Em formação

As bactérias podem liberar DNA livre em seu ambiente?


A transformação natural, também conhecida como competência natural, envolve a absorção de DNA em uma bactéria competente (para transferência horizontal de genes ou como fonte de alimento). Minha pergunta é sobre de onde esse DNA extracelular pode vir. Normalmente, este DNA "livre" se origina de células bacterianas lisadas. Existem casos em que o DNA é liberado sem lise que outras bactérias podem absorver por meio de transformação natural?

Observação: Não estou interessado na conjugação bacteriana porque estou especificamente interessado no DNA extracelular que pode ser internalizado por bactérias competentes.


Transformação Natural

O processo de Transformação Natural (Lorenz e Wackernagel 1994) tem uma importância muito grande na evolução dos procariotos. Definição de citação de (Stewart e Carlson 1986)

A transformação natural faz parte da fisiologia normal da célula. É a única forma de troca genética bacteriana cujas funções são codificadas no cromossomo, e a competência é uma característica hereditária, sujeita a pressão seletiva.

Isso é quase semelhante ao nosso uso diário transformação artificial. Você precisa de algum produto químico como $ CaCl_2 $ para células permiabalizadas, alguns agentes quelantes como EDTA e material de DNA. Você pode imaginar uma célula que ocorre naturalmente enfrentando tais condições, como diminuição da temperatura na presença de certos produtos químicos e proteínas.

Esse conceito de uma célula se externalizando e outra internalizando o DNA ficou mais forte quando os pesquisadores observaram o DNA livre em meios de cultura (Catlin 1959, Sinha e Iyer 1971).

A Criação do eDNA

A liberação de eDNA (DNA extracelular) pode ocorrer por excreção espontânea ou ação autolítica.

Existem mecanismos conhecidos para a liberação de eDNA como a formação de bolhas (Dorward e Garon 1990). Esta produção extracelular de DNA é afetada por muitos fatores físico-químicos além dos bióticos (Paul e David 1989). Existem muitos relatórios detalhados que mostram que esse DNA pode ser passado através da parede celular sem qualquer dano celular (Hara e Ueda, 1981). A meia-vida de tal eDNA em vários ambientes é relatada na tabela a seguir (Lorenz e Wackernagel 1994)

Agora, existem ainda mais novas formas de produção de DNA extracelular, como em Neisseria gonorrhoeae a secreção de DNA cromossômico ocorre por meio de um novo sistema de secreção tipo IV (Hamilton et al 2005). Não apenas experimentos, os modelos matemáticos também mostram o novo papel desse processo na seleção em nível de gene (Draghi e Turner 2006). Não mencionei a absorção desse DNA, que por si só contém muita literatura e mecanismos únicos como esse.


Boa pergunta, a única coisa que posso acrescentar é que em biofilmes, embora o DNA seja liberado por lise, a lise é controlada usando o sensor de quorum e subpopulações específicas de efeitos (Okshevsky & Meyer, 2013).


Qual é o seu princípio e etapas da Transformação Bacteriana?

A transformação bacteriana é a transferência de DNA livre liberado de uma bactéria doadora para o ambiente extracelular que resulta em assimilação e geralmente uma expressão da característica recém-adquirida em uma bactéria receptora.

Este processo não requer uma célula de doador viva e requer apenas DNA livre no ambiente. O receptor que propaga com sucesso o novo DNA é chamado de transformante.

Durante condições ambientais extremas, alguns gêneros bacterianos liberam espontaneamente DNA das células para o ambiente, livre para ser absorvido pelas células competentes. As células competentes também respondem às mudanças no ambiente e controlam o nível de aquisição do gene por meio de um processo de transformação natural.

A transformação é adotada como o método mais comum de transferência de genes, pois é a melhor forma de transferência de DNA alterado artificialmente para as células receptoras.

O processo de transformação pode transferir regiões de DNA de um a dezenas de quilobases.


Construindo genomas do zero

Para criar seus E. coli, a equipe aproveitou uma peculiaridade no processo de como a informação genética é traduzida em proteínas.

Igual ao humano DNA, E. coli cromossomos contêm quatro bases, adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G). Um conjunto de três bases - como TCG ou AGC, por exemplo - é conhecido como um códon, e cada códon corresponde a um aminoácido, ou bloco de construção de proteína. Além disso, alguns códons dizem à célula quando parar de construir uma proteína - eles são chamados de "códons de parada".

