Em formação

7.17A: Proteína Ativadora de Catabólito (CAP) - Um Regulador Ativador - Biologia


objetivos de aprendizado

Explique como um ativador funciona para aumentar a transcrição de um gene

Assim como o operon trp é negativamente regulado por moléculas de triptofano, existem proteínas que se ligam às sequências operadoras que atuam como um regulador positivo para ligar os genes e ativá-los. Por exemplo, quando a glicose é escassa, E. colias bactérias podem recorrer a outras fontes de açúcar como combustível. Para fazer isso, novos genes para processar esses genes alternativos devem ser transcritos. Esse tipo de processo pode ser observado no operon lac, que é ativado na presença de lactose e na ausência de glicose.

Quando os níveis de glicose caem, o AMP cíclico (cAMP) começa a se acumular na célula. A molécula de cAMP é uma molécula de sinalização que está envolvida no metabolismo de glicose e energia em E. coli. Quando os níveis de glicose diminuem na célula, o acúmulo de cAMP liga-se à proteína ativadora catabólica reguladora positiva (CAP), uma proteína que se liga aos promotores de operons que controlam o processamento de açúcares alternativos, como o operon lac. O CAP auxilia na produção na ausência de glicose. CAP é um ativador transcricional que existe como um homodímero em solução, com cada subunidade compreendendo um domínio de ligação ao ligante no terminal N, que também é responsável pela dimerização da proteína e um domínio de ligação ao DNA no terminal C. Duas moléculas de cAMP ligam-se ao CAP dimérico com cooperatividade negativa e funcionam como efetores alostéricos, aumentando a afinidade da proteína para o DNA. CAP tem uma estrutura característica de hélice-volta-hélice que permite que ele se ligue a sucessivas ranhuras principais no DNA. Isso abre a molécula de DNA, permitindo que a RNA polimerase se ligue e transcreva os genes envolvidos no catabolismo da lactose. Quando o cAMP se liga ao CAP, o complexo se liga à região do promotor dos genes que são necessários para usar as fontes alternativas de açúcar. Nestes operões, um sítio de ligação de CAP está localizado a montante do sítio de ligação de ARN-polimerase no promotor. Isso aumenta a capacidade de ligação da RNA polimerase à região do promotor e a transcrição dos genes. Como o cAMP-CAP é necessário para a transcrição do operon lac, este requisito reflete a maior simplicidade com que a glicose pode ser metabolizada em comparação com a lactose.

Pontos chave

  • A proteína ativadora catabólica (CAP) deve se ligar ao cAMP para ativar a transcrição do operon lac pela RNA polimerase.
  • CAP é um ativador transcricional com um domínio de ligação ao ligante no terminal N e um domínio de ligação ao DNA no terminal C.
  • As moléculas de cAMP se ligam a CAP e funcionam como efetores alostéricos, aumentando a afinidade de CAP para o DNA.

Termos chave

  • RNA polimerase: uma RNA polimerase dependente de DNA, uma enzima, que produz RNA
  • operon: uma unidade de material genético que funciona de maneira coordenada por meio de um operador, um promotor e genes estruturais que são transcritos juntos
  • promotor: a seção de DNA que controla a iniciação da transcrição de RNA

7.17A: Proteína Ativadora de Catabólito (CAP) - Um Regulador Ativador - Biologia

A abertura anterior, mais frequentemente referida como yan, é um fator de transcrição que serve para inibir neural e outros tipos de diferenciação. Quando yan é inativado, a diferenciação continua. yan é modulado pelos efeitos de Sevenless / Ras / MAPK, uma importante via de transdução de sinal citoplasmático. Este caminho é uma longa e complicada cascata de eventos que levam à ativação de Pointed e à inativação de Yan. Uma olhada em Sevenless deve ser instrutiva.

Sevenless é um dos pelo menos quatro receptores de Drosophila que utilizam a via Ras / MAPK para transmitir sinais extracelulares de fora da célula para o núcleo; os outros são EGF-R ou Torpedo, o homólogo do receptor do fator de crescimento epidérmico dos vertebrados Torso, o receptor responsável para a sinalização terminal Breathless, o homólogo do receptor FGF de Drosophila e, finalmente, Sevenless, o receptor para BOSS (Noiva de Sevenless). Sevenless regula a determinação do destino celular do fotorreceptor R7 no olho. R7 é o último a se desenvolver dos oito fotorreceptores em cada ommatidium (veja The Drosophila Adult Ommatidium: Ilustração e explicação com animação Quicktime).

Para entender como a cascata funciona fisicamente, deve-se olhar para as proteínas implicadas na sinalização de Sevenless e os sinais de outros receptores tirosina quinases, incluindo Ras1 e a família da proteína quinase ativada por mitogênio (MAPK) de serina / treonina quinases. Estes incluem Raf (MAPKKK), DSor (MAPKK) e laminados (MAPK). Cada uma dessas três quinases adiciona resíduos de fosfato à próxima proteína na cascata de sinalização à medida que o sinal de ativação é passado de uma molécula para outra. Em última análise, a cascata atinge seus alvos, os fatores de transcrição Yan e Pointed. Enquanto Pointed é um regulador positivo de genes, ativado pela cascata, Yan é negativamente regulado pela sinalização de Sevenless. Yan é um antagonista do sinal proneural Sevenless / Ras1, ou seja, quando o sinal de diferenciação é ativado, Yan é desativado.

Yan é um repressor. É expressa em núcleos localizados basalmente de células indiferenciadas no disco imaginal do olho larval. À medida que as células se diferenciam e seus núcleos migram para uma posição apical, a expressão do yan é repentinamente desligada ou regulada para baixo. A fosforilação por MAPK regula a estabilidade e a localização subcelular de Yan. Uma forma mutante de Yan, deficiente em locais de fosforilação, resulta em morte celular, possivelmente devido à inibição da diferenciação mediada por Yan prolongada (Rebay, 1995).

Embora o yan seja expresso no ectoderma e no mesoderma embrionários, ele está ausente no sistema nervoso central em desenvolvimento. A expressão ectópica de yan no SNC inibe o desenvolvimento embrionário. A superexpressão de yan no mesoderma, onde é normalmente expresso, mas posteriormente regulado para baixo, reduz fortemente a expressão de torção. a torção é vital para a diferenciação das células que eventualmente se tornarão mesoderma. Tais resultados indicaram que o yan é um inibidor da diferenciação e não afeta apenas as células neurais, mas também é relevante em outros locais. Yan não é um inibidor universal de diferenciação, uma vez que outros marcadores ectodérmicos, como o gravado, não apresentam efeitos da superexpressão de yan. A função Notch é semelhante a Yan. Também inibe a diferenciação e fornece outro exemplo da importância da regulação negativa no processo de diferenciação (Rebay, 1995).

