Em formação

Valores espectrofotométricos de nucleotídeos individuais


Em toda a rede você encontrará esta lista dando razões de 260/280 de nucleotídeos individuais:

Guanina: 1,15 Adenina: 4,50 Citosina: 1,51 Uracila: 4,00 Timina: 1,47

No entanto, não consigo encontrar uma fonte confiável para esses valores. Uma fonte cita uma versão dos anos 70 da Bioquímica de Leninger, mas embora eu tenha conseguido uma edição mais recente, não consigo encontrar essa informação lá.

Alguém conhece uma fonte citável para isso?


Eu também não consegui encontrar os dados na 3ª Edição da Bioquímica de Lehninger.

Uma boa fonte de informações geralmente é

Dados para pesquisa bioquímica, por Rex M. C Dawson, Daphne C. Elliott, William H. Elliott e Kenneth M. Jones (3ª Edição, 1986, Clarendon Press Oxford).

A primeira coisa a notar é que as razões podem ser significativamente dependentes do pH, e a fonte citada pelo OP não especifica a qual pH os dados se referem.

Os dados na Coluna 2 abaixo foram retirados da fonte acima, a partir da qual os dados na Coluna 3 foram calculados.

(pH 7) -------------UMA280/UMA260--UMA260 /UMA280

Adenina 0,13 ~ 7,7 Citosina 0,58 ~ 1,7 Guanina 1,04 ~ 0,96 Uracil 0,17 ~ 5,9 Timina 0,53 ~ 1,9

Esses dados parecem ter sido retirados substancialmente de um artigo de K. Burton na segunda edição da DFBR.

K. Burton (1969) Spectral Data e valores de pK para purinas, pirimidinas, nucleosídeos e nucleotídeos em Dados para pesquisa bioquímica por Rex M. C Dawson, Daphne C. Elliott, William H. Elliott e Kenneth M. Jones (2ª Edição, Clarendon Press Oxford).


Se é tão importante para você que você precisa de uma fonte citável para isso, eu mesmo mediria com o equipamento que uso para o experimento real.

Caso contrário, sugiro que você olhe um banco de dados químico como o NIST: http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C58617&Mask=400 e use os espectros que podem ser encontrados lá.


Investigação espectrofotométrica do DNA no ultravioleta. II

O presente artigo é a continuação de uma investigação anterior e está preocupado com as propriedades de absorção ultravioleta do DNA e seus constituintes. Os espectros de absorção ultravioleta completos (200–320 mμ) das bases de DNA, nucleosídeos e nucleotídeos foram obtidos em pH 2 e 7. Os espectros mostraram que havia dois máximos proeminentes ocorrendo em cada caso em cerca de 260 mμ e 200 mμ.

A partir de uma comparação das absorções nos dois picos, para uma mistura calculada de nucleotídeos e altamente polimerizada Escherichia coli No DNA B, as hipercromicidades máximas atingíveis nos dois picos foram estimadas em 55% e 77%, respectivamente. A partir de um estudo de hipercromicidades produzidas por tratamentos com álcalis, calor, desoxirribonuclease, etc., foi estabelecido que o grau de desnaturação em qualquer condição poderia ser estimado de forma mais correta a partir da hipercromia no pico Y. Este pico foi mais hipercrômico na desnaturação do que o pico X em todos os casos. Os resultados provaram que, depois de levar em consideração o hipocromismo, os espectros de polímeros helicoidais como o DNA eram funções aditivas dos espectros de componentes nas bandas X e Y. Outros fenômenos espectrais que acompanham a ionização das bases e seus derivados no ultravioleta distante são descritos.


Cloridrato de flavoxato

4.5.1 Métodos Espectrofotométricos

A espectrofotometria de UV tem sido usada para o ensaio no plasma do cloridrato de flavoxato e seu principal metabólito, o ácido 3-metilflavona-8-carboxílico [16]. O método é baseado na extração desses compostos com clorofórmio do material aquoso acidificado e subsequente medição de UV a 319 nm, onde ambas as substâncias têm a mesma absorvância molecular. O método, portanto, fornece a quantidade total na amostra de compostos com uma estrutura de flavona. A absorvância de UV é comparada com a da solução padrão de cloridrato de flavoxato em clorofórmio. A recuperação das amostras de plasma é de 95-100% e o limite de quantificação é de 2 μg / mL para o cloridrato de flavoxato ou seu metabólito.


Métodos

Coleta de carrapatos

Ixodes ricinus ninfas foram coletadas em um parque público municipal no sudoeste da Inglaterra, Reino Unido [14]. Este parque é composto por 344 hectares de pastagens e bosques localizados próximo a oeste da cidade de Bristol, Reino Unido (51 ° 44'79 "N, 2 ° 64'46" W) a uma altitude que varia entre 10 e 120 m acima nível do mar. Apresenta uma variedade de habitats, incluindo bosques, pastagens semi-melhoradas e não geridas, áreas de utilidade pública, lagoas e dois parques de cervos. O parque tem uma população residente de veados vermelhos e gamos e populações não gerenciadas de veados selvagens. Apenas ninfas foram coletadas neste estudo.

Os carrapatos foram coletados pelo procedimento padrão de arrastamento do cobertor [15]. Uma folha de pano branco de 1 m 2, presa a uma vara de madeira com uma corda de 3 m amarrada em ambas as extremidades da vara, foi usada para a coleta do carrapato. O pano foi arrastado lentamente sobre a vegetação para que permanecesse em contato com a vegetação durante todo o processo de arrastamento. Após cada arrasto de aproximadamente 10 m, o pano foi virado e todos os carrapatos presos ao pano foram coletados com pinças finas e armazenados em um frasco de coleta. O frasco foi etiquetado com a data da coleta e os carrapatos foram imediatamente levados para o laboratório e armazenados a -20 ° C para matá-los e preservá-los para processamento posterior.

Extração, medição e calibração de lipídios

Uma amostra agrupada de 108 carrapatos ninfas, coletados ao longo de vários meses entre 2015 e 2016, foi usada pela primeira vez para avaliar e refinar a técnica de extração de lipídios. Para isso, após a retirada do freezer, os carrapatos foram secos a 70 ° C por 12 he então pesados ​​em uma microbalança ultrassensível (Sartorius-ME5, Goettingen, Alemanha) para o micrograma mais próximo. Os lipídios foram estimados usando um método espectrofotométrico baseado no método sulfofosfovanilano colorimétrico de microquantidade (SPV) para lipídios totais descrito pela primeira vez por Van Handel [13]. A técnica é baseada no princípio de que os lipídios insaturados reagem com o ácido sulfúrico para produzir um íon de carbono, a vanilina reage com o ácido fosfórico para produzir um éster de fosfato aromático e o íon de carbono reage com o grupo carbonil ativado da fosfo-vanilina para produzir um , complexo colorido que é estabilizado por ressonância e absorve luz no máximo em cerca de 525 nm [16].