Quando uma célula precisa de uma proteína específica construída, uma enzima invade e copia todos os códons relevantes para aquela proteína e armazena essa informação em uma nova molécula chamada RNA mensageiro (mRNA). O mRNA é então enviado para a fábrica de construção de proteínas da célula, o ribossomo, onde outra molécula chamada RNA de transferência (tRNA) lê essas instruções copiadas. O tRNA então busca todos os aminoácidos necessários para construir a proteína desejada, até o códon de parada.

As bases do DNA podem ser arranjadas em 64 códons de três bases diferentes, com três deles sendo códons de parada. Dito isso, as células na verdade têm apenas 20 aminoácidos para trabalhar, o que significa que vários códons diferentes codificam os mesmos aminoácidos.

"Existe essa redundância inerente ao código genético, onde você tem 64 códons, mas apenas 20 blocos de construção", disse Robertson. Robertson e seus colegas se perguntaram se, ao substituir códons redundantes por seus "sinônimos", eles poderiam então reatribuir alguns desses códons redundantes para codificar novos aminoácidos sem matar a célula.

Em estudo anterior, publicado em 2019 na revista Natureza, a equipe superou o primeiro obstáculo neste desafio, criando uma nova variedade de E. coli com um genoma reduzido. Liderado por Jason Chin, líder do programa no MRC-LMB e chefe do Centro de Biologia Química e Sintética, o grupo trocou todos os códons TCG e TCA por AGC e AGT, todos codificados para o aminoácido serina.

Eles fizeram isso usando uma técnica chamada "excisão de replicon para engenharia de genoma aprimorada por meio de recombinação programada", ou simplesmente REXER. REXER pode cortar grandes porções do E. coli genoma em uma única etapa e substituir o pedaço excisado por DNA sintético, que, neste caso, usou AGC e AGT no lugar de TCG e TCA. Este processo pode ser aplicado passo a passo, avançando lentamente no genoma para que pedaço após pedaço seja substituído por DNA sintético, desta forma, a equipe eliminou todas as instâncias de TCG e TCA de seus E. coli cepa.

"Se você vai fazer um monte de mudanças, é realmente mais eficiente começar do zero e apenas construir de baixo para cima", em vez de trocar códons um a um do genoma natural, disse Robertson. A equipe também trocou o códon de parada TAG por TAA, um códon de parada sinônimo, e assim liberou três códons para reprogramar, uma vez que a célula não continha mais TCG, TCA ou TAG.

E apesar de ter esses três códons removidos, a nova cepa de E. coli sobreviveu bem no ambiente de laboratório, e a equipe selecionou as células que cresceram mais rápido na cultura de células. As células que passaram por esta evolução direcionada cresceram de forma confiável em pratos de laboratório, embora o E. coli morreria rapidamente se fosse colocado fora do ambiente de laboratório controlado, observou Robertson.


2. Engenharia de bactérias para liberação e programação de sua morte

A pesquisa sobre os riscos de biossegurança nas últimas décadas produziu um corpo de informações que se tornou um pano de fundo útil para abordar as preocupações de segurança atuais em genomas sintéticos contemporâneos e futuros e microorganismos não naturais. Um aspecto especial de tal pesquisa sobre microorganismos geneticamente modificados (GEMs) para liberação ambiental [21, 22, 23] lidou com a engenharia de circuitos para a contenção de bactérias modificadas e seus genes (trans) recombinantes. A noção, lançada por S & # x000f8ren Molin [24, 25], contemplou a possibilidade de que os GEMs pudessem ser dotados de circuitos de letalidade condicional para programar sua morte em um determinado momento ou assim que completassem sua missão [26, 27]. Observe que a novidade de tal contenção ativa era totalmente diferente do conceito anterior sustentado na Conferência de Asilomar que defendia o uso de cepas multi & # x02010auxotróficas como recipientes de DNA recombinante com o propósito de diminuir as chances de sobrevivência no ambiente [2, 3]. A desvantagem desse conceito judicioso era que as cepas propostas eram tão fracas que se tornaram quase inúteis para aplicações biotecnológicas e até mesmo para trabalho de laboratório de rotina. Em contraste, a contenção ativa buscou o desempenho vigoroso das células de interesse onde e quando desejado, até que um sinal conhecido apareceu no estágio que desencadeou uma morte rápida.

