Em formação

Formação de protoporfirinogênio (IX) na síntese de heme


Esta imagem mostra uma das etapas da síntese do heme. Nesta etapa, dois grupos de propanoato de coproporfirinogênio III são descarboxilados para formar o protoporfirinogênio IX. A enzima que catalisa essa etapa é uma oxidase. As enzimas oxidase catalisam a remoção de hidrogênio na presença de oxigênio para formar água ou peróxido de hidrogênio.

Então, uma molécula de água se formará nesta etapa? 2h+ virá dos dois grupos carboxilato e o oxigênio se combinará com ele para formar água. Uma molécula de água se formará dessa maneira?


Aparentemente, a enzima usa oxigênio molecular na reação e um dos produtos finais é a água.

Este esquema de reação é mais detalhado e presumivelmente preciso.

http://www.hmdb.ca/reactions/3063

Além disso, há também um conjunto de documentos detalhando a coproporfirinogênio oxidase que também estava no site, esperançosamente, vamos entrar em mais detalhes sobre a reação.

http://www.hmdb.ca/proteins/HMDBP00251


Formação de protoporfirinogênio (IX) na síntese de heme - Biologia

Heme é um anel de porfirina complexado com ferro ferroso e protoporfirina IX. Heme é um grupo protético essencial em proteínas que é necessário como um compartimento subcelular para realizar diversas funções biológicas, como hemoglobina e mioglobina. [1] Outras enzimas que usam heme como grupo protético incluem citocromos da cadeia de transporte de elétrons, catalase e óxido nítrico sintase. Os principais tecidos para a síntese do heme são a medula óssea pelos eritrócitos e o fígado pelos hepatócitos.

Fundamentos

A síntese de heme ocorre no citosol e a aquisição de heme nas mitocôndrias também ocorre por meio da absorção intestinal e do transporte intercelular. [2] Heme é um componente de diferentes estruturas biológicas principalmente, hemoglobina, outros incluem mioglobina, citocromos, catalases, heme peroxidase e óxido nítrico sintase endotelial. Existem diferentes formas de heme biológico. O tipo mais comum é o heme b, encontrado na hemoglobina e leva a um derivado de outros grupos heme. O heme a existe no citocromo ae o heme c no citocromo c, ambos estão envolvidos no processo de fosforilação oxidativa.

A sintase do ácido 5'-aminolevulínico (ALA-S) é a enzima regulada para a síntese do heme no fígado e nas células eritróides. Existem duas formas de ALA Synthase, ALAS1 e ALAS2. Todas as células expressam ALAS1, enquanto apenas o fígado e a medula óssea expressam ALAS2. & # 160O gene para ALAS2 está no cromossomo X.

Celular

A síntese de porfirinas é o processo que produz o heme. A síntese do heme ocorre parcialmente na mitocôndria e parcialmente no citosol. A biossíntese envolve uma via enzimática de oito etapas. & # 160A biossíntese do heme começa na mitocôndria com a condensação de succinil Co-A do ciclo do ácido cítrico e um aminoácido glicina. Eles se combinam para produzir um intermediário chave heme, ácido 5'-aminolevulínico (ALA) na mitocôndria catalisada pela enzima que requer fosfato de piridoxal (vitamina B6), ácido aminolevulínico sintase (ALAS). [3] Essa reação é a etapa limitadora da taxa no caminho. [4]

A molécula de ALA formada sai da mitocôndria para o citosol onde duas moléculas de ALA se condensam para produzir o composto do anel pirrol porfobilinogênio (PBG) catalisado por uma enzima que requer zinco, a enzima ALA desidratase (também chamada de porfobilinogênio sintase). A próxima etapa da via envolve a condensação de quatro moléculas de porfobilinogênio, alinhadas para formar o hidroximetilbilano linear (HMB), catalisado pela porfobilinogênio desaminase (PBG desaminase), também conhecida como hidroximetilbilano sintase. & # 160

O fechamento do HMB linear forma um anel pirrol D assimétrico denominado uroporfirinogênio III, catalisado pela uroporfirinogênio-III sintase. Esta etapa é vital, pois a formação incorreta do anel de porfirina leva à protoporfiria. O anel de porfirina III correto se forma e, em seguida, as cadeias laterais do uroporfirinogênio III são modificadas, catalisadas pela uroporfirinogênio descarboxilase para produzir coproporfirinogênio III.

Após sua síntese, o coproporfirinogênio III é transportado para a mitocôndria. O coproporfirinogênio III é então descarboxilado pela enzima coproporfirinogênio oxidase para formar o produto incolor protoporfirinogênio IX. & # 160

Finalmente, o protoporfirinogênio IX é convertido em protoporfirina IX usando protoporfirinogênio oxidase. & # 160 A reação final envolve a inserção de ferro ferroso na protoporfirina IX catalisada pela enzima ferroquelatase levando à formação de heme. [5]

Molecular

Heme é uma protoporfirina ferrosa IX - quatro anéis de pirrol ligados por meio de pontes de metenil. As cadeias laterais de heme b são metil, vinil, metil, propionil e anel assimétrico D: propionil, metil.

Função

Heme tem uma variedade de funções. Como cofator, permite o seguinte [1]:

  • Transporte de oxigênio na hemoglobina
  • Armazenamento em mioglobina
  • Um grupo protético & # 160 para enzimas do citocromo p450
  • Um reservatório de ferro & # 160
  • Lançadeira de elétrons de enzimas na cadeia de transporte de elétrons
  • Respiração celular
  • Transdução de sinal-heme regula a resposta antioxidante aos ritmos circadianos, processamento de microRNA e # 160
  • Diferenciação e proliferação celular

Mecanismo

Síntese heme em células eritróides:& # 160heme é sintetizado para incorporação na hemoglobina. Em eritrócitos imaturos (reticulócitos), o heme estimula a síntese de proteínas das cadeias de globina e a eritropoetina estimula o heme. O rim libera o hormônio eritropoetina em baixos níveis de oxigênio nos tecidos e estimula a síntese de hemácias e hemoglobina. O acúmulo de heme nas células eritróides é desejado, pois leva a uma maior síntese da cadeia de globina e é necessário na maturação dos eritroblastos. Quando os glóbulos vermelhos amadurecem, a síntese de heme e hemoglobina cessa. & # 160Além disso, o controle da biossíntese do heme nos eritrócitos é controlado pela disponibilidade de ferro intracelular.

Síntese de heme no fígado é altamente variável e rigidamente regulado, pois o heme fora de & # 160proteínas & # 160 causa danos aos hepatócitos em alta concentração. No fígado, o & # 160citocromo P450 (CYP 450) requer heme. O fígado contém a isoforma ALAS1, que é expressa na maioria das células. Os medicamentos aumentam a atividade do ALAS1, pois levam à síntese do CYP 450, que precisa do heme. A baixa concentração de heme intracelular estimula a síntese de ALAS1. A síntese do heme para quando o heme não é incorporado às proteínas e quando o heme e a hemina se acumulam.

Hemin diminui a síntese de ALA sintase 1 de três maneiras: Hemin reduz a síntese de ALAS1 mRNA, desestabiliza ALAS1 mRNA e inibe a importação da enzima ALAS1 do citosol para a mitocôndria.

Fisiopatologia

Um defeito ou mutação na sintase 2 do ácido 5 & rsquoaminolevulínico (ALAS2) leva a um distúrbio denominado anemia sideroblástica ligada ao X. Reduz a produção de protoporfirina e diminui o heme. No entanto, o ferro continua a entrar no eritroblasto & # 160, levando a um acúmulo na mitocôndria e, portanto, a uma manifestação da doença.

Durante a via biossintética, o hidroximetilbilano linear pode formar espontaneamente um anel de porfirina & ldquofaulty & rdquo quando não imediatamente usado como substrato para a síntese de uroporfirinogênio. Se a uroporfirinogênio III sintase for deficiente, o hidroximetilbilano se fecha espontaneamente e forma uma molécula diferente chamada uroporfirinogênio I. O uroporfirinogênio leva à formação do coproporfirinogênio I. Esta molécula não resulta na formação de heme. & # 160

Significado clínico

A síntese de heme é uma via bioquímica que requer uma série de etapas, substratos e enzimas. A deficiência de uma enzima ou substrato leva ao acúmulo de intermediários da síntese do heme no sangue, tecidos e urina, levando a um resultado clinicamente significativo de um grupo de doenças chamadas porfirias. As porfirias são hepáticas ou eritropoiéticas. Eles podem ser agudos ou crônicos, levar a disfunções neurológicas, distúrbios mentais ou fotossensibilidade. Os defeitos da síntese do heme após a formação de hidroximetilbilano levam à fotossensibilidade dos pacientes. Outros sintomas incluem uma mudança na cor da urina, dor abdominal, cólica abdominal, estado altamente agitado, taquicardia, problemas respiratórios, náuseas, confusão, fraqueza das extremidades inferiores. & # 160 & # 160

As porfirias são porfiria eritropoiética congênita congênita, porfiria cutânea tardia, coproporfiria hereditária.

Porfiria aguda intermitente: Isso ocorre devido a uma mutação na hidroximetilbilano sintase, que leva ao acúmulo de ALA e porfobilinogênio. & # 160 Não afeta os eritroblastos. A doença se apresenta como dor abdominal intensa, vômitos, constipação, distensão abdominal e alterações comportamentais (irritabilidade, insônia, instabilidade emocional), [6] hipertensão e taquicardia. Os resultados do laboratório mostram níveis elevados de porfobilinogênio urinário e a urina escurece com a exposição ao ar e à luz solar. Pacientes que apresentam porfiria aguda intermitente são não fotossensível.

Porfiria cutânea tardia: & # 160Essa variante é o tipo mais comum de porfiria. É devido à deficiência de & # 160a ou diminuição da atividade da uroporfirinogênio descarboxilase (UROD). Pode ser adquirida ou hereditária (autossômica dominante). & # 160A uroporfirina se acumula na urina. Os sintomas incluem fotossensibilidade, levando ao desenvolvimento de bolhas nas áreas expostas ao sol, hiperpigmentação e lesão hepática. O tratamento inclui evitar a luz solar, hidroxicloroquina e flebotomia.

Porfiria eritropoiética: Isso ocorre devido a uma deficiência de ferroquelatase, a enzima responsável pela formação final do heme na via de biossíntese, combinando protoporfirina IX e ferro ferroso. A deficiência leva ao acúmulo de protoporfirina IX nos eritrócitos. Os sintomas incluem dolorosa fotossensibilidade - inchaço e coceira em áreas expostas ao sol, às vezes disfunção hepática.

Envenenamento por chumbo: O chumbo interage com os cofatores de zinco para ALA desidratase e ferrochelatase levando à inibição dessas duas enzimas na via bioquímica biossintética do heme. Esta inibição leva principalmente ao acúmulo de ALA e alguma protoporfirina IX na urina. Os sintomas incluem dor abdominal, vômitos, fadiga, irritabilidade e deficiência de desenvolvimento em crianças.


1 resposta 1

Então, uma molécula de água se formará nesta etapa. 2H + virá dos dois grupos carboxílicos e o oxigênio se combinará com ele para formar água. A molécula de água se formará dessa maneira?

Em primeiro lugar, observe que há mais 4 átomos de hidrogênio no reagente do que no produto (um de cada grupo de ácido carboxílico e um onde cada ligação dupla se forma).

No entanto, em pH fisiológico, os dois prótons nos grupos carboxila não estarão realmente lá. A equação em questão também ignora os 4 elétrons transferidos.

Quanto aos outros dois prótons, um radical 5'-desoxiadenosil abstrai um átomo de hidrogênio (próton + elétron) de cada cadeia lateral de propionato.

Consulte a Enzima Coproporfirinogênio III Oxidase e as referências aí citadas para obter mais informações.


Oxidação de protoporfirinogênio, uma etapa na síntese de heme em nódulos de raiz de soja e rizóbios de vida livre.

Os extratos da fração bacteróide bruta de Bradyrhizobium japonicum cultivado simbioticamente foram muito mais ativos na oxidação do protoporfirinogênio em protoporfirina do que os extratos de células cultivadas em condições de vida livre, especialmente quando testados em ambientes contendo apenas traços de oxigênio. Isso se correlaciona com o maior conteúdo de heme dos nódulos microaerofílicos. Além disso, o alto nível de atividade oxidativa na fração bacteróide bruta foi associado a uma fração de membrana não caracterizada, provavelmente de origem vegetal, que era separável dos bacteróides por centrifugação em gradiente de Percoll.


Estruturas e mecanismos das enzimas biossintéticas heme

A biossíntese do heme pode ser dividida em três partes: (i) formação da molécula precursora ALA, (ii) formação do primeiro tetrapirrol uroporfirinogênio III cíclico e (iii) conversão do uroporfirinogênio III em heme.

