou mudanças conformacionais únicas do β2AR quando estabilizado por um painel de ligantes variando de agonistas completos a um agonista polarizado por β-arrestina. 65 Esses dados são consistentes com estudos recentes que mostram que os agonistas tendenciosos para a proteína G e β-arrestina estabilizam conformações distintas para o receptor de vasopressina tipo 2 66 e o ​​receptor de colecistocinina-2. 67

GPCRs em Regulação Cardiovascular e HF

Os GPCRs são amplamente expressos no sistema cardiovascular e em uma ampla gama de tipos de células, como cardiomiócitos, fibroblastos, células endoteliais (ECs) e células do músculo liso vascular (VSMCs). Nesta seção, destacaremos vários dos GPCRs mais bem estudados e terapeuticamente direcionados e sua regulação em diferentes tipos de células cardíacas.

Receptores adrenérgicos β

Entre os GPCRs, β1AR e β2AR são os subtipos GPCR predominantes expressos no coração de muitas espécies de mamíferos, incluindo humanos, e são os principais reguladores da função cardiovascular. 68 Em condições fisiológicas normais, o β1AR é o subtipo βAR mais abundante em cardiomiócitos, compreendendo ≈80% do total de βARs, enquanto o β2AR compreende ≈20%. A estequiometria dos 2 subtipos βAR muda para ≈60: 40 sob condições de HF, causada principalmente pela regulação negativa seletiva de β1Expressão AR. 69

Os βARs desempenham um papel importante na fisiopatologia da doença cardíaca humana e são alvos terapêuticos comuns de drogas. Os βARs são tradicionalmente ativados pelo hormônio catecolamina epinefrina e pelo neurotransmissor norepinefrina. Eles também podem ser modulados por uma variedade de vias, como vasopressina, insulina 70, 71 TNF-α (fator de necrose tumoral-α) 72 e prostaglandina E. 73 O β1AR acopla principalmente com Gαs, que ativa o efetor de sinalização adenilil ciclase para promover a produção de AMPc de segundo mensageiro e ativa PKA, regulando uma matriz diversa de respostas intracelulares e, finalmente, um aumento na função cardíaca inotrópica e cronotrópica. 69 Com a estimulação tendenciosa do ligante, o β1AR pode engajar seletivamente Gαeu para ativar as vias mediadas pela β-arrestina. 74 O β2AR também acopla principalmente a Gαs mas também pode acoplar a Gαeu através de um mecanismo de troca de proteína G induzido pela fosforilação do receptor mediada por PKA. 19 Vários estudos sugerem que β excessivo1A sinalização de AR promove apoptose de cardiomiócitos, ativação de vias de sinalização adversas e exerce efeitos prejudiciais no coração, enquanto β2A sinalização de AR tem efeitos antiapoptóticos e cardioprotetores. 75-77

Os β-bloqueadores são uma das classes de drogas mais amplamente utilizadas em várias condições, especialmente em doenças cardiovasculares, como hipertensão, infarto do miocárdio pós-agudo e IC. 78 Por exemplo, estudos clínicos demonstraram que o tratamento com β-bloqueadores, carvedilol, bisoprolol ou metoprolol reduz significativamente a morbidade e mortalidade na IC. 79–81 O tratamento com β-bloqueadores normaliza a sinalização βAR, evitando a ativação excessiva do receptor e revertendo a regulação negativa do receptor e melhora a função contrátil do ventrículo esquerdo. O principal uso cardiovascular dos β-bloqueadores é bloquear a hiperativação deletéria da proteína G no coração. Os principais efeitos colaterais envolvem constrição brônquica e dos vasos sanguíneos, que são causados ​​principalmente pela inibição global de β2ARs em outros tecidos. 82

O carvedilol β-bloqueador em particular foi identificado como um ligante βAR polarizado por β-arrestina que ativa preferencialmente as vias mediadas por β-arrestina, embora tenha agonismo inverso para Gαs sinalização. 83,84 O βAR estimulado por carvedilol ativa uma variedade de eventos de sinalização de maneira dependente de β-arrestina, incluindo processamento de microRNA, transativação de EGFR e indução de ERK. 42,84,85 A transativação de EGFR mediada por β-arrestina parece ter um efeito cardioprotetor, conforme demonstrado pelo aumento da apoptose e dilatação cardíaca em camundongos transgênicos com superexpressão de um β mutante1AR sem sítios de fosforilação de GRK que não podem recrutar β-arrestina e, portanto, incapaz de transativar EGFRs. 33 Assim, a sinalização β-arrestina-dependente de βAR parece ser benéfica para o coração.

Dentre os diversos tipos de células que compõem o coração dos mamíferos, os mais abundantes são os cardiomiócitos, fibroblastos cardíacos, CEs e VSMCs. 86 Na seção seguinte, discutiremos os papéis exclusivos dos βARs nos vários tipos de células relevantes para a fisiopatologia cardiovascular (Figura 3A).

Figura 3. Papéis funcionais dos GPCRs (receptores acoplados à proteína G) no sistema cardiovascular. A, Papéis fisiopatológicos de βARs (receptores β-adrenérgicos) em células cardiovasculares. β1ARs (β1-receptores adrenérgicos) e β2ARs (β2receptores adrenérgicos) são expressos diferencialmente no sistema cardiovascular. β1Os ARs são o subtipo βAR predominante nos cardiomiócitos, cuja ativação aumenta a contratilidade cardíaca e promove a hipertrofia dos miócitos. β2Os ARs são mais abundantes em fibroblastos cardíacos, células endoteliais e células do músculo liso vascular, onde desempenham papéis importantes na fibrose e vasodilatação. B, Representação esquemática das funções do AT1R (receptor da angiotensina II tipo 1) em tipos de células cardiovasculares. Os AT1Rs regulam um conjunto complexo de respostas no sistema cardiovascular. A ativação crônica do AT1R promove hipertrofia, fibrose e remodelação cardíaca. C, Principais efeitos dos outros GPCRs. Os GPCRs participam em diferentes níveis na regulação da fisiopatologia cardiovascular. Cada classe de receptor terá efeitos diferenciais dependendo do subtipo de receptor, tipo de célula e modo de estimulação, contribuindo de diversas maneiras para um fenótipo específico. Para papéis funcionais específicos de subtipos de receptores individuais, consulte a Tabela. αAR indica receptor α-adrenérgico 5-HT, receptor de serotonina APJ, receptor de apelina AR, receptor de adenosina ECM, matriz extracelular eNOS, NO sintase endotelial ETR, receptor de endotelina HR, receptor de histamina MLCK, cadeia leve de miosina quinase MMP, metaloproteinase MR, muscarínico receptor RXFP, receptor de peptídeo da família da relaxina S1PR, receptor de esfingosina 1-fosfato VR, receptor de vasopressina e VSMC, célula de músculo liso vascular.