Cada carrapato seco e pesado individualmente foi colocado em um tubo de ensaio de vidro limpo separado e esmagado com uma vareta de vidro em 0,5 ml de uma mistura de clorofórmio-metanol 1: 1. O tubo foi então agitado suavemente para incluir qualquer resíduo de carrapato que havia se acumulado em seu lado, então metade do volume (0,25 ml) deste tubo foi cuidadosamente transferido para um segundo tubo de vidro limpo. Este tubo foi então colocado em um bloco de aquecimento a 100 ° C em um exaustor para evaporar o solvente. Após a evaporação do solvente, adicionou-se 0,1 ml de ácido sulfúrico e o tubo foi novamente aquecido durante 10 minutos à mesma temperatura. O tubo foi deixado a arrefecer e após o arrefecimento, foi adicionado reagente de vanilina para perfazer um volume total de 2,5 ml. O reagente de vanilina usado aqui foi preparado dissolvendo 600 mg de vanilina em 100 ml de água quente e 400 ml de ácido fosfórico a 85% e armazenado no escuro. Depois de adicionar vanilina ao tubo, uma cor avermelhada desenvolveu-se em 5 minutos e depois desapareceu lentamente após 30 minutos. O tubo foi lido 5 a 10 min após a vanilina ter sido adicionada em um espectrofotômetro (Biochrome, Biowave II, Cambridge, UK) a 525 nm contra um reagente em branco (reagente de vanilina puro) e o teor de lipídios foi lido diretamente de uma curva de calibração .

Uma curva de calibração foi obtida usando sete diluições: 0, 12,5, 25, 50, 100, 200 e 400 μl, de solução analítica de óleo de soja padrão (0,917 g / ml) (Sigma-Aldrich, Gillingham, Reino Unido) diluída em metanol: clorofórmio (1: 1) e submetendo-os ao procedimento descrito acima. Absorbância maior que 1,00 foi relida em 490 nm e a leitura foi então duplicada para obter os valores de absorbância para 525 nm, seguindo o procedimento de Van Handel [13].

Para permitir que as reservas lipídicas registradas sejam relacionadas a um tempo aproximado entre as refeições de sangue, um lote de aproximadamente 300 ninfas foi coletado em maio de 2017. Este lote foi coletado relativamente tarde na temporada de carrapatos do Reino Unido para garantir que uma gama heterogênea de histórias de alimentação seria ser obtido. Esses carrapatos foram colocados em caixas plásticas de 25 × 25 × 10 cm contendo uma base de areia úmida com 1 cm de profundidade e mantidos em incubadora resfriada a 15 ° C e 80% de umidade relativa (UR). Esse ambiente foi adequado para garantir bons níveis de sobrevivência dos carrapatos durante o ensaio. Lotes de carrapatos vivos foram então removidos das caixas para análise de lipídios 9, 39, 92 e 239 dias após a coleta para quantificar as mudanças nos lipídios associadas ao esgotamento das reservas e fome.

O método espectrofotométrico de análise lipídica foi comparado ao método gravimétrico. Para isso, oito ninfas de I. ricinus foram secos durante a noite a 70 ° C, pesados ​​e depois lavados em três trocas de clorofórmio de 24 h para remover o lipídio, ressecados no forno a 70 ° C novamente por 24 h e pesados ​​novamente para obter o peso corporal livre de lipídios, conforme descrito por Randolph et al. [3]. As ninfas tratadas com clorofórmio foram subsequentemente submetidas ao método espectrofométrico, conforme descrito acima, para determinar se algum lípido residual permaneceu.

Padrão sazonal de uso de lipídios

Para análise do uso da medição espectrofotométrica de lipídios para examinar padrões sazonais de reservas de lipídios, questionando I. ricinus as ninfas foram coletadas mensalmente por dois anos por arrastamento de cobertores, conforme descrito acima. A coleta de carrapatos começou em janeiro de 2015 e continuou até dezembro de 2016 (exceto em agosto de 2016, quando nenhuma amostra foi coletada). Todos os carrapatos foram coletados na mesma área do parque público descrito acima. Em cada ocasião de amostragem, entre 25 e 60 ninfas foram coletadas para fornecer uma amostra estatisticamente significativa para análise de lipídios. As coletas feitas a cada mês foram analisadas separadamente.

Análise estatística

Para análise das mudanças nos valores de lipídios ao longo do tempo, os dados foram transformados em raiz quadrada para normalizar a distribuição e submetidos à análise de variância (ANOVA) e comparações múltiplas de Tukey post-hoc testes (Statgraphics, 16.1, StatPoint technologies Inc.). A análise de variância também foi usada para examinar as diferenças nos valores de lipídios entre grupos homogêneos de carrapatos dentro das amostras, identificados pela análise de agrupamento do vizinho mais próximo. Os conteúdos de lipídios são representados graficamente como valores não transformados para maior clareza.


Conteúdo

Edição Icosaédrica

A estrutura icosaédrica é extremamente comum entre os vírus. O icosaedro consiste em 20 faces triangulares delimitadas por 12 vértices quíntuplos e consiste em 60 unidades assimétricas. Assim, um vírus icosaédrico é feito de subunidades de proteínas 60N. O número e a disposição dos capsômeros em um capsídeo icosaédrico podem ser classificados usando o "princípio de quase-equivalência" proposto por Donald Caspar e Aaron Klug. [13] Como o poliedro Goldberg, uma estrutura icosaédrica pode ser considerada como sendo construída a partir de pentâmeros e hexâmeros. As estruturas podem ser indexadas por dois inteiros h e k, com h ≥ 1 < displaystyle h geq 1> ek ≥ 0 < displaystyle k geq 0> a estrutura pode ser considerada como h passos da borda de um pentâmero, girando 60 graus no sentido anti-horário e, em seguida, k passos para chegar ao próximo pentâmero. O número de triangulação T para o capsid é definido como:

Neste esquema, os capsídeos icosaédricos contêm 12 pentâmeros mais 10 (T - 1) hexâmeros. [14] [15] O T-number é representativo do tamanho e complexidade das cápsides. [16] Exemplos geométricos para muitos valores de h, k, e T pode ser encontrado em Lista de poliedros geodésicos e poliedros Goldberg.