Duas maneiras levam ao ácido 5-aminolevulínico

O ácido 5-aminolevulínico (ALA) é sintetizado na natureza por duas vias biossintéticas diferentes e não relacionadas. O primeiro, descoberto por Shemin, envolve a condensação de glicina e succinil-CoA pela sintase do ácido 5-aminolevulínico (ALAS) e ocorre em mamíferos, fungos e α-proteobactérias. Em plantas, arquéias e na maioria das bactérias, o curso alternativo, denominado “C5-pathway ”, constrói ALA a partir do glutamato ligado ao tRNA em duas etapas. O substrato inicial do C5-caminho, glutamil-tRNA, é fornecido pela glutamil-tRNA sintetase e é compartilhado entre heme e biossíntese de proteínas. Glutamil-tRNA redutase (GluTR) então converte glutamil-tRNA em uma reação dependente de NADPH no intermediário lábil glutamato-1-semialdeído que é então posteriormente transformado em ALA por glutamato-1-semialdeído-2,1-aminomutase (GSAM). 9

Caminho de Shemin

A sintase do ácido 5-aminolevulínico (ALAS EC 2.3.1.37) catalisa a condensação de glicina e succinil-CoA para produzir ALA. Durante esta reação CO2 e a coenzima A livre é lançada. O primeiro relatório sobre a incorporação de átomos de nitrogênio oriundos da glicina no heme foi publicado em 1945, por Shemin e Rittenberg. 10 A ingestão de glicina marcada com 15N durante um período de 3 dias levou à incorporação de 15N no próprio heme de Shemin. Outros estudos de incorporação usando acetato marcado radioativamente realizados pelos grupos Shemin e Neuberger levaram à identificação de succinil-CoA como a segunda fonte de átomos de carbono para a formação de heme em 1952. 11-13 Após a identificação de ALA como um potencial precursor para a biossíntese de heme , 14, 15 A atividade da ALA sintase (ALAS) em extratos celulares brutos foi simultaneamente descrita pelos grupos Shemin e Neuberger em 1958. 16-19 Desde esses primeiros estudos, o ALAS foi purificado de várias fontes eucarióticas e bacterianas e caracterizado bioquimicamente. 20 Enquanto geralmente há apenas uma isoforma de proteínas ALAS bacterianas, os mamíferos carregam duas isoformas ALAS diferentes, uma delas desempenhando uma função de manutenção (ALAS1) e a outra sustentando altos níveis de biossíntese de heme em eritrócitos (ALAS2). 21 Mutações na isoforma ALAS específica do eritroide humano, reduzindo sua atividade catalítica, são a causa da anemia sideroblástica ligada ao X que se manifesta no acúmulo de ferro na mitocôndria de eritroblastos. 22 Por outro lado, um nível de expressão extremamente alto de ALAS2 devido a alterações genéticas leva ao acúmulo de protoporfirina IX e causa protoporfiria dominante ligada ao X. 23 Única estrutura cristalina de ALAS, da bactéria fototrófica Rhodobacter capsulatus, foi elucidado em 2005. 24

Sintase do ácido 5-aminolevulínico

ALAS funciona como um homodímero e requer o cofator piridoxal 5'-fosfato (PLP) para a catálise. 25, 26 Dentro da família de enzimas dependentes de PLP, ALAS pertence à subfamília de α-oxoamina sintases que catalisam a condensação de um tioéster CoA de ácido carboxílico e pequenos aminoácidos com descarboxilação concomitante deste último. 27 O mecanismo de reação ALAS é incomum para uma enzima dependente de PLP, pois duas ligações α-carbono são clivadas durante o ciclo de reação. O conhecimento atual sobre o mecanismo de reação ALAS foi derivado de vários estudos usando substratos especificamente marcados e extensas investigações cinéticas usando técnicas de fluxo interrompido, em combinação com a estrutura cristalina disponível de ALAS de R. capsulatus. 28-34 Na forma ativa, o cofator PLP está covalentemente ligado a um resíduo de lisina do sítio ativo essencial por meio de uma aldimina interna. A catálise começa com a ligação da glicina ao sítio ativo e a formação de uma aldimina externa entre a glicina e o cofator PLP [Fig. 2 (A)]. Posteriormente, o pro-R o próton da glicina é removido pelo sítio ativo lisina, o succinil-CoA é ligado ao carbono α da glicina e a coenzima A é liberada levando a um intermediário adipato α-amino-β-ceto. A descarboxilação desse intermediário é alcançada por uma etapa de protonação para a qual um resíduo de histidina do local ativo atua como ácido geral [Fig. 2 (B)]. O intermediário enol formado está em equilíbrio com um intermediário quinonoide espectroscopicamente rastreável e com a aldimina externa ligada ao ALA após a protonação da posição C-5. Finalmente, o ALA é liberado e a aldimina interna restaurada. 35

Arquiteturas de sites ativos e etapas catalíticas de enzimas envolvidas na formação de ALA. A + B, ALAS C + D, GluTR E + F, GSAM. R: Site ativo do ALAS de R. capsulatus modelado a partir das estruturas ligadas a glicina e succinil-CoA mostrando a aldimina externa entre PLP e glicina em estreita proximidade com a posição de succinil-CoA CS1. B: Durante o ciclo de reação ALAS, a descarboxilação do intermediário α-amino-β-ceto adipato é promovida pela protonação mediada por His. C: site ativo do GluTR de M. kandleri com glutamicina ligada e a Cys (Ser) 48 cataliticamente essencial. D: Durante a catálise, Cys48 ataca nucleofilicamente o α-carboxilato ativado do glutamil-tRNA. E: Site ativo do GSAM de Synechococcus mostrando o inibidor gabaculina covalentemente ligado ao cofator PLP, resultando no estável m-carboxifenilpiridoxalamina fosfato (mCPP). F: O potencial intermediário de reação 4,5-diaminovalerato ligado covalentemente a PLP como uma aldimina externa.

As estruturas cristalinas de R. capsulatus A holoenzima ALAS, em sua forma livre, bem como em complexo com glicina e succinil-CoA, forneceram informações detalhadas sobre a arquitetura do local ativo [Fig. 2 (A)]. 24 Cada subunidade do homodímero ALAS fortemente interligado consiste em três domínios (Fig. 1). Os domínios catalíticos centrais de cada monômero abrigam as fendas do sítio ativo localizadas na interface da subunidade. Os bolsões do sítio ativo estão profundamente enterrados na estrutura dimérica do ALAS, excluindo a água da reação que ocorre. A glicina e o succinil-CoA podem entrar na bolsa do sítio ativo através de um canal estreito. O PLP é mantido precisamente em seu local de ligação por várias interações com os resíduos de aminoácidos circundantes. Na estrutura do complexo ALAS-glicina, o substrato glicina substitui o sítio ativo lisina, formando a aldimina externa com PLP. No entanto, a lisina permanece em uma posição adequada para abstração de prótons da glicina ligada a PLP. A estrutura do complexo ALAS-succinil-CoA revelou que a porção 3'-fosfato ADP do co-substrato esticado se liga a uma bolsa hidrofóbica na entrada do canal do sítio ativo na superfície da enzima e o grupo succinato carboxilato próximo ao PLP. Uma sobreposição de ambas as estruturas ligadas ao substrato revelou uma distância de -2,8 Å entre o Cα de PLP ligada à glicina e o CS1 de succinil-CoA sendo preparado para o ataque nucleofílico necessário para a formação da ligação C  C [Fig. 2 (A)]. Em todas as estruturas ligadas ao substrato, uma histidina, localizada diretamente acima do anel PLP, poderia atuar como um ácido promovendo a descarboxilação do intermediário adipato α-amino-β-ceto.

Por causa da alta conservação de sequência (49% de identidade) entre R. capsulatus e ALAS2 humano, a estrutura da enzima bacteriana pode ser usada como um modelo para o mapeamento e análise de mutações pontuais que causam anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA). Algumas das mutações XLSA estão afetando direta ou indiretamente o PLP ou a ligação do substrato. Por exemplo, Thr245 (Thr388 em ALAS2 humano) está envolvido na ligação de hidrogênio do grupo fosfato PLP. Quando este resíduo é substituído por serina, os pacientes sofrem de uma forma de XLSA que pode ser tratada com piridoxina suplementar. Em outra mutação XLSA, Arg517 (ALAS2 humana), que é crucial para o reconhecimento e a discriminação da glicina, é substituída por uma cisteína.

C5-Pathway

O segundo caminho que leva à formação do ALA não foi descoberto até a década de 1970. Naquela época, a via de Shemin estava bem estabelecida, no entanto, todas as tentativas de detectar a atividade ALAS em extratos de plantas verdes haviam falhado. Além disso, experimentos com tecidos sintetizadores de clorofila usando glicina marcada não resultaram no padrão de incorporação típico, como foi observado antes para a biossíntese de heme aviário. Em 1973, Beale e Castelfranco usaram vários compostos marcados com 14C para estudar a incorporação do marcador no ALA por cotilédones de pepino esverdeados. Eles observaram que os compostos metabolicamente relacionados glutamato, α-cetoglutarato e glutamina deram origem a ALA marcado com 14C. 36 Dois anos depois, descobriu-se que o esqueleto intacto de cinco carbonos do glutamato foi incorporado ao ALA. 37 Foi demonstrado apenas alguns anos depois que o glutamato foi transformado em ALA através do intermediário reduzido glutamato-1-semialdeído (GSA) pela detecção da atividade da GSA aminotransferase na cevada e a subsequente purificação e caracterização da enzima. 38, 39 A próxima grande descoberta a respeito do C5O caminho em meados da década de 1980 foi a descoberta de que uma porção do RNA estava envolvida na transformação do glutamato em ALA. 40 Finalmente, foi estabelecido que o metabólito inicial do C5-pathway é Glu-tRNA Glu que é reduzido por glutamil-tRNA redutase (GluTR, EC 1.2.1.70) para GSA que é então convertido em ALA por glutamato-1-semialdeído-2,1-aminomutase (GSAM, EC 5.4.3.8 ) 41, 42 Desde esses estudos iniciais, ambas as enzimas foram purificadas e caracterizadas a partir de várias fontes vegetais e bacterianas. 43-52 A primeira estrutura cristalina de GluTR foi resolvida para a enzima de Methanopyrus kandleri revelando uma estrutura em forma de V incomum. 53 estruturas de cristal para GSAM foram resolvidas para o Synechococcus (GSAMSyn) e o Thermosynechococcus elongatus enzima (GSAMTel). 54 , 55

Glutamil-tRNA redutase

GluTR funciona como uma proteína homodimérica dependente de NADPH. O grande substrato de tRNA é reconhecido por sua forma geral e o NADPH se liga à enzima com todos os seus principais determinantes. 53,56,57 Durante a catálise, um resíduo de cisteína altamente conservado localizado no sítio ativo da enzima atua como um nucleófilo atacando o grupo α-carboxila ativado do glutamato ligado ao tRNA [Fig. 2 (C, D)]. Isso resulta na liberação do tRNA e na formação de um intermediário tioéster ligado à enzima. 58 A transferência de hidreto mediada por NADPH para o intermediário tioéster leva à formação de glutamato-1-semialdeído, enquanto na ausência de NADPH a ligação tioéster é hidrolisada lentamente produzindo glutamato livre.

A estrutura cristalina de M. kandleri GluTR foi resolvido em complexo com o inibidor de antibiótico glutamicina e revelou uma estrutura em forma de V incomum para a proteína dimérica (Fig. 1). 53 Cada monômero consiste em três domínios distintos que estão dispostos ao longo de uma hélice α "espinhal" curva que liga os domínios II e III. O domínio N-terminal I está localizado na parte central da hélice espinhal e representa o domínio catalítico. O domínio II está localizado no topo da hélice estendida e adota uma dobra de ligação de nucleotídeo clássica contendo motivos βαβ característicos e uma alça rica em glicina conservada. O domínio de dimerização III está localizado na extremidade C-terminal da hélice espinhal e, juntamente com o domínio correspondente do segundo monômero, forma um feixe incomum de seis hélices. A glutamicina se ligou a uma bolsa profunda do domínio catalítico. Vários resíduos de aminoácidos altamente conservados mantêm especificamente o inibidor em sua posição. O grupo γ-carboxilato de glutamicina é especificamente reconhecido por uma ponte de sal bidentada com uma arginina e duas ligações de hidrogênio adicionais. Tanto o grupo inibidor α-amino quanto o grupo amida da glutamicina estão envolvidos em ligações de hidrogênio com a enzima. A análise mutacional desses resíduos do sítio ativo e a caracterização cinética das variantes enzimáticas revelaram sua importância funcional. 57 Durante a catálise, Cys48 ataca nucleofilicamente o α-carboxilato ativado do glutamil-tRNA. Na estrutura cristalina do GluTR, Cys48 (substituída por uma serina por razões técnicas) está localizada nas proximidades (3,9 Å) do carbono α-carbonil da glutamicina. O cofator NADPH foi modelado no domínio de ligação de nucleotídeo da enzima, que foi observado ser ligeiramente comprimido em comparação com outros domínios de ligação de NADPH. A partir desse modelo, concluiu-se que a conformação GluTR observada provavelmente representava um estado aberto e pré-ativo da enzima, uma vez que o NADPH estava a ∼21 Å de distância da bolsa de ligação ao glutamato. Foi sugerido que, após a ligação de glutamil-tRNA, uma inclinação do domínio II em direção ao domínio I com uma abertura concomitante da bolsa de ligação de nucleotídeo poderia ser induzida. O autêntico substrato glutamil-tRNA também foi modelado na estrutura GluTR revelando uma notável complementaridade de superfície entre a enzima e seu substrato incomum. A identificação funcional de elementos de identidade tRNA Glu para reconhecimento GluTR mostrou a importância da estrutura geral única da molécula de tRNA. 56

