Em formação

O que acontece com a sequência de sinal da proteína precursora depois que ela é clivada?


Para onde essa sequência de sinal "vai" depois de ter sido clivada pela peptidase de sinal e qual é sua próxima função?


Após a clivagem, a sequência de sinal é geralmente considerada degradada por proteases intramembrana (uma vez que está embutida na membrana do retículo endoplasmático). Para pelo menos algumas proteínas, a sequência de sinal é posteriormente processada e liberada no citoplasma ou lúmen ER.

Martoglio B. 2003. Proteólise intramembrana e funções pós-direcionamento de peptídeos de sinal. Biochem Soc Trans 31: 1243-1247

Quando a translocação continua, a região c da sequência de sinal aparece no lúmen ER e torna-se acessível à peptidase de sinal, que cliva a sequência de sinal da pré-proteína. Este último é translocado para o lúmen ER, enquanto o peptídeo sinal liberado geralmente não é detectado em sistemas de ensaio, implicando em rápida degradação. Em um sistema in vitro sem células com membranas ER do pâncreas canino, relatamos há vários anos que, após a clivagem pela peptidase de sinal, o peptídeo de sinal liberado é transitoriamente incorporado na bicamada lipídica e sofre processamento adicional para ser liberado da membrana.


A atividade das sequências de sinal liberadas não é totalmente conhecida e apenas parcialmente caracterizada para algumas proteínas. A revisão a seguir discute algumas funções dos peptídeos de sinal após a clivagem:

Martoglio B, Dobberstein B. 1998. Sequências de sinal: mais do que apenas peptídeos gordurosos. Trends Cell Bio 8 (10): 410-415

O peptídeo sinal de preprolactina bovina e gp160 de HIV pode se ligar à calmodulina.

... a sequência de sinal da preprolactina bovina, que consiste em 30 resíduos de aminoácidos, é clivada pela peptidase de sinal e, em seguida, processada por um peptídeo de sinal desconhecido (SPPase; Fig. 4) ... Este fragmento de peptídeo de sinal reside inicialmente na membrana e, após um período de perseguição, é liberado no citosol. Uma vez no citosol, o fragmento do peptídeo sinal liga-se à calmodulina de uma maneira dependente de Ca2 +. Um fragmento de peptídeo de sinal derivado de HIV-1 gp160 também se liga à calmodulina quando é liberado no citosol ... Com suas regiões n tendo o potencial de formar uma hélice α anfifílica básica e sua região C-terminal hidrofóbica, eles são semelhantes a outros domínios de ligação à calmodulina. A calmodulina é uma pequena proteína ácida envolvida na regulação de muitos processos celulares controlados por vias de sinalização dependentes de Ca2 +. É possível que a ligação de fragmentos de peptídeo sinal à calmodulina influencie as vias de transdução de sinal celular dependentes de Ca2 + / calmodulina. Mais estudos são necessários para elucidar as consequências fisiológicas das interações entre os fragmentos do peptídeo sinal e a calmodulina.

Os peptídeos de sinal de proteínas MHC classe I são apresentados às células NK por MHC-I (com cadeia alfa HLA-E). Isso permite o monitoramento da expressão de MHC-I, que muitas vezes é interrompida em células infectadas por vírus ou cancerosas.

Os peptídeos apresentados pelas moléculas clássicas de MHC de classe I representam o amplo espectro de peptídeos gerados pelo proteassoma. Em contraste com esta utilização geral de péptidos, apenas um fragmento de péptido de sinal muito específico é apresentado pelas chamadas moléculas MHC de classe I não clássicas (HLA-E em humanos). Estas moléculas monitoram a presença de moléculas MHC clássicas de classe I, apresentando um fragmento de peptídeo sinal derivado de HLA-A, -B ou -C para células assassinas naturais (NK) (Fig. 5b). As células NK destroem as células incapazes de ativar os receptores inibitórios específicos para as moléculas MHC de classe I.


Esta seção do livro discute a função dos peptídeos de sinal em alguns vírus:

Kapp K, Schrempf S, Lemberg MK, Dobberstein B. 2009. Funções pós-direcionamento de peptídeos de sinal. In: Protein Transport into the Endoplasmic Reticulum, Zimmermann R.


Explicação da bioinformática: clivagem proteolítica

A clivagem proteolítica é basicamente o processo de quebrar as ligações peptídicas entre os aminoácidos nas proteínas. Este processo é realizado por enzimas chamadas peptidases, proteases ou enzimas de clivagem proteolítica.

As proteínas freqüentemente sofrem processamento proteolítico por enzimas proteolíticas específicas (proteases / peptidases) antes da maturação final da proteína. As proteínas também podem ser clivadas como resultado do processamento intracelular de, por exemplo, proteínas mal dobradas. Outro exemplo de processamento proteolítico de proteínas são proteínas secretoras ou proteínas direcionadas a organelas, que têm seu peptídeo sinal removido por peptidases sinalizadoras específicas antes da liberação para o ambiente extracelular ou organela específica.

  • Os resíduos de metionina N-terminal são frequentemente removidos após a tradução.
  • Peptídeos de sinal ou sequências de direcionamento são removidos durante a translocação através de uma membrana.
  • As proteínas virais que foram traduzidas de um mRNA monocistrônico são clivadas.
  • Proteínas ou peptídeos podem ser clivados e usados ​​como nutrientes.
  • As proteínas precursoras são freqüentemente processadas para produzir a proteína madura.