Cardiomiócito

Os cardiomiócitos, responsáveis ​​por ≈30% do número de células e 70% da massa celular do coração dos mamíferos, compõem o músculo cardíaco e fornecem a força contrátil para o coração. 86 Quando estressados, eles sofrem respostas hipertróficas e apoptóticas que podem levar à cardiomiopatia e, por fim, à IC. Enquanto ambos os β1AR e o β2AR acopla-se principalmente a Gαs e estão presentes nos cardiomiócitos, eles desempenham efeitos distintos nas vias de sinalização e nas respostas celulares. O β1AR é o subtipo predominante em cardiomiócitos. A estimulação de β1A AR em cardiomiócitos aumenta a contratilidade cardíaca por meio da fosforilação mediada por PKA de várias proteínas regulatórias importantes do nível de Ca 2+ intracelular ou da sensibilidade ao Ca 2+ do miofilamento, como canais de Ca 2+ do tipo L, receptor de rianodina, fosfolambano e troponina I. 69 , 87 Os camundongos com superexpressão específica de cardiomiócitos de β1Os ARs desenvolveram hipertrofia dos miócitos em uma idade jovem que evoluiu progressivamente para IC. 88 Em contraste, β2A estimulação com AR exerce efeito inibitório sobre a contratilidade e protege os cardiomiócitos da apoptose e hipertrofia. 75,87 Esses papéis funcionais distintos dos subtipos de receptor podem ser atribuídos a 2 aspectos: o β2Gα ativado por AReu inibe a adenilil ciclase enquanto ativa a via 75 de PI3K-AKT e a compartimentação de sinalização diferencial. 89 Considerando que o efeito de β1A ativação do AR é difusiva, o β2A acumulação de cAMP induzida por AR e a fosforilação de proteína mediada por PKA são localizadas. 89

Fibroblasto

Os fibroblastos cardíacos são o tipo de célula não miocitária mais abundante no coração, constituindo-se aproximadamente 60% do número de células e 15% da massa celular do tecido. 90 Eles desempenham papéis regulatórios importantes na remodelação cardíaca, fibrose e hipertrofia por meio da regulação da proliferação celular, produção e remodelação da matriz extracelular (MEC), bem como geração de moléculas de sinalização autócrina e parácrina. 91 O β2AR é o subtipo βAR com maior expressão em fibroblastos cardíacos. 91 Estimulação de β2ARs, mas não β1Os ARs promovem a degradação do colágeno e induz a autofagia. 92 β2Os ARs também induzem a ativação de ERK e a proliferação celular por meio da transativação de EGFR. 91

Célula endotelial

Os CEs regulam as funções vasculares, como permeabilidade, homeostase e angiogênese. 93 A disfunção endotelial pode aumentar o estresse oxidativo cardíaco, promover angiogênese e fibrose e levar ao comprometimento da função cardíaca na IC. 93 β2ARs, mas não β1ARs, são expressos em ECs. 94 β2A estimulação de AR ativa a eNOS (NO sintase endotelial) e, subsequentemente, promove a vasodilatação dependente de NO. 95 Além disso, estimulação ou superexpressão do β2AR promove a proliferação de EC por meio da ativação de ERK. 96

Célula muscular lisa vascular

Os VSMCs estão envolvidos na regulação da contratilidade vascular e na produção de moléculas de ECM. 97 Na estimulação, o β2AR expresso em VSMCs induz a geração de cAMP e diminui a atividade de MLCK (miosina quinase de cadeia leve) - uma enzima que fosforila a miosina de músculo liso e aumenta a contratilidade. 98 Portanto, o cAMP induzido pelo β2AR em VSMCs diminui a contratilidade e promove o relaxamento do músculo liso. Foi relatado que β2AMPc induzido por AR também inibe a migração de VSMC. 99

Receptores de angiotensina

Os receptores de angiotensina, particularmente AT1R, desempenham um papel fundamental na fisiopatologia do coração. Os AT1Rs cardíacos são regulados positivamente em resposta a estímulos hipertróficos, com isquemia, e promovem remodelação cardíaca adversa mal-adaptativa na IC. 69 Ang II - o ligante endógeno do AT1R - é um hormônio peptídico que regula vários processos fisiológicos importantes, como a contração do músculo liso vascular e a liberação de aldosterona. É também um componente principal do sistema renina-angiotensina - um sistema regulatório chave que controla a pressão arterial. AT1Rs acoplam-se ao Gαq família de proteínas G para transduzir a sinalização, mas também pode mediar a sinalização através das subunidades Gβγ e β-arrestina. 100,101 Curiosamente, evidências recentes sugerem que, para alguns sinais dependentes de β-arrestina, os AT1Rs precisam recrutar inicialmente Gαeu ao complexo AT1R-β-arrestina para transduzir totalmente o sinal. 101