Glutamato-1-semialdeído-2,1-aminomutase

GSAM pertence à família α de enzimas dependentes de piridoxal 5'-fosfato (PLP) e pode ser classificado estrutural e mecanicamente como uma aminotransferase. No entanto, em contraste com outras aminotransferases GSAM funciona como aminomutase agindo em uma única molécula de substrato. Duas rotas mecanísticas alternativas são concebíveis para a catálise GSAM. A reação começa com a enzima ligada piridoxamina 5'-fosfato (PMP) ou PLP e prossegue através dos intermediários 4,5-diaminovalerato (DAVA) e PLP ou 4,5-dioxovalerato (DOVA) e PMP, respectivamente. 59-61 Todas as proteínas GSAM estudadas até agora são capazes de catalisar ambas as reações. 51, 62 No entanto, o primeiro mecanismo foi considerado cineticamente preferido e, portanto, o DAVA foi proposto como o verdadeiro intermediário da reação durante a catálise GSAM. 63-65 GSAM atua como um homodímero funcional, conforme confirmado por cristalografia de raios-X (Fig. 1). Cada monômero da enzima consiste em três domínios. Os grandes domínios centrais abrigam os sites ativos que estão localizados na interface do dímero. Para o GSAMSyn estrutura um homodímero assimétrico foi observado em que uma subunidade continha o cofator em sua forma PMP enquanto a segunda subunidade continha PLP covalentemente ligado ao resíduo de lisina do sítio ativo. Devido à falta de ordem para cerca de 30 resíduos de aminoácidos, a subunidade contendo PLP foi descrita para adotar uma conformação "aberta". Em contraste, a mesma região foi bem ordenada na subunidade de ligação de PMP e cobriu o sítio ativo levando a uma conformação "fechada". Em contraste com essas observações, um homodímero simétrico foi observado para o GSAMTel estrutura na qual ambas as subunidades foram observadas para adotar a forma ligada a PLP "aberta" com a região desordenada cobrindo o sítio ativo. O grupo fosfato PLP é reconhecido por meio de ligações de hidrogênio aos resíduos de aminoácidos circundantes e uma molécula de água. O anel de piridínio PLP é imprensado entre um resíduo de valina e tirosina. Em ambas as estruturas GSAM, observou-se uma arginina altamente conservada posicionada idealmente para ligar o grupo carboxilato do substrato GSA. Em um estudo recente, observou-se que o inibidor de suicídio gabaculina se ligava covalentemente ao cofator PLP, resultando em um mforma de fosfato de -carboxifenilpiridoxalamina (mCPP). 66 A estrutura do complexo inibidor de GSAM revelou que o cofator gira ~ 15 ° para longe do resíduo de lisina do sítio ativo em comparação com a forma da enzima ligada a PLP. Além disso, o grupo carboxilato de gabaculina forma ligações de hidrogênio com a cadeia lateral de uma serina de sítio ativo e interage com uma tirosina próxima e a arginina conservada por meio de moléculas de água ordenadas [Fig. 2 (E, F)].

O uroporfirinogênio III é formado a partir do ALA em três etapas enzimáticas consecutivas

O uroporfirinogênio III (UROGEN) representa o primeiro intermediário cíclico da biossíntese de tetrapirrol e, ao mesmo tempo, o primeiro ponto de ramificação principal para as rotas divergentes que levam à formação de diferentes classes de tetrapirróis. 5 Este importante intermediário é construído a partir de oito moléculas de ALA em três etapas enzimáticas consecutivas. Primeiro, duas moléculas de ALA são condensadas assimetricamente pela enzima porfobilinogênio sintase (PBGS, EC 4.2.1.24, também conhecido como ALA desidratase) para produzir o derivado de pirrole PBG. Em seguida, quatro moléculas de PBG são ligadas entre si de forma linear pela enzima porfobilinogênio desaminase (PBGD, EC 2.5.1.61, também chamada de hidroximetilbilano sintase), produzindo o tetrapirrol linear pré-uroporfirinogênio (1-hidroximetilbilano). Finalmente, o UROGEN é formado a partir do pré-uroporfirinogênio pela ação da enzima uroporfirinogênio III sintase (UROS, EC 4.2.1.75). O precursor de heme PBG foi detectado pela primeira vez na urina de um paciente com porfiria aguda em 1931. 67 Pouco depois de seu isolamento e determinação da estrutura em 1952, 68, 69 foi demonstrado que PBG serve como um precursor eficaz para a formação de heme nas hemácias aviárias. 70 Levantou-se a hipótese de que uma etapa inicial durante a biossíntese do heme poderia ser a condensação de duas moléculas de ALA em PBG 14, 15 e, finalmente, as primeiras purificações e caracterizações de proteínas de PBGS de diferentes fontes em meados da década de 1950 comprovaram essa proposta. 71, 72 Quase ao mesmo tempo, Bogorad e Granick descobriram que a conversão de PBG em uroporfirina III exigia a ação cooperativa de duas enzimas e, posteriormente, essas foram identificadas como PBGD e UROS. 73, 74 No início desses estudos iniciais de biossíntese do heme, acreditava-se que as porfirinas uroporfirina III, coproporfirina III e protoporfirina IX eram intermediários biossintéticos. No entanto, em meados da década de 1950, foi estabelecido que as formas reduzidas dessas porfirinas, os “porfirinógenos”, são os verdadeiros intermediários durante a biossíntese do heme. 75 Desde esses estudos iniciais, as proteínas PBGS, PBGD e UROS foram purificadas de muitas fontes eucarióticas e procarióticas diferentes e caracterizadas bioquimicamente. 76 Estruturas de cristal de PBGS foram resolvidas muito mais tarde para as enzimas de levedura, E. coli e Pseudomonas aeruginosa e Clorobium vibrioforme com muitos deles contendo inibidores ou intermediários de reação. 77-80 Estruturas para PBGD estão disponíveis para o E. coli e proteínas humanas. 81-83 A estrutura do UROS humano foi elucidada em 2001, seguida pela Thermus thermophilus estrutura enzimática em complexo com UROGÊNIO. 84, 85

Porfobilinogênio sintase

As sintases de porfobilinogênio geralmente funcionam como homooctâmeros, com exceção da enzima hexamérica de Rhodobacter capsulatus. 86 Apesar do alto grau de similaridade da sequência de aminoácidos entre PBGSs de diferentes organismos, eles são divididos em subgrupos de acordo com sua dependência de metais. PBGS humano e de levedura contêm dois íons zinco, um deles desempenhando um papel na catálise, que são coordenados por resíduos de cisteína altamente conservados. E. coli PBGS também contém o sítio ativo de zinco e um íon de magnésio adicional. P. aeruginosa PBGS não requer nenhum zinco, mas contém íons de magnésio em um local alostérico e cátions monovalentes no local ativo. Finalmente, foi relatado que algumas proteínas PBGS são independentes de metal. 86 Em uma série de estudos bioquímicos e estruturais de PBGS usando vários análogos de substrato e inibidores, o mecanismo enzimático foi elucidado. 87-96 Na primeira etapa, a molécula de ALA que forma o grupo propionato de PBG (ALA do lado P) se liga a um resíduo de lisina altamente conservado dentro do chamado "sítio P" da enzima por meio da formação de base de Schiff. Isto é seguido pela ligação da segunda molécula de ALA (ALA do lado A) dando origem ao grupo acetato de PBG ao "sítio A", também covalentemente ligado a outro resíduo de lisina do sítio ativo estritamente conservado [Fig. 3 (A, B)]. Esta segunda base de Schiff no local A então sofre transformação em uma enamina como um pré-requisito para a próxima etapa catalítica. Em uma reação de adição de aldole, o átomo C3 do ALA do lado A ataca o C4 do ALA do lado P, o que resulta na formação da ligação C  C entre as duas moléculas de ALA. Em seguida, o grupo amino do ALA do lado P ataca a base de Schiff no átomo C4 do ALA do lado A, o que leva à formação da ligação C  N e à liberação da lisina no local A. A lise da ligação restante entre a lisina do local P e o intermediário da reação é desencadeada pela protonação do primeiro e, possivelmente, por alterações conformacionais da enzima. Finalmente, a abstração de prótons leva à aromatização e liberação de PBG.

Arquiteturas de sites ativos e etapas catalíticas de enzimas envolvidas na formação do uroporfirinogênio III. A + B, PBGS C + D, PBGD E + F, UROS. R: Site ativo de P. aeruginosa PBGS com inibidor ligado ao ácido 5-fluorolevulínico (5F-LA). B: No início do ciclo de reação de PBGS, ambas as moléculas de ALA são covalentemente ligadas à enzima por meio de bases de Schiff para conservar resíduos de lisina. C: Sítio ativo de PBGD humano mostrando o cofator dipirrometano único (DPM) covalentemente ligado a um resíduo de cisteína invariante. D: A oligomerização de moléculas de PBG prossegue por meio de intermediários azafulvenos desaminados. E: site ativo de T. thermophilus UROS com uroporfirinogênio III ligado (UROGEN) mostrando uma conformação enrugada “dois para cima, dois para baixo” do produto da reação. F: A desidratação do pré-uroporfirinogênio resulta no primeiro intermediário azafulvene que reage posteriormente para formar um intermediário de pirrolenina espirocíclico, conforme indicado pelas setas.

As estruturas cristalinas da levedura, P. aeruginosa, e E. coli PBGS revelou que as enzimas octaméricas são compostas por quatro dímeros que estão dispostos em torno de um eixo central quádruplo. Cada monômero adota a clássica dobra do cilindro TIM com os sítios ativos localizados nas extremidades do terminal C do cilindro β. Os locais ativos são cobertos por um circuito flexível e, portanto, protegidos do meio circundante. Os monômeros PBGS contêm um “braço N-terminal” que envolve seu parceiro dimérico. Recentemente, este “abraço” dos monômeros foi observado como importante para a formação da estrutura quaternária octamérica funcional de PBGS, uma vez que PBGS humano com um braço N-terminal destacado só foi capaz de formar PBGS hexamérico com baixa atividade catalítica. 97 Na estrutura cristalina de P. aeruginosa PBGS em complexo com o inibidor de ácido 5-fluorolevulínico (5F-LA) observou-se que ambas as moléculas de 5F-LA se ligavam covalentemente aos resíduos de lisina dos locais A e P, respectivamente [Fig. 3 (A)]. 93 Além disso, os inibidores são precisamente posicionados no local P e A, respectivamente, por meio de ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas. No geral, os dois resíduos de lisina do local ativo com as moléculas inibidoras ligadas covalentemente são orientados aproximadamente paralelos um ao outro dando origem a duas estruturas em forma de T empilhadas. Uma comparação das conformações 5F-LA em torno de seus átomos C3 implica que a formação de enamina é facilitada para a molécula de inibidor do local A, sugerindo que a formação da ligação C  C através da condensação aldole ocorre antes da formação da ligação C  N.

Em humanos, existem três distúrbios distintos devido à diminuição dos níveis de atividade de PBGS, dos quais apenas um é causado por mutações no gene PBGS. A porfiria PBGS é uma doença autossômica recessiva muito rara devido a mutações no gene PBGS e se manifesta com acúmulo e excreção urinária de ALA e ataques neuroviscerais agudos. Nos casos de tirosinemia hepatorrenal, um defeito genético que afeta a última etapa do catabolismo da tirosina leva ao acúmulo de succinilacetona, que é um inibidor potente de PBGS. Finalmente, o envenenamento por chumbo também leva à inibição de PBGS devido à substituição dos íons de zinco cataliticamente essenciais de PBGS humano pelo metal tóxico. 3 PBGS bacteriano fornece um alvo para terapia antibiótica, conforme revelado pela recente estrutura de P. aeruginosa PBGS em complexo com o antibiótico alaremicina. 98

Porfobilinogênio desaminase

Foi descoberto por volta de 1980 em uma série de estudos usando PBG marcado, que primeiro um tetrapirrol linear é formado seguido pelo fechamento do anel com rearranjo do anel D. 99, 100 Nessa época também foi observado que a oligomerização do PBG começa com o anel A seguido pelos anéis B, C e D. 101, 102 Finalmente, 1-hidroximetilbilano (pré-uroporfirinogênio) foi identificado pelos grupos de Scott e Battersby como o produto da reação da enzima agora conhecida como porfobilinogênio desaminase. 103-105 Outro grande progresso para a compreensão da proteína PBGD foi a descoberta por Jordan e Warren e o grupo de Battersby de que a enzima contém um cofator dipirrometano único covalentemente ligado que consiste em duas moléculas de PBG ligadas [Fig. 3 (C, D)]. 106-108 Este cofator serve como um iniciador para a oligomerização de outras quatro moléculas de PBG resultando na formação de um hexapirrol linear ligado à proteína. A partir desse precursor, o pré-uroporfirinogênio tetrapirrol linear é então clivado, deixando para trás a enzima livre com seu cofator dipirrometano. 109 Durante a catálise, um resíduo de aspartato altamente conservado desempenha um papel importante, provavelmente auxiliando na desaminação de moléculas de PBG de entrada. 81, 110 O intermediário azafulveno reativo formado pode então reagir com o oligopirrol ligado à proteína [Fig. 3 (D)]. Embora ainda não esteja claro como exatamente a enzima lida com a cadeia crescente de oligopirrol durante a catálise, vários resíduos de arginina conservados parecem estar envolvidos no posicionamento correto do cofator dipirrometano e das moléculas de PBG de entrada. Além disso, foi observado que a proteína sofre alterações conformacionais durante a catálise que podem ajudar a enzima a "puxar" o oligopirrol através do sítio ativo ou, alternativamente, sendo causada pela reorganização do oligopirrol conforme ele é formado. 111 Mutações no PBGD humano podem causar porfiria aguda intermitente (AIP), um distúrbio autossômico dominante hereditário que se manifesta com ataques de dor abdominal e sintomas neurológicos acompanhados por níveis elevados de ALA e PBG na urina dos pacientes.