Existem muitas exceções a esta regra: Por exemplo, os poliomavírus e papilomavírus têm pentâmeros em vez de hexâmeros em posições hexavalentes em uma rede quase-T = 7. Membros da linhagem de vírus de RNA de fita dupla, incluindo reovírus, rotavírus e bacteriófago φ6 têm capsídeos construídos de 120 cópias da proteína do capsídeo, correspondendo a um capsídeo "T = 2", ou indiscutivelmente um capsídeo T = 1 com um dímero no assimétrico unidade. Da mesma forma, muitos vírus pequenos têm um capsídeo pseudo-T = 3 (ou P = 3), que é organizado de acordo com uma rede T = 3, mas com polipeptídeos distintos ocupando as três posições quase equivalentes [17]

Os números T podem ser representados de maneiras diferentes, por exemplo T = 1 só pode ser representado como um icosaedro ou dodecaedro e, dependendo do tipo de quase-simetria, T = 3 pode ser apresentado como um dodecaedro truncado, um icosidodecaedro ou um icosaedro truncado e seus respectivos duais um icosaedro triakis, um triacontaedro rômbico ou um dodecaedro pentakis. [18] [ esclarecimento necessário ]

Edição Prolada

Um icosaedro alongado é uma forma comum para as cabeças dos bacteriófagos. Essa estrutura é composta por um cilindro com uma tampa em cada extremidade. O cilindro é composto por 10 faces triangulares alongadas. O número Q (ou Tmeio), que pode ser qualquer número inteiro positivo, [19] especifica o número de triângulos, compostos de subunidades assimétricas, que compõem os 10 triângulos do cilindro. Os limites são classificados por T (ou Tfim) número. [20]

A bactéria E. coli é o hospedeiro do bacteriófago T4 que possui uma estrutura de cabeça prolata. A proteína gp31 codificada pelo bacteriófago parece ser funcionalmente homóloga a E. coli proteína chaparona GroES e capaz de substituí-la na montagem de vírions do bacteriófago T4 durante a infecção. [21] Como GroES, gp31 forma um complexo estável com a chaperonina GroEL que é absolutamente necessário para o dobramento e montagem na Vivo da proteína principal da cápside do bacteriófago T4, gp23. [21]

Edição Helicoidal

Muitos vírus de plantas em forma de bastão e filamentosos têm capsídeos com simetria helicoidal. [22] A estrutura helicoidal pode ser descrita como um conjunto de n Hélices moleculares 1-D relacionadas por um nsimetria axial dobrada. [23] As transformações helicoidais são classificadas em duas categorias: sistemas helicoidais unidimensionais e bidimensionais. [23] A criação de uma estrutura helicoidal inteira depende de um conjunto de matrizes translacionais e rotacionais que são codificadas no banco de dados de proteínas. [23] A simetria helicoidal é dada pela fórmula P = µ x ρ, Onde µ é o número de unidades estruturais por volta da hélice, ρ é o aumento axial por unidade e P é o passo da hélice. A estrutura é dita aberta devido à característica de que qualquer volume pode ser encerrado variando o comprimento da hélice. [24] O vírus helicoidal mais conhecido é o vírus do mosaico do tabaco. [22] O vírus é uma única molécula de RNA de fita (+). Cada proteína de revestimento no interior da hélice liga três nucleotídeos do genoma do RNA. Os vírus da gripe A diferem por compreenderem várias ribonucleoproteínas, a proteína NP viral organiza o RNA em uma estrutura helicoidal. O tamanho também é diferente - o vírus do mosaico do tabaco tem 16,33 subunidades de proteína por volta helicoidal, [22] enquanto o vírus influenza A tem uma alça de cauda de 28 aminoácidos. [25]

As funções do capsídeo são:

O vírus deve formar uma camada protéica estável e protetora para proteger o genoma de agentes químicos e físicos letais. Estes incluem formas de radiação natural, extremos de pH ou temperatura e enzimas proteolíticas e nucleolíticas. Para vírus sem envelope, o próprio capsídeo pode estar envolvido na interação com receptores na célula hospedeira, levando à penetração da membrana da célula hospedeira e internalização do capsídeo. A entrega do genoma ocorre por subseqüente desencapsulamento ou desmontagem do capsídeo e liberação do genoma no citoplasma, ou por ejeção do genoma através de uma estrutura portal especializada diretamente no núcleo da célula hospedeira.

Foi sugerido que muitas proteínas do capsídeo viral evoluíram em várias ocasiões a partir de proteínas celulares funcionalmente diversas. [26] O recrutamento de proteínas celulares parece ter ocorrido em diferentes estágios de evolução, de modo que algumas proteínas celulares foram capturadas e refuncionalizadas antes da divergência dos organismos celulares nos três domínios contemporâneos da vida, enquanto outras foram sequestradas há relativamente pouco tempo. Como resultado, algumas proteínas do capsídeo são difundidas em vírus que infectam organismos distantemente relacionados (por exemplo, proteínas do capsídeo com a dobra em gelatina), enquanto outras são restritas a um grupo particular de vírus (por exemplo, proteínas do capsídeo de alfavírus). [26] [27]

Um modelo computacional (2015) mostrou que os capsídeos podem ter se originado antes dos vírus e que serviram como um meio de transferência horizontal entre comunidades replicadoras, uma vez que essas comunidades não poderiam sobreviver se o número de parasitas de genes aumentasse, com certos genes sendo responsáveis ​​pela formação dessas estruturas e daquelas que favoreciam a sobrevivência de comunidades autorreplicantes. [28] O deslocamento desses genes ancestrais entre organismos celulares pode favorecer o aparecimento de novos vírus durante a evolução. [27]


Conteúdo

Jannik Bjerrum desenvolveu o primeiro método geral para a determinação das constantes de estabilidade de complexos de metal-amina em 1941. [1] As razões pelas quais isso ocorreu em uma data tão tardia, quase 50 anos após Alfred Werner ter proposto as estruturas corretas para complexos de coordenação, foram resumidos por Beck e Nagypál. [2] A chave para o método de Bjerrum era o uso do então recentemente desenvolvido eletrodo de vidro e medidor de pH para determinar a concentração de íons de hidrogênio em solução. Bjerrum reconheceu que a formação de um complexo metálico com um ligante era uma espécie de equilíbrio ácido-base: há competição pelo ligante, L, entre o íon metálico, M n +, e o íon hidrogênio, H +. Isso significa que há dois equilíbrios simultâneos que devem ser considerados. No que se segue, as cargas elétricas são omitidas por uma questão de generalidade. Os dois equilíbrios são

Portanto, seguindo a concentração de íon hidrogênio durante a titulação de uma mistura de M e HL com base, e conhecendo a constante de dissociação de ácido de HL, a constante de estabilidade para a formação de ML pode ser determinada. Bjerrum passou a determinar as constantes de estabilidade para sistemas nos quais muitos complexos podem ser formados.