Nos anos seguintes, o campo da contenção biológica cresceu com múltiplas proposições para circuitos de suicídio condicional com o objetivo de diminuir a viabilidade das células caso elas entrassem em situações indesejadas ou chegassem ao seu tempo [26, 28, 29, 30, 31, 32]. As proposições variaram de esquemas simples (por exemplo, tornando o crescimento do GEM dependente de um composto intermediário essencial que não poderia ser sintetizado pelas células: ácido diaminopimélico ou timidina) até circuitos genéticos intrincados que programavam a morte celular uma vez que um poluente ambiental alvo foi degradado pelas bactérias modificadas [33]. O importante é que a morte celular não significa o desaparecimento de seu DNA. Há um grande corpo de evidências de que o material genético de organismos recombinantes mortos permanece perfeitamente ativo e transferível no meio ambiente [34]. Além disso, fenômenos meteorológicos como a iluminação podem promover a absorção de DNA em ambientes naturais [35]. Nessa linha, projetos inteligentes foram propostos para inibir a aquisição de genes recombinantes de GEMs em outras bactérias, seja por transformação natural ou por um processo ativo de transferência horizontal de genes (HGT). Muitos desses esquemas funcionaram tanto em condições de laboratório quanto em microcosmos. Em certa medida, eles imitaram as condições ambientais que se esperava que as bactérias GM enfrentassem ao serem liberadas. Mas o sonho de bactérias perfeitamente contidas recebeu um sério golpe em 2003 com um estudo mostrando que havia um limite para a eficiência dos circuitos de contenção de qualquer tipo na faixa de 10 & # x022126 [29]. Em outras palavras, independentemente da sofisticação do projeto genético, pelo menos uma célula em um milhão pode sempre escapar do dispositivo de letalidade condicional ou das armadilhas HGT e, eventualmente, sobreviver. Dado o fato de que 1 ml de uma cultura bacteriana padrão cultivada tem mais de 10 8 células, é claro que tais abordagens de contenção & # x02013 bonitas como são & # x02013 não resolvem o problema. A razão para isso foi a atividade de sequências de inserção móveis que povoam os cromossomos de bactérias ambientais e saltam aleatoriamente entre os segmentos de DNA das células in vivo. Essa circunstância acaba por nocautear tanto os sistemas endógenos de viabilidade condicional quanto os genes tóxicos que poderiam estar associados aos genes transferidos horizontalmente.

Um segundo dividendo da pesquisa intensiva de avaliação de risco de GEMs durante o final dos anos 1980 e toda a década de 1990 foi o desenvolvimento de uma série de ferramentas genéticas feitas sob medida para projetar bactérias destinadas à liberação ambiental. A questão em jogo era como garantir a manutenção estável dos transgenes sem qualquer seleção de antibióticos e sem ser oneroso para os microrganismos que precisam operar em campo aberto. Muitos desses problemas poderiam ser resolvidos com os assim & # x02010 chamados vetores de transposon com marcadores de seleção não & # x02010 antibióticos ou excisáveis, que melhoraram espetacularmente a engenharia genética e as manipulações que poderiam ser feitas com bactérias Gram & # x02010 negativas diferentes Escherichia coli [32, 36, 37, 38]. Tais vetores permitiam a implantação múltipla e estável de longos segmentos de DNA nos hospedeiros desejados, evitavam o uso de antibióticos, diminuíam as chances de transferência horizontal de genes [39] e evitavam a imprevisibilidade de ter os transgenes clonados em plasmídeos. Um dos vetores foi projetado para produzir GEMs que eram indistinguíveis de contrapartes não & # x02010 engenheiradas (o então & # x02010 chamado de recombinante, mas quase& # x02010 bactérias naturais [40]). Com citações de & # x0003e3000 e apesar das melhorias recentes [41], os artigos originais que descrevem tais vetores mini & # x02010transposon permanecem até hoje como referências clássicas de ferramentas genéticas para liberação ambiental e outras aplicações biotecnológicas. No entanto, independentemente da abundância de ativos para o design aceitavelmente seguro para biorremediação, o campo de GEMs para o meio ambiente tem perdido força progressivamente nos anos mais recentes. A razão final para isso não tem sido as preocupações com a segurança ou a falta de aceitação do público, mas os fatos concretos sobre seu mau comportamento como catalisadores in situ [42]. Esta estagnação, no entanto, mudou recentemente com o aparecimento de Sistemas e Biologia Sintética [43], que permite adotar uma abordagem em várias escalas & # x02010 para o mesmo problema e chegar a métodos muito mais seguros e previsíveis para impedir a interação entre o natural e o homem & # x02010 fez construções biológicas.


O argumento para a seleção sexual em bactérias

Crédito CC0: domínio público

A pressão evolutiva para transmitir o DNA pode produzir um comportamento que, de outra forma, não faria sentido na luta pela sobrevivência. Carneiros batem cabeças em lutas por fêmeas de pavão que desenvolvem elaboradas penas da cauda que atraem companheiros e predadores. A seleção sexual às vezes pode explicar fenômenos que a seleção natural sozinha não pode. Mas as bactérias poderiam exibir seleção sexual? Em artigo de opinião publicado em 4 de setembro na revista Tendências em microbiologia, pesquisadores da Universidade de Exeter argumentam que algumas bactérias podem.