A clivagem proteolítica de proteínas mostrou sua importância em experimentos de laboratório, onde muitas vezes é útil trabalhar com fragmentos de peptídeos específicos em vez de proteínas inteiras.

As proteases também têm aplicações comerciais. Como exemplo, as proteases podem ser usadas como detergentes para a clivagem de manchas proteicas em roupas.

A nomenclatura geral das posições dos locais de clivagem do substrato foi formulada por Schechter e Berger, 1967-68 [Schechter e Berger, 1967], [Schechter e Berger, 1968]. Eles designam o local de clivagem entre P1-P1 ', incrementando a numeração na direção N-terminal da ligação peptídica clivada (P2, P3, P4, etc.). No lado carboxil do local de clivagem, a numeração é incrementada da mesma maneira (P1 ', P2', P3 'etc.). Isso é visualizado na figura 16.27.


Figura 16. 27: Nomenclatura do substrato peptídico. O substrato é clivado entre as posições P1-P1 '.

As proteases geralmente têm um local de reconhecimento específico onde a ligação peptídica é clivada. Como um exemplo, a tripsina apenas cliva em resíduos de lisina ou arginina, mas não importa (com algumas exceções) qual aminoácido está localizado na posição P1 '(carboxiterminal do local de clivagem). Outro exemplo é a trombina que cliva se uma arginina for encontrada na posição P1, mas não se um D ou E for encontrado na posição P1 'ao mesmo tempo. (Veja a figura 16.28).


Figura 16. 28: Hidrólise da ligação peptídica entre dois aminoácidos. A tripsina cliva inespecificamente em resíduos de lisina ou arginina, enquanto a trombina cliva em argininas se asparato ou glutamato estiverem ausentes.

Abordagens de bioinformática são usadas para identificar potenciais locais de clivagem de peptidase. Os fragmentos podem ser encontrados examinando a sequência de aminoácidos em busca de padrões que correspondam ao local de clivagem correspondente para a protease. Ao identificar fragmentos clivados, é relativamente importante saber o peso molecular calculado e o ponto isoelétrico.


& ltp> Esta seção fornece qualquer informação útil sobre a proteína, principalmente conhecimento biológico. & ltp> & lta href = '/ help / function_section' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Função i

S1 anexa o vírion à membrana celular, interagindo com receptores celulares contendo ácido siálico, iniciando a infecção.

anexa o vírion à membrana celular, interagindo com o receptor do hospedeiro, iniciando a infecção.

& # xd & ltp> Informações validadas manualmente geradas pelo sistema de anotação automática UniProtKB. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / evidences # ECO: 0000255"> Mais. & lt / a> & lt / p> & # xd Asserção manual de acordo com as regras i

medeia a fusão do vírion e das membranas celulares, agindo como uma proteína de fusão viral de classe I. No modelo atual, a proteína tem pelo menos três estados conformacionais: estado nativo de pré-fusão, estado intermediário pré-grampo e estado em grampo pós-fusão. Durante a fusão da membrana viral e da célula alvo, as regiões da bobina enrolada (repetições do heptal) assumem uma estrutura de trímero de grampos de cabelo, posicionando o peptídeo de fusão em estreita proximidade com a região C-terminal do ectodomínio. A formação dessa estrutura parece conduzir a aposição e subsequente fusão das membranas virais e das células-alvo.

Asserção manual de acordo com as regras i

Age como um peptídeo de fusão viral que é desmascarado após a clivagem S2 que ocorre após a endocitose do vírus.

Asserção manual de acordo com as regras i

& ltp> O projeto & lta href = "http://www.geneontology.org/"> Gene Ontology (GO) & lt / a> fornece um conjunto de vocabulário controlado hierárquico dividido em 3 categorias: & ltp> & lta href = '/ help / gene_ontology 'target =' _ top '> Mais. & lt / a> & lt / p> GO - Função molecular i

    Fonte: UniProtKB & # xd & ltp> Declaração do autor não rastreável & lt / p> & # xd & # xd & ltp> Usado para declarações no resumo, introdução ou discussão de um artigo que não pode ser rastreado até outra publicação. & Lt / p> & # xd & # xd & ltp> Mais informações no & lta href = "http://geneontology.org/page/guide-go-evidence-codes#nas"> Guia do código de evidência GO & lt / a> & lt / p> & # xd Declaração do autor não rastreável i

      GO - Processo biológico i

      & ltp> Palavras-chave UniProtKB constituem um & lta href = "http://www.uniprot.org/keywords"> vocabulário controlado & lt / a> com uma estrutura hierárquica. Palavras-chave resumem o conteúdo de uma entrada UniProtKB e facilitam a busca por proteínas de interesse. & Ltp> & lta href = '/ help / keywords' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Palavras-chave i

      Bancos de dados de enzimas e vias

      SABIO-RK: Banco de dados de cinética de reação bioquímica


      CAPÍTULO 9 - TRANSDUÇÃO DE SINAL

      A apoptose não requer nova transcrição ou tradução, sugerindo que a maquinaria molecular necessária para a morte celular permanece latente na célula e requer apenas ativação apropriada. Quais são os "sinais" que induzem a apoptose?