Uma etapa fundamental no desenvolvimento é o estabelecimento da diversidade do tipo de célula em um campo celular. A padronização segmentar na epiderme embrionária da Drosophila é um paradigma para esse processo. Em cada limite de parassegmento, as células que expressam o membro da família Wnt Wingless enfrentam as células que expressam a homeoproteína Engrailed. As células que expressam Engrailed normalmente se diferenciam como um de dois tipos de células alternativos. Ao investigar a geração desta diversidade de tipo de célula entre a faixa Engrailed de 2 células, foi demonstrado que Wingless, expresso imediatamente anterior às células Engrailed, é essencial para a especificação do destino de célula Engrailed anterior. Em uma tela para mutações adicionais que afetam o destino da célula Engrailed, anterior aberto (aop) (também conhecido como yan) foi identificado, um gene que codifica um fator de transcrição do domínio ETS inibitório que é regulado negativamente pela cascata de sinalização da quinase Ras-MAP. A abertura anterior deve ser inativada para que as células do Engrailed posterior adotem seu destino correto. Isto é conseguido pelo receptor EGF (Egfr), que é necessário autonomamente nas células Engrailed para desencadear a via da quinase Ras1-MAP. A ativação localizada de Egfr é realizada por processamento restrito do ligante de ativação, Spitz. O processamento é confinado à fileira de células posterior ao domínio Engrailed pela expressão restrita de Rhombóide. Essas células também expressam o ligante inibitório Argos, que atenua a ativação de Egfr em fileiras celulares mais distantes da fonte do ligante. Assim, sinais distintos flanqueiam cada borda do domínio Engrailed, uma vez que Wingless é produzido anteriormente e o Spitz posteriormente. Como as células En têm a capacidade de responder a Wingless ou Spitz, essas células devem escolher seu destino dependendo do nível relativo de ativação das duas vias (O'Keefe, 1997).

A cutícula larval compreende uma série repetida de cinturas denticulares precisamente padronizadas intercaladas com cutícula lisa. Nos segmentos abdominais, cada uma dessas cintas é composta por 6 fileiras de dentículos, onde cada fileira tem um tamanho e orientação característicos que refletem as decisões de destino feitas pelas células subjacentes. Usando um gene repórter lacZ expresso nas células En, foi demonstrado que as células En anteriores normalmente produzem cutícula lisa, enquanto as células En posteriores produzem dentículos e, assim, formam a primeira fileira de cada cinto. Assim, as células no domínio En adotam um destino liso ou dentículo, dependendo de sua posição. Para identificar genes envolvidos na especificação de destinos de células En, coleções existentes de mutantes foram rastreadas para aqueles em que células En anteriores produzem dentículos de maneira inadequada. Dentículos ectópicos são observados imediatamente anteriores às cintas denticulares em mutantes aop. Os dentículos extras estão localizados nas bordas laterais das correias dentárias e são mais comumente observados nos segmentos posteriores. Para determinar se os destinos das células En foram alterados nesses mutantes, as células En foram visualizadas com uma construção repórter lacZ. As células En anteriores produzem dentículos em vez da cutícula lisa normal. Assim, aop A função é necessária para que algumas células En anteriores adotem o destino de células lisas (O'Keefe, 1997).

Desde a aop a atividade é necessária para que as células En anteriores adotem o destino de células lisas, a atividade Aop foi testada para ver se era suficiente para forçar as células En posteriores a produzir cutícula lisa em vez de dentículos da primeira linha. Uma forma constitutivamente ativa de Aop foi examinada, onde todos os oito sítios de fosforilação de consenso da MAP quinase foram mutados, e sua expressão foi conduzida nas células En usando o sistema UAS / GAL4. Enquanto os embriões En-GAL4 carregando UAS-Aop WT exibem um padrão de dentículo normal, tais embriões carregando UAS-Aop Act estão perdendo a primeira fileira de dentículo normal de cada cinto. Assim, se as células En posteriores expressam uma forma de Aop que não pode ser inibida pela quinase MAP, então essas células adotam o destino suave. Isso sugere que, normalmente, Aop deve ser inativado nas células En posteriores para que adotem o destino do dentículo. Dado que a cascata da quinase Ras1-MAP é responsável por inibir a função Aop em outros tecidos, ela se tornou um bom candidato para inativar Aop nas células En posteriores. Se esta via está realmente envolvida, a ativação inadequada da via deve imitar o aop fenótipo mutante e permitir que as células En anteriores produzam dentículos incorretamente. Para testar isso, os embriões que expressam uma forma constitutivamente ativa de Ras (UAS-Ras1 val-12) nas células En foram examinados. Esses embriões têm uma fileira ectópica de dentículos anterior à primeira fileira normal, correspondendo à localização das células En anteriores. Assim, as células En anteriores são especificadas incorretamente pela atividade ectópica da quinase Ras1-MAP, semelhante aos efeitos da perda de aop função. Isso sugere que a atividade da quinase Ras1-MAP pode normalmente ser responsável pela inativação de Aop nas células En posteriores, permitindo que elas adotem o destino do dentículo (O'Keefe, 1997).

Uma vez que a cascata de quinase Ras1-MAP é ativada por tirosina quinases receptor, um teste foi realizado para ver se tal receptor poderia estar envolvido na especificação do destino da célula En. Por várias razões, o melhor candidato era o Receptor EGF de Drosophila (Egfr). (1) No olho, um alelo de aop foi isolado como um intensificador de mutações em Ellipse, um alelo de ganho de função de Egfr. (2) Egfr é epiderme ubiquamente expressa ao longo da embriogênese e é necessária precocemente para padronização ventral-lateral, assim como Aop. Finalmente, em estágios posteriores, Egfr é necessário para que as células adotem destinos de dentículo (O'Keefe, 1997 e referências).

Para determinar se a função Egfr é necessária para que as células En posteriores adotem seu destino correto, uma forma negativa dominante de Egfr foi expressa especificamente em células En. Esses embriões não possuem a primeira fileira de dentículos, correspondendo à posição das células En posteriores. Portanto, Egfr é autonomamente necessário para que as células En posteriores adotem um destino de dentículo. Em seguida, foi determinado se há uma fonte de ligante Egfr posicionada de forma adequada para sinalizar para as células En. A fonte do Spitz é posteriormente adjacente às células En. Parecia provável que Egfr seria ativado por Spi, seu ligante em muitos outros contextos. Spi é ubiquamente expresso como uma molécula inativa ligada à membrana com homologia ao TGF-alfa. Um evento de processamento, que requer atividade Rhomboid (Rho), libera o ligante ativo. Assim, a expressão espacialmente regulada de Rho marca células que são a fonte de Spi secretado ativo. Essas células podem desencadear a ativação de Egfr em células adjacentes. A expressão de Rhomboid sugere que existe uma nova fonte de ligante Spi ativo no momento e local apropriados para influenciar o destino das células En (O'Keefe, 1997).