As bactérias geralmente se clonam para se reproduzir, mas também são conhecidas por trocar DNA. Uma célula de bactéria doadora pode transferir genes para uma célula receptora em um processo chamado transferência lateral de genes, que pode acontecer por meio de três mecanismos: transdução, conjugação e transformação. O grupo de pesquisa acredita que essa troca de DNA (e transformação em particular) pode ser governada pela seleção sexual às vezes.

"A transformação e outras formas de transferência de DNA são muito prevalentes em quase todos os tipos de bactérias e têm um grande efeito em sua evolução. Por exemplo, as bactérias podem absorver genes de resistência a antibióticos de outras cepas e espécies, com profundas consequências para a saúde humana", afirmou. diz o primeiro autor Michiel Vos, microbiologista da Universidade de Exeter. "Portanto, é importante tentar entender exatamente por que eles evoluíram para liberar e absorver o DNA."

Na transformação, uma célula doadora libera seu DNA no ambiente circundante, bombeando-o ativamente para fora da célula ou simplesmente rompendo e derramando seu conteúdo. A célula receptora pode então pegar o DNA flutuante e incorporá-lo em seu próprio genoma. Quando a célula receptora posteriormente se clona, ​​ela propaga um genoma que é principalmente DNA próprio, mas contém fragmentos de DNA doador.

Os cientistas têm várias teorias que explicam por que as bactérias fazem isso. Alguns enfocam a seleção natural e como o novo DNA doador beneficia a sobrevivência celular. Outros argumentam que a transformação não tem nada a ver com a seleção natural, mas com outras funções, como usar o DNA do ambiente como alimento ou para reparo, e que a mistura genética é apenas um subproduto coincidente. Vos e seus colegas pensam que, embora a seleção natural deva atuar na liberação e absorção do DNA, pode haver benefícios adicionais da seleção sexual.

"Uma analogia que traçamos, que será controversa para alguns, é entre a liberação e absorção de DNA como, respectivamente, as funções masculina e feminina", diz Vos. "As funções femininas e masculinas são definidas pelo tamanho dos gametas - óvulos grandes ou espermatozóides pequenos - e, é claro, as bactérias não têm gametas."

Mas Vos e seus colegas vêem várias analogias testáveis ​​entre a transformação em bactérias e a seleção sexual em outros organismos. Por exemplo, as bactérias investem energia na liberação do DNA e os animais machos investem energia na criação de muito esperma - idem para a captação e reprodução do DNA, e investindo energia para criar um óvulo, do qual apenas metade do material genético deriva da mãe. Estudos futuros podem examinar quanta energia diferentes espécies de bactérias investem na transformação, quais bactérias passam mais de seu DNA e o que deu a essas bactérias uma vantagem.

A seleção sexual pode às vezes resultar em coerção onde (geralmente) os machos desenvolvem táticas ofensivas para coagir as fêmeas ao acasalamento. Isso, por sua vez, seleciona que as mulheres se tornem resistentes à coerção. Nas bactérias, a coerção pode assumir a forma de liberação de sinais químicos que induzem outras bactérias a absorver o DNA. Em outro possível exemplo de seleção sexual, pesquisas recentes descobriram que algumas espécies bacterianas absorvem DNA após lisarem seletivamente (ruptura) de cepas não relacionadas, o que pode aumentar as chances de adquirir novos genes adaptativos das células rompidas.

"Acreditamos que o sexo por coerção também pode acontecer nas bactérias", diz Vos. Os cientistas de Exeter agora estão planejando experimentos para testar essas idéias.

Em cerca de duas dúzias de espécies de bactérias que servem como sistemas modelo para a transformação, há uma grande variação nos mecanismos genéticos e nas pistas ecológicas que controlam a captação e a liberação do DNA. É provável que essa diversidade seja muito maior nos milhões de espécies bacterianas que ainda não foram descritas. Os autores esperam que pesquisas futuras sobre a troca de genes bacterianos levem em consideração a teoria de seleção sexual desenvolvida no contexto de animais.


Um novo insight sobre como o DNA é mantido unido por efeitos hidrofóbicos (atualização)

Para que o DNA seja lido, replicado ou reparado, as moléculas de DNA devem se abrir. Isso acontece quando as células usam uma proteína catalítica para criar um ambiente hidrofóbico ao redor da molécula. Crédito: Yen Strandqvist / Chalmers University of Technology

Pesquisadores da Chalmers University of Technology, na Suécia, descobriram um novo aspecto na maneira como o DNA se liga a si mesmo e no papel desempenhado pelos efeitos hidrofóbicos. Eles mostram como pequenas mudanças nas propriedades da água podem controlar delicadamente o processo de ligação. A descoberta abre portas para um novo entendimento na pesquisa em medicina e ciências da vida. A pesquisa é apresentada na revista PNAS.