A superexpressão de AT1R promove fibrose cardíaca e hipertrofia cardíaca, enquanto o nocaute de AT1Rs mostra função cardíaca aumentada após infarto do miocárdio, sugerindo que o AT1R tem efeitos cardíacos prejudiciais. Considerando seu papel central na fisiologia cardiovascular, os AT1Rs tornaram-se um alvo atraente para o desenvolvimento de medicamentos para doenças cardiovasculares. 16 ARBs (bloqueadores do receptor da angiotensina) e inibidores da ECA são amplamente utilizados no tratamento da IC. Além disso, estudos recentes em sistemas de modelos experimentais sugerem que a ativação seletiva da sinalização de β-arrestina, enquanto bloqueia a ativação da proteína G a jusante do AT1R, pode fornecer benefícios adicionais em comparação com os ARBs atuais. 49–52 Isso levou ao desenvolvimento de ligantes polarizados de AT1R-β-arrestina, como os ligantes polarizados de β-arrestina TRV120027 e TRV120023. Em estudos pré-clínicos, o TRV120027 demonstrou ser capaz de aumentar o desempenho cardíaco, além do efeito positivo na preservação da função renal observado também com BRAs convencionais. 49,50 Como os ARBs, o TRV120027 promove vasodilatação (via inibição da via da proteína G), mas também oferece o benefício adicional de aumentar a contratilidade cardíaca (via sinalização de β-arrestina). Estudos clínicos foram realizados para avaliar o potencial desta molécula 102, embora o BLAST-AHF (ligante enviesado do estudo do receptor da angiotensina na insuficiência cardíaca aguda) tenha falhado em melhorar o estado clínico no seguimento de 30 dias em pacientes com IC aguda, 103 ligantes tendenciosos ainda permanecem uma perspectiva atraente para o design de novos medicamentos. Outro membro da família de ligantes polarizados por β-arrestina, TRV120023, demonstrou inibir a hipertrofia cardíaca induzida por Ang II 52 e promover a contratilidade cardíaca 51,104 e sobrevivência de cardiomiócitos após lesão isquêmica, 51 enquanto o ligante polarizado por β-arrestina, TRV120067, pode melhorar a função cardíaca por meio da alteração da resposta do miofilamento-Ca 2+ em um modelo de cardiomiopatia de camundongo. 105 Todos esses estudos sugerem o potencial de ligantes tendenciosos como novos agentes terapêuticos, ativando seletivamente as vias de sinalização favoráveis ​​enquanto minimizam a ativação indesejável da sinalização da proteína G, sabidamente prejudicial na doença cardiovascular.

AT1Rs também são conhecidos como mecanossensores.O estresse mecânico é um regulador crítico da função cardíaca e um estímulo importante para o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca. 106 O estresse mecânico induz uma variedade de respostas hipertróficas, como a regulação da expressão de genes hipertróficos e o aumento da síntese protéica e da atividade de várias proteínas quinases. O tratamento com bloqueadores AT1R atenua essas respostas hipertróficas induzidas por estresse mecânico em miócitos cardíacos. 107 O estresse mecânico pode ativar os AT1Rs, promovendo a liberação autócrina de Ang II pelos cardiomiócitos, bem como por meio de vias independentes de Ang II. 108,109 Estudos recentes sugerem que o estresse mecânico ativa direta e especificamente a sinalização polarizada por β-arrestina de AT1Rs, independente de ligantes e proteínas G, ao estabilizar alostericamente uma conformação AT1R polarizada por β-arrestina única. 110,111 A análise biofísica da conformação do AT1R sugere que, quando o receptor é ativado por estiramento mecânico, o TM7 do AT1R sofre uma rotação no sentido anti-horário que o desloca para a bolsa de ligação ao ligante. 112 Um estudo recente sugere que o estresse mecânico ativa AT1R por meio de um mecanismo distinto daquele ativado por ligantes polarizados de β-arrestina, onde os receptores ativam especificamente Gαeu para ativar a sinalização de β-arrestina. 101 É importante ressaltar que a sinalização polarizada por β-arrestina mediada por AT1R mecanoativada parece ser o mecanismo pelo qual a lei de Frank-Starling do coração usa para gerar força. 104

Embora os efeitos da Ang II em AT1Rs tenham sido bem estudados, agora é reconhecido que o subtipo AT2R (receptor de Ang II tipo 2) desempenha um papel importante na fisiologia cardiovascular. Os níveis de AT2R são elevados no tecido fetal, mas diminuem rapidamente com o envelhecimento, sugerindo um papel mais proeminente nos processos de desenvolvimento. As evidências sugerem um papel potencial para AT2R em antagonizar a sinalização de AT1R. Em cardiomiócitos e fibroblastos de rato, AT2R antagoniza a proliferação induzida por AT1R. 113 A sinalização induzida por Ang II que em fibroblastos cardíacos ativa AT1R e AT2R para regular o crescimento celular e a secreção de colágeno e se mostra alterada na IC. 114 No entanto, o papel preciso e a importância do AT2R na fisiopatologia cardiovascular ainda precisam ser determinados.

AT1Rs são expressos em diferentes componentes do sistema cardiovascular (Figura 3B). Dependendo do tipo de célula, o AT1R estimulado pode provocar a ativação de diferentes vias. 115

Cardiomiócito

Em cardiomiócitos, foi demonstrado que os AT1Rs afetam processos que variam da hipertrofia à apoptose. Os camundongos com superexpressão de AT1R especificamente em cardiomiócitos exibem corações significativamente maiores do que os controles pareados por idade, área aumentada de miócitos, deposição de colágeno e expressão de fator natriurético atrial. 116 Ativação de Gαq foi demonstrado que a sinalização contribui para os fenótipos hipertróficos. 117 Este fenótipo é bloqueado pelo antagonista AT1R losartan. 118 Camundongos transgênicos com expressão induzível de AT1R específica para cardiomiócitos mostraram que a ativação do receptor é responsável pela hipertrofia independente da pressão arterial e disfunção cardíaca. 119 Curiosamente, foi descoberto recentemente que um peptídeo endógeno definido como Ang (1-7) (angiotensina [1-7]), anteriormente conhecido por ser um inibidor competitivo natural de Ang II, 120 se liga ao AT1R agindo como uma β-arrestina- ligando tendencioso, recrutando e ativando β-arrestina para promover a fosforilação de ERK. 121 Em um modelo de remodelação cardíaca de rato, a infusão de Ang (1–7) é suficiente para reduzir a espessura da parede ventricular esquerda e a pressão diastólica final. 121 Embora o efeito positivo do peptídeo Ang (1–7) tenha sido demonstrado anteriormente, 120 agora está ficando claro que parte de sua ação é derivada de suas propriedades como um ligante polarizado por AT1R.