Para testar diretamente se a via Egfr é ativada nessas listras transversais, a distribuição espacial da MAP quinase ativada foi examinada, usando um anticorpo que é específico para a forma difosforilada (ativa) da MAP quinase (dp-ERK). Em embriões em estágio avançado (9,5 horas AEL), uma faixa de quinase MAP ativada é detectada logo após as células En. Esta faixa é dependente de Egfr, uma vez que é removida seletivamente em embriões mutantes flb. No tipo selvagem, a MAP quinase ativa é detectável nas próprias células En, embora em níveis baixos. Assim, parece que a ativação de Egfr de fato se espalha para as células En. Não foi possível determinar se há uma diferença entre as células En anteriores e posteriores. A ativação da via de Egfr foi confirmada testando a indução de um gene alvo de Egfr, argos, cuja expressão está intimamente correlacionada com regiões de ativação máxima de Egfr. Por exemplo, durante a padronização ventral-lateral anterior, argos é expresso nas fileiras mais ventrais de 1 a 2 células, o ponto de maior ativação de Egfr. No entanto, em estágios posteriores o mRNA de Argos é expresso em uma faixa de células posterior às células En, coincidente com a expressão de Rho e os níveis mais altos de MAP quinase ativada. Tomados em conjunto, esses dados demonstram que um ligante Egfr secretado (provavelmente Spitz secretado), produzido por células imediatamente posteriores às células En, ativa Egfr. Além disso, parece que a ativação de Egfr é graduada mais alta posteriormente às células En e em níveis mais baixos dentro das células En. Essa sinalização corresponde ao momento em que os destinos das células En estão sendo determinados, o que é consistente com o papel do Egfr na determinação dos destinos das células En. Experimentos realizados revelaram que as células En anteriores podem, de fato, responder ao Spitz (O'Keefe, 1997).

A sinalização de Spitz e Wingless demonstrou ter efeitos competitivos no destino das células En. As células En anteriores assumem um destino de dentículo quando a função wg é eliminada em 8 horas AEL. Wg é expresso imediatamente anterior ao domínio En, em uma região de cutícula lisa. Assim, enquanto a entrada de Wg instrui as células a adotar o destino suave, a ativação de Egfr instrui as células a adotarem o destino do dentículo. A resposta oposta das células En a esses dois sinais levanta a questão de qual destino essas células adotariam na ausência de ambos os sinais. Para determinar isso, a sinalização de Egfr foi bloqueada pela expressão de Aop Act em células En, ao mesmo tempo que removeu a função wg usando um alelo condicional. Quando embriões wg ts portadores de En-GAL4 e UAS-Aop Act são transferidos para temperatura não permissiva em 8 horas AEL, as células En adotam destinos suaves. Isso sugere que a cutícula lisa é o destino celular padrão. A sinalização Wg neste contexto é necessária principalmente para antagonizar o efeito da sinalização DER nas células En anteriores (O'Keefe, 1997).

As células En posteriores, que adotam um destino denticulado, ou não podem responder a Wg devido à ausência de transdutores de sinal chave, ou não vêem concentrações eficazes de Wg. Na verdade, parece que a célula En posterior não recebe entrada de Wg. A presença de transdutores de sinal a jusante foi testada em células En posteriores. As células que expressam uma forma ativada de Tatu ou níveis mais elevados de Desgrenhado do tipo selvagem respondem como se tivessem recebido o sinal Wg. Em embriões carregando tanto En-GAL4 quanto UAS-Arm S10, a expressão de Armadillo ativado faz com que as células En posteriores adotem inadequadamente o destino de células lisas. Resultados idênticos foram obtidos expressando Desgrenhado. Assim, os transdutores de sinal Wg a jusante de Disheveled estão presentes nas células En posteriores. Durante a padronização normal, essas células provavelmente não são expostas a níveis de Wg suficientes para antagonizar os efeitos de Egfr nessas células (O'Keefe, 1997).

Um modelo é apresentado para a cooperação entre Wingless e Spitz na especificação do destino das células em células que expressam Engrailed. As células que expressam En são flanqueadas anteriormente por uma fileira de células que produz Wg e, posteriormente, por uma fileira de células que expressa o romboide, que produz Spitz secretado. A célula En mais próxima da fonte de Spi recebe uma concentração mais alta de Spi e, portanto, ativa a via de Egfr o suficiente para especificar o destino de um dentículo. Reciprocamente, a célula En mais próxima da fonte de Wg recebe uma concentração mais alta de Wg e adota um destino suave. Spi também ativa a via Egfr na célula que expressa Rho, que, portanto, produz e secreta Argos. Argos pode inibir a ativação de Spi da via de Egfr à distância. Como consequência, a via Egfr não é suficientemente ativada na célula En anterior para competir com a sinalização de Wg nesta célula e adota um destino tranquilo. Na verdade, os alvos específicos da sinalização Egfr responsáveis ​​por conferir o destino do dentículo são desconhecidos (O'Keefe, 1997).

Sinalização combinatória pelas vias Frizzled / PCP e Egfr durante o estabelecimento da polaridade celular plana no olho de Drosophila

A sinalização Frizzled (Fz) / PCP regula a orientação plana e vetorial de células ou grupos de células em tecidos inteiros. Embora a sinalização Fz / PCP tenha sido analisada em vários contextos, pouco se sabe sobre eventos nucleares agindo a jusante da sinalização Fz / PCP na decisão do destino das células R3 / R4 no olho de Drosophila ou em outros contextos. Este estudo demonstra um requisito específico para a sinalização Egfr e os fatores de transcrição Fos (AP-1), Yan e Pnt na especificação R3 / R4 dependente de PCP. Os ensaios de perda e ganho de função sugerem que os fatores de transcrição integram a entrada de Fz / PCP e sinalização Egfr e que os fatores ETS Pnt e Yan cooperam com Fos (e Jun) na determinação de R3 / R4 específico de PCP. Os dados indicam que Fos (a jusante da sinalização Fz / PCP ou paralelo a ela) e Yan são necessários em R3 para especificar seu destino (Fos) ou inibir o destino R4 (Yan) e que a sinalização Egfr é necessária em R4 via Pnt para sua especificação de destino. Juntamente com o trabalho anterior que estabelece uma função Su (H) dependente de Notch em R4, conclui-se que Fos, Yan, Pnt e Su (H) integram Egfr, Fz e entrada de sinalização Notch em R3 ou R4 para estabelecer o destino da célula e polaridade ommatidial (Weber, 2008).