As estruturas cristalinas de E. coli e a PBGD humana revelou uma proteína monomérica consistindo em três domínios α / β de tamanho igual com um alto grau de flexibilidade em termos de movimentos de domínio. 81-83 O domínio N-terminal I e ​​o domínio central II adotam uma dobra semelhante às transferrinas e algumas proteínas de ligação periplasmáticas bacterianas.O domínio III consiste em uma folha β antiparalela de três fitas decorada em um lado por três hélices α e interage com os domínios I e II. A grande fenda no sítio ativo está localizada na interface entre os domínios I e II e é predominantemente carregada positivamente. O cofator dipirrometano é covalentemente ligado à enzima por meio de uma ligação tioéter a uma cisteína conservada que reside em uma alça do domínio III. O cofator é posicionado no sítio ativo por várias interações iônicas entre os grupos carboxilato de suas cadeias laterais de acetato e propionato em resíduos de arginina e lisina conservados. O aspartato cataliticamente essencial forma ligações de hidrogênio a ambos os grupos NH pirrole do cofator [Fig. 3 (C)]. O sítio ativo proposto de PBGD foi ocupado por um íon acetato no E. coli Estrutura PBGD e um íon sulfato na estrutura PBGD humana. O íon sulfato foi localizado na distância da ligação de hidrogênio a uma arginina e uma serina que foram propostas para estar envolvidas na ligação do substrato. De fato, uma mutação envolvendo essa arginina resulta em AIP em humanos. Outras mutações que levam a AIP envolvem resíduos de arginina envolvidos na montagem e posicionamento do cofator ou ligação do substrato. No total, existem mais de 100 mutações conhecidas que causam AIP em humanos devido a formas menos estáveis ​​ou truncadas da proteína ou defeitos no cofator e ligação ao substrato.

Uroporfirinogênio III sintase

UROS catalisa a ciclização do pré-uroporfirinogênio tetrapirrol linear em uroporfirinogênio III sob inversão do anel D. Embora a primeira purificação de uma proteína UROS remonta a 1957, levou mais 20 anos até que o substrato real, pré-uroporfirinogênio, desta enzima foi identificado. No entanto, em 1961, um mecanismo para a formação de UROGEN foi proposto por Mathewson e Corwin que resistiu ao teste do tempo. 112 Estudos usando PBG marcado com 13 C e espectroscopia de NMR, investigações empregando inibidores espirocíclicos sintéticos, bem como o aprisionamento de um intermediário de reação azafulvene contribuíram para a compreensão atual do mecanismo catalítico UROS. 113-115 Nas primeiras etapas da catálise, o grupo hidroxila no anel A do pré-uroporfirinogênio é perdido como uma molécula de água, resultando na formação do primeiro intermediário azafulveno [Fig. 3 (F)]. Em seguida, o intermediário de pirrolenina espirocíclico é formado pela reação do azafulveno com a posição α substituída do anel D. A quebra da ligação entre os anéis C e D leva à formação do segundo intermediário azafulveno no anel C. Nas etapas finais da catálise, o A enzima deve orientar o pirrol do anel D de tal forma que o azafulvene do anel C possa reagir com sua posição α livre. Finalmente, a desprotonação e os rearranjos das ligações levam à formação de UROGEN.

Além da estrutura cristalina do UROS humano, a estrutura do T. thermophilus UROS em complexo com seu produto de reação UROGEN foi obtido apenas recentemente. 84, 85 Apesar de um nível bastante baixo de identidade de sequência de aminoácidos de apenas 14% entre humanos e T. thermophilus UROS a dobra geral das enzimas dos dois organismos diferentes foi encontrada conservada. UROS é uma proteína monomérica que consiste em dois domínios α / β conectados por um ligante flexível de duas fitas (Fig. 1). O domínio I pertence à família de pregas do tipo flavodoxina e o domínio II adota uma dobra do tipo DNA glicosilase. Na estrutura UROS humana, o ligante que conecta os dois domínios adota uma conformação β-ladder antiparalela. Em contraste, T. thermophilus O UROS cristalizou em várias conformações diferentes nas quais o ligante é muito menos ordenado do que na estrutura do UROS humano. A notável matriz observada de diferentes orientações de domínio-domínio sugere que o ligante é altamente móvel em solução na ausência do substrato. 85 Na estrutura cristalina do T. thermophilus Complexo UROS-produto foi observado que o uroporfirinogênio III se liga na interface entre os domínios I e II e que os dois domínios se aproximam mais do que nas diferentes estruturas apo-UROS. O porfirinogênio adota uma conformação enrugada "dois para cima, dois para baixo" na qual os grupos NH do pirrole dos anéis A e C apontam em uma direção e os dos anéis B e D na direção oposta [Fig. 3 (E)]. Apenas algumas interações hidrofóbicas entre a enzima e os anéis pirrol D e B foram observadas. Os grupos pirrol NH não interagem diretamente com a enzima, mas formam ligações de hidrogênio com moléculas de água ordenadas, enquanto os grupos carboxilato dos substituintes acetato e propionato formam ligações de hidrogênio com grupos NH da cadeia principal. A maioria dessas ligações de hidrogênio envolve as cadeias laterais de acetato e propionato dos anéis A e B, que são posicionados com precisão em uma conformação restrita dentro da forma "fechada" do sítio ativo. Isto é consistente com a observação de que a ligação ao substrato é abolida para porfirinogênios nos quais os substituintes do anel A ou B estão alterados. 116, 117 Para os substituintes do anel C, há ligações de hidrogênio entre o grupo carboxilato de propionato e os grupos NH da cadeia principal, ao passo que a cadeia lateral de acetato não interage diretamente com a proteína. Da mesma forma, os grupos carboxilato das cadeias laterais do anel D não interagem com a enzima facilitando a virada do anel durante a reação.

Mutações em UROS humanos causam porfiria eritropoiética congênita (CEP), que é caracterizada pelo acúmulo de uroporfirina I na urina dos pacientes e fotossensibilidade severa. A maioria das mutações CEP conhecidas reduz a atividade da enzima, reduzindo sua estabilidade, interrompendo a integridade estrutural geral. Por muito tempo, a identificação do UROS vegetal falhou devido ao baixo grau de conservação da sequência de aminoácidos. Recentemente, o Arabidopsis thaliana A enzima foi identificada e caracterizada como um UROS típico. 118

A conversão de uroporfirinogênio III em heme requer quatro etapas enzimáticas

Durante a conversão do uroporfirinogênio III em heme, as cadeias laterais do macrociclo são modificadas, o sistema de anéis tetrapirrol é oxidado e, finalmente, o ferro é inserido. Uroporfirinogênio III descarboxilase (UROD, EC 4.1.1.37) catalisa a descarboxilação gradual das quatro cadeias de ácido acético de UROGEN para produzir os grupos metil correspondentes de coproporfirinogênio III. COPROGEN é então oxidativamente descarboxilado produzindo protoporfirinogênio IX pela ação de coproporfirinogênio III oxidase dependente de oxigênio (CPO, EC 1.3.3.3) ou CPO independente de oxigênio que deve ser denominado coproporfirinogênio III desidrogenase (CPDH, EC 1.3.99.22). Na penúltima etapa da biossíntese do heme, o PROTOGÊNIO é oxidado a PROTO por protoporfirinogênio IX oxidase dependente ou independente de oxigênio (PPO, EC 1.3.3.4) antes de, finalmente, o ferro ser inserido no macrociclo pela ferrocelatase (FC, EC 4.99.1.1 ) rendendo heme. 119 As formas oxidadas dos intermediários da via, uroporfirina III, coproporfirina III e protoporfirina IX, são encontradas em quantidades incomuns e elevadas na urina de pacientes que sofrem de diferentes porfirias. As primeiras descrições de tais acumulações de porfirina datam de meados do século 19 e foram seguidas pelo isolamento e caracterização dessas porfirinas, fornecendo as primeiras dicas para intermediários biossintéticos heme. As enzimas UROD, CPO e CPDH, PPO e FC foram subsequentemente purificadas de várias fontes eucarióticas e procarióticas e os genes correspondentes foram clonados e sequenciados. 120-122 Estruturas de cristal estão disponíveis para UROD humano em suas formas ligadas a apo e COPROGEN, bem como para Nicotiana tabacum e Bacillus subtilis UROD. 123-126 CPO foi cristalizado e as estruturas resolvidas para a levedura e enzimas humanas. 127, 128 A estrutura de E. coli O CPDH foi relatado em 2003. 129 A primeira estrutura de PPO foi obtida para a proteína do tabaco seguida por estruturas de Myxococcus xanthus e B. subtilis PPOs. 130-132 A ferrochelatase foi estruturalmente caracterizada para o solúvel em água B. subtilis a proteína, a enzima humana ligada à membrana e o FC de levedura seguido por várias estruturas de variantes de FC e de FC em complexo com substrato e inibidores. 133-136

Uroporfirinogênio III descarboxilase

A atividade UROD foi descrita pela primeira vez em 1958 por Mauzerall e Granick. 137 Em 1976, foi proposto que as quatro reações de descarboxilação ocorressem sequencialmente no sentido horário, começando com a cadeia lateral de acetato no anel D seguida por aquelas nos anéis A, B e C. 138 Isso foi comprovado por estudos em que diferentes parcialmente descarboxilados intermediários que se acumulam na urina de pacientes que sofrem de porfiria cutânea tardia (PCT) como resultado da atividade diminuída de UROD foram analisados. 139 PCT é a forma mais comum de porfiria em humanos que ocorre com uma frequência estimada de 1 em 20.000 caucasianos. As proteínas UROD foram purificadas de muitas espécies, incluindo bactérias, leveduras e humanos. 140 Foi descoberto que UROD aceita uma grande variedade de substratos diferentes, incluindo uroporfirinogênios I e III, bem como todos os 14 intermediários possíveis entre UROGEN e COPROGEN. 141 Consequentemente, em altas concentrações de substrato, as quatro reações de descarboxilação ocorrem aleatoriamente. 142 UROD representa uma descarboxilase incomum, pois não depende de nenhum grupo protético ou cofator. Em um estudo recente, a reação de descarboxilação catalisada por UROD foi descrita como uma “referência para a proficiência catalítica de enzimas” devido ao enorme aumento da taxa de descarboxilação do substrato por esta enzima. 143 As estruturas cristalinas resolvidas para proteínas UROD revelaram uma enzima dimérica na qual as duas subunidades de domínio único são orientadas cabeça a cabeça com as fendas do sítio ativo voltadas uma para a outra na interface do dímero (Fig. 1). Este arranjo dos dois monômeros resulta em um grande sítio ativo bem protegido do solvente circundante. Com base nessas observações estruturais, foram apresentados dois cenários possíveis para a descarboxilação sequencial das quatro cadeias laterais de acetato de UROGEN. Em uma dessas propostas, a cadeia lateral de acetato do anel D é primeiro descarboxilada no sítio ativo de um monômero, o intermediário resultante então passado para o sítio ativo do outro monômero onde as três reações de descarboxilação restantes nos anéis A, B e C ocorre, tornando supérflua a rotação de 180 ° do substrato. 125 No entanto, recentemente foi mostrado usando um construto UROD de cadeia única dimérico e suas variantes, que o transporte de substrato entre os sítios ativos de UROD não é necessário para gerar COPROGEN, 144 sugerindo uma reorientação do substrato em apenas 90 ° para cada descarboxilação que está de acordo com a estrutura cristalina do UROD humano em complexo com o seu produto de reação COPROGEN ligado em uma conformação em forma de cúpula. 124 Esta conformação colocou os quatro grupos NH centrais do tetrapirrol na distância da ligação de hidrogênio a um resíduo de aspartato altamente conservado sendo proposto para estar envolvido na ligação do substrato e na catálise [Fig. 4 (A)]. De acordo com este mecanismo, o anel de pirrole do substrato é primeiro protonado na posição α adjacente ao átomo C que carrega a cadeia lateral de acetato. Esta protonação é promovida pelo resíduo de aspartato, estabilizando o intermediário de reação carregado positivamente e, possivelmente, agindo como o ácido conjugado doando diretamente o próton necessário [Fig. 4 (B)]. 143 A descarboxilação da cadeia lateral de acetato produz outro intermediário de reação que deve ser protonado no carbono de metileno e desprotonado no átomo α-C para produzir o produto da reação. Foi sugerido que um resíduo de arginina altamente conservado dentro do sítio ativo poderia estar envolvido na etapa de protonação final. 143 Após a reorientação do substrato em 90 °, a próxima descarboxilação ocorre no mesmo sítio ativo seguindo a mesma estratégia mecanística.