Os AT1Rs estimulados por Ang II modulam a apoptose dos cardiomiócitos por meio de múltiplas vias. 122.123 Gαq a ativação aumenta amplamente o nível de Ca 2+ intracelular, que por sua vez aumenta a atividade da endonuclease intracelular. 122 Além disso, AT1Rs podem acoplar ao Gα12/13 promover a ativação de Rho e Rac e, portanto, a produção de ROS (espécies reativas de oxigênio). Isso levará à ativação de vias a jusante, como JNK (c-Jun N-terminal quinase), p38 e sinalização de MAPK, bem como HSF1 (fator de choque térmico 1) acetilação e IGF-IIR (fator de crescimento semelhante à insulina Receptor II). 123,124 Enquanto os efeitos deletérios dos AT1Rs na função cardíaca parecem ser dependentes da proteína G, a via do AT1R mediada pela β-arrestina confere efeitos cardioprotetores, como aumento da contratilidade dos cardiomiócitos.

Fibroblasto

Embora a remodelação cardíaca que ocorre como resultado da estimulação crônica do AT1R seja proeminente por causa dos efeitos nos cardiomiócitos, os fibroblastos também contribuem de maneira importante para esse processo. A ativação do AT1R leva à transição de fibroblastos cardíacos para miofibroblastos ativos, resultando na produção de diferentes componentes da MEC, como colágenos, laminina e fibronectina, e modificando a expressão de MMPs (metaloproteinases de matriz). 125 Esse efeito é, pelo menos em parte, regulado por um aumento na produção de TGF-β (fator transformador de crescimento-β), que por sua vez promove a translocação de proteínas Smad para o núcleo, conduzindo à produção de vários fatores profibróticos. 126.127 Camundongos com superexpressão de construções mutantes AT1R, que são incapazes de sinalizar via proteínas G, apresentam fibrose cardíaca reduzida em comparação com camundongos que superexpressam AT1R WT (tipo selvagem), indicando assim que a via da proteína G contribui para a fibrose. 128 No entanto, há evidências de que as β-arrestinas também contribuem para a fibrose em vários contextos de doença. 129 Embora o bloqueio de AT1Rs tenha demonstrado inibir a fibrose miocárdica, 130 a contribuição precisa das β-arrestinas para o desenvolvimento da fibrose exigirá estudos adicionais para avaliar até que ponto os agonistas com tendência de AT1R contribuem para esse processo.

Célula endotelial

Em CEs, a ativação do AT1R produz vários efeitos, como produção de ROS, aumento da apoptose e aumento da trombose. A estimulação da Ang II, de fato, promove a produção de NO dependente de eNOS 131 e exacerba o estresse oxidativo, 132 levando à disfunção endotelial - um processo relevante no contexto da hipertensão. A ativação de AT1R em CEs promove a permeabilidade microvascular por meio de um aumento nos níveis de cálcio intracelular e disfunção endotelial por meio da ativação de calpaínas dependentes de cálcio. 133 O bloqueio de AT1Rs em CEs é, portanto, uma opção terapêutica atraente e é apoiado por dados que mostram que os BRAs podem melhorar a disfunção endotelial em pacientes hipertensos. 134

Célula muscular lisa vascular

As alterações observadas na produção de ECM por fibroblastos são um evento chave na remodelação vascular e têm implicações para a migração e adesão de VSMC também. 135 Ang II modula a remodelação vascular, estimulando diretamente VSMC para produzir componentes da ECM. 115 In vitro, AT1Rs estimulados por Ang II promovem as vias PKC e Jak-STAT, produção de ROS e transativação de EGFR, 34,101,136, todas resultando na estimulação da cascata MAPK, 137, bem como RhoA, Rho-quinase, c-fos, c -Src e JNK. 138,139 Ao todo, esses sinais levam a uma mudança de um fenótipo contrátil para um proliferativo e subsequente crescimento celular. 115 O efeito proproliferativo também foi observado in vivo, onde a proliferação de VSMC induzida por lesão vascular é fortemente reduzida em camundongos knockout para AT1R em comparação com WT e é distinta dos efeitos mediados pelo AT2R. 140 Além disso, em humanos e ratos, c-Src medeia a ação contrátil da Ang II, e esse efeito é exacerbado na hipertensão. 141 No entanto, a Ang II atua não apenas por meio da ação direta em AT1Rs, mas também como um efeito indireto em várias cascatas de sinalização celular por meio da transativação de outros receptores tirosina quinases (PDGFR [receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas], EGFR e IGFR [semelhante à insulina receptor do fator de crescimento]). Entre eles, é particularmente interessante o EGFR, que contribui ativamente para a ativação de ERK induzida por Ang II em cardiomiócitos e hipertrofia de VE in vivo. 142 In vivo, a inibição da transativação do EGFR atenua a hipertensão e a hipertrofia. 142 Em VSMCs, a transativação de EGFR mediada por Ang II modula a hipertrofia e a migração. 143 Além disso, a estimulação de Ang II em VSMCs conduz uma resposta pró-inflamatória robusta induzindo a produção de ROS, liberação de citocinas e regulação positiva de moléculas de adesão e genes inflamatórios. 144 Em conjunto, esses estudos mostram a importância da Ang II e do AT1Rs na remodelação vascular. Embora a transativação de EGFR mediada por AT1R pareça ser importante para o crescimento de cardiomiócitos, pode não ser uma característica crítica que direciona a proliferação de fibroblastos cardíacos. 145