Os vinte anos seguintes viram uma verdadeira explosão no número de constantes de estabilidade que foram determinadas. Relacionamentos, como a série Irving-Williams foram descobertos. Os cálculos foram feitos manualmente, usando os chamados métodos gráficos. A matemática subjacente aos métodos usados ​​neste período é resumida por Rossotti e Rossotti. [3] O próximo desenvolvimento chave foi o uso de um programa de computador, LETAGROP [4] [5] para fazer os cálculos. Isso permitiu o exame de sistemas muito complicados para serem avaliados por meio de cálculos manuais. Posteriormente, programas de computador capazes de lidar com equilíbrios complexos em geral, como o SCOGS [6] e o MINIQUAD [7], foram desenvolvidos de forma que hoje a determinação de constantes de estabilidade quase se tornou uma operação de "rotina". Valores de milhares de constantes de estabilidade podem ser encontrados em dois bancos de dados comerciais. [8] [9]

A formação de um complexo entre um íon metálico, M, e um ligante, L, é de fato geralmente uma reação de substituição. Por exemplo, em soluções aquosas, íons metálicos estarão presentes como íons aquo, então a reação para a formação do primeiro complexo pode ser escrita como

A constante de equilíbrio para esta reação é dada por

[L] deve ser lido como "a concentração de L" e da mesma forma para os outros termos entre colchetes. A expressão pode ser bastante simplificada removendo os termos que são constantes. O número de moléculas de água ligadas a cada íon metálico é constante. Em soluções diluídas, a concentração de água é efetivamente constante. A expressão se torna

Seguindo esta simplificação, uma definição geral pode ser dada, para o equilíbrio geral

A definição pode ser facilmente estendida para incluir qualquer número de reagentes. Os reagentes não precisam ser sempre um metal e um ligante, mas podem ser quaisquer espécies que formem um complexo. Constantes de estabilidade definidas desta forma, são Associação constantes. Isso pode levar a alguma confusão, pois pKuma valores são dissociação constantes. Em programas de computador de uso geral, é comum definir todas as constantes como constantes de associação. A relação entre os dois tipos de constantes é dada em constantes de associação e dissociação.

Editar constantes stepwise e cumulativas

Uma constante cumulativa ou geral, dado o símbolo β, é a constante para a formação de um complexo a partir de reagentes. Por exemplo, a constante cumulativa para a formação de ML2 É dado por

As constantes graduais, K1 e K2 referem-se à formação dos complexos um passo de cada vez.

Uma constante cumulativa sempre pode ser expressa como o produto de constantes graduais. Por outro lado, qualquer constante gradual pode ser expressa como um quociente de duas ou mais constantes globais. Não existe uma notação acordada para constantes graduais, embora um símbolo como K eu
ML às vezes é encontrado na literatura. É uma boa prática especificar cada constante de estabilidade explicitamente, conforme ilustrado acima.

Produtos de hidrólise Editar

A formação de um complexo hidroxilado é um exemplo típico de uma reação de hidrólise. Uma reação de hidrólise é aquela em que um substrato reage com a água, dividindo uma molécula de água em hidróxido e íons de hidrogênio. Nesse caso, o íon hidróxido então forma um complexo com o substrato.

Na água, a concentração de hidróxido está relacionada à concentração de íons de hidrogênio pela constante de autoionização, KC.

A expressão para a concentração de hidróxido é substituída na expressão da constante de formação

Em geral, para a reação

Na literatura mais antiga, o valor de log K é geralmente citado como uma constante de hidrólise. O registro β * o valor é geralmente citado para um complexo hidrolisado com a fórmula química genérica Mpeuq(OH)r.

Complexos ácido-base Editar

Um ácido de Lewis, A, e uma base de Lewis, B, podem ser considerados como formando um complexo AB.

Existem três teorias principais relacionadas à força dos ácidos e bases de Lewis e às interações entre eles.

  1. Teoria de ácido-base duro e mole (HSAB). [10] Isso é usado principalmente para fins qualitativos.
  2. Drago e Wayland propuseram uma equação de dois parâmetros que prevê a entalpia padrão de formação de um grande número de adutos com bastante precisão. −ΔH ⊖ (A - B) = EUMAEB + CUMACB. Valores do E e C parâmetros estão disponíveis. [11]
  3. Números de doadores de Guttmann: para bases, o número é derivado da entalpia de reação da base com pentacloreto de antimônio em 1,2-dicloroetano como solvente. Para ácidos, um número aceitador é derivado da entalpia de reação do ácido com óxido de trifenilfosfina. [12]

A termodinâmica da formação do complexo de íons metálicos fornece muitas informações significativas. [13] Em particular, é útil para distinguir entre efeitos entálpicos e entrópicos. Os efeitos entálpicos dependem da força da ligação e os efeitos entrópicos têm a ver com mudanças na ordem / desordem da solução como um todo. O efeito quelato, abaixo, é melhor explicado em termos de termodinâmica.

Uma constante de equilíbrio está relacionada à mudança de energia livre de Gibbs padrão para a reação

R é a constante do gás e T é a temperatura absoluta. A 25 ° C, ΔG ⊖ = (−5,708 kJ mol −1) ⋅ log β . A energia livre é composta de um termo de entalpia e um termo de entropia.

A alteração da entalpia padrão pode ser determinada por calorimetria ou usando a equação de Van 't Hoff, embora o método calorimétrico seja preferível. Quando a mudança de entalpia padrão e a constante de estabilidade foram determinadas, a mudança de entropia padrão é facilmente calculada a partir da equação acima.

O fato de constantes de formação graduais de complexos do tipo MLn diminuir em magnitude à medida que n os aumentos podem ser parcialmente explicados em termos do fator de entropia. Veja o caso da formação de complexos octaédricos.

Para o primeiro passo m = 6, n = 1 e o ligante pode ir para um dos 6 locais. Para a segunda etapa m = 5 e o segundo ligante pode ir para um de apenas 5 locais. Isso significa que há mais aleatoriedade na primeira etapa do que na segunda ΔS ⊖ é mais positivo, então ΔG ⊖ é mais negativo e K 1 & gt K 2 < displaystyle K_ <1> & gtK_ <2>>. A razão das constantes de estabilidade graduais pode ser calculada nesta base, mas as razões experimentais não são exatamente as mesmas porque ΔH ⊖ não é necessariamente o mesmo para cada etapa. [14] As exceções a esta regra são discutidas abaixo, em # efeito de quelato e # Fatores geométricos.

Dependência de força iônica Editar

A constante de equilíbrio termodinâmico, K ⊖, para o equilíbrio

Onde é a atividade da espécie química ML etc. K ⊖ é adimensional, pois a atividade é adimensional. As atividades dos produtos são colocadas no numerador, as atividades dos reagentes são colocadas no denominador. Consulte o coeficiente de atividade para obter uma derivação dessa expressão.

Uma vez que a atividade é o produto da concentração e do coeficiente de atividade (γ) a definição também pode ser escrita como

onde [ML] representa a concentração de ML e Γ é um quociente de coeficientes de atividade. Esta expressão pode ser generalizada como

Para evitar as complicações envolvidas no uso de atividades, as constantes de estabilidade são determinadas, sempre que possível, em um meio que consiste em uma solução de um eletrólito de fundo de alta força iônica, ou seja, sob condições nas quais Γ pode ser assumido como sempre constante. [15] Por exemplo, o meio pode ser uma solução de 0,1 mol dm −3 de nitrato de sódio ou 3 mol dm −3 de perclorato de sódio. Quando Γ for constante, pode ser ignorado e a expressão geral em teoria, acima, é obtida.