      • um hormônio (como a tiroxina, que causa apoptose nas caudas dos girinos
      • uma falta de um sinal de & quotSurvival & quot (que inibe a apoptose), como um fator de crescimento
      • uma célula: contato de uma célula adjacente

      MECANISMOS E REGULAÇÃO DA APOPTOSE:

      A caracterização dos mecanismos apoptóticos e agentes celulares começou com o estudo de C. elegans, um verme redondo. O verme maduro tem cerca de 1000 células. Durante o desenvolvimento, 131 células morrem. Duas mutações foram encontradas nas quais as células 131 não morreram. Essas mutações foram chamadas de ced3 e ced4 (ced apoia cetudo death). A sequência de ced 3 era muito homóloga a uma proteína chamada eunterleucina cconvertendo enzyme (GELO), que é necessária para a ativação proteolítica do precursor da interleucina 1, um hormônio proteico liberado por certas células do sistema imunológico durante a ativação e que pode promover a inflamação. Isso sugeriu que a proteólise era necessária para a apoptose. Estudos subsequentes mostram que toda uma família de proteases (cerca de 10 em humanos) chamadas caspases (o ICE foi renomeado como caspase 1) são necessárias para a morte celular programada. Estas proteases são encontradas na célula em uma forma inativa que deve sofrer proteólise limitada para ativação. Essas caspases formam uma cascata de proteases que são ativadas neste processo. São endoproteases com sítio ativo Cys (C) e clivar no lado C-terminal dos resíduos Asp (asp) e, portanto, são conhecidos como caspases - cys contendo-asp proteína específicaases).

      O ICE não está normalmente envolvido na apoptose, mas sua ativação artificial em células de mamíferos em cultura pode levar a ela. Cada caspase tinha a mesma sequência que foram projetadas para clivar, então tornou-se evidente que elas provavelmente clivam umas às outras em um mecanismo de cascata de ativação, semelhante à cascata de protease de coagulação de ativação de precursores (zimogênios) de serina proteases que ativam a próxima em as séries. Duas séries de caspases parecem estar envolvidas. Um conjunto inicia o processo de ativação da caspase. Assim como no sistema de coagulação, a questão do que ativa a primeira caspase parecia problemática até que os investigadores descobriram que a caspase iniciadora pode ser ativada se agregarem a uma concentração crítica. Isso pode ocorrer pela ligação de uma molécula de sinal de suicídio na superfície da célula. Mudanças conformacionais no receptor podem levar à agregação de moléculas receptoras de superfície com agregação concomitante de caspases intracelulares que interagem com os receptores agregados.

      Sinais intracelulares

      Como os ativadores intracelulares da apoptose (como radiação ou espécies reativas de oxigênio) funcionam. A pesquisa indicou o envolvimento das mitocôndrias na via apoptótica. Acredite ou não, citocromo C, a proteína heme que atua como um transportador móvel de elétrons solúvel em água na fosforilação oxidativa mitocondrial, transportando elétrons através da citocromo C oxidase ou complexo IV, vaza do espaço intermembrana e se liga a uma proteína citoplasmática chamada Apaf-1 para umapoptótico protease umacativante fator-1. Isso então ativa um iniciador caspase-9 no citoplasma.

      Essas proteínas parecem vazar da mitocôndria após um colapso do potencial eletroquímico através da membrana interna. O potencial colapsa como consequência da abertura de um canal denominado membrana interna não específica poro de transição de permeabilidade, composto por uma proteína da membrana interna (umadenine nucleotida translocator - formiga) e uma proteína da membrana externa (porina, a vportão de oltagemd umanião cHannel - VDAC) Essas proteínas agem juntas, provavelmente em locais onde as membranas interna e externa estão em contato. Este canal passa por qualquer coisa menor que o peso molecular 1500. O colapso do gradiente de prótons desacopla a oxidação e a fosforilação na mitocôndria. Mudanças na força iônica causam um inchaço da matriz. Como a membrana interna é altamente convoluta e tem uma área de superfície muito maior do que a membrana externa, o inchaço da matriz leva à ruptura da membrana externa, espalhando as proteínas do espaço da membrana interna (citocromo C e Apaf-1) no citoplasma.

      1. ruptura de ox-phos. e o transporte de elétrons, causado pela irradiação e certos segundos mensageiros, como a ceramida.
      2. mudanças no potencial redox celular e geração de rativo oxygen species (ROS).
      3. danos ao DNA (causados ​​por radiação, ROS, etc). Uma proteína chamada p53 é frequentemente expressa em células com danos no DNA. A expressão desta proteína resulta na inibição da divisão celular, ou apoptose, ambas as quais impediriam a célula danificada de se tornar uma célula tumoral. Portanto, o gene p53 é um gene supressor de tumor. É inativado por mutação em aproximadamente 50% de todas as células tumorais humanas estudadas. O p53 pode induzir a expressão gênica. Dos 14 diferentes genes cuja expressão é significativamente alterada pelo p53, muitos parecem ser usados ​​pelas células para gerar ou responder ao estresse oxidativo. As células sofrem apoptose de p53 por dano oxidativo.
      4. aumenta em íons de cálcio intracelular por meio de transdução de sinal.
      1. condensação do núcleo da célula e quebra em pedaços
      2. condensação e fragmentação do citoplasma em corpos apoptóticos ligados à membrana
      3. quebrar cromossomos em fragmentos contendo vários números de nucleossomos (uma escada de nucleossomos)

      Como a ativação da caspase leva a esses eventos? Foi descoberta uma proteína que, quando clivada por uma caspase, leva à ruptura nuclear. A proteína-alvo geralmente está ligada a outra proteína, uma endonuclease de DNA. Quando a proteína alvo é clivada, a DNase fica livre para migrar para o núcleo e iniciar a execução. As alterações da membrana na apoptose ocorrem quando a caspase 3 cliva a gelsolina, uma proteína envolvida na manutenção da morfologia celular. A gelsolina clivada cliva os filamentos de actina dentro da célula. Outra proteína é necessária para formar corpos apopóticos: uma quinase chamada quinase 2 ativada por p21 (PAK-2). Esta quinase é ativada pela caspase-3 por proteólise limitada. As caspases também clivam a proteína precursora de beta-amilóide, que pode gerar mais proteína beta-amilóide, causando morte de células neurais em pacientes com Alzheimer.