Receptores adrenérgicos α

Semelhante aos βARs, os αARs (receptores α-adrenérgicos) também se ligam e são ativados por catecolaminas endógenas. A família αAR é composta por α1AR (α1A, α1B, α1D) e α2AR (α2-receptor adrenérgico α2A, α2B, α2C) subfamílias (Tabela). 146 α1ARs se acoplam principalmente a Gαq para ativar o PLC, levando à geração de segundos mensageiros inositol 1,4,5-trifosfato e diacilglicerol que, subsequentemente, aumentam o nível de Ca 2+ intracelular. 147 Todos os 3 α1Os subtipos de AR são expressos no coração. Os cardiomiócitos expressam tanto α1A e α1B, com α1B sendo predominante. 147 α1DAR (α1D-adrenérgico) é o principal α1Subtipo AR expresso em células de músculo liso coronário. 148 Em resposta a estímulos hipertróficos ou estímulos crônicos, a expressão de α1A está aumentado nos cardiomiócitos, enquanto os níveis de α1B e α1D são diminuídos, com o α geral1Nível de AR inalterado ou aumentado. 147 Ao contrário de outros Gqreceptores acoplados, como o AT1R, dos quais a superexpressão ou ativação crônica exercerá efeito cardíaco adverso, α1Os ARs desempenham funções cardioprotetoras importantes, incluindo hipertrofia fisiológica, aumento da contratilidade e diminuição da apoptose. 149,150 Em resposta à sobrecarga de pressão por constrição transversal da aorta, camundongos com nocaute duplo de α1A e α1BAR (α1B-adrenérgico) apresentou aumento da apoptose, piora da cardiomiopatia dilatada e redução da sobrevida global. 151 Esses dados sugerem que algum cuidado deve ser considerado ao usar α1Antagonistas de AR, medicamentos para o tratamento de hipertensão ou doenças da próstata. Na verdade, embora o mecanismo preciso não seja totalmente claro, o α1Os antagonistas de AR doxazosina e prazosina foram associados ao aumento da incidência de IC e mortalidade em ensaios clínicos. 152,153 Em contraste com os cardiomiócitos, os fibroblastos cardíacos não expressam α1ARs. 154 o α1BO AR é expresso nas células do endotélio da artéria coronária e pode regular a vasodilatação e a angiogênese. 155

Mesa. GPCRs representativos no sistema cardiovascular

αAR indica receptor α-adrenérgico A1R, receptor de adenosina A1 A2aR, receptor de adenosina A2a A2bR, receptor de adenosina A2b A3R, receptor de adenosina A3 APJ, receptor de apelina AR, receptor de adenosina ET, endotelina ETUMAR, ETUMA receptor ETBR, ETB receptor Gαeu, Gαinibitórios, GαestimulanteRXFP1, receptor de peptídeo da família da relaxina 1 RXFP2, receptor de peptídeo da família de relaxina 2 RXFP3, receptor de peptídeo da família de relaxina 3 RXFP4, receptor de peptídeo da família de relaxina 4 S1PR1, receptor de esfingosina-1-fosfato 1 S1PR2, receptor de esfingosina-1-fosfato 2 S1PR3, esfingosina- Receptor de 1-fosfato 3 S1PR4, receptor de esfingosina-1-fosfato 4 e S1PR5, receptor de esfingosina-1-fosfato 5.

α2ARs par para Geu para inibir a adenilil ciclase, reduzindo a geração de AMPc e diminuindo o nível de Ca 2+ intracelular. Eles ocorrem pré e pós-sinápticamente. Α pré-sináptico2Os ARs são os principais reguladores das liberações simpáticas e de catecolaminas. 156 No coração saudável, α ativado pela norepinefrina2Os ARs atuam como um feedback negativo para inibir a liberação de norepinefrina. 156 Deleção de gene de α2AAR (α2Areceptor -adrenérgico) ou α2CAR (α2C-adrenérgico), ou ambos, em camundongos leva a níveis elevados de norepinefrina e piora da insuficiência cardíaca. 157.158 O α2BAR está presente em VSMCs e regula a vasoconstrição. 159

Receptores Muscarínicos

Os receptores muscarínicos são ubiquamente expressos em órgãos humanos e estão envolvidos em diversos processos fisiopatológicos, que vão desde a contração do músculo liso até a secreção glandular. 226 Como consequência, a possibilidade de direcionar esses receptores para fins terapêuticos tem sido amplamente investigada, inclusive para doenças cardiovasculares. Existem 5 subtipos principais de receptor muscarínico (M1, M2, M3, M4, M5) Entre os diferentes subtipos, M1, M3, e M5 sinal através de Gq, enquanto M2 e M4 casal para Geu, 227 apoiando seus diferentes papéis na fisiologia cardíaca (Tabela). No coração, a isoforma predominante é a M2 receptor, e sua função fundamental é mediar a sinalização parassimpática, principalmente inibindo a resposta da frequência cardíaca. 164 Em resposta à acetilcolina, o M ativado2 receptor liga Geu levando a uma redução do cAMP intracelular, reduzida corrente If através do canal HCN (hiperpolarização-ativada por nucleotídeo cíclico), 166,167 uma diminuição no Ca 2+ intracelular, 168 com efeitos cronotrópicos e inotrópicos negativos subsequentes. Simultaneamente, as subunidades Gβγ liberadas ativam o canal de potássio muscarínico, promovendo ainda mais os efeitos cronotrópicos negativos. 228

Em pacientes com IC, M2 a densidade do receptor muscarínico é regulada positivamente, enquanto os outros subtipos permanecem inalterados, 163,164,169,229 e M ativado2 os receptores podem promover a resposta inotrópica por meio da fosforilação da cadeia leve da miosina. 230 Funcional M3 subtipo também parece desempenhar um papel importante no coração. 170

Os receptores muscarínicos foram um dos primeiros exemplos de sinalização tendenciosa. De fato, desde o início dos anos 90, diferentes análogos da acetilcolina foram avaliados quanto à sua capacidade de ativar seletivamente um número limitado de vias de sinalização a jusante do receptor M1, como uma possível terapia para a doença de Alzheimer. 161 Recentemente, a descoberta de mutações nas bolsas de ligação alostérica e ortostérica, juntamente com outros locais, despertou um novo interesse no potencial terapêutico desses receptores. 231.232 Além disso, medicamentos bem conhecidos estão assumindo um novo papel. Um exemplo é dado pela pilocarpina - um agonista do receptor muscarínico comumente usado como cura para glaucoma e boca seca, que agora foi encontrado como um ligante polarizado de β-arrestina para o receptor M3. 162 Além disso, a própria β-arrestina parece atuar como interruptor molecular no receptor M1, que coordena não apenas a sua dessensibilização, mas também a finalização da sinalização dependente do diacilglicerol. 232 Portanto, o uso de agonista tendencioso nesses receptores parece particularmente promissor.