O DNA é constituído de duas fitas, consistindo de moléculas de açúcar e grupos de fosfato. Entre essas duas fitas estão as bases de nitrogênio, os compostos que constituem os genes dos organismos, com ligações de hidrogênio entre eles. Essas ligações de hidrogênio às vezes foram vistas como cruciais para manter as duas fitas juntas.

Mas agora, pesquisadores da Chalmers University of Technology mostram que o segredo da estrutura helicoidal do DNA pode ser que as moléculas têm um interior hidrofóbico, em um ambiente constituído principalmente de água. O ambiente é, portanto, hidrofílico, enquanto as bases de nitrogênio das moléculas de DNA são hidrofóbicas, afastando a água circundante. Quando as unidades hidrofóbicas estão em um ambiente hidrofílico, elas se agrupam para minimizar sua exposição à água.

O papel das ligações de hidrogênio, que às vezes foram vistas como cruciais para manter unidas as hélices do DNA, parece ter mais a ver com a classificação dos pares de bases, de modo que eles se liguem na sequência correta.

A descoberta é crucial para entender a relação do DNA com seu meio ambiente.

"As células querem proteger seu DNA e não expô-lo a ambientes hidrofóbicos, que às vezes podem conter moléculas prejudiciais", diz Bobo Feng, um dos pesquisadores por trás do estudo. "Mas, ao mesmo tempo, o DNA das células precisa se abrir para ser usado."

"Acreditamos que a célula mantém seu DNA em solução aquosa na maior parte do tempo, mas assim que uma célula quer fazer algo com seu DNA, como ler, copiar ou consertá-lo, ela expõe o DNA a um ambiente hidrofóbico."

A reprodução, por exemplo, envolve os pares de bases se dissolvendo um do outro e se abrindo. As enzimas então copiam ambos os lados da hélice para criar um novo DNA. Quando se trata de reparar DNA danificado, as áreas danificadas são submetidas a um ambiente hidrofóbico, para serem repostas. Uma proteína catalítica cria o ambiente hidrofóbico. Esse tipo de proteína é fundamental para todos os reparos de DNA, o que significa que pode ser a chave para o combate a muitas doenças graves.

A compreensão dessas proteínas pode render muitos novos insights sobre como poderíamos, por exemplo, combater bactérias resistentes ou, potencialmente, até mesmo curar o câncer. As bactérias usam uma proteína chamada RecA para reparar seu DNA, e os pesquisadores acreditam que seus resultados podem fornecer uma nova visão sobre como esse processo funciona - potencialmente oferecendo métodos para interrompê-lo e, assim, matar as bactérias.

Em células humanas, a proteína Rad51 repara DNA e corrige sequências de DNA mutantes, que de outra forma poderiam levar ao câncer.

"Para entender o câncer, precisamos entender como o DNA se repara. Para entender isso, primeiro precisamos entender o próprio DNA", diz Bobo Feng. "Até agora, não, porque acreditávamos que as ligações de hidrogênio eram o que o mantinham coeso. Agora, mostramos que, em vez disso, são as forças hidrofóbicas que estão por trás disso. Também mostramos que o DNA se comporta de maneira totalmente diferente em um ambiente hidrofóbico . Isso poderia nos ajudar a entender o DNA e como ele se repara. Ninguém colocou o DNA em um ambiente hidrofóbico como este e estudou como ele se comporta, então não é surpreendente que ninguém tenha descoberto isso até agora. "

Mais informações sobre os métodos que os pesquisadores usaram para mostrar como o DNA se liga

Os pesquisadores estudaram como o DNA se comporta em um ambiente que é mais hidrofóbico do que o normal, um método que eles foram os primeiros a experimentar.

Eles usaram a solução hidrofóbica de polietilenoglicol e, passo a passo, mudaram os arredores do DNA de um ambiente naturalmente hidrofílico para um hidrofóbico. O objetivo deles foi descobrir se existe um limite onde o DNA começa a perder sua estrutura, quando o DNA não tem um motivo para se ligar, porque o ambiente não é mais hidrofílico. Os pesquisadores observaram que quando a solução atingiu a fronteira entre hidrofílica e hidrofóbica, a forma espiral característica das moléculas de DNA começou a se desfazer.