      Controle de apoptose

      Deve ficar claro que as células mantêm um controle rígido sobre as caspases. Dois agentes que parecem inibir a apoptose são as proteínas mitocondriais Bcl-2 e Bcl-X, que pode bloquear a liberação do citocromo C da mitocôndria. A família de proteínas Bcl tem uma cauda hidrofóbica e se liga à superfície externa da mitocôndria e de outras organelas, como o núcleo e o retículo endoplasmático. Essas proteínas parecem ser capazes de formar canais iônicos em lipossomas. Até agora, 15 membros desta família (aparentados com ced-9 de C. elegans) foram descobertos em humanos. Bcl-2 também pode se ligar a Apaf-1 (mencionado acima) e inibir sua ativação do iniciador caspase-9. O Bcl-2 é regulado por alterações na expressão do gene Bcl-2, por fosforilação pós-tradução por quinases ou por clivagem por caspases. A superexpressão de Bcl-2 pode fazer com que uma célula se torne uma célula tumoral. Outro membro da família, BAX e MAU ligam-se à mitocôndria e facilitam a apoptose, estimulando a liberação do citocromo C.

      Além disso, outras proteínas chamadas IAPde (euinibidores de apoptose) pode inibir a caspase ou outras proteínas apoptóticas. Alguns vírus produzem a protease para manter as células hospedeiras viáveis.

      As células podem ser instruídas a sofrer apoptose por meio de interações da superfície celular com outras células, que geralmente são células imunes. Uma das tarefas da célula imune é destruir uma célula alterada (por exemplo, uma célula infectada por vírus ou uma célula tumoral). As próprias células imunológicas também devem morrer após serem ativadas em uma resposta imunológica. Os linfócitos ativados (como células T citotóxicas ou células natural killer) podem atingir e matar células usando várias maneiras que podem envolver apoptose. Em um, um linfócito ativado se liga a uma célula-alvo (como uma célula infectada por vírus) e segregam perforina, uma proteína que se reúne na membrana da célula-alvo para formar um canal transmembrana. Outras proteínas liberadas pelo linfócito ativado podem entrar na célula-alvo através do poro e iniciar a apoptose. Uma dessas proteínas que entra, granzima B é uma protease que ativa caspases na célula-alvo.

      Células alvo que expressam uma chamada de proteína de membrana específica CD95 (também chamado Fas) também são direcionados para apoptose. Este receptor de proteína, um membro do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR), liga-se a um ligante de proteína de membrana na superfície de um linfócito ativado chamado CD95 Ligante - CD95L- (também chamado de Ligante Fas) Na ligação, os receptores CD95 (Fas) na membrana alvo agregam-se após as alterações de conformação. Uma proteína adaptadora na célula, FADD (domínio de morte associado a Fas) se liga ao domínio citoplasmático agregado (o domínio de morte) de CD95 (Fas) e recruta a caspase-8 inativa para o local, onde sua concentração aumenta. Isso leva à ativação das caspases.

      Esse mecanismo é usado para se livrar dos linfócitos ativados depois que eles concluírem seu trabalho. As células imunes ativadas começam a expressar Fas alguns dias após a ativação, visando sua eliminação. Algumas células que sofreram estresse expressam os ligantes Fas e Fas e se matam. Várias células expressam CD95 (Fas), mas CD95L (Fas-Ligante) é expresso predominantemente por células T ativadas.

      Os eventos da superfície celular também podem inibir a apoptose. A ligação de fatores de "sobrevivência" (como fatores de crescimento) aos receptores da superfície celular pode interromper as vias apoptóticas nas células. Alguns receptores de fator de sobrevivência são acoplados a PI-3-quinase (fosfoinositol-3-quinase) por meio da proteína G ras (p21) que é direcionado para a membrana celular por adição pós-tradução de uma âncora hidrofóbica. A quinase ativada produz PI-3,4-P2 e PI-3,4,5-P3, que ativa Akt, uma proteína quinase Ser / Thr. Essa quinase ativada fosforila a proteína pró-apoptótica BAD, que então se torna inativa. Além disso, a Akt ativa fosforila procapse, que em sua forma fosforilada não interage com o citocromo C, inibindo a apoptose.

      O ponto final da apoptose é o envolvimento da célula fragmentada por uma célula fagocítica (como um macrófago). Em um artigo recente (Nature, 405, pg 85, 2000), foi mostrado que a atividade dos fagócitos poderia ser inibida estereoespecificamente pela adição de fosfatidilserina (PS) à mistura, mas não por outros fospolipídeos negativos. Se você se lembra de nossa descrição de lipídios, PS é encontrado exclusivamente no folículo interno das células vermelhas do sangue). Os pesquisadores clonaram um gene da célula fagocítica para um receptor que reconhece PS. Quando adicionadas aos linfócitos T e B comuns (células do sistema imunológico), essas células também podem absorver células apoptóticas. O gene é homólogo aos genes em Drosophila (mosca da fruta) e C. elegans (verme redondo) sugerindo que é conservado na natureza. A mensagem: quando as células sofrem apopotose, o PS, normalmente encontrado apenas no leaftlet interno, é exposto para o exterior. Ele pode então se ligar a receptores nas células fagocíticas para completar o processo de apoptose.