Receptores de endotelina

Dos 4 ETs (ET 1–4), ET-1 é a principal isoforma encontrada no sistema cardiovascular. A estimulação crônica com ET-1 está associada a efeitos adversos que variam de hipertrofia de miócitos 178 a hipertensão 179 e níveis elevados de ET-1 no plasma foram encontrados em pacientes e modelos experimentais de IC. 233.234 ET-1 exerce seus efeitos ligando-se a qualquer um dos ETUMAR (ETUMA receptor) ou o ETBR (ETB Tabela do receptor) no entanto ETUMA parece ser o principal jogador no coração. Tanto no tecido atrial quanto no ventricular, ETUMARs par para Gq promover a formação de IP3 e ativar a sinalização MAPK. 235 Nos átrios, ETUMARs também pode levar à inibição da adenilil ciclase, provavelmente através de Geu acoplamento. Além disso, em vasos humanos foram encontradas diferentes moléculas atuando como ligantes tendenciosos, o que pode ser relevante na hipertensão. 176,177 A inibição da sinalização de ET resulta em sobrevida prolongada na IC experimental, 236 embora o bloqueio da ETR (receptor de endotelina) em ensaios clínicos com IC humana não tenha se mostrado benéfico. 237.238

Uma recente meta-análise de ensaios clínicos que testaram 4 antagonistas da ETR, bosentan, sitaxentan, macitentan ou ambrisentan, revelou vários efeitos adversos significativos de cada medicamento. 239 Está claro que embora os antagonistas da ETR conferam efeitos protetores sobre os sistemas cardiovasculares, eles também promovem vários efeitos colaterais indesejados. O desenvolvimento de drogas que evitem esses efeitos é, portanto, desejável. Para tanto, a estrutura cristalina do ETBR ligado a bosentan foi recentemente decifrado. 240 Este estudo revelou interações detalhadas entre os dois, que são provavelmente conservadas no ET intimamente relacionadoUMAR. A esperança é que uma compreensão estrutural mais sólida da relação entre esse antagonista e o receptor possibilite o desenho racional de alternativas terapeuticamente superiores.

Receptores de Adenosina

A adenosina é uma purina à base de adenina e exerce sua função em diversos processos fisiológicos, incluindo aqueles que ocorrem no sistema cardiovascular. A ação da adenosina é mediada por GPCRs conhecidos como ARs (receptores de adenosina). Existem 4 subtipos de ARs: A1R (receptor de adenosina A1), A2aR (receptor de adenosina A2a), A2bR (receptor de adenosina A2b) e A3R (tabela de receptor de adenosina A3). 241 Embora todos os ARs se liguem à adenosina, cada receptor difere em vários aspectos, incluindo a expressão em vários tipos de células e os transdutores e efetores aos quais eles se acoplam. A1Rs e A3Rs transmitem seu sinal principalmente por meio de Geu, inibindo a produção de cAMP, enquanto A2Rs se acoplam principalmente a Gs. Gβγ subunidades liberadas por estimulação de AR também desempenham um papel importante no crescimento e remodelação celular, o que não é surpreendente porque a sinalização de Gβγ foi demonstrada para outros GPCRs. O 228 A1R interage com o PLC, influenciando a liberação de inositol 1,4,5 – trifosfato e Ca 2+ e modulando indiretamente os canais de K + e Ca 2+. 163.188

Conforme mostrado para outros GPCRs, também os ARs exibem sinalização tendenciosa, como o agonista tendencioso VCP746, que não tem efeito sobre a frequência cardíaca enquanto reduz a hipertrofia em ratos 185 ou capadenoson - um conhecido agonista parcial A1R capaz de contrastar a remodelação cardíaca em um modelo animal de HF – foi encontrado atuando como um ligante tendencioso para A2BR em fibroblastos e cardiomiócitos. 186 Outro exemplo é dado pela inosina, que atua como um ligante tendencioso no A2aR de forma única, prolongando a estimulação da adenosina. 187

Na vasculatura, A2R é considerado o principal subtipo envolvido na sinalização da adenosina, 188 enquanto no coração, os efeitos cardioprotetores induzidos pela adenosina são mediados principalmente por A1Rs, cuja ativação demonstrou proteger da lesão de I / R para neutralizar vários processos associados com IC, como arritmogênese, fibrose, apoptose, hipertrofia e disfunção ventricular e para promover um efeito positivo no desenvolvimento de IC. 189.191.192

A1Rs são considerados alvos terapêuticos potenciais na IC, e vários agonistas e antagonistas foram testados. 242 Diferentes estudos foram feitos em humanos com antagonistas A1R, como rolofilina e KW-3902 243,244. No entanto, apesar da melhora da função renal e de um efeito positivo na IC, vários efeitos colaterais, como aumento de acidente vascular cerebral, diminuíram o impacto desta terapia . 243 Em contraste, os agonistas A1R têm sido usados ​​com sucesso para controlar a frequência cardíaca para o tratamento de arritmias 245 e são seguros para uso em pacientes com IC crônica. 246 Atualmente, parece atraente a possibilidade de uso de um agonista parcial, 247 bem como a possibilidade de descobrir um ligante enviesado, ativando o receptor evitando efeitos negativos devido ao espectro de ação mais amplo. No entanto, considerando que A1Rs exercem sua ação principalmente no coração e A2R na vasculatura com um resultado potencialmente diferente, será importante determinar se um ligante enviesado mostra seletividade para ativação de uma via específica, bem como para cada subtipo de receptor.