Arquiteturas de sites ativos e etapas catalíticas de enzimas envolvidas na formação do protoporfirinogênio IX. A + B, UROD C + D, CPO E + F, CPDH. A: Sítio ativo de UROD humano com coproporfirinogênio III ligado (COPROGEN) em uma conformação em forma de cúpula mostrando o aspartato essencial cataliticamente na distância de ligação de hidrogênio aos grupos NH do pirrole. B: O resíduo de aspartato estabiliza o intermediário de reação protonado com carga positiva. C: Sítio ativo do CPO humano com citrato ligado mostrando vários resíduos de arginina possivelmente envolvidos na ligação do substrato e o aspartato essencial cataliticamente. D: Durante a catálise, um ânion peróxido de pirrol é formado, o qual ainda reage via abstração de prótons através do peróxido para formar um intermediário contendo uma ligação dupla exocíclica. E: site ativo de E. coli CPDH mostrando o cluster cataliticamente essencial [4Fe-4S] e as duas moléculas de SAM ligadas. F: Durante as etapas iniciais da reação, o aglomerado reduzido de ferro-enxofre transfere um elétron para o SAM, que é, assim, clivado em metionina e um radical 5'-desoxiadenosil. Este radical, então, abstrai um átomo de hidrogênio da cadeia lateral do propionato do substrato, resultando na formação de 5'-desoxiadenosina e um radical do substrato. R = tetrapirrole.

O complexo UROD-produto representou a primeira estrutura cristalina que continha um porfirinogênio altamente sensível ao oxigênio. 124 Observou-se que o produto da reação UROD, COPROGEN, se ligava à fenda do sítio ativo em uma conformação em forma de cúpula com uma face do tetrapirrol aninhada contra um anel de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos conservados. Na conformação observada, os anéis pirrólicos A, B e D estão inclinados de 35 a 60 ° do plano, enquanto o anel C está aproximadamente no plano dos quatro grupos NH centrais. Como resultado disso, as aminas do anel A, B e D são posicionadas a uma distância ótima para ligação de hidrogênio com um dos átomos de oxigênio γ-carboxilato do aspartato cataliticamente essencial que está precisamente posicionado acima do tetrapirrole. As cadeias laterais de propionato de COPROGEN são coordenadas por resíduos de arginina conservados dentro do sítio ativo. Essas argininas, no entanto, fornecem um ambiente favorável positivamente carregado para acomodar o substrato carregado negativamente em vez de orientar precisamente o porfirinogênio, explicando assim a capacidade da enzima de aceitar uma grande variedade de substratos diferentes.

Coproporfirinogênio III oxidase

A conversão de coproporfirinogênio III em protoporfirinogênio IX requer a descarboxilação oxidativa das cadeias laterais de propionato nos anéis A e B do tetrapirrol para produzir os grupos vinil correspondentes. Esta reação é catalisada por enzimas geralmente denominadas coproporfirinogênio III oxidases. No entanto, dependendo da necessidade de oxigênio molecular como aceitador de elétrons terminais, existem dois tipos distintos de CPO que são proteínas estrutural e mecanisticamente completamente não relacionadas. Nesta revisão, iremos nos referir à enzima dependente de oxigênio como CPO, enquanto chamaremos a proteína independente de oxigênio coproporfirinogênio III desidrogenase (CPDH).

O CPO é encontrado principalmente em eucariotos com apenas alguns representantes bacterianos descritos. 145 A diminuição da atividade do CPO em humanos se manifesta na coproporfiria hereditária autossômica dominante. 146 A primeira purificação parcial do CPO foi relatada em 1961 por Sano e Granick para a enzima hepática bovina. 147 Isso foi seguido 4 anos depois pelo isolamento parcial da enzima do fígado de rato por Battle et al. e em meados da década de 1970 pela purificação da levedura CPO por Poulson e Polglase. 148, 149 Desde esses estudos iniciais, várias proteínas CPO nativas e recombinantes foram purificadas até a homogeneidade e caracterizadas bioquimicamente. 150-155 CPO funciona como uma proteína dimérica que requer oxigênio molecular como o aceitador de elétron terminal durante a catálise. Foi mostrado que o CPO catalisa a descarboxilação da cadeia lateral do propionato do anel A antes daquela no anel B sob a formação do intermediário de reação mais duro porfirinogênio. 156, 157 Os primeiros estudos estereoquímicos e mecanísticos usando substratos marcados com deutério e trítio mostraram que apenas oSO átomo de hidrogênio no carbono β da cadeia lateral do propionato do substrato é removido durante a reação e que a conversão geral das cadeias laterais do propionato em cadeias laterais do vinil ocorre estereoquimicamente por eliminação antiperiplanar. 158-160 Recentemente, um mecanismo de reação putativo foi proposto para a descarboxilação dependente de oxigênio do COPROGEN e avaliado por tratamentos químicos quânticos. 161, 162 Nesta proposta, a primeira etapa é uma desprotonação catalisada por base do grupo NH pirrol produzindo um ânion azaciclopentadienil. Esse ânion então reage com o oxigênio molecular na posição α para formar um ânion peróxido de pirrol [Fig. 4 (D)]. Em seguida, um próton na posição β da cadeia lateral de propionato do substrato é abstraído pelo peróxido por meio de um estado de transição de anel de seis membros, resultando em uma ligação dupla exocíclica. Finalmente, a eliminação de CO2 e H2O2 e os rearranjos das ligações levam à formação do grupo vinil. Na verdade, foi mostrado em um estudo recente que H2O2 é gerado durante a catálise CPO. 155 Infelizmente, as duas estruturas de cristal resolvidas para CPO não continham substrato ou produto impedindo uma atribuição precisa de resíduos de aminoácidos diretamente envolvidos na catálise. 127, 128 No entanto, em um estudo bioquímico recente empregando CPOs humanos mutantes, foi sugerido que um resíduo de aspartato altamente conservado poderia servir como base para a abstração de prótons NH, e dois resíduos de arginina conservados foram propostos para coordenar os grupos de carboxilato do substrato. 163

Ambas as estruturas de levedura e CPO humana confirmaram o estado dimérico da proteína. 127, 128 Cada monômero consiste em um único domínio que adota uma dobra sem precedentes contendo uma grande folha β antiparalela de sete fitas coberta em ambos os lados por hélices α. No homodímero, as duas folhas β dos monômeros estão voltadas uma para a outra e as subunidades são giradas ∼40 ° uma em relação à outra (Fig. 1). Uma fenda putativa no sítio ativo foi localizada, correspondendo ao tamanho do substrato [Fig. 4 (C)]. Curiosamente, a levedura CPO cristalizou em duas formas de cristal diferentes. As estruturas revelaram que em uma dessas formas a fenda do sítio ativo estava em uma conformação aberta e acessível, enquanto na segunda forma o sítio ativo era coberto por uma das hélices α levando a uma cavidade bem protegida do solvente. Dois resíduos de arginina invariantes foram encontrados apontando suas cadeias laterais para a cavidade do sítio ativo, sugerindo interações com as cadeias laterais de propionato do substrato. Um resíduo de aspartato invariante que expõe sua cadeia lateral à cavidade perto do centro de uma face foi proposto para coordenar os grupos NH do pirrole semelhantes à estrutura complexa do produto UROD.

Mutações no CPO humano causam a coproporfiria hereditária da doença autossômica dominante (HCP). A maioria das & gt20 mutações HCP conhecidas clinicamente identificadas causam uma diminuição da estabilidade geral da proteína. Acredita-se que algumas mutações localizadas na cavidade do sítio ativo, como a de uma arginina e serina invariantes, tenham efeitos deletérios devido à alteração do tamanho, forma e polaridade do sítio ativo. 128

Coproporfirinogênio III desidrogenase

Na maioria das bactérias, a conversão de COPROGÊNIO em PROTOGÊNIO é catalisada pela coproporfirinogênio III desidrogenase. O CPDH usa um aceptor terminal de elétrons diferente do oxigênio para a reação de descarboxilação oxidativa. Os primeiros relatórios que descrevem a atividade de CPDH em extratos livres de células preparados a partir de Rhodobacter sphaeroides foram publicados por volta de 1970 pela Tait. 164, 165 Dez anos depois, descobriu-se que a conversão independente de oxigênio de COPROGÊNIO em PROTOGÊNIO procede com a mesma estereoquímica da reação dependente de oxigênio e que apenas aSo átomo de hidrogênio no carbono β da cadeia lateral do propionato do substrato é perdido. 159 No entanto, todos esses estudos não resultaram no isolamento ou caracterização da (s) proteína (s) responsável (is) pela reação. Na década de 1990, as abordagens genéticas finalmente levaram à identificação de genes codificadores de CPDH de várias bactérias, que foram clonados e sequenciados. 166-170 Posteriormente, CPDH recombinante de E. coli foi purificado até a homogeneidade e caracterizado bioquímica e estruturalmente. O CPDH é uma proteína monomérica que pertence à chamada família de proteínas “SAM Radical”. Como tal, ele contém um aglomerado [4Fe-4S] lábil ao oxigênio no qual três átomos de ferro são coordenados por três resíduos de cisteína altamente conservados do CX característico3CX2Motivo C. 171 O quarto átomo de ferro do aglomerado FeS é ligado por um SMolécula de -adenosil-L-metionina (SAM) que atua como um co-fator iniciando a catálise baseada em radicais. 129 O ciclo de reação do CPDH começa com a redução do centro de FeS por um sistema doador de elétrons ainda não identificado, como flavodoxina / flavodoxina redutase. O agrupamento de ferro-enxofre reduzido, então, transfere o elétron para o SAM ligado, que é assim homoliticamente clivado em metionina e um radical 5'-desoxiadenosil [Fig. 4 (F)]. Este radical altamente reativo então abstrai um átomo de hidrogênio da cadeia lateral do propionato do substrato, resultando na formação de 5'-desoxiadenosina e um radical do substrato alílico. 172 Finalmente, a eliminação de CO2 e a transferência do único elétron remanescente para um aceitador de elétrons terminal ainda não identificado completa o ciclo de reação CPDH. Foi descoberto que durante a formação de uma molécula de PROTOGÊNIO duas moléculas de SAM são clivadas. 173 Curiosamente, duas moléculas de SAM foram ligadas na estrutura cristalina do E. coli enzima que fornece a possibilidade de que ambas as reações de descarboxilação possam ocorrer sem a necessidade de liberação de um intermediário de ácido tricarboxílico do sítio ativo.

A estrutura geral do CPDH revelou uma proteína monomérica de dois domínios (Fig. 1). 129 O domínio N-terminal maior consiste em uma folha β curva, de doze filamentos, largamente paralela, que é decorada em sua superfície externa por hélices α. O núcleo central deste domínio é formado pelas seis fitas β N-terminais que fazem parte de uma curva (β / α)6 repetir. Este (β / α)6 repetir estruturalmente se assemelha a domínios de barril TIM conhecidos, no entanto, na estrutura CPDH as fitas β são menos fortemente inclinadas em relação ao eixo do barril e a curvatura não é tão apertada como nas estruturas de barril TIM conhecidas levando a um barril de três quartos com uma lateral abertura. O domínio C-terminal consiste em um feixe de quatro hélices α e uma pequena folha β antiparalela de três fitas. Os primeiros 35 resíduos de aminoácidos da proteína não pertencem a nenhum dos dois domínios e são apenas parcialmente ordenados. Uma vez que vários resíduos de aminoácidos conservados estão localizados dentro deste trecho N-terminal, foi proposto que ele poderia adotar uma conformação totalmente ordenada após a ligação do substrato. O cluster [4Fe-4S] está localizado no centro do barril de três quartos perto das extremidades do terminal C das fitas β. Duas moléculas de SAM estão ligadas em estreita proximidade ao aglomerado ferro-enxofre, com uma delas atuando como o quarto ligante do aglomerado FeS [Fig. 4 (E)]. Com base em um complexo CPDH-substrato modelado, vários resíduos de arginina conservados foram propostos para interagir com os substituintes de propionato do substrato. Quaisquer conclusões definitivas sobre a sequência dos dois eventos sucessivos de descarboxilação não foram possíveis. No entanto, muito recentemente foi relatado que o CPDH, como o CPO, catalisa a descarboxilação da cadeia lateral do propionato do anel A antes daquela no anel B através do intermediário de reação mais duro porfirinogênio. 174

Protoporfirinogênio IX oxidase

Na penúltima etapa da biossíntese do heme, o protoporfirinogênio IX é oxidado em protoporfirina IX. Embora essa oxidação também ocorra por conta própria, foi descoberto nos primeiros estudos no início da década de 1960 que na Vivo esta reação é catalisada pela protoporfirinogênio IX oxidase. 147,175,176 Como no caso do CPO, também existem duas proteínas PPO distintas e não relacionadas que catalisam a oxidação de seis elétrons do PROTOGÊNIO. O PPO dependente de oxigênio usa oxigênio molecular como o aceptor de elétrons terminal, enquanto o PPO independente de oxigênio transporta os elétrons para cadeias respiratórias anaeróbicas com aceitadores de elétrons terminais alternativos, como nitrato ou fumarato. 177, 178 No final da década de 1980, proteínas PPO dependentes de oxigênio nativas foram purificadas até a homogeneidade de fígado bovino, fígado de camundongo e levedura, mais tarde, seguidas por PPOs recombinantes de fontes eucarióticas. 179-183 PPOs dependentes de oxigênio bacteriano foram purificados e caracterizados a partir de Bacillus subtilis, Myxococcus Xanthus, e a bactéria termofílica Aquifex aeolicus. 184-186 Mutações no ppo gene em humanos leva ao distúrbio hereditário dominante, porfiria variegata (VP). Os PPOs dependentes de oxigênio são geralmente proteínas homodiméricas associadas à membrana, com exceção do PPO monomérico de B. subtilis e A. aeolicus. 132, 186 Além disso, B. subtilis O PPO foi considerado solúvel no citoplasma. 187 Em todos os casos, os PPOs dependentes de oxigênio contêm um cofator FAD que transfere os elétrons do substrato para o oxigênio aceptor de elétrons. Durante toda a reação três O2 moléculas são, portanto, reduzidas a três H2O2 moléculas. Com base nos resultados de estudos bioquímicos utilizando substratos marcados com trítio, foi proposto um mecanismo de reação em que três meso- íons de hidreto de carbono são removidos sucessivamente da mesma face do plano macrocíclico, cada um acompanhado pela perda de um próton NH. A tautomerização final levando a PROTO ocorre então através da perda estereoespecífica do restante mesohidrogênio -carbono como um próton da face oposta do plano do tetrapirrol. 121 Em uma proposta mecanística recente baseada no complexo modelado enzima-substrato do PPO do tabaco, todas as três abstrações de hidreto ocorrem a partir do C20-meso-carbon seguido por rearranjos de hidrogênio via tautomerizações enamina-imina que ocorrem ao longo de todo o sistema de anel. 130