Após uma inspeção mais detalhada, eles observaram que quando os pares de bases se separam (devido à influência externa ou simplesmente de movimentos aleatórios), buracos são formados na estrutura, permitindo que a água vaze. Como o DNA quer manter seu interior seco, ele se pressiona, com os pares de bases se juntando novamente para espremer a água. Em um ambiente hidrofóbico, essa água está faltando, então os orifícios permanecem no lugar.

Leia o artigo científico Catálise hidrofóbica e um papel biológico potencial do desempilhamento de DNA induzido por efeitos ambientais na revista Proceedings da National Academy of Sciences dos Estados Unidos da América (PNAS).


Declarações de ética

Interesses competitivos

T.-C.T., E.T., X.L., H.Y., X.Z. e T.K.L. entrou com um pedido de patente com base nas tecnologias de encapsulamento de hidrogel com o US Patent and Trademark Office. T.K.L. é cofundador da Senti Biosciences, Synlogic, Engine Biosciences, Tango Therapeutics, Corvium, BiomX, Eligo Biosciences, Bota.Bio, Avendesora e NE47Bio. T.K.L. também detém interesses financeiros em nest.bio, Armata, IndieBio, MedicusTek, Quark Biosciences, Personal Genomics, Thryve, Lexent Bio, MitoLab, Vulcan, Serotiny, Avendesora e Pulmobiotics.


Colocando em foco a defesa das bactérias e # 8217s

Ao tirar uma série de instantâneos de resolução quase atômica, os cientistas da Cornell University e da Harvard Medical School observaram passo a passo como as bactérias se defendem contra invasores externos, como o bacteriófago, um vírus que infecta bactérias.

O processo que observaram usa locais CRISPR (repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas), onde o DNA da célula pode ser cortado para inserir DNA adicional.

Os biólogos usam o CRISPR para experimentos de engenharia genética, mas as células podem ter desenvolvido o mecanismo como parte de um sistema de defesa. A célula usa esses locais para armazenar memórias moleculares de invasores para que eles possam ser erradicados seletivamente no próximo encontro.

“O sistema de imunidade do bug funciona tão eficientemente quanto o nosso, exceto que nosso sistema funciona no nível de reconhecimento de proteínas, enquanto o CRISPR funciona no nível de reconhecimento de ácido nucleico”, explicou Ailong Ke, professor de biologia molecular e genética.

No primeiro encontro, a bactéria insere um pouco do DNA de um invasor em seu próprio genoma no local CRISPR. Quando necessário, um transcrito de RNA do DNA armazenado, denominado RNA guia, pode ser montado com outras proteínas em um complexo denominado Cascade (CRISPR Associated Complex for Antiviral Defense). O sistema é tão eficiente e preciso que os pesquisadores pensaram em maneiras de reformulá-lo para aplicações de edição de genoma, para introduzir mudanças em localizações precisas do DNA. “Uma revolução CRISPR está varrendo a biologia enquanto falamos”, disse Ke.

Em pesquisas anteriores, Ke definiu a função dos complexos de proteína-RNA envolvidos no processo e usou as instalações de cristalografia de raios-X da Fonte Síncrotron de Alta Energia Cornell (CHESS) para determinar sua estrutura. Yibei Xiao, um pesquisador de pós-doutorado no laboratório de Ke, elaborou todo o processo de imunidade, passo a passo. “A próxima etapa é capturar instantâneos estruturais dessas etapas, para produzir um filme de alta definição do que está acontecendo”, disse Ke.

Ke colaborou com Maofu Liao, professor assistente de biologia celular na Harvard Medical School, que é especialista no uso de um microscópio crioeletrônico para determinar estruturas de alta resolução de macromoléculas congeladas em uma fina camada de gelo. Trabalhando com a bactéria Thermobifida fusca, usada na fermentação, o laboratório de Ke preparou amostras que representam estágios distintos da resposta imune. Liao e seu pesquisador de pós-doutorado Min Luo congelaram essas amostras e tiraram instantâneos de alta resolução em cada etapa. O estudo se concentrou em uma versão específica da defesa relacionada ao CRISPR, conhecida como Tipo I-E.

“Sabíamos aproximadamente como isso funcionava, mas sem as estruturas não tínhamos os detalhes”, disse Ke. "Uma imagem vale mais que mil palavras."

“Os cientistas levantaram a hipótese de que esses estados existiam, mas não tinham a prova visual de sua existência”, disse Luo. “Agora, ver realmente é acreditar.”