      & ltp> Esta seção fornece informações sobre a localização e a topologia da proteína madura na célula. & ltp> & lta href = '/ help / subcellular_location_section' target = '_ top'> Mais. & lt / a> & lt / p> Localização subcelular i

      Região extracelular ou secretada

      & # xd & ltp> Informações selecionadas manualmente que foram propagadas de uma proteína caracterizada experimentalmente relacionada. & lt / p> & # xd & # xd & ltp> & lta href = "/ manual / evidences # ECO: 0000250"> Mais. & lt / a> & lt / p> & # xd Asserção manual inferida da semelhança de sequência com i

      Região extracelular ou secretada

      Asserção manual inferida da semelhança de sequência com i

      Asserção manual inferida da semelhança de sequência com i

      Retículo endoplasmático
      Região extracelular ou secretada
      Mitocôndria
      Núcleo
      Outros locais

      Palavras-chave - Componente celular i


      NEUROPRED

      NeuroPred foi escrito para a web usando Python (http://www.python.org) e pode ser acessado em http://neuroproteomics.scs.uiuc.edu/neuropred.html. O objetivo principal da ferramenta NeuroPred é prever os locais de clivagem de precursores de neuropeptídeos usando modelos de regressão logística treinados em informações de clivagem verificadas experimentalmente. Além disso, os indicadores de precisão do modelo e as massas de neuropeptídeos podem ser calculados a partir dos locais de clivagem previstos.

      A entrada necessária para o NeuroPred é uma ou mais sequências, fornecidas no formato FASTA, inseridas diretamente em uma caixa de texto na página ou carregadas por meio de um arquivo de texto. As opções de usuário disponíveis incluem 'Seleção de modelo e saída', 'Opções para modelagem e cálculos de massa' e 'Modificações pós-tradução' (Figura 1).

      Seleção de modelo

      A seleção do modelo padrão é o Motivo conhecido (10) os outros modelos que podem ser selecionados são o Molusco Básico e Complexo de Molusco (11), Mamífero (12) e dois modelos de inseto, um treinado usando o A.mellifera e o outro o D.melanogaster informação genômica (B. R. Southey, A. B. Hummon, T. A. Richmond, S. L. Rodriguez-Zas e J. V. Sweedler, manuscrito submetido). Vários modelos podem ser usados ​​simultaneamente para prever a clivagem na mesma sequência. Detalhes específicos sobre os respectivos modelos, incluindo treinamento, informações de sequência e termos finais, são fornecidos pela Hummon et al . (11), Amare et al . (12) e Southey et al . [(10), B. R. Southey, A. B. Hummon, T. A. Richmond, S. L. Rodriguez-Zas e J. V. Sweedler, manuscrito submetido].

      Seleção de saída

      Na opção padrão, 'Predict Cleavage Sites Only', NeuroPred irá apenas prever os locais de clivagem calculando a probabilidade de clivagem para cada sequência inserida para todos os modelos selecionados. Esta etapa é concluída para todas as opções de saída. Depois de prever os locais de clivagem, o NeuroPred irá computar as estatísticas de precisão do modelo ou realizar cálculos de massa, de acordo com as opções selecionadas.

      Pré-processando

      Antes de prever a probabilidade de clivagem, todas as sequências precursoras passam por uma série de etapas de pré-processamento, descritas em detalhes por Southey et al . (B. R. Southey, A. B. Hummon, T. A. Richmond, S. L. Rodriguez-Zas e J. V. Sweedler, manuscrito submetido). O tamanho da janela e a localização do local de clivagem dentro da janela são determinados pelo modelo selecionado, a possibilidade de clivagem é considerada apenas em um local básico. Os componentes de pré-processamento que podem ser alterados pelo usuário são o comprimento do peptídeo sinal e o número mínimo de aminoácidos ao redor do local de clivagem. O comprimento do peptídeo sinal pode ser especificado pelo usuário, este comprimento se torna o valor global que é usado para todas as sequências precursoras. Alternativamente, o comprimento do peptídeo sinal pode ser incluído no marcador FASTA de cada sequência, que substitui o valor global e pode variar entre as sequências. O exame de uma ampla gama de precursores e da estrutura da furina (14) sugere que um número mínimo de aminoácidos em torno do local de clivagem é necessário para que a clivagem ocorra, portanto, o número mínimo de aminoácidos, precedendo e após o local de clivagem, pode também ser especificado pelo usuário.

      Previsão de clivagem

      A previsão da clivagem é obtida calculando a probabilidade de clivagem a partir da regressão logística (15) ou modelos de Motivos conhecidos para cada local de clivagem possível. A probabilidade prevista de clivagem é comparada com um limite predefinido e convertida em previsões de clivagem ou não clivagem. Uma probabilidade limite padrão de 50% e um intervalo de confiança padrão de 95% são exibidos para os sites com previsão de clivagem. O intervalo de confiança assimétrico reflete a natureza não gaussiana do evento predito e espaço de parâmetros das probabilidades entre 0 e 1 (15). Tanto a probabilidade limite quanto a cobertura do intervalo de confiança podem ser modificadas pelo usuário.