Estudos anteriores estabeleceram que Fz é necessário de forma autônoma em relação à célula para a indução do destino de R3. As análises atuais de ok/fos Os alelos LOF indicam que o Fos também é necessário de forma autônoma em relação à célula em R3 para sua determinação de destino. Quando superexpresso, o Fos também atua como Fz nos fotorreceptores R3 / R4 no momento do estabelecimento do PCP, com a célula do par que tem níveis de Fos mais altos adotando o destino R3. Com base em sua necessidade em R3 e nas interações genéticas, o Fos poderia atuar como um efetor nuclear da sinalização Fz / PCP. Isso é apoiado pela observação de que é capaz de suprimir sev-dsh defeitos de PCP induzidos, os dados genéticos não podem, no entanto, descartar que Fos possa atuar em paralelo à sinalização Fz / Dsh-PCP). As diferenças sutis observadas entre fz e kay / fos Requisitos LOF (em fz & # x2212 R3 / R4 mosaicos a célula do tipo selvagem adota o destino R3, muitas vezes causando inversões quirais, enquanto em kay / fos pares de mosaico com um R3 mutante (o par frequentemente adota a aparência R4 / R4 simétrica) é provavelmente devido à natureza hipomórfica do kay / fos alelos que tiveram que ser usados ​​na análise ou redundância potencial com junho (Weber, 2008).

Além da entrada de sinalização Fos positiva, a especificação R3 também requer a função repressora de Yan, com Yan inibindo o destino de R4 no precursor R3. Isso é evidente pela necessidade celular de Yan e destacado pelo aumento dos defeitos em um kay / fos e yan cenário de mutante duplo, em que ambos os aspectos são parcialmente prejudicados causando defeitos de decisão de destino frequentes de R3 / R4. O realce dominante de ok 2 por yan LOF sugere que manter o destino R4 desligado nos precursores R3 é tão importante quanto induzir o destino R3 (Weber, 2008).

Trabalhos anteriores demonstraram que a sinalização Fz / PCP leva a Dl e neur regulação positiva em R3, ativando a sinalização Notch no precursor R4 vizinho. Este estudo mostra que a sinalização Egfr também é especificamente necessária para a determinação do destino R4. Os fatores ETS Yan e Pnt são efetores nucleares da sinalização Egfr em muitos contextos, incluindo indução de fotorreceptores, e os dados indicam que eles atuam também na determinação de R3 / R4. A sinalização Egfr leva a uma inativação de Yan e uma ativação de Pnt por meio de sua fosforilação pelo Rl / Erk MAPK. Como Yan reprime o destino de R4, ele precisa ser inativado no precursor R4 por sinalização Egfr e, inversamente, Pnt é ativado em R4. Juntamente com a atividade Notch-Su (H), isso leva à indução do destino R4. Assim, para a determinação de R3, a sinalização de Fz / PCP e seus efetores nucleares Fos (e Jun) são suficientes, juntamente com a repressão mediada por Yan do destino de R4 em precursores de R3. A determinação do destino de R4, por outro lado, requer a atividade conjunta de duas vias, Notch e Egfr-sinalização e seus efetores nucleares. Uma cooperação Egfr-Notch semelhante é observada na indução R7 e em células cone (Weber, 2008).

Esses dados suportam um cenário de interação complexo entre Fz / PCP, Notch e sinalização Egfr na determinação do destino R3 / R4. Enquanto a ativação Notch-Su (H) em R4 depende da sinalização Fz / PCP no precursor R3, as vias de sinalização Fz / PCP e Egfr requerem um equilíbrio preciso. Isso se reflete em suas interações genéticas, tanto no nível dos receptores fz e Egfr e seus efetores nucleares Fos / Jun e os fatores ETS Pnt e Yan, sugerindo um envolvimento cooperativo entre as vias Fz / PCP e Egfr (Weber, 2008).

A resposta de sinalização de Egfr nuclear é muito provavelmente mediada por Pnt em R4. Embora isso não possa ser resolvido em pnt Clones LOF devido a defeitos não autônomos, que são causados ​​por requisitos de loop de feedback dos quais Pnt participa. Os experimentos de suficiência suportam totalmente um requisito autônomo de célula de Pnt em R4 para especificar o destino de R4, consistente com o requisito de Egfr (Weber, 2008).

Em resumo, o comportamento dos efetores nucleares das respectivas vias de sinalização envolvidas na especificação R3 / R4 reflete a natureza combinatória da entrada da via de sinalização nos destinos R3 e R4 (Weber, 2008).

Embora no embrião Fos e Jun precisem atuar como parceiros heterodiméricos de forma não redundante, nos discos imaginais o cenário é mais complicado. Enquanto que junho clones mutantes exibem apenas fenótipos moderados e não afetam a proliferação / sobrevivência, forte kay / fos Os alelos LOF mostram defeitos graves, sugerindo que kay / fos é o principal componente AP-1 atuando em discos imaginais. Isso é corroborado por estudos recentes sobre o papel do Fos na regulação e proliferação do ciclo celular (Hyun, 2006). No entanto, a combinação dupla mutante de ok e junho revelou um requisito de não kay / fos, junho células duplas mutantes são recuperadas, sugerindo uma função parcialmente redundante de kay / fos e junho em discos imaginários (Weber, 2008).

O papel específico dos possíveis heterodímeros distintos entre as diferentes isoformas de Fos e Jun, ou as próprias isoformas de Fos, pode ser muito complexo. Esta complexidade também é evidente no fato de que a superexpressão de uma forma de proteína Fos negativa dominante ou uma única isoforma de tipo selvagem (transcrito RA, de acordo com Flybase) causa defeitos fenotípicos semelhantes (por exemplo, no olho ou no fechamento do tórax). Experimentos futuros terão que abordar qual das isoformas de Fos é necessária em qual contexto e se e como elas interagem com Jun (Weber, 2008).

O recrutamento cooperativo de Yan por meio de um supersítio ETS de alta afinidade organiza a repressão para conferir especificidade e robustez à especificação do destino da célula cardíaca

Os módulos Cis-regulatórios (CRMs) são definidos por combinações únicas de locais de ligação a fatores de transcrição. Evidências emergentes sugerem que o número, a afinidade e a organização dos locais desempenham papéis importantes na regulação da produção do intensificador e, em última análise, na expressão do gene. Este estudo investigou como a lógica cis-regulatória de um CRM específico de tecido responsável por pares saltados (véspera) a indução durante a cardiogênese organiza as entradas concorrentes de dois membros E-vinte e seis (ETS): o ativador apontado (Pnt) e o repressor Yan. Usando uma combinação de ensaios de gene repórter e edição de gene CRISPR-Cas9, sugere-se que Yan e Pnt têm preferências de sintaxe distintas. Yan não apenas prefere locais de alta afinidade, mas um par sobreposto de tais locais é necessário e suficiente para Yan ajustar os níveis de expressão de Eve em cardioblastos recentemente especificados e bloquear a indução de Eve ectópica e a especificação de destino celular em progenitores circundantes. Mecanicamente, o recrutamento Yan eficiente promovido por este super site ETS de alta afinidade não apenas influencia a competição Yan-Pnt no CRM específico, mas também organiza complexos repressivos Yan em três dimensões através do véspera locus. Tomados em conjunto, esses resultados descobrem um novo mecanismo pelo qual a interpretação diferencial da sintaxe de CRM por um par competidor de repressor-ativador pode conferir especificidade e robustez às transições de desenvolvimento (Boisclair Lachance, 2018).