Outros GPCRs

Mais de 200 GPCRs são expressos no coração (Tabela). 248 Além dos receptores discutidos acima, vários outros foram identificados como tendo implicações importantes no desenvolvimento ou tratamento de doenças cardiovasculares. Por exemplo, a serotonina 5-HT2b receptor regula o desenvolvimento e a função cardíaca, e sua ativação promove fibrose e hipertrofia cardíaca. 204.249 Antagonistas do receptor H2 da histamina melhoraram a função cardíaca de pacientes com IC crônica. 250 A ativação de APJ (receptor de apelina) pela apelina aumenta a contratilidade cardíaca, 251 promove vasodilatação e aumenta o débito cardíaco. 252 O hormônio peptídico relaxina e seus receptores exercem funções antifibrose e cardioprotetor, e a serelaxina (relaxina 2 humana recombinante) está em desenvolvimento como tratamento para IC aguda. 216 O bloqueio dos receptores da vasopressina V2 previne disfunção miocárdica e lesão renal na IC experimental. 253 A ativação de receptores cardíacos de esfingosina-1-fosfato demonstrou conferir efeitos cardioprotetores. 222 Os principais efeitos desses GPCRs no coração e nos vasos sanguíneos são descritos na Figura 3C.

Conclusões

Os GPCRs desempenham papéis vitais na regulação fisiológica da função cardíaca e são os principais alvos de drogas para o tratamento de uma ampla variedade de doenças cardiovasculares. Avanços em nossa compreensão da estrutura e função do GPCR levaram a uma nova onda de desenvolvimento de drogas que visa aumentar a especificidade do receptor e promover diferentes eficácias de sinalização direcionadas ao ligante. Por exemplo, estudos biofísicos de estruturas GPCR agora permitem docking in silico de compostos químicos e design de drogas baseado em estrutura. Um dos maiores desafios dos primeiros estudos da estrutura GPCR foi a instabilidade do receptor e a existência transitória dos complexos de sinalização receptor-transdutor. Avanços recentes na identificação de vários formatos de anticorpos direcionados a GPCR para bloquear receptores em estados conformacionais específicos ou em complexos com parceiros de sinalização, como Fab (fragmento de ligação ao antígeno) e nanocorpos, bem como avanços na tecnologia de criomicroscopia eletrônica (CryoEM) agora permitem para caracterização de resolução atômica de conjuntos estruturais heterogêneos. Esses avanços tecnológicos e metodológicos continuarão a fornecer percepções significativas sobre os recursos dinâmicos da estrutura e função do GPCR. Elucidar os mecanismos para ativação seletiva de componentes de sinalização de GPCR por agonistas tendenciosos pode render novos medicamentos que são capazes de aumentar mais precisamente os efeitos cardioprotetores desejados, enquanto bloqueiam ações potencialmente prejudiciais indesejáveis ​​ou diminuem os efeitos colaterais indesejados. À medida que novos ligantes GPCR e mecanismos de ação são descobertos, muitos alvos terapêuticos potenciais se tornarão evidentes que um dia poderão ser traduzidos em novas estratégias terapêuticas e medicamentos.


GPCRs: Gi e Gs - Biologia

Os GPCRs passam por ciclos de ativação e inativação. No estado inativo, a proteína G heterotrimérica é composta de subunidades G & alfa e G & beta & gama fortemente associadas de GDP (guanosina-5 & rsquo-difosfato). Após a ligação do ligante, os GPCRs sofrem uma mudança conformacional, catalisando G & alfa para trocar GDP por GTP (guanosina-5 & rsquo-trifosfato). Então, GTP-ligado G & alfa e G & beta & gama se dissociam do GPCR e ativam os efetores de sinalização a jusante. A hidrólise de G & alfa-GTP em G & alfa-GDP causa a reassociação da proteína G heterotrimérica com o GPCR.

As proteínas G heterotriméricas sinalizam por meio de quatro classes de proteínas G & alfa: Gs / olf, Gi / o, G12 / 13 e Gq. Gs / olf estimula a adenilil ciclase (AC), enquanto Gi / o a inibe. G12 / 13 ativa RhoGEFs (fatores de troca de nucleotídeo de guanina de homologia Ras). A subfamília Gq contém quatro tipos de subunidades & alfa (G & alphaq, G & alpha11, G e alfa14, e G & alpha16) todos eles estimulam a fosfolipase C e beta (PLC- e beta) G e alfaq / 11 também demonstrou ativar o p63RhoGEF. Embora o trabalho inicial tenha se concentrado na sinalização G & alfa, G & beta & gama também ativa cascatas de transdução de sinal.

No final dos anos 1950, Sutherland e Rall foram os primeiros a caracterizar como os GPCRs ativam as cascatas de segundos mensageiros. Eles mostraram que a estimulação de vários tecidos com epinefrina ou glucagon (ambos agonistas de GPCR) promoveu a produção de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) por AC. Os mamíferos expressam pelo menos nove isoformas diferentes de AC, que variam em seu padrão de expressão e regulação tecidual.

A produção de cAMP por AC pode ser tanto inibida como estimulada. GeuGPCRs acoplados inibem AC. A toxina da coqueluche catalisa a ribosilação do ADP de Gi, que impede o acoplamento de GPCR e a inibição de AC.

As proteínas G heterotriméricas e as Ras GTPases monoméricas compartilham a característica de serem inativas no estado ligado ao GDP e ativas no estado ligado ao GTP. Fatores de troca de nucleotídeos de guanina (GEFs) catalisam a troca de GDP por GTP para gerar a Ras GTPase ativa. A sinalização de Ras GTPase é terminada por meio de proteínas ativadoras de GTPase (GAPs), que aceleram a atividade GTPase intrínseca de membros da família Ras.