      Saída de clivagem prevista

      Após a seleção da opção básica "Prever locais de clivagem apenas", a saída resultante para cada precursor é um diagrama que inclui a sequência e os locais de clivagem previstos (semelhante à Figura 2). Um ‘C’ abaixo das combinações de localização de aminoácidos indica que a probabilidade prevista de clivagem naquele aminoácido ultrapassou o limite de probabilidade de clivagem definido pelo usuário. A probabilidade prevista de clivagem e os limites de intervalo de confiança de 95% associados são exibidos para as combinações de localização de aminoácidos que se prevê serem clivadas. O resto das combinações de localização de aminoácidos são denotadas com um '.' Para indicar uma previsão não clivada. Quando vários modelos são selecionados, os locais de clivagem previstos para cada abordagem são relatados no mesmo diagrama, permitindo assim a comparação direta dos locais de clivagem previstos.

      Estatísticas de precisão do modelo

      O NeuroPred também pode avaliar o desempenho da abordagem selecionada. Ao comparar as clivagens previstas com as informações de clivagem inseridas pelo usuário, as estatísticas de precisão do modelo são fornecidas para cada sequência de precursor individual e em todas as sequências de precursor inseridas.

      Essas estatísticas de precisão são geradas selecionando a opção de saída, ‘Prever locais de clivagem e calcular estatísticas de precisão do modelo’. NeuroPred irá calcular várias estatísticas de precisão de modelo com base nos sites de clivagem previstos e informações de clivagem fornecidas pelo usuário ou "conhecidas". A informação de clivagem conhecida é inserida como uma linha seguindo a sequência em que '0' indica nenhuma clivagem e '1' indica clivagem. Observe que, ao selecionar esta opção de saída, se as informações fornecidas pelo usuário não forem inseridas ou inseridas incorretamente, o NeuroPred irá prever os locais de clivagem, mas não fornecerá as estatísticas de precisão.

      A saída da seleção de estatísticas de precisão do modelo é semelhante à da opção 'Predict Clivage Sites Only', além disso, as informações de clivagem inseridas pelo usuário também são representadas no diagrama de saída (Figura 2) para auxiliar na visualização de corretos e incorretos previsões. Os sites de clivagem que excedem a probabilidade limite especificada são denotados como previsões verdadeiras ou falsas. Além disso, os limites de probabilidade e intervalo de confiança são fornecidos para locais de clivagem conhecidos que não excedem a probabilidade limite especificada.

      A opção ‘Prever locais de clivagem e calcular estatísticas de precisão do modelo’ fornece estatísticas de precisão do modelo para cada precursor e em todos os precursores, usando probabilidades de limite que variam de 0,1 a 0,9. Para cada precursor, o desempenho do modelo é avaliado usando o número de previsões de clivagem correta (resultado positivo verdadeiro), clivagem incorreta (resultado falso positivo), não clivagem correta (resultado negativo verdadeiro) e não clivagem incorreta (resultado falso negativo) ao longo do comprimento do precursor. Esses valores são então resumidos em todos os precursores inseridos. A adequação da abordagem para a clivagem do modelo é avaliada em todos os precursores usando as seguintes estatísticas:

      Taxa de classificação correta: número de sites previstos corretamente dividido pelo número total de sites.

      Sensibilidade (um menos taxa de falsos positivos): número de verdadeiros positivos dividido pelo número total de locais clivados.

      Especificidade (um menos taxa de falsos negativos): número de verdadeiros negativos dividido pelo número total de locais não clivados.

      Poder preditivo positivo (proporção de sites com previsão de clivagem que são verdadeiros positivos): número de verdadeiros positivos dividido pelo número total de sites com previsão de clivagem.

      Poder preditivo negativo (proporção de sites que não estão previstos para serem clivados que são negativos verdadeiros): número de negativos verdadeiros dividido pelo número total de sites previstos para não serem clivados.

      Coeficiente de correlação: coeficiente de correlação de Mathew (16) entre a clivagem observada e a prevista.

      A área sob a característica do operador do receptor ou curva ROC relaciona a sensibilidade e 1-especificidade (17). Valores de área inferiores a 0,7 indicam desempenho ruim do modelo.

      Predição de massa de peptídeo

      A massa de peptídeos previstos para múltiplos precursores pode ser calculada por NeuroPred, onde as massas dos peptídeos são calculadas usando modificações pós-tradução de neuropeptídeos comuns. Para aplicações que usam espectrometria de massa, uma lista de peptídeos intermediários e finais e suas massas associadas oferece informações mais completas sobre os peptídeos derivados de precursores do que uma lista de massas de peptídeos finais.

      Os peptídeos são determinados usando os resultados do modelo. Especificamente, os locais básicos são previstos como não clivados quando há um consenso dos modelos selecionados para não clivagem. A sequência, após a remoção do peptídeo sinal especificado para cada precursor, é clivada nos locais básicos restantes para fornecer peptídeos de comprimentos diferentes. A fim de contabilizar quaisquer clivagens falsamente previstas e diferentes previsões de modelos, os peptídeos que são adjacentes na sequência são unidos (assumindo que a clivagem não ocorreu) e essas massas adicionais são incluídas na saída. Este processo de união de peptídeos pode ser estendido até, mas não incluindo, a sequência completa após a remoção do peptídeo sinal especificado.