As estruturas cristalinas para o tabaco mitocondrial PPO e os PPOs de M. xanthus e B. subtilis revelou que a dobra geral da proteína é conservada, apesar de um baixo grau de conservação da sequência de aminoácidos (-27% de identidade). Cada monômero de tabaco dimérico e M. xanthus PPO e monomérico B. subtilis O PPO consiste em três domínios, um de ligação de FAD, um de ligação de substrato e um terceiro domínio envolvido na dimerização no caso do tabaco e M. xanthus PPO (Fig. 1). Os domínios de ligação FAD e de ligação ao substrato mostram um p-hydroxybenzoate-hydroxylase fold-like topology. O domínio de dimerização é exclusivamente α-helicoidal e responsável pela ligação à membrana no caso do tabaco e M. xanthus enzimas. Diferenças conformacionais foram observadas para este domínio no B. subtilis proteína explicando os diferentes estados de oligomerização dos diferentes PPOs. Com base na localização de moléculas inibidoras nas estruturas de PPO, o sítio ativo de PPO foi identificado [Fig. 5 (A)]. Considerando que no tabaco e M. xanthus PPO, o local de ligação do substrato é uma cavidade rasa, é muito mais amplo no B. subtilis Estrutura do PPO explicando a capacidade da última enzima de aceitar PROTOGÊNIO e COPROGÊNIO como substratos. No complexo PPO-substrato de tabaco modelado, anel pirrol A de protoporfirinogênio IX em pilhas contra um resíduo de fenilalanina conservado e o anel B é ensanduichado entre dois resíduos de leucina conservados. Uma arginina altamente conservada dentro da cavidade do sítio ativo fornece um contra-íon para o grupo carboxilato de propionato do anel C. Análises bioquímicas recentes de variantes de PPO do tabaco mostraram a importância desses resíduos de aminoácidos para a ligação do substrato e catálise. 188 Neste modelo de substrato PPO, a ponte de metileno C20 do substrato é orientada para o átomo N5 reativo do cofator FAD, sugerindo que todas as abstrações de hidreto ocorrem a partir desta posição. A mutação mais comum no PPO humano que causa VP é uma troca de Arg59 por triptofano. De acordo com a estrutura do PPO do tabaco, esta arginina está localizada em uma alça entre o anel de isoaloxazina do FAD e a cavidade de ligação ao substrato e sua substituição por um triptofano na proteína humana nesta posição provavelmente perturba a arquitetura do sítio ativo e também pode interferir com FAD e ligação de substrato.

Arquiteturas de sites ativos e etapas catalíticas de enzimas envolvidas na transformação de protoporfirinogênio IX em heme. A + B, PPO C + D, FC. R: Site ativo de M. xanthus PPO com inibidor ligado acifluorfen (AF). B: PPO catalisa a oxidação de protoporfirinogênio IX em protoporfirina IX. C: sítio ativo de FC humana com protoporfirina IX (PROTO) ligada. D: A inserção do ferro ferroso no PROTO ocorre por meio de um complexo “sentado no topo” entre a porfirina e o íon metálico.

Muito menos se sabe sobre o PPO independente de oxigênio que ocorre em bactérias anaeróbias e anaeróbios facultativos. Em meados da década de 1970, foi mostrado por Jacobs e Jacobs usando extratos livres de células preparados a partir de E. coli que a atividade de PPO independente de oxigênio estava associada à fração de membrana e poderia ser solubilizada por detergentes. Além disso, foi observado que a atividade da PPO estava acoplada à cadeia respiratória. 177.178.189 Mais tarde, um E. coli cepa mutante foi encontrada que era deficiente em atividade de PPO. O gene mutado foi posteriormente mapeado e denominado hemG. 190, 191 Apenas recentemente recombinante E. coli HemG foi purificado, caracterizado e mostrou ser um PPO independente de oxigênio. 192 A proteína pertence à família de proteínas das chamadas flavodoxinas de cadeia longa e contém um cofator FMN. Foi relatado que HemG é capaz de oxidar PROTOGÊNIO a PROTO na presença de menadiona como o aceitador de elétrons terminal, substituindo o aceitador de elétrons fisiológico ligado à membrana, a menaquinona.

Ferrochelatase

A ferroquelatase catalisa a etapa terminal da biossíntese do heme, ou seja, a inserção de ferro ferroso na protoporfirina IX. O primeiro relatório descrevendo a atividade da ferrochelatase em eritrócitos aviários foi publicado em 1956 por Ashenbrucker et al. e foi seguido por descrições da mesma atividade enzimática em uma variedade de tipos de células. 193, 194 No entanto, demorou mais 25 anos até que a primeira ferrochelatase fosse purificada até a homogeneidade de mitocôndrias de fígado de rato ainda com baixo rendimento. 195 No início dos anos 1990, os genes que codificam a ferrochelatase de vários organismos eucarióticos foram clonados e sequenciados. A produção de ferrochelatases recombinantes finalmente resultou em alto rendimento proteico para caracterização funcional e estrutural. Hoje, a ferrochelatase é uma das enzimas mais bem caracterizadas da via de biossíntese do heme. 122, 194 Em humanos, a deficiência de ferrochelatase resulta no distúrbio metabólico da protoporfiria eritropoiética (EPP). Em eucariotos, a ferrocelatase é um homodímero associado à membrana, enquanto é monomérica nas bactérias. 134.186.196 Além disso, em bactérias Gram-positivas, como B. subtilis FC é uma proteína solúvel localizada no citoplasma bacteriano. 197 As proteínas FC eucarióticas, com exceção das enzimas vegetais, contêm um cluster [2Fe-2S] por subunidade. 198, 199 Ferrochelatases bacterianas foram descritas com e sem cluster FeS. 200, 201 No entanto, o papel do cluster ferro-enxofre é atualmente desconhecido. FC aceita uma variedade de porfirinas diferentes como substratos, mostrando que FC é bastante tolerante a diferentes substituintes nos anéis A e B. 122, 202 Em contraste, as cadeias laterais de propionato nos anéis C e D são mais críticas para a catálise. Algumas porfirinas que não são aceitas como substratos, como N-alquil porfirinas atuam como inibidores competitivos. O 203 FC também é capaz de inserir íons metálicos divalentes como Ni 2+ e Zn 2+ nas porfirinas, enquanto outros como Mn 2+, Hg 2+ ou Pb 2+ têm efeitos inibitórios. 204, 205 Durante a catálise, o macrociclo da porfirina planar deve ser distorcido pela enzima em uma conformação em sela para facilitar a quelação do metal. 136,206–208 A dessolvatação do ferro ferroso e a formação de ligações entre o metal e dois dos nitrogênios pirrólicos levam a um complexo denominado "sentado sobre o topo" [Fig. 5 (D)]. Finalmente, a desprotonação dos dois grupos NH restantes resulta na formação da porfirina metalada. 207

Embora ferrochelatases de diferentes espécies compartilhem pouca identidade de sequência de aminoácidos, as estruturas cristalinas de humanos, leveduras e B. subtilis FC apresentam alto grau de conservação estrutural. Cada subunidade das enzimas eucarióticas diméricas consiste em dois domínios semelhantes, cada um contendo uma folha β paralela de quatro cadeias rodeada por hélices α (Fig. 1). Uma extensão C-terminal que não está presente no B. subtilis FC adota uma estrutura hélice-volta-hélice e está envolvido na coordenação do cluster [2Fe-2S]. Na verdade, o aglomerado de ferro-enxofre parece contribuir para ancorar a extensão do terminal C ao resto do monômero. No homodímero FC, esta extensão C-terminal está envolvida nas interações entre os monômeros e sua ausência no B. subtilis enzima pode explicar a estrutura monomérica do último. As bolsas do sítio ativo de FC humano dimérico estão ambas localizadas na mesma superfície que se acredita estar embutida dentro da membrana. A entrada da bolsa do local ativo é revestida principalmente por resíduos hidrofóbicos, enquanto a base da bolsa é povoada com vários resíduos hidrofílicos. A estrutura cristalina do FC humano em complexo com PROTO revelou que o sítio ativo fecha após a ligação da porfirina e que o substrato é completamente engolfado pela proteína. Várias interações importantes entre o FC e o substrato posicionam a porfirina na bolsa do local ativo [Fig. 5 (C)]. O grupo carboxilato de propionato do anel D forma uma ponte de sal com uma arginina e o do anel C está envolvido na ligação de hidrogênio com as cadeias laterais de uma serina e uma tirosina. Além disso, as interações com histidina e metionina próximas, localizadas em locais opostos do macrociclo, também contribuem para o posicionamento do substrato. A estrutura do complexo FC-substrato também revelou que o PROTO é distorcido em ± 11,5 ° para adotar uma conformação de sela modesta que é consistente com os cálculos teóricos. 209 Após a inserção do metal, foi observado em uma estrutura de complexo de produto FC que uma histidina oscila para longe da porfirina metalada e que as interações entre a cadeia lateral do propionato C do anel do produto e os resíduos de serina e tirosina são quebradas. Na estrutura do produto FC, também foi observado que uma reorganização estrutural ocorre em uma hélice π conservada no FC humano, o que facilita a liberação do produto do sítio ativo. 210 Mutações no gene da ferrochelatase humana que causam a EPP incluem mutações missense e deleções de exon. Entre as mutações missense que causam trocas de aminoácidos, muitas levam à diminuição dos níveis de atividade enzimática, embora apenas duas delas envolvam diretamente resíduos do sítio ativo. 211


Biossíntese de heme

O heme é a protoporfirina de ferro sintetizada principalmente na medula óssea (85%) e no fígado devido aos requisitos para incorporação na hemoglobina e nos citocromos, respectivamente. As três etapas enzimáticas iniciais e finais são catalisadas por enzimas que estão presentes na mitocôndria, enquanto as etapas intermediárias ocorrem no citoplasma.

Etapas da síntese do heme

Síntese de ácido δ-aminolevulínico (ALA): Na mitocôndria pela enzima ALA sintase, succinil COA condensa-se com glicina para formar ácido α-amino-β-cetoadípico na presença de vitamina B6 que ativam a glicina. Pela mesma enzima α-amino-β-cetoadípico, o ácido é descarboxilado para formar ácido δ-aminolevulínico (ALA).

Síntese do porfobilinogênio (PBG): No citoplasma, 2 moléculas da enzima ALA desidratase para formar o porfobilinogênio (PBG) A ALA desidratase é uma enzima contendo zinco inibida pelo chumbo.

Estrutura heme

Síntese de uroporfirinogênio: No citosol, quatro moléculas de porfobilinogênio condensam-se juntas pela uroporfirinogênio I sintase para formar uma tetrapirrol de cadeia aberta que pode formar espontaneamente uroporfirinogênio I, o tetrapirrol linear na presença de uroporfirinogênio III co-sintetase uroporfirinogênio.

Síntese de coproporfirinogênio: No citosol, todos os grupos acetato (A) são descarboxilados em substituintes metil.

Síntese de protoporfirinogênio III, protoporfirina e heme: Na coproporfirinogênio oxidase mitocondrial, que atua apenas no tipo III, oxida e descarboxila duas cadeias laterais propiônicas nos anéis I e II em grupos vinil (-CH = CH2) e o protoporfirinogênio III é formado. Protoporfirinogênio (4 pontes de metileno -CH2-), por oxidase forma a protoporfirina (4 pontes de metenil -CH =), e então por heme sintase ferrochelatase) heme é formado.

Regulação da síntese de heme

  1. A enzima ALA sintase controla a etapa limitante da taxa de síntese de heme. O heme e também a hematina atuam como repressores da síntese da ALA sintase e atuam como um inibidor de feedback nesta etapa, a inibição ocorre em um sítio alostérico.
  2. O bloqueio da biossíntese do heme no ácido pantotênico ou deficiência de vitamina B6 ocorre em uma etapa muito inicial da síntese do heme (ALA sintase).
  3. A ALA desidratase é uma enzima sulfidrila e é muito sensível à inibição por metais pesados ​​como mercúrio ou chumbo.

Desordem da biossíntese de heme (porfirias)

Eles são um grupo de doenças devido a anormalidades na via de biossíntese do heme, podem ser genéticas ou adquiridas. Além disso, as porfirias podem ser classificadas de acordo com os órgãos ou células mais afetados em hepáticas e eritropoiéticas em ambos.

Os sinais e sintomas clínicos da porfiria resultam da deficiência de produtos metabólicos além do bloqueio enzimático da biossíntese da Hb ou do acúmulo de metabólitos antes do bloqueio. Quando a lesão enzimática ocorre no início da via antes da formação dos porfirinogênios, o ALA e o PBG se acumulam no corpo, causando efeitos tóxicos nos nervos abdominais e no SNC, resultando em dor abdominal e sintomas neuropsiquiátricos.