Eles viram como a bactéria monta o complexo Cascade - uma grande proteína que se parece com um cavalo-marinho sob o microscópio - com um pedaço de RNA guia anexado. Quando o guia encontra DNA viral, o complexo Cascade fornece um mecanismo para desenrolar a dupla hélice do DNA e entrar. O RNA bloqueia em seu DNA correspondente para formar um "R-loop" impenetrável que impede o DNA de funcionar. O processo também altera a conformação da proteína Cascade de uma forma que atrai uma enzima chamada Cas3, que fragmenta o DNA viral além do reparo. A enzima se move ao longo do DNA como se abrisse um zíper.

O sistema inclui várias camadas de detecção de erros para evitar mastigar seu próprio DNA, disseram os pesquisadores. “Descobrimos que essas etapas devem ocorrer em uma ordem precisa”, disse Luo. “Evolutivamente, esse mecanismo é muito rigoroso e tem redundância tripla, para garantir que esse complexo degrada apenas o DNA invasor.”

“O sistema Tipo I-E é um dos sistemas mais bem estudados em toda a pesquisa do CRISPR”, disse Xiao, “mas anteriormente a resolução do complexo era muito baixa, 8 angstrom, nós o levamos para perto da resolução atômica. Agora podemos falar sobre o processo com muita confiança. Nosso trabalho explica lindamente o mecanismo de como o Cascade pode reconhecer e abrir o DNA estranho. Esta é a primeira vez que vimos este sistema. Bioquimicamente é lindo, como um estudo no estilo de um livro didático. ”

As descobertas, publicadas em 29 de junho na revista Cell, fornecem dados estruturais que podem melhorar a eficiência e a precisão das operações biomédicas do CRISPR. Aspectos desse mecanismo de defesa - particularmente como ele busca seus alvos de DNA - não eram claros e levantaram preocupações sobre efeitos fora do alvo não intencionais e a segurança do uso do mecanismo CRISPR-Cas para o tratamento de doenças humanas.

“Para resolver os problemas de especificidade, precisamos entender cada etapa da formação do complexo CRISPR”, disse Liao.

“Para aplicar o CRISPR na medicina humana, devemos ter certeza de que o sistema não atinge acidentalmente os genes errados”, disse Ke. “Nosso argumento é que o sistema Tipo I é potencialmente mais preciso do que CRISPR-Cas9, porque verifica um trecho mais longo da sequência antes da ação, e o sistema divide a busca e degradação do alvo em duas etapas, com recursos de segurança integrados entre eles. ”

Até agora, o CRISPR tipo I oferece utilidade limitada para a edição de genes de precisão, mas pode ser usado como uma ferramenta para combater cepas de bactérias resistentes a antibióticos.

Ke e Xiao são co-autores de outro artigo na mesma edição da Cell, com Ilya Finkelstein, professor assistente de biociências moleculares na Universidade do Texas em Austin, para caracterizar como o Cascade procura alvos no nível de uma única molécula.

“Um herói não celebrado”, acrescentou Ke, “é o próprio inseto, Thermobifida fusca. As proteínas CRISPR dessa bactéria se comportam extremamente bem, o que possibilitou tudo. O falecido professor da Cornell, David Wilson, utilizou a bactéria para a produção de biocombustíveis e nos forneceu a cepa de graça. ”

Este trabalho é apoiado pelo National Institutes of Health. O CHESS é financiado pela National Science Foundation.


Usando Apêndices Parecidos com Arpão, Bactérias ‘Peixe’ para Novo DNA

Ver como os micróbios retiram novo material genético de seu ambiente pode ajudar na luta contra a resistência aos antibióticos.

Duas bactérias estão sentadas perto do DNA flutuante. De repente, uma bactéria dispara um longo apêndice, se agarra a um fragmento de DNA e se enrola em sua captura. Acontece rápido, mas é claro: esse organismo tinha acabado de ir pescar.

Biólogos da Universidade de Indiana recentemente capturaram essa manobra na câmera pela primeira vez.

Suas descobertas, publicadas segunda-feira na revista Nature Microbiology, verificam a existência de um mecanismo semelhante a um arpão que os cientistas vêm montando há décadas.

O trabalho também avança a compreensão de como as bactérias absorvem DNA de seu ambiente, o que é chamado de transformação natural. Esse processo é a chave para a disseminação da resistência aos antibióticos, o que torna as doenças bacterianas cada vez mais difíceis de tratar com medicamentos convencionais. A cada ano, estima-se que dois milhões de americanos sejam infectados por bactérias resistentes a antibióticos.

Os pesquisadores sabiam que as bactérias dependem de fibras chamadas pili para capturar DNA estranho. Mas os detalhes exatos permaneceram indefinidos porque os pelos - mais de 10.000 vezes mais finos que o cabelo humano - são muito difíceis de observar, disse Lori Burrows, professora de bioquímica e ciências biomédicas da Universidade McMaster em Ontário que não esteve envolvida no estudo.