      As opções para controlar a saída da previsão de massa incluem: o número de locais adjacentes que podem ser unidos, a faixa de tamanhos de massa e o número máximo de aminoácidos de um peptídeo previsto resultante da clivagem. Os peptídeos resultantes são então processados ​​usando uma variedade de modificações pós-tradução possíveis - com a remoção de aminoácidos básicos terminais, amidação e piroglutaminação sendo selecionadas por padrão. Outras modificações não padrão podem ser selecionadas. As modificações pós-tradução selecionadas são aplicadas a cada peptídeo quando apropriado, resultando em peptídeos adicionais. The average and monoisotopic masses are calculated for every peptide.

      The output ( Figure 3 ) includes a list of peptides and the mass calculation table. The columns of the mass calculation table are the abbreviation of the sequence, the post-translational modifications applied to that sequence, the average and monoisotopic masses, and the full sequence. The user can sort the list of peptides by the combination of actual sequence location of the peptide and post-translational modification, or by either the average or monoisotopic mass.


      Western blotting (or immunoblotting) is a commonly used molecular biology technique for analyzing proteins. The predicted protein molecular weight (MW) is the sum of all protein amino acid MWs. It can be calculated using, for example, the online ExPASy tool. However, the calculated MW may be different from that observed on the Western blot. The figure below summarizes the most common reasons as to why this may occur (Figure 1).

      Figure 1. The most common reasons for differences between observed and theoretical MWs. Credit: Proteintech.

      1. The signal peptide (and a pro-peptide) gets cleaved off

      Many proteins that are transported through the secretory pathway have signal peptides of 15–35 amino acids in length, located predominantly at their N-termini. They are often cleaved by various proteases during subcellular transport, resulting in the mature protein running at a lower than predicted MW. The presence of a signal peptide can be predicted using various online tools or may be established based on previously published data. They are usually well annotated in protein databases, e.g., UniProt. Additionally, a subset of proteins has pro-peptides – protein domains that are present in protein precursors. Protein precursors need to be processed by proteases in order to engender a functional product, without a pro-peptide (Figure 2).

      2. Post-translational modifications (PTMs)

      PTMs are covalent modifications of proteins that occur after their synthesis. Many modifications are catalyzed by enzymes that reside within the secretory pathway, i.e. the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. PTMs are important regulators of protein-protein interactions, protein stability, function, enzymatic activity, and localization. The most common modification is phosphorylation, which occurs predominantly on serine, tyrosine and threonine residues. Phosphorylation, like many other PTMs, is often transient – kinases catalyze the attachment of the phosphoryl groups, while phosphatases remove them. Most proteins undergo N-terminal acetylation, an enzymatic reaction catalyzed by N-terminal acetyltransferases (NATs). Some amino acid residues can be linked with oligosaccharides in a process known as N- and O-linked glycosylation. Ubiquitination, the addition of ubiquitin, is a common initial step for proteasome degradation. You can find out more about PTMs here.

      Glycosylation and glycanation

      Most proteins that are synthesized on ribosomes associated with the endoplasmic reticulum undergo glycosylation. This means that a covalent attachment of sugar moieties is added to the polypeptide chain.

      Fosforilação

      One of the most common PTMs is protein phosphorylation, which takes place on serine, threonine, and tyrosine residues. Phosphorylation regulates protein function, its enzymatic activity, protein–protein interactions, and protein localization.

      The addition of a single phosphoryl group adds +/- 1 kDa to the MW, which is often beyond the resolution of the standard SDS-PAGE. However, multiple phosphorylation sites can lead to more prominent MW changes.

      Ubiquitinação

      Protein ubiquitination means a covalent ubiquitin is added to lysine, cysteine, serine, threonine, or directly to the protein N-terminus. Ubiquitination via the proteome can mark proteins for degradation.

      3. Complexos de proteínas

      The majority of protein complexes consist of proteins associated by non-covalent bonds. These interactions are destroyed during sample preparation and electrophoresis, and individual proteins run as monomers. This is due to the fact that SDS-PAGE for Western blotting is performed in reducing conditions. Despite this, some protein complexes are not fully disrupted, and proteins can still exist in the form of homo- or heteromeric complexes, even in the presence of reducing agents, such asSDS and β-Mercaptoethanol. The observed MW of the complexes is subsequently higher than the calculated MW of monomers. It is also common to observe multiple bands that represent monomeric and complex species (Figure 3).

      Note: 20% β-Mercaptoethanol (or 100 mM DTT) for the 4X SDS sample buffer might help to remove unspecific bands due to dissociation of the protein complex.

      Figure 3: NQO1 (11451-1-AP) is an enzyme that serves as a quinone reductase together with conjugation reactions of the hydroquinones involved in detoxification pathways as well as in biosynthetic processes such as the vitamin K-dependent gamma-carboxylation of glutamate residues in prothrombin synthesis. NQO1 has three isoforms: 26, 27, and 31 kDa MW, and the formation of homodimers (66-70 kDa) is needed for its enzymatic activity.

      Mlx-interacting protein (MLXIP, also known as MONDOA) (13614-1-AP) acts as a transcription factor forming a heterodimer with MLX protein. This complex binds and activates transcription from CACGTG E boxes, playing a role in the transcriptional activation of the glycolytic target and glucose-responsive gene regulation. MLXIP has three isoforms: 110, 57, and 69 kDa, and the MW of the MLXIP-MLX heterodimer is 130 kDa.
      Credit: Proteintech.