Por outro lado, os bloqueios de enzimas mais tarde na via resultam no acúmulo de porfirinogênios (incolores), que após a oxidação produzem as porfirinas correspondentes (coloridas) que causam fotossensibilidade.

Tipos de porfirias

  1. Porfirias congênitas
  2. Porfirias adquiridas (tóxicas). Causada pela exposição a compostos tóxicos como hexaclorobenzeno e metais pesados ​​como chumbo que inibe a ferroquelatase e ALA desidratase. Os pacientes sofrem de anemia grave com acúmulo de ALA e coproporfirina III na urina.

Tratamento de porfirias

  1. Evite a exposição à luz solar.
  2. Injeção de hemin.
  3. Antioxidantes e β-caroteno.
Destino dos RBs e catabolismo da hemoglobina

Os glóbulos vermelhos regularmente saem das arteríolas na polpa esplênica e viajam através de pequenos poros para entrar no seio esplênico, onde os glóbulos vermelhos velhos são separados e destruídos. Macrófagos no baço, fígado, osso, medula, etc, engolfam e quebram os fragmentos celulares.

A hemoglobina é liberada das células e se divide em globina e heme. A porção da globina é hidrolisada em aminoácidos, que são reutilizados para a síntese de proteínas. O heme é convertido em biliverdina e bilirrubina (pigmentos biliares, normalmente ∼ 0,2-0,8 mg / dL de sangue) que são excretados na bile enquanto o ferro é reutilizado para a síntese de hemoglobina.


A síntese de heme bacteriana é necessária para a expressão da holoproteína de leghemoglobina, mas não da apoproteína em nódulos de raiz de soja

Na simbiose de Bradyrhizobium japonicum / soja, a apoproteína leghemoglobina (hemoglobina leguminosa) é um produto vegetal, mas a origem do grupo protético heme é desconhecida. A cepa LO505 de B. japonicum é um mutante deficiente de citocromo induzido por transposon Tn5 que excretou o precursor coproporfirina III do heme oxidado para o meio de crescimento. A cepa mutante LO505 era especificamente deficiente na atividade da protoporfirinogênio oxidase (protoporfirinogênio-IX: oxidoredutase de oxigênio, EC 1.3.3.4) e, portanto, não poderia catalisar a penúltima etapa na biossíntese do heme. Os nódulos da raiz da soja formados a partir desse mutante não continham leghemoglobina, mas a apoproteína foi sintetizada. Os dados mostram que a síntese de heme bacteriana é necessária para a expressão de leghemoglobina, mas a porção heme não é essencial para a síntese de apolehemoglobina pela planta. A leghemoglobina da soja, portanto, é um produto de simbiontes vegetais e bacterianos.


Resultados e discussão

A estrutura geral

Os 503 aminoácidos de PPO2 dobram em uma estrutura compacta (Figura 2) em três domínios, um domínio de ligação a FAD, um domínio de ligação ao substrato e um domínio de ligação à membrana (Figura 3A, Figura 1 suplementar). Os primeiros dois domínios exibem um p-hidroxibenzoato-hidroxilase (PHBH) topologia em dobra (Schreuder et al, 1992 Pawelek et al, 2000). As partes da estrutura responsáveis ​​pela ligação de FAD (Figura Suplementar 2) mostram sequência significativa de aminoácidos (aa) e homologias estruturais com outras flavoenzimas (Ghisla e Massey, 1989), como a monoamina oxidase B humana (Binda et al, 2002) (MAO B, 1,68 Å rmsd sobre 256 Cα átomos com 15,1% de identidade de sequência aa), poliamina oxidase (Binda et al, 1999) (PAO, 1,71 Å rmsd sobre 190 Cα átomos com 14,9% de identidade de sequência aa) e D-aminoácido oxidase (Mizutani et al, 1996) (DAO, 1,98 Å rmsd sobre 148 Cα átomos com 14,9% de identidade de sequência aa) e, além disso, fitoeno dessaturase (PDS) (Norris et al, 1995) com 15,2% de identidade de sequência aa, uma enzima vegetal envolvida na biossíntese de carotenóides (Figura Suplementar 3).

A interface do dímero e a ligação à membrana

O PPO2 está fortemente ligado à membrana mitocondrial interna. A solubilização e cristalização da proteína recombinante só são possíveis após a extração do detergente com Triton X-100. A massa molecular aparente de PPO2 em solução é 130 kDa conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho, indicando um dímero com uma massa molecular calculada de ca. 110 kDa (dados não mostrados). Sugerimos que o domínio englobando as oito hélices α4–11 com as regiões de sequência conservada (Figura 2B) do resíduo 112 a 136 e de 150 a 213 é a âncora da membrana e é monotopicamente (Blobel, 1980) inserida na membrana que lembra as proteínas monotópicas da membrana esqualeno-hopeno ciclase (Wendt et al, 1999) e prostaglandina-H2 sintase (Loll et al, 1995). Em PPO2 hélices α4, α5 e α11 formar a base deste domínio com resíduos principalmente apolares, que ficariam de frente para a porção lipídica das membranas. A parede do suposto domínio de ligação à membrana cilíndrica é alinhada por um par de resíduos carregados negativamente e positivamente, que podem interagir com grupos de cabeça carregados positiva e negativamente dos fosfolipídios da membrana mitocondrial. Nos cristais de PPO2, os domínios de ligação à membrana putativos de quatro protômeros contatam um ao outro, formando dois contatos que cada um enterra 800 Å 2 de área de superfície acessível e perpendicular a esses dois outros contatos com áreas de interface de 400 Å 2 (Figura 3B). Supomos que a interface menor corresponde ao dímero PPO2 natural, possivelmente ainda mais estabilizado por fosfolipídios da membrana circundante na Vivo. Na montagem dimérica de PPO2, as aberturas das cavidades do sítio ativo são posicionadas na parte externa do dímero perto da membrana levando a dois sítios ativos independentes. A interface do dímero é formada pelas hélices α14 e α5, com as principais contribuições feitas pelos resíduos de leucina da hélice α5 que interagem com os resíduos de leucina correspondentes do segundo monômero (Figura 2A). Apesar da alta homologia estrutural geral com MAO B (Binda et al, 2002), a dimerização ocorre em partes da superfície completamente diferentes das duas enzimas. Não está claro se o PPO2 é inserido na membrana como um monômero ou dímero. Ambos os modos de inserção são estruturalmente possíveis.

Complexo putativo com ferrochelatase

O domínio de ligação à membrana contém um canal em forma de U aberto em um lado que vai do sítio ativo para a bicamada da membrana (Figura 2C). Sugerimos que a protoporfirina IX é translocada para Fc dimérico através deste canal (Fc, Figura 4A). Foi proposto que Fc seja inserido monotopicamente na membrana como um dímero com um arranjo visto na estrutura cristalina da ferroquelatase humana (HFc) (Wu et al, 2001). Em nosso modelo do complexo heterodimérico dos dímeros PPO2 e HFc, os eixos duplos dos dois dímeros foram alinhados e os protômeros foram girados e deslocados até que o melhor ajuste seja obtido (Figura 4B). Os resíduos que formam a interface correspondem muito bem aos resíduos 195-212 (α10 e α11) de PPO2 interagem com os resíduos 99-122 de HFc (lábio grande, hélice de 104 a 122) e os resíduos 131-137 (α5, PPO2) com os resíduos 304-310 (loop labial pequeno, HFc) (Wu et al, 2001). Curiosamente, esses resíduos de interface de PPO são idênticos àqueles que dão origem ao contato de cristal de 800 Å 2 descrito acima (Figura 4A). A parte do complexo que deve abranger a membrana mitocondrial interna tem um comprimento de 28 Å, correspondendo bem à largura assumida de 30 Å para a parte lipídica de uma membrana. Uma característica atraente do modelo é a sobreposição das aberturas de canal de PPO2 e HFc, facilitando a difusão ininterrupta de produto / substrato dos sítios ativos do dímero PPO2 para aqueles do HFc dimérico no complexo. No complexo, a absorção de protoporfirinogênio IX pode ocorrer do lado periplasmático através da abertura abaixo da cavidade do sítio ativo de PPO2, talvez por meio de um complexo com coproporfirinogênio III oxidase que fornece o substrato de PPO2 em mitocôndrias animais. Após a oxidação do protoporfirinogênio IX, o produto poderia ser canalizado para o sítio ativo de Fc e, após a inserção do ferro, ser liberado na membrana pela abertura lateral dos canais combinados. A observação de que a inserção de ferro por Fc requer a presença de PPO (Ferreira et al, 1988) defende um complexo fisiológico entre os dois componentes.

O sítio ativo e a base estrutural da catálise

O sítio ativo do PPO está localizado entre o FAD- e o domínio de ligação ao substrato. O mapa de densidade de elétrons (Figura 5A) mostra a ligação do inibidor INH na cavidade do sítio ativo (Figura 5B) próximo ao cofator FAD em sua conformação estendida. O local de ligação do substrato abaixo do FAD é uma cavidade plana que é formada por uma série de aminoácidos aromáticos e alifáticos, bem como por Asn67 e Arg98 (Figura 5C). Abaixo do inibidor, há uma densidade de elétrons bem definida para uma molécula de Triton X-100. Ele está localizado no canal do produto, com a fração óxido de dietileno polar direcionada para o sítio ativo. Dois outros máximos de densidade de elétrons são encontrados mais profundamente no canal, o que poderia representar duas moléculas de detergente menos bem definidas. Esse canal também pode ser um local de ligação putativo para a ubiquinona quando ela inibe a reação de PPO em concentrações acima de 30 μM, conforme descrito anteriormente (Ferreira e Dailey, 1988). Ubiquinonas, que são ligadas à membrana, podem entrar no canal a partir da membrana e inibir a reação de PPO por impedimento estérico da ligação do substrato e pelo bloqueio da canalização do produto.

Modelamos a ligação de protoporfirinogênio IX e protoporfirina IX guiada pelo sítio de ligação de INH (Figura 5D). Os grupos propionil carregados negativamente são orientados para as partes expostas ao solvente da cavidade do sítio ativo. Arg98 sendo altamente conservado sobre todos os PPOs eucarióticos fornece uma contra-carga para o grupo carboxilato do inibidor INH e mais provavelmente também para o grupo propionato do anel C da protoporfirina (ogen) IX. O anel pirazol da INH serve como modelo para o anel A da protoporfirina (ogen) IX, e é mantido em posição por empilhamento aromático com o resíduo Phe392 conservado nas enzimas mitocondriais da planta. Nas isoenzimas do cloroplasto, um resíduo de tirosina o substitui. O fenilring do INH que mimetiza o anel B da protoporfirina (ogen) IX é ensanduichado entre os resíduos conservados Leu356 e Leu372. A ponte de metileno (C20) entre os anéis A e D do protoporfirinogênio IX modelado é orientado para o N reativo5 átomo do FAD, dando origem à suposição de que esta posição é inicialmente oxidada pelo FAD. A oxidação posterior pode ocorrer a partir desta posição apenas porque a cavidade estreita do sítio ativo permite a ligação do protoporfirinogênio IX apenas nesta orientação e impede rotações do substrato. Por rearranjos de hidrogênio por meio de tautomerizações imina-enamina, todas as reações de abstração de hidreto ocorrem a partir de C20. O átomo C10 entre os anéis B e C não pode ser orientado perto o suficiente para o N5 átomo do FAD por causa do grupo vinil interferente no C10 lado das moléculas. O FAD é reoxidado três vezes pelo oxigênio molecular, produzindo três moléculas de peróxido de hidrogênio (Jordan, 1991) (Figura 6). Nenhum resíduo conservado é observado próximo ao substrato que possa servir de base. Um possível mecanismo de desprotonação incluiria a redução do oxigênio molecular por um FADH carregado negativamente - para produzir um ânion peróxido, que poderia servir de base e abstrair um próton da molécula do substrato.

Porfiria variegada

Em humanos, um defeito no PPO que resulta na diminuição da atividade enzimática é responsável pelo distúrbio hereditário dominante, porfiria variegata, cujo sinal mais óbvio é a sensibilidade à luz da pele do paciente. Em mais de 94% dos pacientes, Arg59 é mutado para Trp (Maneli et al, 2003). O resíduo na enzima mitocondrial do tabaco que corresponde ao Arg59 humano conservado em camundongo e Drosophila é Asn67 conservado em todas as enzimas vegetais conhecidas (Figura 2B). Asn67 está posicionado em uma alça entre o anel de isoaloxazina de FAD e o local de ligação ao substrato. Um resíduo volumoso de triptofano nesta posição pode perturbar a estrutura da proteína no sítio ativo e interferir na FAD e na ligação ao substrato. Um mutante Arg59Lys de PPO humano mostrou mais de um terço da atividade da enzima de tipo selvagem, enquanto os mutantes Arg59Ser e Arg59Ile foram quase inativos (Maneli et al, 2003). Em PPOs animais, incluindo PPO humano, o Arg59 conservado desempenha um papel importante. No N. tabacum estrutura de PPO, Ser374 que é conservada entre várias espécies de plantas (Figura 2B) está em uma posição oposta a Asn67. O resíduo correspondente em PPOs de animais é o Asp349 conservado que provavelmente formará uma ponte de sal com Arg59. Esta ponte de sal está estabilizando a estrutura do site ativo. A mutação de Arg59 em um resíduo sem carga interrompe essa ponte salina, desestabilizando a estrutura do sítio ativo do PPO animal.