O desenvolvimento de um organismo multicelular depende de programas de expressão gênica específicos de tecido para estabelecer destinos e morfologias celulares distintas. Os padrões de expressão gênica exigidos devem ser precisos espaço-temporalmente e robustos em face da variação genética e ambiental, isto é obtido por meio da ação de fatores de transcrição (TFs), cujas entradas ativadoras e repressivas estão integradas nos módulos cis-reguladores (CRMs) ou potenciadores de seus genes alvo. Consequentemente, a sequência de cada CRM fornece um projeto físico para um código regulatório combinatório que traduz as informações de sinalização upstream em expressão gênica downstream. Embora avanços significativos tenham sido feitos na capacidade de distinguir elementos reguladores de DNA genômico não codificador de fundo e identificar motivos consensuais de ligação a TF dentro deles, a compreensão de como a lógica intrínseca da sintaxe cis-regulatória (ou seja, o número, afinidade, posição, espaçamento e orientação dos locais de ligação) organiza o conjunto necessário de interações proteína-proteína e proteína-DNA permanece pobre. Como os polimorfismos de nucleotídeo único em locais de ligação ao TF estão sendo cada vez mais correlacionados com a expressão gênica alterada e suscetibilidade à doença, a capacidade de deduzir a lógica regulatória de um potenciador com base em sua sequência é importante (Boisclair Lachance, 2018).

As tendências para os TFs se agruparem em superfamílias e para as células coexpressarem vários membros não redundantes da mesma superfamília implicam que a sintaxe do intensificador deve permitir que os TFs com preferências de ligação de DNA muito semelhantes possam competir, cooperar e discriminar entre os locais de ligação para obter a saída de expressão gênica apropriada . Uma visão recente desses comportamentos veio de estudos de TFs da família Hox. O modelo emergente sugere uma troca de especificidade-afinidade de modo que os locais de baixa afinidade são melhor discriminados, enquanto os locais de alta afinidade podem ser ligados por muitos fatores Hox diferentes. O agrupamento de vários locais Hox de baixa afinidade permite as interações cooperativas e aditivas necessárias para respostas robustas de ativação de genes sem comprometer a especificidade. Se as regras de sintaxe análogas se aplicam a outras superfamílias de TF não é conhecido, e como os repressores transcricionais resolvem o problema de especificidade-afinidade ainda precisa ser testado (Boisclair Lachance, 2018).

A superfamília ETS inclui ativadores e repressores, todos os quais reconhecem a mesma sequência de DNA central, 5'-GGAA / T-3 '. ETS TFs são encontrados em metazoários filos e desempenham papéis importantes na regulação dos programas de expressão gênica que direcionam muitos aspectos do desenvolvimento normal e padronização. Exemplificando isso, o ativador transcricional de Drosophila Pointed (Pnt) e o repressor Yan operam a jusante das vias de sinalização do receptor tirosina quinase (RTK) para orquestrar numerosas transições de destino celular. Muito do entendimento atual de Yan e Pnt deriva do estudo de sua regulamentação de pares saltados (véspera) expressão durante a especificação do precursor do músculo cardíaco no estágio 11 da embriogênese e prospero (pros) expressão durante a especificação do fotorreceptor R7 no olho em desenvolvimento. Revogação da ativação mediada por Pnt ou repressão mediada por Yan de véspera ou prós leva à respectiva perda ou indução ectópica do destino celular associado. Ensaios de deslocamento de gel usando sondas de véspera ou prós Os CRMs revelaram que a maioria dos locais ETS ligados a Yan também são ligados por Pnt, e os subsequentes ensaios de alto rendimento confirmam suas preferências por sequências muito semelhantes. Como nenhuma bioquímica in vitro foi feita com proteínas de comprimento total, a precisão com que os resultados predizerão o resultado da competição Yan-Pnt por locais ETS em CRMs in vivo é incerta (Boisclair Lachance, 2018).

Sugestões de que a sintaxe do sítio de ligação pode influenciar o recrutamento de Yan vêm de estudos de ligação in vitro com TEL1, a contraparte humana de Drosophila Yan, e da modelagem matemática da ocupação do sítio ETS de Yan. TEL1 e Yan, ao contrário de Pnt ou seu equivalente mamífero, ETS1, se autoassociam por meio de seus motivos estéreis e alfa (SAMs), e essa interação homotípica é essencial para a repressão transcricional em moscas e humanos. Usando ensaios de deslocamento de gel, as interações SAM-SAM mostraram mediar a ligação cooperativa de TEL1 em ​​locais ETS emparelhados. Uma análise teórica recente da ocupação TEL1 / Yan em equilíbrio explica como tais interações SAM-SAM cooperativas podem promover o recrutamento preferencial para locais de ligação ETS em tandem. Como nenhum dos estudos examinou a produção repressiva, a questão de saber se a ligação preferencial ou cooperativa de Yan a locais ETS estreitamente opostos pode influenciar a competição Yan-Pnt para permitir uma discriminação mais complexa da sintaxe de CRM do que os modelos atuais assumem permanece premente (Boisclair Lachance, 2018).

To evaluate how CRM syntax organizes the opposing repressive and activating inputs from Yan and Pnt to dictate precise transcriptional output, this study assessed the impact of mutating the eight putative ETS-binding sites identified in the eve muscle heart enhancer (MHE) that drives eve expression in 10 segmentally arrayed clusters of pericardial and muscle cells. This study found that sites with strong affinity best discriminate between Yan and Pnt, with paired sites showing the strongest bias. Thus, mutating a pair of overlapping, conserved, high-affinity ETS sites significantly elevated or expanded MHE reporter expression, consistent with compromised repression. Using CRISPR/Cas9 gene editing of the endogenous MHE, it was shown that mutation of this high-affinity ETS supersite reduced Yan recruitment to not only the MHE but also two other CRMs across the eve locus. Mesodermal Eve expression was elevated, consistent with compromised Yan recruitment, resulting in inadequate repression. In this compromised background, environmental and genetic stresses that would normally be buffered against were now sufficient to induce specification of ectopic Eve-positive (Eve+) cells and reduce survival. It is concluded that the conserved high-affinity ETS pair within the MHE plays a unique and pivotal role in not just recruiting Yan-repressive complexes to the isolated enhancer but also longer-range coordination of transcriptional complex organization and function across the locus (Boisclair Lachance, 2018).