“É legal realmente ver isso em ação”, disse ela.

We typically think of genes as passed down vertically, from parent to offspring. But there are also processes called horizontal gene transfer, in which DNA moves laterally between organisms that are not parent and child.

Natural transformation is one example, and it’s an important way in which bacteria, which typically reproduce asexually, introduce variation and new traits into their genetic code, said Ankur Dalia, an assistant professor of biology and an author of the new paper.

The process has mesmerized biologists since 1928, when a British bacteriologist named Frederick Griffith stumbled across it while searching for a pneumonia vaccine.

To his amazement, he discovered that if he injected a heat-killed, virulent strain of Streptococcus pneumoniae, followed by a live, nonvirulent strain, bacteria that were normally innocuous would somehow become pathogenic.

A “transforming principle” had to be at play, he declared.

Sixteen years later, scientists showed that the transforming principle was in fact a molecule called DNA, providing one of the first clues that DNA carried genetic material.

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When bacteria die, their DNA becomes up for grabs by other microbes. Often, this process is bad news for humans. Through natural transformation, bacteria can gain the ability to degrade compounds like pesticides, become better at infecting hosts and evolve antibiotic resistance.

In their study, Dr. Dalia and his colleagues used a custom fluorescent dying process created by Courtney Ellison, a graduate student, and Yves Brun, a biology professor, to visualize natural transformation in Vibrio cholera, the bacterium that causes cholera.

Ms. Ellison recounted dashing into Dr. Dalia’s lab and blurting “you need to follow me right now” after she became the first person to directly witness the behavior.

In the wild, V. cholerae engage in natural transformation when they land on a piece of chitin, a major ingredient in insect and crustacean shells, and a rich source of nutrients.

“It’s exactly the kind of environment other bacteria would be latching onto,” and therefore a good site for DNA swapping, Dr. Dalia said.

When the researchers induced this behavior in the lab, they were able to discern new details about how V. cholerae latch onto DNA at the tip of their pili, fold and thread the DNA through a tiny surface pore and then pull it into their bodies using a special ratcheting mechanism.

Pili in V. cholerae can stretch about as far as the length of the bacteria. The organisms make one or two pili a minute, extending and retracting the appendages with proteins that quickly build the pili up and then tear them back down.

The study is a reminder that even single-celled organisms can operate in sophisticated ways.

These bacteria are actually acting “like fishermen,” Ms. Ellison said.

Her team believes many aspects of this maneuver are shared among other microbes, though more studies are needed. Eventually, the work could lead to new strategies for fighting antibiotic resistance.


Bacteria Will Commit Suicide to Spare Their Colony

In nature, strains of bacteria usually grow in colonies, and together, they are tougher. The vast number of microbes in the world have to compete for resources, and the competition can be brutal. Bacteria often produce antibiotics that will kill other microbes, for example. While it was known that in extreme cases, microbes can opt to die, break open, and release toxic contents to battle other strains, researchers have now found that when bacterial colonies are engaged in warfare, microbes in a colony can commit mass simultaneous suicide, in which almost all cells die, to destroy their competitors. The findings have been reported in Current Biology.

"The sheer number of bacteria that died in these attacks was very surprising. But the study explains why they do this: cells engage in the suicidal behavior when they are about to die anyway from a competitor's toxin. This behavior represents a last gasp attack from dying cells, which allows them to mount a formidable counter-attack before they themselves perish," explained study co-author Dr. Elisa Granato of Oxford University's Departments of Zoology and Biochemistry.

With the possible exception of programmed cell death pathways, suicide doesn't typically serve a biological function that is critical to the survival of a species. This work, which used a commonly used research microbe, Escherichia coli, shows that bacteria can and will perform just such a mass action to conserve a few members. There are parallels in this behavior to social insects like ants, which will use similar strategies against invaders.

In this study, the researchers monitored bacterial colonies with three-dimensional, time-lapse fluorescence microscopy. The bacterial colonies were engineered to change color as the suicide happened. The behavior could then be seen as it moved through the front lines that were engaging with foes, and how many cells in the colony did the same thing.

"Bacteria, like E. coli, can be both deadly pathogens and protective symbionts that live inside us," said the study co-author Professor Kevin Foster. "Whether these bacteria win their wars, therefore, can be the difference between good health and a devastating disease. The study of bacteria warfare, therefore, might help us to both push back pathogens and promote so-called friendly bacteria."

This work may help scientists develop better probiotics that will encourage good health and immune function.


Assista o vídeo: Biology: Cell Structure I Nucleus Medical Media (Janeiro 2022).