COMPLEXOS MULTIENZIMÁTICOS NA BIOSSÍNTESE HEME

Dada a reatividade dos intermediários da via, é altamente improvável que as concentrações intracelulares de qualquer um deles atinjam as concentrações micromolares da enzima medida Kms. Portanto, é razoável supor que “intermediários livres” não existam na célula. Este tópico foi abordado experimentalmente pela primeira vez na década de 1980, quando os dados foram apresentados para apoiar a hipótese de que as três enzimas terminais, que são todas associadas à membrana mitocondrial, formam um complexo transitório para facilitar a transferência de intermediários (Ferreira et al. 1988 Dailey 1990 Proulx et al. 1993). Dados bioquímicos mostraram claramente que, embora obrigatória, a canalização de substrato restrita, como ocorre na síntese de triptofano, não existe, em circunstâncias normais o equilíbrio de produtos / substratos com o meio a granel não ocorre. Para a interação potencial entre as duas enzimas da via terminal, os dados recolhidos das estruturas de cristal PPOX e FECH fornecem um bom suporte para a possível interação (Koch et al. 2004 Medlock et al. 2007b). A presença e a natureza dos complexos multienzimáticos envolvendo as três enzimas terminais associadas à membrana são consideravelmente avançadas em relação ao que é conhecido, ou não conhecido, sobre as enzimas da via anterior, mas ainda é extremamente rudimentar. Experimentos de radiomarcação usando fragmentos mitocondriais isolados claramente suportam interações transitórias in situ, embora a reconstituição deste processo com componentes purificados não tenha sido realizada (Proulx et al. 1993). Estudos estruturais in silico mostram que uma interação através da membrana mitocondrial interna para transportar protoporfirina de PPOX para FECH é viável e altamente provável (Koch et al. 2004). Curiosamente, no complexo PPOX-FECH ancorado, as aberturas dos túneis do sítio ativo do dímero PPOX não apenas coincidem com a posição das aberturas para os bolsos do sítio ativo do FECH dimérico, mas são espacialmente justapostos para os ligados à superfície moléculas de porfirina observadas em algumas estruturas cristalinas de FECH. A observação de que a ligação do substrato e do produto induz mudanças no contorno da superfície e distribuição de carga em torno da abertura do bolso do sítio ativo de FECH fornece uma explicação de como PPOX e proteínas aceitadoras de heme pós-catalíticas "reconhecem" a forma apropriada de FECH com a qual interagir (Medlock et al. 2007b). Dada a necessidade de adquirir coproporfirinogênio do citosol e movimento de pelo menos algum heme para fora da mitocôndria, a existência de um complexo de um transportador de coproporfirina de membrana externa, CPOX, PPOX, o transportador de ferro de membrana interna mitoferrina (Shaw et al. 2006) , FECH e um transportador de heme chaperona / membrana externa em uma junção mediada por mitofilina entre as membranas mitocondriais externa e interna é uma possibilidade intrigante (Fig. 2).

Além dos dados para as enzimas associadas à membrana terminais, existe pouca evidência experimental para apoiar complexos multienzimáticos de enzimas de vias anteriores. Para a primeira etapa, uma interação de ALAS-2 com succinil CoA sintetase na membrana mitocondrial interna foi demonstrada por dois grupos (Furuyama e Sassa 2000 Cox et al. 2004). Com a recente identificação de SLC25A38 como o transportador putativo de glicina / ALA (Guernsey et al. 2009), é razoável antecipar a existência de complexos transitórios entre ALAS, succinil CoA sintetase e SLC25A38 na membrana interna mitocondrial. A possibilidade de um complexo estável e rígido para essas e muitas outras enzimas de síntese de heme parece improvável, dado que elas possuem bolsões de sítio ativo com uma única entrada / saída. A necessidade de substrato (s) e produto (s) entrar e sair por uma única rota exigiria o movimento de uma enzima entre as moléculas doadoras e aceitadoras no complexo, assim como o citocromo c ciclos fisicamente entre doadores e aceitadores de elétrons. A única enzima para a qual esse pode não ser o caso é a PPOX, que parece ter um canal através da proteína, com o sítio ativo localizado dentro dessa característica.

Para a síntese de uroporfirinogênio III a partir de PBG, os indivíduos acreditaram por muito tempo que a proximidade de HMBS e UROS seria provavelmente dada a reatividade química do intermediário tetrapirrólico linear, HMB. Infelizmente, no momento, não existem dados para apoiar a presença de um complexo multienzimático envolvendo PBGS e HMBS. Dado que ALA deve ser exportado e coproporfirinogênio importado para a mitocôndria, a lógica sugeriria que não apenas PBGS e HMBS, mas também UROS e UROD existem em um complexo supramolecular que está espacialmente próximo à mitocôndria. Até o momento, faltam estudos microscópicos de alta resolução ou bioquímicos / biofísicos que possam identificar a distribuição intracelular dessas enzimas. Abordagens que dependem de ruptura celular e isolamento físico de complexos ou reconstituição in vitro de complexos de componentes isolados assumem uma força de interação proteína-proteína em solução que pode não existir e pode não ser necessária no meio citosólico altamente concentrado. Uma possibilidade intrigante é que PBGS, que forma um grande complexo melhor categorizado como um tetrâmero de homodímeros, poderia, por causa de seu tamanho, servir como um andaime para um complexo multienzimático. A observação de que este octômero também pode assumir uma forma hexamérica pode sugerir seu papel plástico como um local de nucleação de montagem supramolecular. A resolução dessas questões exigirá pesquisa magistral, mas os resultados devem ser interessantes.

Embora a síntese de tetrapirrol e o metabolismo do ferro devam estar intimamente ligados para prevenir o acúmulo inadequado de qualquer uma das moléculas, há estudos limitados que abordam essa questão tanto no nível genético quanto no molecular. O papel do elemento responsivo ao ferro foi examinado por uma série de grupos (Dierks 1990 Bhasker et al. 1993 Melefors et al. 1993 Wang e Pantopoulos 2011), e a maquinaria celular para a montagem do aglomerado de ferro e enxofre (Lill e Kispal 2000) também atraiu um interesse significativo. O tráfico de ferro no corpo inteiro e intercelular é bastante bem compreendido, mas apenas recentemente houve um avanço significativo com a identificação da mitoferrina como o transportador de ferro da membrana interna mitocondrial que fornece ferro à ferrocelatase para a síntese de heme (Shaw et al. 2006 Troadec et al. 2011). Especificamente, a mitoferrina 1 é responsável pelo transporte de ferro para a síntese do heme durante a eritropoiese, mas a presença de outra proteína de transporte da membrana interna, ABCB10, é necessária para estabilizar a mitoferrina 1 (Chen et al. 2009). O papel exato que o ABCB10 desempenha ainda não foi elucidado.Evidências também foram apresentadas mostrando que a mitoferrina forma um complexo com a ferrochelatase que pode tornar possível uma transferência direta do ferro ferroso transportado para a síntese do heme para a ferrochelatase (Chen et al. 2010). Se isso ocorrer, os dados estruturais da ferrochelatase humana e sua orientação em relação à membrana interna indicariam que o ferro entraria no sítio ativo da ferrochelatase por meio de um canal cheio de solvente cuja entrada externa é no lado posterior da enzima (Sellers et al 2001 Medlock et al. 2007b). Será de interesse aprender os detalhes moleculares deste processo e como ele é regulado.

O trânsito do heme para longe de seu local de síntese é um território inexplorado. Foi demonstrado que em ensaios in vitro, a liberação de heme da pós-metalização da enzima é a etapa limitante da taxa (Hoggins et al. 2007). Isso provavelmente reflete a ausência do aceitador de heme nativo no ensaio in vitro. Dado que o heme é usado em toda a célula em uma variedade de compartimentos, é claro que uma variedade de chaperones heme pode existir. Para o trânsito da mitocôndria para outros compartimentos membranosos, parece provável que a transferência possa ocorrer em pontos de contato direto em vez de por difusão através do citoplasma (Schultz et al. 2010), mas mesmo isso exigirá mover o heme de FECH para o local de transferência entre as membranas. Ainda não se sabe qual molécula primeiro aceita o heme da ferrochelatase. Dada a sua localização na membrana interna, parece que, para a maturação do citocromo respiratório, pode ocorrer a transferência direta do FECH para a maquinaria de montagem do citocromo. Alguns sistemas experimentais sugerem fortemente esta possibilidade (Richard-Fogal e Kranz 2010), mas ainda faltam dados definitivos. Para hemoproteínas citoplasmáticas, incluindo hemoglobina, não há chaperones identificados. As proteínas putativas de ligação / carreador de heme / porfirina foram sugeridas e até mesmo caracterizadas bioquimicamente (Blackmon et al. 2002 Dias et al. 2006), mas nenhuma delas é suportada por dados como participantes in vivo no tráfico de heme.


Formação de protoporfirinogênio (IX) na síntese de heme - Biologia

Se o nome de uma enzima estiver em negrito, há evidências experimentais dessa atividade enzimática.

BioCyc ID: HEME-BIOSYNTHESIS-II-1

Resumo:
Antecedentes Gerais

Em procariontes e eucariontes, heme (protoheme IX, protoheme, heme b) é um grupo protético contendo ferro encontrado em muitas proteínas essenciais, incluindo citocromos e globinas contendo heme. Além de seu papel no metabolismo oxidativo, o heme também funciona como uma molécula reguladora na transcrição, tradução, direcionamento de proteínas, estabilidade de proteínas e diferenciação celular. Heme é um membro porfirínico dos tetrapirróis cíclicos. Embora seja biossintetizado como protoheme IX, diferentes derivados do protoheme IX podem ser formados que diferem nas modificações do anel de porfirina, incluindo a forma como ele está ligado à proteína, como o heme o, heme uma, heme ce heme d.

Em vários organismos, pontos de ramificação importantes dentro da via biossintética do heme levam à biossíntese de outros compostos importantes, como a vitamina B12 (cobalamina) (ver biossíntese de adenosilcobalamina II da via MetaCyc (aeróbica)), coenzima F430 (ver biossíntese do fator 430 da via MetaCyc), siroheme (ver biossíntese de siroheme da via EcoCyc), heme D (ver heme reação EcoCyc b + peróxido de hidrogênio & rarr heme d), e bacterioclorofila (ver via MetaCyc 3,8-divinil-clorofilida uma biossíntese I (aeróbia, dependente da luz)).

No Escherichia coli, a biossíntese do heme começa com o L-glutamato e prossegue através do 5-amino-levulinato (o precursor universal do tetrapirrol) até o uroporfirinogênio III, conforme mostrado na via da biossíntese do tetrapirrol I (do glutamato). O uroporfirinogênio III é convertido em protoheme IX na via mostrada aqui. Reações subsequentes que produzem heme o e heme d são mostrados nos links de reação. No E. coli, hemes c, d, e o funcionam como grupos protéticos para c-tipo citocromos, citocromo bde citocromo bo, respectivamente. o ccitocromos do tipo são sintetizados apenas anaerobicamente na presença de aceptores de elétrons nitrogenados. Citocromo bd e citocromo bo são O2-redução de complexos terminais de oxidase.

Embora a regulação da biossíntese do heme não seja bem estudada em E. coli, a evidência sugere que o nível celular de protoheme IX livre controla a taxa de síntese de heme no nível de formação de glutamato-1-semialdeído pela glutamil-tRNA redutase codificada por hemA (ver EcoCyc pathway tetrapyrrole biosynthesis I (from glutamate)).

Revisão: Beale, S.I. (2007) "Biosynthesis of Hemes" EcoSal 3.6.3.11 [ECOSAL]

A via mostrada aqui do uroporfirinogênio III ao protoheme IX é um segmento da via biossintética geral do heme. Os links do caminho no início e no final desse caminho mostram as etapas anteriores e posteriores. Esta via descreve a rota aeróbia para a biossíntese do protoheme IX. Envolve a enzima coproporfirinogênio III oxidase (HemF), que requer oxigênio molecular para a conversão do coproporfirinogênio III em protoporfirinogênio IX.

Nessa via, os quatro grupos acetato do uroporfirinogênio III são descarboxilados sequencialmente, e os grupos metil desses quatro acetatos permanecem no coproporfirinogênio III. Dois grupos propionato nas posições 3 e 8 do coproporfirinogênio III são oxidativamente descarboxilados em grupos vinil pelo O2-requerendo HemF, produzindo protoporfirinogênio IX [Breckau03]. No aeróbico facultativo E. coli e Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium, um O2-enzima independente, coproporfirinogênio desidrogenase (HemN) pode funcionar em condições anaeróbias. HemN contém um O2aglomerado de ferro-enxofre sensível [Camada03] (ver via heme b biossíntese II (independente de oxigênio)).

Na próxima etapa, seis elétrons são removidos do protoporfirinogênio IX por uma oxidase associada à membrana (HemG), formando a protoporfirina IX. No E. coli sob condições aeróbias, esta enzima usa ubiquinona como aceitador de elétrons acoplado a citocromo e mdashubiquinol oxidases com oxigênio como o aceitador de elétrons final, enquanto sob condições anaeróbicas, a oxidação é acoplada à redução de nitrato ou fumarato [Mobius10]. A etapa final de formação do heme (protoheme IX) é catalisada pela ferroquelatase, que insere Fe 2+ na protoporfirina IX.