Focusing on ETS-binding motifs within a conserved regulatory module, the eve MHE, this study identified a simple syntax that allows for robust qualitative and quantitative control of enhancer output. Based on extensive mutagenesis of this enhancer, it is proposed that Yan's and Pnt's respective preferences for high- and low-affinity ETS sites provide a mechanism for integrating their competing repressive and activating inputs at individual CRMs. In particular, it was found that the use of paired strong-affinity sites appears critical to the assembly of repressive complexes that dampen eve expression in newly specified cardiac precursors where Yan levels are low and prevent ectopic eve induction in the surrounding mesoderm where levels of activating TFs such as Twi are high. CRISPR/Cas9-mediated mutation of the endogenous MHE confirmed the importance of such optimized syntax for precise Eve expression levels and uncovered an unexpected role of the ETS2,3 dual Yan-binding supersite in longer-range organization of Yan complexes across the locus. It is speculated that efficient Yan recruitment to high-affinity supersites not only influences short-range interactions at the specific enhancer but also fosters longer-range communication across multiple CRMs (Boisclair Lachance, 2018).

The unique repressive contribution of the ETS2,3 pair may reflect an unconventional form of cooperative recruitment that provides novel regulatory capabilities to Yan-repressive complexes. Specifically, even though the two sites in the ETS2,3 pair are probably too close to permit simultaneous occupancy, their immediate juxtaposition may significantly increase the probability of stable Yan binding. For example, although nothing is known about the kinetics and dynamics of Yan-DNA interactions, the presence of two overlapping high-affinity binding sites could promote stable occupancy by increasing the chance that a newly dissociated Yan molecule would immediately rebind. The syntax could also support a more organized dynamic in which the two molecules of a Yan dimer toggle back and forth rapidly between bound and unbound states at the two sites. Even more speculatively, because SAM-mediated dimerization is required for Yan-mediated repression, if the configuration of the ETS2,3 pair ensured that one molecule of the dimer was always bound, this could leave the second free to interact with either an adjacent nonspecific sequence, as was modeled previously (Hope, 2017) another high-affinity ETS site elsewhere in the MHE (for example, site 8) or, even more speculatively, an ETS motif in the D1 or D2 CRM. It is also possible that the in vivo mechanism by which full-length Yan contacts DNA is different from that suggested by the in vitro assays. For example, interactions with other TFs and cofactors might somehow mitigate the steric clash to allow simultaneous occupancy by a Yan dimer. In this case, higher-order Yan complexes (for example, trimers or tetramers) could mediate the requisite longer-range contacts. Regardless of specific mechanism, the idea that high-affinity 'supersites' might be used to anchor longer-range TF-TF and TF-DNA interactions will be an interesting direction for future investigations (Boisclair Lachance, 2018).

Previous work exploring the in vivo functionality of a Yan protein in which the SAM-SAM interface has been mutated to prevent self-association further supports the importance of SAM-mediated repressor cooperativity. Specifically, it was found that although Yan monomers are recruited to enhancers genome-wide in a pattern close to that of wild-type Yan, adequate repression does not occur, and phenotypes consistent com yan loss of function ensue (Webber, 2013a). This work also noted the prevalence of clustered high-affinity ETS sites across a number of Yan ChIP targets, suggesting that the mechanisms uncovered in the dissection of MHE ETS site syntax might be broadly applicable. Focando em eve, it is suspected that at the resolution of individual ETS sites, in the absence of SAM-mediated cooperativity, Yan occupancy of the ETS2,3 tandem would be insufficiently stable to either compete appropriately with Pnt at the MHE or organize the necessary 3D communication across the locus (Boisclair Lachance, 2018).

A parallel is noted between the consequences of mutating the high-affinity ETS2,3 supersite in the endogenous eve locus and the findings of an earlier analysis in which three different Yan-bound CRMs were deleted within a genomic Eve-YFP BAC transgene (Webber, 2013b). In this earlier study, while deleting the pattern-driving MHE almost completely ablated mesodermal Eve-YFP induction, deleting a 'repressive' Yan-bound element (referred to as the D1) increased Eve-YFP expression ∼1.5-fold and led to the specification of extra Eve+cells. Additionally, deletion of either the MHE or the D1 in the BAC transgene reduced Yan occupancy at not only the deleted element but also the remaining intact CRMs. This study reports a comparable loss of Yan occupancy across the eve locus upon mutation of the MHE ETS2,3 supersite but only a modest increase in Eve levels and no cell fate specification defects. The discrepancy between reduced Yan occupancy and increased Eve levels in the eveMHEmut2,3 mutant relative to the D1 deletion mutant suggests that deleting an entire CRM not only compromises Yan occupancy across the locus but also disrupts additional repressive inputs. Consistent with this interpretation, the eveMHEmut2,3 background appeared highly sensitized, with the increase in Eve levels and Eve+ cell fate specification associated with a twofold increase in pnt dose almost exactly matching the effects of deleting an entire 'repressive' CRM. Further exploration of how high-affinity ETS pairs organize Yan repression at and between CRMs and how this coordinates the competing and collaborating inputs from other TFs will be needed to test these ideas at eve and, more broadly, other target genes (Boisclair Lachance, 2018).

To conclude, a working model is proposed in which Yan's and Pnt's differential interpretation of ETS syntax adds a 'dimmer' capability to the classic on/off switch, thereby refining its sensitivity and tunability. Focando em eve as an example, prior to the onset of RTK-induced cardiac cell fate specification or in cells subject to submaximal signaling, it is suggested that Yan's bias for high-affinity sites ensures an effectively 100% probability of occupancy at the ETS2,3 supersite and hence stable repression. In this regime, Yan could also outcompete Pnt at the lower-affinity sites to occupy fully the CRM, or, if Yan levels are limiting, as the data suggest, its preference for high-affinity sites and relative 'distaste' for lower-affinity sites could offer Pnt an opportunity to occupy the latter and perhaps influence Yan repression. In contrast, if Yan and Pnt had identical ETS-binding preferences, a less tuned response to RTK signaling would be expected indeed, when the high-affinity 2,3 pair was removed and hence the strong bias toward Yan occupancy and repression at the MHE, stochastic ectopic expression was induced in the surrounding mesoderm where RTK levels are submaximal. Thus, their distinct preferences ensure that only maximal RTK activation will trigger the necessary shift in Yan-Pnt occupancy and activity to activate eve expressão. Furthermore, while previous models assumed a complete switch from total Yan occupancy to total Pnt occupancy as Eve+ cell fates are specified, this work suggests that the ETS2,3 supersite still recruits Yan-repressive input even in Eve+ cells with very low Yan concentration. It is speculated that the ability to apply continued Yan-repressive input after cell fate induction may contribute to the robustness of certain developmental transitions by stabilizing the newly acquired cell fate. In agreement with this, in the context of the endogenous eve locus, disruption of the ETS2,3 pair sensitized eve to both fluctuations in upstream signaling and environmental conditions (Boisclair Lachance, 2018).