Todos os valores de constantes de estabilidade publicados referem-se ao meio iônico específico utilizado em sua determinação e diferentes valores são obtidos em diferentes condições, conforme ilustrado para o complexo CuL (L = glicinato). Além disso, os valores da constante de estabilidade dependem do eletrólito específico usado como o valor de Γ é diferente para diferentes eletrólitos, mesmo com a mesma força iônica. Não é necessário haver nenhuma interação química entre as espécies em equilíbrio e o eletrólito de fundo, mas tais interações podem ocorrer em casos particulares. Por exemplo, os fosfatos formam complexos fracos com metais alcalinos, portanto, ao determinar constantes de estabilidade envolvendo fosfatos, como ATP, o eletrólito de fundo usado será, por exemplo, um sal de tetralquilamônio. Outro exemplo envolve o ferro (III), que forma complexos fracos com haletos e outros ânions, mas não com íons perclorato.

Quando as constantes publicadas se referem a uma força iônica diferente daquela exigida para uma aplicação particular, elas podem ser ajustadas por meio da teoria de íons específicos (SIT) e outras teorias. [17]

Dependência da temperatura Editar

Todas as constantes de equilíbrio variam com a temperatura de acordo com a equação de Van 't Hoff [18]

R é a constante do gás e T é a temperatura termodinâmica. Assim, para reações exotérmicas, onde a entalpia padrão muda, ΔH ⊖, é negativo, K diminui com a temperatura, mas para reações endotérmicas, onde ΔH ⊖ é positivo, K aumenta com a temperatura.

O efeito quelato Editar

Considere os dois equilíbrios, em solução aquosa, entre o íon cobre (II), Cu 2+ e etilenodiamina (en) por um lado e a metilamina, MeNH2 no outro.

Na primeira reação, o ligante bidentado etilenodiamina forma um complexo quelato com o íon cobre. A quelação resulta na formação de um anel de cinco membros. Na segunda reação, o ligante bidentado é substituído por dois ligantes metilamina monodentados de aproximadamente o mesmo poder de doador, o que significa que a entalpia de formação de ligações Cu-N é aproximadamente a mesma nas duas reações. Em condições de concentrações iguais de cobre e quando a concentração de metilamina é duas vezes a concentração de etilenodiamina, a concentração do complexo bidentado será maior do que a concentração do complexo com 2 ligantes monodentados. O efeito aumenta com o número de anéis quelatos, de modo que a concentração do complexo EDTA, que tem seis anéis quelatos, é muito maior do que um complexo correspondente com dois ligantes doadores de nitrogênio monodentados e quatro ligantes carboxilados monodentados. Assim, o fenômeno do efeito quelato é um fato empírico firmemente estabelecido: sob condições comparáveis, a concentração de um complexo quelato será maior do que a concentração de um complexo análogo com ligantes monodentados.

A abordagem termodinâmica para explicar o efeito do quelato considera a constante de equilíbrio para a reação: quanto maior a constante de equilíbrio, maior a concentração do complexo.

Quando a concentração analítica de metilamina é o dobro da etilenodiamina e a concentração de cobre é a mesma em ambas as reações, a concentração [Cu (en)] 2+ é muito maior do que a concentração [Cu (MeNH2)2] 2+ porque β11β12.

A diferença entre as duas constantes de estabilidade é principalmente devido à diferença na mudança de entropia padrão, ΔS ⊖. Na reação com o ligante quelante, há duas partículas à esquerda e uma à direita, enquanto na equação com o ligante monodentado há três partículas à esquerda e uma à direita. Isso significa que menos entropia do distúrbio é perdida quando o complexo quelato é formado do que quando o complexo com ligantes monodentados é formado. Este é um dos fatores que contribuem para a diferença de entropia. Outros fatores incluem mudanças de solvatação e formação de anel. Alguns dados experimentais para ilustrar o efeito são mostrados na tabela a seguir. [19]

Equilíbrio registro β ΔG ⊖ / kJ mol −1 ΔH ⊖ / kJ mol −1 TΔS ⊖ / kJ mol −1
Cd 2+ + 4 MeNH2 ⇌ Cd (MeNH
2 ) 2+
4
6.55 −37.4 −57.3 19.9
Cd 2+ + 2 en ⇌ Cd (en) 2+
2
10.62 −60.67 −56.48 −4.19

Esses dados mostram que as mudanças de entalpia padrão são de fato aproximadamente iguais para as duas reações e que a principal razão pela qual o complexo de quelato é muito mais estável é que o termo de entropia padrão é muito menos desfavorável; na verdade, é favorável neste caso. Em geral, é difícil explicar precisamente os valores termodinâmicos em termos de mudanças na solução no nível molecular, mas é claro que o efeito quelato é predominantemente um efeito da entropia. Outras explicações, incluindo a de Schwarzenbach, [20] são discutidas em Greenwood e Earnshaw. [19]

O efeito de quelato aumenta à medida que o número de anéis de quelato aumenta. Por exemplo, o complexo [Ni (dien)2)] 2+ é mais estável do que o complexo [Ni (en)3)] 2+ ambos os complexos são octaédricos com seis átomos de nitrogênio em torno do íon níquel, mas dien (dietilenotriamina, 1,4,7-triazaheptano) é um ligante tridentado e en é bidentado. O número de anéis quelatos é um a menos do que o número de átomos doadores no ligante. O EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) tem seis átomos doadores, então forma complexos muito fortes com cinco anéis quelatos. Ligantes como o DTPA, que têm oito átomos doadores, são usados ​​para formar complexos com grandes íons metálicos, como lantanídeos ou íons actinídeos, que geralmente formam complexos de 8 ou 9 coordenadas. Anéis quelatos de 5 e 6 membros fornecem os complexos mais estáveis. Os anéis de 4 membros estão sujeitos à deformação interna devido ao pequeno ângulo de interligação do anel. O efeito quelato também é reduzido com anéis de 7 e 8 membros, porque os anéis maiores são menos rígidos e, portanto, menos entropia é perdida ao formá-los.

Desprotonação de grupos -OH alifáticos Editar

Removal of a proton from an aliphatic –OH group is difficult to achieve in aqueous solution because the energy required for this process is rather large. Thus, ionization of aliphatic –OH groups occurs in aqueous solution only in special circumstances. One such circumstance is found with compounds containing the H2N–C–C–OH substructure. For example, compounds containing the 2-aminoethanol substructure can form metal–chelate complexes with the deprotonated form, H2N–C–C–O − . The chelate effect supplies the extra energy needed to break the –OH bond.

An important example occurs with the molecule tris. This molecule should be used with caution as a buffering agent as it will form chelate complexes with ions such as Fe 3+ and Cu 2+ .