A superfamília de proteínas GTPase pequenas relacionadas com Ras contém a subfamília Rho GTPase. A subfamília Rho GTPase humana contém 22 membros, os membros desta família mais extensamente caracterizados são RhoA, Rac1 e CDC42 devido à sua capacidade de causar mudanças marcantes na morfologia celular após a ativação. Rho GTPases têm sido implicadas em uma variedade de respostas celulares, incluindo transcrição de genes, embriogênese e dinâmica do citoesqueleto de actina.

A estimulação de GPCRs acoplados a G12 / 13 leva à ligação de G & alfa-GTP do domínio RH de RhoGEF. Isso induz uma mudança conformacional no RhoGEF, ativando-o. RhoGEF ativado pode então ativar a RhoGTPase promovendo a liberação de GDP ligado, que então permite a ligação subsequente de GTP.

A maioria dos GPCRs que se acoplam ao G12/13 também acoplar a Gq. GPCRs acoplados a Gq estimulam PLC- & beta, que catalisa a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) em IP3 e diacilglicerol (DAG). O IP3 se liga aos receptores IP3 no retículo endoplasmático (ER) e induz a liberação de cálcio. PLC- & beta promove a terminação dos complexos de sinalização Gq-GPCR estimulando a hidrólise do GTP do Gq ligado ao GTP.

Embora PLC- & beta tenha sido considerado o efetor Gq canônico, evidências da última década mostraram que Gq-GPCRs também são ativadores potentes de p63RhoGEF. A análise de Northern blot e a imuno-histoquímica sugerem que o p63RhoGEF é expresso no coração humano e no tecido cerebral. Vários grupos de investigadores mostraram que p63RhoGEF ativa a pequena GTPase RhoA, mas não Rac1 ou CDC42.

Os astrócitos expressam GPCRs que sinalizam por meio de todas as quatro classes de proteínas G e alfa. Sinalização de astrócitos por meio de três dessas classes Gs, Geu, e G12/13-coupled GPCRs é mal compreendido. Astrocítico Gq-GPCRs têm sido os mais amplamente estudados devido ao desenvolvimento precoce de corantes indicadores de cálcio que permitem o monitoramento das concentrações citoplasmáticas de cálcio em tempo real.


Como funcionam os GPCRs?

A primeira etapa na transdução de sinal é a ligação do ligante. A natureza dos locais de ligação ao ligante GPCR é melhor estudada por uma combinação de mutagênese direcionada ao local, modelagem molecular dos receptores e triagem de um grande número de ligantes potenciais. Nosso grupo faz a curadoria do maior banco de dados de afinidades de ligantes de acesso público como parte do Programa de Triagem de Drogas Psicoativas (http://pdsp.cwru.edu), enquanto o banco de dados mais abrangente dos efeitos das mutações em GPCRs sobre a ligação do ligante pode ser encontrado em http://wwwgrap.fagmed.uit.no. A ligação do agonista é seguida por uma mudança na conformação do receptor que pode envolver a interrupção de uma forte interação iônica entre a terceira e a sexta hélices transmembrana (Ballesteros et al., 2001 Shapiro et al., 2002), o que facilita a ativação do G -heterotrímero de proteína. Dependendo do tipo de proteína G à qual o receptor está acoplado, uma variedade de vias de sinalização a jusante podem ser ativadas (revisado por Marinissen e Gutkind, 2001 Neves et al., 2002). A sinalização é então atenuada (dessensibilizada) pela internalização do GPCR, que é facilitada pela ligação da arrestina (Ferguson, 2001). A sinalização, dessensibilização e eventual ressensibilização são reguladas por interações complexas de vários domínios intracelulares dos GPCRs com numerosas proteínas intracelulares (Hall e Lefkowitz, 2003 Bockaert et al., 2003).

Embora muitos estudos tenham usado receptores β-adrenérgicos como GPCRs prototípicos, tornou-se cada vez mais claro que muito mais pode ser aprendido pelo estudo sistemático de outros receptores. Nossos estudos do receptor 5-HT2A da serotonina, por exemplo, mostraram que a internalização e dessensibilização do GPCR podem ocorrer por vias independentes da arrestina (Bhatnagar et al., 2001 Gray et al., 2003) e achados semelhantes foram relatados para outros GPCRs ( Lee et al., 1998). As interações de GPCRs com outras proteínas, incluindo componentes do citoesqueleto como PSD-95 (Hall e Lefkowitz, 2002 Xia et al., 2003), estão cada vez mais sendo consideradas importantes para regular a atividade, direcionamento e tráfego de GPCRs.


Descrição do Curso

Como nos comunicamos com o mundo exterior? Como nossos sentidos de visão, olfato, paladar e dor são controlados nos níveis celular e molecular? O que causa problemas médicos como alergias, hipertensão, depressão, obesidade e vários distúrbios do sistema nervoso central? Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) fornecem a maior parte da resposta a todas essas perguntas. Os GPCRs constituem a maior família de receptores de superfície celular e, em humanos, são codificados por mais de 1.000 genes. Os GPCRs convertem mensagens extracelulares em respostas intracelulares e estão envolvidos em essencialmente todos os processos fisiológicos. A disfunção do GPCR resulta em vários distúrbios humanos, e mais de 50% de todos os medicamentos prescritos no mercado hoje visam direta ou indiretamente os GPCRs.

Neste curso, discutiremos as vias de transdução de sinal do GPCR, a oligomerização do GPCR e as doenças causadas pela disfunção do GPCR. Vamos estudar a estrutura e função da rodopsina, um fotorreceptor de luz fraca e um GPCR bem estudado que converte a luz em impulsos elétricos enviados ao cérebro e leva à visão. Também discutiremos como as mutações na rodopsina causam degeneração retinal e cegueira noturna congênita.

Este curso é um dos muitos Seminários de Graduação Avançados oferecidos pelo Departamento de Biologia do MIT. Esses seminários são adaptados para alunos com interesse em usar a literatura de pesquisa primária para discutir e aprender sobre a pesquisa biológica atual em um ambiente altamente interativo. Muitos instrutores dos Seminários Avançados de Graduação são cientistas de pós-doutorado com grande interesse pelo ensino.


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