      4. Protein isoforms

      In eukaryotes, newly transcribed pre-mRNAs undergo differential mRNA maturation steps, leading to mRNA species that differ in the number and length of exons – protein-coding sequences. Protein variants of the same gene are regarded as protein isoforms. Protein isoforms can differ in tissue expression patterns and they can have distinctive physiological roles. Because of their varied exon content, protein isoforms can differ in MW (Figure 4). Additionally, mRNAs can bear more than one translation start site (TSS) marking the start of the N-terminus of proteins. The use of multiple TSSs creates protein isoforms with a distinct N-terminus and hence different MW.

      Figure 4: GLS, also known as GLS1 and KIAA0838, belongs to the glutaminase family. Three isoforms of GLS, named KGA, GAM, and GAC, vary in their MW and tissue expression patterns (PMID: 11015561). KGA, kidney-type glutaminase, has an MW of 65 kDa. GAC, glutaminase C, is 58 kDa, being a product of gene splicing that results in loss of the C-terminal domain that is present in KGA. GAM is the shortest isoform with no catalytic activity and comes into being from the inclusion of intron 2 and a premature stop codon (12855-1-AP detects KGA and GAC isoforms, 20170-1-AP is specific to KGA, 23549-1-AP is specific to all three (KGA, GAM, GAC) isoforms of GLS, and 19958-1-AP is specific to GAC).


      5. Technical obstacles

      Experimental validation with appropriate controls is vital to verify whether detected bands represent a protein of interest. Good positive controls are a recombinant target protein, or a cell lysate from a cell line that expresses or overexpresses the analyzed protein. Purified recombinant protein enables easy detection in a non-complex environment, and purified proteins can therefore act as a reference standard. However, it must be noted that recombinant mammalian proteins made in bacterial, yeast, or insect expression systems can have different PTMS. Because of these differences, recombinant proteins can differ in MW compared to the proteins naturally occurring in mammalian cells and tissues. Running a lysate sample from a cell line with an overexpressed target protein that is additionally tagged is particularly useful because tagged protein can be detected by two antibodies: an antibody against the analyzed protein and an antibody against the tag. This allows a comparison of the band pattern between the two antibodies and can identify protein-specific bands and any cross-reactivity. However, the addition of a tag can also affect protein PTMs, proteolytic processing, and the folding and stability of proteins – hence protein tagging has to be undertaken with caution. Cell lysates with low expression levels of the target protein (siRNA/shRNA or CRISPR-mediated knock out) are good negative controls where specific bands should have been less intense with an equal sample load.

      The choice of extraction buffer is essential in decreasing the effect of antibody cross-reactivity. If the analyzed protein is cytoplasmatic, a mild extraction buffer that does not extract nuclear proteins (e.g., using saponin as a detergent) may be more suitable to lower non-specific cross-reactivity with nuclear proteins. Following the transfer of the protein from polyacrylamide gel onto a membrane, the type of blocking buffer, incubation times of membranes with primary and secondary antibodies, and washing step all require optimization. It is recommended to compare different antibody types raised against the target protein. If cross-reactivity is detected with polyclonal antibodies, it may not be seen with monoclonal antibodies that are raised against a specific epitope rather than the whole protein sequence or a larger protein fragment.

      b. Unspecific proteolytic cleavage and protein degradation

      Proteins can be subject to non-specific proteolytic cleavage and degradation. The breaking down of cells and tissues releases extra- and intracellular proteases that can cleave proteins into polypeptides. Therefore, it is vital to supplement lysis buffers with protease inhibitors that block the activity of proteases. A suggestion is to perform cell lysis on ice to further prevent protein degradation. Both proteolytic cleavage and degradation can affect proteins to various degrees and result in protein fragments with a lower MW.

      2. Antibody is detecting a protein isoform with a longer sequence (see point 4).

      3. Protein complexes (see point 3).

      1. Cleavage of signal peptide (see point 1).

      2. Antibody is detecting a protein isoform with a shorter sequence (see point 4).

      3. Unspecific protein cleavage (see point 5b).

      1. Protein isoforms (see point 4).

      2. One protein product but with different posttranslational modifications (see point 2).

      3. Antibody is detecting protein with and without pro-peptide (see point 1).

      4. Protein complexes (see point 3).

      5. Antibody cross-reactivity (see point 5a), potentially due to homology of the immunogen sequence.

      1. Protein cleavage (see point 5b).

      2. Protein degradation (see point 5b).

      - Make sure to include appropriate controls (see point 5a).

      - It is possible that further protocol optimization is needed (see point 5a).


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      Key events in protein synthesis

      • First, ribosomes attach firmly to the ER membrane by its large subunit. Almost all proteins made on the ER have a stretch of largely hydrophobic amino acids.
      • The initial binding of the ribosome to the RER is mediated by the nascent polypeptide chain. This nascent polypeptide chain act as a signal with which the growing chain can attach to the membrane.
      • The signal sequence translated on a free ribosome and then it binds the synthesizing complex to the ER. About 70 amino acids translated before the SRP stops it. This SRP binds the protein-synthesizing complex via a docking protein.
      • Now, a signal peptidase cuts off the signal. The N-terminus is now in the ER lumen and the signal peptide cleaved. Cleavage of the signal peptide appears an essential event for the functioning of the protein translated after it.
      • After cleavage, modification of proteins will occur which include glycosylation, hydroxylation, carboxylation and the formation of disulfide bonds.
      • ribosomes and mRNA released just after translation completes.

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