More broadly, it is speculated that the interplay between the cis-regulatory logic of a CRM and the unique biophysical parameters of different TFs permits evolution to fine-tune gene expression output to a specific threshold depending on each cell's developmental requirement. In the case of Yan-Pnt-regulated genes, the interplay between the degree of Yan SAM-mediated self-association and ETS syntax enables this repressor-activator pair to discriminate between ETS sites with unexpected precision. Furthermore, instead of RTK activation inducing a complete switch from Yan occupancy to Pnt occupancy as cell fates are induced, the cooperative recruitment of Yan to supersites may enable newly differentiating cells with lower Yan:Pnt ratios to sustain the Yan-repressive influence needed to ensure precision and robustness of the gene expression patterns. It is suggested that these ideas provide an interesting new vantage point for considering how single-nucleotide polymorphisms in TF-binding sites may heighten susceptibility to disease by compromising the robustness of gene regulatory networks (Boisclair Lachance, 2018).

Longevity is determined by ETS transcription factors in multiple tissues and diverse species

Ageing populations pose a major public health crises. Reprogramming gene expression by altering the activities of sequence-specific transcription factors (TFs) can ameliorate deleterious effects of age. This explore how a circuit of TFs coordinates pro-longevity transcriptional outcomes, which reveals a multi-tissue and multi-species role for an entire protein family: the E-twenty-six (ETS) TFs. In Drosophila, reduced insulin/IGF signalling (IIS) extends lifespan by coordinating activation of Aop, an ETS transcriptional repressor, and Foxo, a Forkhead transcriptional activator. Aop and Foxo bind the same genomic loci, and this study shows that, individually, they effect similar transcriptional programmes in vivo. In combination, Aop can both moderate or synergise with Foxo, dependent on promoter context. Moreover, Foxo and Aop oppose the gene-regulatory activity of Pnt, an ETS transcriptional activator. Directly knocking down Pnt recapitulates aspects of the Aop/Foxo transcriptional programme and is sufficient to extend lifespan. The lifespan-limiting role of Pnt appears to be balanced by a requirement for metabolic regulation in young flies, in which the Aop-Pnt-Foxo circuit determines expression of metabolic genes, and Pnt regulates lipolysis and responses to nutrient stress. Molecular functions are often conserved amongst ETS TFs, prompting examination of whether other Drosophila ETS-coding genes may also affect ageing. This study shows that five out of eight Drosophila ETS TFs play a role in fly ageing, acting from a range of organs and cells including the intestine, adipose and neurons. This study expands the repertoire of lifespan-limiting ETS TFs in C. elegans, confirming their conserved function in ageing and revealing that the roles of ETS TFs in physiology and lifespan are conserved throughout the family, both within and between species (Dodson, 2019).

Ageing is characterised by a steady systematic decline in biological function, and increased likelihood of disease. Understanding the basic biology of ageing therefore promises to help improve the overall health of older people, who constitute an ever-increasing proportion of populations. In experimental systems, healthy lifespan can be extended by altered transcriptional regulation, coordinated by sequence-specific TFs. Thus, understanding TFs' functions can reveal how to promote health in late life. Forkhead family TFs, especially Forkhead Box O (Foxo) orthologues, have been studied extensively in this context. This effort has been driven by the association of Foxo3a alleles with human longevity and the findings that the activation of Foxos is necessary and sufficient to explain the extension of lifespan observed following reduced insulin/IGF signalling (IIS) in model organisms. Foxos interact with additional TFs in regulatory circuits, and it is in this context that their function must be understood. Por exemplo, em Caenorhabditis elegans, the pro-longevity activity of Daf-16 is orchestrated with further TFs including Hsf, Elt-2, Skn-1, Pqm-1 e Hlh-30/Tfeb. Examining regions bound by Foxos across animals has highlighted the conserved presence of sites to bind ETS family TFs. No Drosófila, two members of this family, namely Aop (a.k.a. Yan) e Pnt, have been linked to ageing via genetic interactions with Foxo and IIS, and similar interactions are evident in C. Elegans. These findings raise questions of the overall roles of ETS factors in ageing, and their relationship to the activities of Foxos (Dodson, 2019).

The ETS TFs are conserved across animals, including 28 representatives in humans. Their shared, defining feature is a core helix-turn-helix DNA-binding domain, which binds DNA on 5'-GGA(A/T)-3' ETS-binding motifs (EBMs). They are differentiated by tissue-specific expression, and variation in peripheral amino acid residues which, along with variation in nucleotides flanking the core EBM, confers DNA-binding specificity. ETS TFs generally function as transcriptional activators, but a few repress transcription. Aop is one such repressor in Drosófila. Aop and its human orthologue Tel are thought to repress transcription by competing with activators for binding sites, recruiting co-repressors, and forming homo-oligomers that limit activator access to euchromatin. Consequentemente, Aop's role in physiology must be explored in the context of its interactions with additional TFs, especially activators. Foxo is one such activator. Ambos Foxo e Aop are required for longevity by IIS inhibition, each is individually sufficient to extend lifespan, and both are recruited to the same genomic loci na Vivo. Whilst activating either in the gut and fat body extends lifespan, the effect of activating both is not additive. Furthermore, if Aop is knocked down, activating Foxo not only ceases to extend lifespan, but even becomes deleterious for lifespan. Overall, these findings suggest that gene expression downstream of IIS is orchestrated by the coordinated activity of Aop e Foxo, and that there is a redundancy in the function of the two TFs, even though Foxo is a transcriptional activator and Aop a transcriptional repressor. This study started by characterising Aop and its relationship with relevant transcriptional activators, including Foxo. This led revealing that roles in ageing are widespread throughout the ETS TF family, extending across multiple fly tissues and diverse animal taxa (Dodson, 2019).

Promoting healthy ageing by transcriptional control is an attractive prospect, because targeting one specific protein can restructure global gene expression to provide broad-scale benefits. This study suggests key roles for ETS TFs in such optimisation. The results show dual roles for Aop: balancing Foxo's outputs, and opposing Pnt's outputs. These functions coordinate transcriptional changes that correspond to lifespan. Repressing transcription from the ETS site appears to be the key longevity-promoting step, and indeed lifespan was extended by limiting multiple ETS TFs, in multiple fly tissues, and in multiple taxa. Altogether, these results show that inhibiting lifespan is a general feature of ETS transcriptional activators. Presumably the expression of these TFs is maintained, despite costs in late life, because of benefits in other contexts. Por exemplo, Pnt is important during development, and expression may simply run-on into adulthood. This study now shows that Pnt is also important for adults facing nutritional variation or stress, and genomic evidence suggests equivalent functions for Ets-4 no C. Elegans. Além disso, Ets21C is required to mount an effective immune response, and both Ets21C e Pnt control gut homeostasis. Tissue environment appears to be another important contextual factor that determines the lifespan effects of specific ETS TFs. Differences between tissues in chromatin architecture are likely to alter the capacity of a given TF to bind a given site, and the current results show that a given TF, and also upstream RTKs, do not necessarily lead to the same lifespan effect across all tissues. The tissue-specific functions that are shown for ETS TFs, Foxo and RTKs, suggests that transcription is locally coordinated by distinct receptors and TFs in distinct tissues, but that lifespan-regulatory signalling nevertheless converges on the ETS site. This differentiation makes it all the more remarkable that roles in lifespan appear to be conserved amongst ETS family TFs, even in diverse tissue contexts (Dodson, 2019).