The macrocyclic effect Edit

It was found that the stability of the complex of copper(II) with the macrocyclic ligand cyclam (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane) was much greater than expected in comparison to the stability of the complex with the corresponding open-chain amine. [21] This phenomenon was named "the macrocyclic effect" and it was also interpreted as an entropy effect. However, later studies suggested that both enthalpy and entropy factors were involved. [22]

An important difference between macrocyclic ligands and open-chain (chelating) ligands is that they have selectivity for metal ions, based on the size of the cavity into which the metal ion is inserted when a complex is formed. For example, the crown ether 18-crown-6 forms much stronger complexes with the potassium ion, K + than with the smaller sodium ion, Na + . [23]

In hemoglobin an iron(II) ion is complexed by a macrocyclic porphyrin ring. The article hemoglobin incorrectly states that oxyhemoglogin contains iron(III). It is now known that the iron(II) in hemoglobin is a low-spin complex, whereas in oxyhemoglobin it is a high-spin complex. The low-spin Fe 2+ ion fits snugly into the cavity of the porhyrin ring, but high-spin iron(II) is significantly larger and the iron atom is forced out of the plane of the macrocyclic ligand. [24] This effect contributes the ability of hemoglobin to bind oxygen reversibly under biological conditions. In Vitamin B12 a cobalt(II) ion is held in a corrin ring. Chlorophyll is a macrocyclic complex of magnesium(II).

Cyclam Porphine, the simplest porphyrin.
Structures of common crown ethers: 12-crown-4, 15-crown-5, 18-crown-6, dibenzo-18-crown-6, and diaza-18-crown-6

Geometrical factors Edit

Successive stepwise formation constants Kn in a series such as MLn (n = 1, 2, . ) usually decrease as n increases. Exceptions to this rule occur when the geometry of the MLn complexes is not the same for all members of the series. The classic example is the formation of the diamminesilver(I) complex [Ag(NH3)2] + in aqueous solution.

Nesse caso, K2 & gt K1. The reason for this is that, in aqueous solution, the ion written as Ag + actually exists as the four-coordinate tetrahedral aqua species [Ag(H2O)4] + . The first step is then a substitution reaction involving the displacement of a bound water molecule by ammonia forming the tetrahedral complex [Ag(NH3)(H2O)3] + . In the second step, all the aqua ligands are lost and a linear, two-coordinate product [H3N–Ag–NH3] + is formed. Examination of the thermodynamic data [25] shows that the difference in entropy change is the main contributor to the difference in stability constants for the two complexation reactions.

equilíbrio ΔH ⊖ /kJ mol −1 ΔS ⊖ /J K −1 mol −1
Ag + + NH3 ⇌ [Ag(NH3)] + −21.4 8.66
[Ag(NH3)] + + NH3 ⇌ [Ag(NH3)2] + −35.2 −61.26

Other examples exist where the change is from octahedral to tetrahedral, as in the formation of [CoCl4] 2− from [Co(H2O)6] 2+ .

Classification of metal ions Edit

Ahrland, Chatt and Davies proposed that metal ions could be described as class A if they formed stronger complexes with ligands whose donor atoms are nitrogen, oxygen or fluorine than with ligands whose donor atoms are phosphorus, sulfur or chlorine and class B if the reverse is true. [26] For example, Ni 2+ forms stronger complexes with amines than with phosphines, but Pd 2+ forms stronger complexes with phosphines than with amines. Later, Pearson proposed the theory of hard and soft acids and bases (HSAB theory). [27] In this classification, class A metals are hard acids and class B metals are soft acids. Some ions, such as copper(I), are classed as borderline. Hard acids form stronger complexes with hard bases than with soft bases. In general terms hard–hard interactions are predominantly electrostatic in nature whereas soft–soft interactions are predominantly covalent in nature. The HSAB theory, though useful, is only semi-quantitative. [28]

The hardness of a metal ion increases with oxidation state. An example of this effect is given by the fact that Fe 2+ tends to form stronger complexes with N-donor ligands than with O-donor ligands, but the opposite is true for Fe 3+ .

Effect of ionic radius Edit

The Irving–Williams series refers to high-spin, octahedral, divalent metal ion of the first transition series. It places the stabilities of complexes in the order

This order was found to hold for a wide variety of ligands. [29] There are three strands to the explanation of the series.

  1. The ionic radius is expected to decrease regularly for Mn 2+ to Zn 2+ . This would be the normal periodic trend and would account for the general increase in stability.
  2. The crystal field stabilisation energy (CFSE) increases from zero for manganese(II) to a maximum at nickel(II). This makes the complexes increasingly stable. CFSE returns to zero for zinc(II).
  3. Although the CFSE for copper(II) is less than for nickel(II), octahedral copper(II) complexes are subject to the Jahn–Teller effect which results in a complex having extra stability.

Another example of the effect of ionic radius the steady increase in stability of complexes with a given ligand along the series of trivalent lanthanide ions, an effect of the well-known lanthanide contraction.

Stability constant values are exploited in a wide variety of applications. Chelation therapy is used in the treatment of various metal-related illnesses, such as iron overload in β-thalassemia sufferers who have been given blood transfusions. The ideal ligand binds to the target metal ion and not to others, but this degree of selectivity is very hard to achieve. The synthetic drug deferiprone achieves selectivity by having two oxygen donor atoms so that it binds to Fe 3+ in preference to any of the other divalent ions that are present in the human body, such as Mg 2+ , Ca 2+ and Zn 2+ . Treatment of poisoning by ions such as Pb 2+ and Cd 2+ is much more difficult since these are both divalent ions and selectivity is harder to accomplish. [30] Excess copper in Wilson's disease can be removed by penicillamine or Triethylene tetramine (TETA). DTPA has been approved by the U.S. Food and Drug Administration for treatment of plutonium poisoning.

DTPA is also used as a complexing agent for gadolinium in MRI contrast enhancement. The requirement in this case is that the complex be very strong, as Gd 3+ is very toxic. The large stability constant of the octadentate ligand ensures that the concentration of free Gd 3+ is almost negligible, certainly well below toxicity threshold. [31] In addition the ligand occupies only 8 of the 9 coordination sites on the gadolinium ion. The ninth site is occupied by a water molecule which exchanges rapidly with the fluid surrounding it and it is this mechanism that makes the paramagnetic complex into a contrast reagent.

EDTA forms such strong complexes with most divalent cations that it finds many uses. For example, it is often present in washing powder to act as a water softener by sequestering calcium and magnesium ions.

The selectivity of macrocyclic ligands can be used as a basis for the construction of an ion selective electrode. For example, potassium selective electrodes are available that make use of the naturally occurring macrocyclic antibiotic valinomycin.

An ion-exchange resin such as chelex 100, which contains chelating ligands bound to a polymer, can be used in water softeners and in chromatographic separation techniques. In solvent extraction the formation of electrically-neutral complexes allows cations to be extracted into organic solvents. For example, in nuclear fuel reprocessing uranium(VI) and plutonium(VI) are extracted into kerosene as the complexes [MO2(TBP)2(NO3)2] (TBP = tri-n-butyl phosphate). In phase-transfer catalysis, a substance which is insoluble in an organic solvent can be made soluble by addition of a suitable ligand. For example, potassium permanganate oxidations can be achieved by adding a catalytic quantity of a crown ether and a small amount of organic solvent to the aqueous reaction mixture, so that the oxidation reaction occurs in the organic phase.

In all these examples, the ligand is chosen on the basis of the stability constants of the complexes formed. For example, TBP is used in nuclear fuel reprocessing because (among other reasons) it forms a complex strong enough for solvent extraction to take place, but weak enough that the complex can be destroyed by nitric acid to recover the uranyl cation as nitrato complexes, such as [UO2(NO3)4] 2− back in the aqueous phase.

Supramolecular complexes Edit

Supramolecular complexes are held together by hydrogen bonding, hydrophobic forces, van der Waals forces, π-π interactions, and electrostatic effects, all of which can be described as noncovalent bonding. Applications include molecular recognition, host–guest chemistry and anion sensors.

A typical application in molecular recognition involved the determination of formation constants for complexes formed between a tripodal substituted urea molecule and various saccharides. [32] The study was carried out using a non-aqueous solvent and NMR chemical shift measurements. The object was to examine the selectivity with respect to the saccharides.

An example of the use of supramolecular complexes in the development of chemosensors is provided by the use of transition-metal ensembles to sense for ATP. [33]

Anion complexation can be achieved by encapsulating the anion in a suitable cage. Selectivity can be engineered by designing the shape of the cage. For example, dicarboxylate anions could be encapsulated in the ellipsoidal cavity in a large macrocyclic structure containing two metal ions. [34]

The method developed by Bjerrum is still the main method in use today, though the precision of the measurements has greatly increased. Most commonly, a solution containing the metal ion and the ligand in a medium of high ionic strength is first acidified to the point where the ligand is fully protonated. This solution is then titrated, often by means of a computer-controlled auto-titrator, with a solution of CO2-free base. The concentration, or activity, of the hydrogen ion is monitored by means of a glass electrode. The data set used for the calculation has three components: a statement defining the nature of the chemical species that will be present, called the model of the system, details concerning the concentrations of the reagents used in the titration, and finally the experimental measurements in the form of titre and pH (or emf) pairs.

It is not always possible to use a glass electrode. If that is the case, the titration can be monitored by other types of measurement. Ultraviolet–visible spectroscopy, fluorescence spectroscopy and NMR spectroscopy are the most commonly used alternatives. Current practice is to take absorbance or fluorescence measurements at a range of wavelengths and to fit these data simultaneously. Various NMR chemical shifts can also be fitted together.

The chemical model will include values of the protonation constants of the ligand, which will have been determined in separate experiments, a value for log KC and estimates of the unknown stability constants of the complexes formed. These estimates are necessary because the calculation uses a non-linear least-squares algorithm. The estimates are usually obtained by reference to a chemically similar system. The stability constant databases [8] [9] can be very useful in finding published stability constant values for related complexes.

In some simple cases the calculations can be done in a spreadsheet. [35] Otherwise, the calculations are performed with the aid of a general-purpose computer programs. The most frequently used programs are:

  • Potentiometric and/or spectrophotometric data: PSEQUAD [36]
  • Potentiometric data: HYPERQUAD, [37] BEST, [38]ReactLab pH PRO
  • Spectrophotometric data: HypSpec, SQUAD, [39] SPECFIT, [40][41]ReactLab EQUILIBRIA. [42]
  • NMR data HypNMR, [43]WINEQNMR2[44]

In biochemistry, formation constants of adducts may be obtained from Isothermal titration calorimetry (ITC) measurements. This technique yields both the stability constant and the standard enthalpy change for the equilibrium. [45] It is mostly limited, by availability of software, to complexes of 1:1 stoichiometry.

The following references are for critical reviews of published stability constants for various classes of ligands. All these reviews are published by IUPAC and the full text is available, free of charge, in pdf format.


Spectrophotometric Values of Individual Nucleotides - Biology

Todos os artigos publicados pela MDPI são disponibilizados imediatamente em todo o mundo sob uma licença de acesso aberto. Nenhuma permissão especial é necessária para reutilizar todo ou parte do artigo publicado pela MDPI, incluindo figuras e tabelas. Para artigos publicados sob uma licença Creative Common CC BY de acesso aberto, qualquer parte do artigo pode ser reutilizada sem permissão, desde que o artigo original seja claramente citado.

Os artigos de destaque representam a pesquisa mais avançada com potencial significativo de alto impacto no campo. Artigos de destaque são submetidos a convite individual ou recomendação dos editores científicos e passam por revisão por pares antes da publicação.

O artigo pode ser um artigo de pesquisa original, um estudo de pesquisa substancial que frequentemente envolve várias técnicas ou abordagens ou um artigo de revisão abrangente com atualizações concisas e precisas sobre os últimos avanços no campo que revisa sistematicamente os avanços mais interessantes na área científica literatura. Este tipo de papel fornece uma perspectiva sobre as futuras direções de pesquisa ou possíveis aplicações.

Os artigos do Editor’s Choice são baseados em recomendações de editores científicos de periódicos MDPI de todo o mundo. Os editores selecionam um pequeno número de artigos publicados recentemente na revista que eles acreditam ser particularmente interessantes para os autores ou importantes neste campo. O objetivo é fornecer um instantâneo de alguns dos trabalhos mais interessantes publicados nas várias áreas de pesquisa da revista.


Spectrophotometric Values of Individual Nucleotides - Biology

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Materiais e métodos

Origin of Mosquito DNA.

o Ae. aegypti used in these experiments are from a field collection of ≈1,600 mosquitoes collected from throughout Mexico ( Gorrochotegui-Escalante et al. 2002). o Um. gambiae are from a field collection of ≈2,000 mosquitoes collected in Mali by F. Tripet and G. Lanzaro. DNA was isolated using the salt extraction procedure ( Coen et al. 1982). We received ≈1% of the DNA isolated from individual Um. gambiae, which was then subject to whole genome amplification with multiple displacement amplification (MDA) ( Dean et al. 2001, Gorrochotegui-Escalante and Black 2003).

PCR and Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP).

PCR primers ( Table 1) were designed to amplify a 250–500-bp fragment of the TrypAbun e TrypEarl genes em Ae. aegypti, and of the α-GPDH no Um. gambiae by using Primer Premier 5.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA). These products were amplified in 100 mosquitoes from disparate geographic locations, and the products were subject to SSCP analysis ( Orita et al. 1989, Black and DuTeau 1997). Novel SSCP genotypes were sequenced, and sequences were aligned. Segregating sites with the largest expected heterozygosity were chosen as SNP markers.

Oligonucleotides for SNP detection by HOLA in the TrypAbun e TrypEarl SNP loci in Ae. aegypti e αGPDH-*+ locus in Um. gambiae

Oligonucleotides for SNP detection by HOLA in the TrypAbun e TrypEarl SNP loci in Ae. aegypti e αGPDH-*+ locus in Um. gambiae

Detector and Reporter Oligonucleotide Design.

The detector and reporter oligonucleotides for TrypAbun, TrypEarl, e αGPDH loci are shown in Table 1. The TrypAbun SNP locus occurs at nucleotide 1,249 of the cDNA (L17023) in the third position of a Leu codon. There are cytosine, thymine, and guanine alleles at this locus that encode synonymous codons. o TrypEarl SNP locus occurs at nucleotides 21–31 immediately 5′ to the ATG start codon of the cDNA (X64362). The detector oligonucleotides identify the presence or absence of a 5′-CTGAACCACAG-3′ insertion at this locus. o αGPDH locus occurs at 47,520,828–47,525,414 bp (47.5 Mb) on chromosome 2L. The SNP occurs at nucleotide 624 of the cDNA (XM 308279) in the third position of a Glu codon. There are adenine and guanine alleles at this locus that encode synonymous codons.

With OLA, detector and reporter oligonucleotides can be designed to anneal either to the top strand (e.g., TrypAbun ou αGPDH in Table 1) or to the bottom strand (e.g., TrypEarl) The two alternative detector and reporter sets, each 24 nt and located immediately 5′ and 3′ to the SNP sites were checked for hairpin, dimers, and false annealing in the amplified fragment using Primer Premier 5.0 and were either shortened as needed or designed to anneal to the opposite strand. Note that mixed sites were included in the detector and reporter in each of the three SNP markers.

The PCR products from homozygous mosquitoes were TA cloned into the pCR2.1 vector (Invitrogen, Carlsbad, CA) and sequenced. If the insert contained the correct allele, a large amount of plasmid was grown and isolated to act as a positive control during SNP determinations. All detector and reporter oligonucleotide were synthesized by QIAGEN (Valencia, CA). Each was diluted to 500 pm/µl in TE (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA, pH 8.0). A 1 pm/µl working stock was made by mixing in a 1.5-ml tube, 996 µl of TE, 2 µl of a detector, and 2 µl of reporter.

Heated Ligation.

Each 20-µl HOLA reaction contained 13.2 µl of ddH2O, 2.0 µl of 10× Ampligase reaction buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8.3, 250 mM KCl, 100 mM MgCl2, 5 mM nicotinamide adenine dinucleotide, and 0.1% Triton X-100), 3.0 µl of PCR product, 1.0 µl of detector/reporter mix (1 pm/µl) and 0.8 µl of Ampligase thermostable DNA ligase (Epicenter Technologies, Madison, WI). When more than a single reaction was to be run the ddH2O, 10× reaction buffer and Ampligase were mixed into a master tube. The master mix was then split equally into two tubes for two-allele SNPs or three tubes for three-allele SNPs. Each allele specific master mix then received a specific detector/reporter. After mixing, 17 µl of allele specific master mix was pipetted into a well of a 96-well skirted polypropylene microplate (MJ Research, Inc., Waltham, MA). PCR product (3 µl) was then loaded into each well followed by one drop (≈25 µl) of paraffin oil. The plate was placed on thermal cycler set for 1) 95°C for 5 min, 2) 94°C for 1 min, 3) optimal Ta°C for 2 min (55°C for TrypAbun, 50°C for TrypEarl e αGPDH), 4) 25 times to step 2, and 5) 4°C hold.

Streptavidin Plate Preparation.

To each well of a Nunc flat-bottomed MaxiSorb F96 Immuno-Plate (catalog no. 4–42404, Nalge Nunc International, Naperville, IL) was added 100 µl of streptavidin (5 mg/ml of Sigma [St. Louis] catalog no. S-4762 in purified water). In Colorado, plates were exposed to the air at 25°C overnight to allow the solution to evaporate to dryness. In humid tropical climates, plates were instead placed inside a 3.8-liter (1-gal) sealed plastic Zip-Lock bag containing ≈100 g of Drierite (four mesh regular, W. A. Hammond DRIERITE Co. Ltd., Xenia, OH) at 37°C overnight to allow the solution to evaporate to dryness. After two to three uses, the Drierite was heated for ≈10 min in a microwave to evaporate accumulated water and then returned to the Zip-Lock bag.

Streptavidin plates were washed four times with 250 µl of 1× phosphate-buffered saline (PBS, 0.01 M sodium phosphate and 0.15 M NaCl, pH 7.2) containing 0.1% (vol:vol) Tween 20 (PBS/Tween 20). Each well received 200 µl of 1× PBS containing 2% (wt:vol) bovine serum albumin to block nonspecific absorption. The plate was incubated at room temperature for 1 h. Plates were then washed four times with 250 µl of PBS +Tween 20/well. Plates could be individually stored in a zip-locked plastic bags in a light safe box in a 4°C refrigerator for up to a week.

Ligation Detection.

To each well of the streptavidin plate was added 20 µl of TNE (10 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, and 1 mM EDTA). The entire 20 µl of HOLA reaction was then added to each well and mixed by pipetting. The biotinylated detector was captured by the streptavidin at 25°C for 30 min. The TNE + ligase mix was removed with individual pipette tips to avoid contamination across wells. The plate was washed twice with 250 µl of fresh wash 1 [0.01 M NaOH and 0.05% (vol:vol) Tween 20] and twice with 250 µl of wash 2 [100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, and 0.05% (vol:vol) Tween 20]. Lyophilized and stabilized anti-fluorescein-peroxidase, Fab fragments (150,000 mU, catalog no. 1 426 346, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) was diluted in 1 ml of 1% bovine serum albumin (BSA) in wash 2. Diluted Fab fragments 0.5 µl (75 mU) were pipetted into 1 ml of 1% BSA in wash 2, vortexed, and 40 µl (3 mU) was pipetted into each of 24 wells and incubated at 25°C for 30 min. The solution was removed with individual pipette tips, and each well was washed three times with 250 µl of wash 2, and 100 µl of 3,3′ 5,5′ tetramethyl benzidine (TMB, catalog no. T-0440, Sigma) was added. The plate was scanned on a flatbed scanner after 5 min of constant mixing. When necessary, the optical density (OD)650 was measured in the detection plate with a 96-well plate reader (Benchmark Plus microplate spectrophotometer, Bio-Rad, Hercules, CA).


Part III: Standard Curves

Introdução

Standard curves (also known as calibration curves) show the relationship between two quantities. The standard curves are most often used to determine the concentration of &ldquounknown&rdquo samples by comparing them to reference samples with &ldquoknown&rdquo concentrations. Later in the course, we will use standard curves to measure amounts of extracted protein and to determine the size of DNA molecules. In today&rsquos lab, you made three serial dilutions and should be able to calculate the concentrations for each dilution. Using Excel, you will prepare standard curves for each serial dilution and determine if your standard curve is accurate. Then you will determine the concentration of unknown samples, using your standard curves.

Figure 3: Standard curve of a five-fold serial dilution

The R-squared value (R2) is the correlation coefficient or the square of the correlation. For the standard curve, this value measures how strong the linear relationship is between the reagent concentration (X-axis) and the absorbance value (Y-axis). If the R2 value = 1, then that shows a perfect positive relationship. Since your standard curves are generated from the serial dilutions you pipetted, the R2 values can also show how accurate your pipetting skills are.


Assista o vídeo: FUNDAMENTOS EM ANÁLISES CLÍNICAS - AULA 4 ESPECTROFOTOMETRIA #QUIZ (Dezembro 2021).