The structure of molecular networks and their integration amongst tissues underpins phenotype, including into old age. Unravelling the basics of these networks is a critical step in identifying precise anti-ageing molecular targets. Identifying the least disruptive perturbation of these networks, by targeting the 'correct' effector, is a key goal in order to achieve desirable outcomes without undesirable trade-offs that may ensue from broader-scale perturbation. This targeting can be at the level of specific proteins, cell types, points in the life-course, or a combination of all three. The tissue-specific expression pattern of ETS TFs, and the apparent conservation of their roles in longevity, highlights them as important regulators of tissue-specific programs that may be useful in precise medical targeting of specific senescent pathologies (Dodson, 2019).

Exons - two, separated by 16 kb

Yan has an ETS domain, bracketed by glutamate rich regions, two preceding it, and one following (Lai, 1992).

The members of the ets gene family of transcription factors are characterized by a conserved 85-residue DNA-binding region, termed the ETS domain, that lacks sequence homology to structurally characterized DNA-binding motifs. The ETS domain is composed of three alpha-helices (H) and four beta-strands (S) arranged in the order H1-S1-S2-H2-H3-S3-S4. The four-stranded antiparallel beta-sheet is the scaffold for a putative helix-turn-helix DNA recognition motif formed by helices 2 and 3. The 25 residues extending beyond the ETS domain to the native C-terminus of the truncated Ets-1 also contain a helical segment. On the basis of the similarity of this topology with that of catabolite activator protein (CAP), heat shock factor (HSF), and hepatocyte nuclear factor (HNF-3 gamma), it is proposed that ets proteins are members of the superfamily of winged helix-turn-helix DNA-binding proteins (Donaldson, 1994).

There are eight MAPK phosphorylation consensus repeats on Yan as well as six PEST sequences conferring rapid turnover (Rebay, 1995).


Molecular Biology of the Cell. 4th edition.

How does a cell determine which of its thousands of genes to transcribe? As mentioned briefly in Chapters 4 and 6, the transcription of each gene is controlled by a regulatory region of DNA relatively near the site where transcription begins. Some regulatory regions are simple and act as switches that are thrown by a single signal. Many others are complex and act as tiny microprocessors, responding to a variety of signals that they interpret and integrate to switch the neighboring gene on or off. Whether complex or simple, these switching devices contain two types of fundamental components: (1) short stretches of DNA of defined sequence and (2) gene regulatory proteins that recognize and bind to them.

We begin our discussion of gene regulatory proteins by describing how these proteins were discovered.


Claims

1. A method for assessing and mitigating suicidality in a male bipolar subject in need thereof, comprising:

determining an expression level of at least a first panel of blood biomarkers or a second panel of blood biomarkers in a sample from the subject, where the first panel of blood biomarkers comprises small cell lung carcinoma cluster 4 antigen (CD24 CD24 molecule), ATPase type 13A2 (ATP13A2), epoxide hydrolase 1, microsomal (xenobiotic) (EPHXl), HtrA serine peptidase 1 (HTRAl) leptin receptor (LEPR), spectrin beta non-erythrocytic 1 (SPTBNl), muscleblind-like 2 (MBNL2), olfactory receptor family 2 subfamily J member 3 (OR2J3), Ras homolog enriched in brain (RHEB), and where the second panel of blood biomarkers comprises spermidine/spermine Nl-acetyltransferase 1 (SATl) forkhead box N3 (FOXN3), guanylate binding protein 1 (GBPl), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 5 (PIK3R5), apolipoprotein L2 (APOL2), ATPase H+ transporting lysosomal 9 kDa, VO subunit el (ATP6V0E1), GRINLlA complex locus (GCOMl), interleukin 1 beta (ILlB), lipoma HMGIC fusion partner (LHFP), lipase A (LIPA), myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), 6-phosphogluconolactonase (PGLS), phosphatase and tensin homolog (PTEN), reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs (RECK), tumor necrosis factor (ligand) superfamily member 10 (TNFSFlO), ATP-binding cassette, subfamily A (ABCl) member 1 (ABCAl), Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 40 (ARHGEF4 FLJ10357), cancer susceptibility candidate 1 (CASCl), dehydrogenase/reductase (SDR family) member 9 (DHRS9), disrupted in schizophrenia 1 (DISCl), eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2 (EIF2AK2), uncharacterized LOC727820 (LOC727820), mitogen-activated protein kinase kinase kinase 3 (MAP3K3), mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 6 (MT-ND6 ND6), RNA binding motif protein 47 (RBM47), RPTOR independent companion of MTOR complex 2 (RICTOR), sterile alpha motif domain containing 9-like (SAMD9L), scavenger receptor class F member 1 (SCARFl), solute carrier family 36 (proton/amino acid symporter) member 1 (SLC36Al), signal transducer and activator of transcription 1, 91 kDa (STATl), cytochrome c oxidase subunit Vb (COX5B), SWI/SNF related matrix associated actin dependent regulator of chromatin subfamily a member 1 (SMARCAl), ubiquitin-like modifier activating enzyme 6 (UBA6), zinc finger CCCH-type antiviral 1 (ZC3HAV1) and tyrosine kinase, non-receptor 2 (TNK2) identifying a subject having suicidality where the expression level of the blood biomarkers in the first panel is decreased relative to a reference expression level, or, the expression level of the blood biomarkers in the second panel is increased relative to a reference expression level and, administering to the subject identified as having suicidality a drug to treat the suicidality.

2. The method according to claim 1, where the identifying step further comprises comparing a biomarker panel score of the subject to a biomarker panel score of a reference.

3. The method according to claim 1, wherein: (a) individuals who have changes in one or more of SPTBN1, MBNL2, S100A8 are treated with clozapine and (b) individuals who have changes in one or more of SAT1, GBP1, IL1B, LHFP, MAP3K3, S100A8 are treated with docosahexaenoic acid (DHA).


The Cyclic AMP Receptor Protein, CRP, Is Required for Both Virulence and Expression of the Minimal CRP Regulon in Yersinia pestis Biovar microtus

FIGO. 1 Growth curves for Y. pestis in TMH. Overnight Y. pestis cultures of the WT, Δcrp, e C-crp strains (at an OD620 of 1.0) were diluted 20-fold into 50 ml of fresh TMH-1 mM cAMP. O OD620 values of each strain were monitored for each culture at 2-h intervals until the cultures reached the stationary phase. Experiments were repeated three times. FIGO. 2 Kinetics of in vivo growth of Y. pestis. Bacteria were inoculated into mice by the intravenous route. At 24 and 48 h postinfection, bacterial loads in livers, spleens, and lungs were determined. The data shown are normalized log10 CFU values for each time point. FIGO. 3 EMSAs. The band of free promoter DNA disappeared with increasing amounts of CRP protein, and a retarded DNA band with decreased mobility turned up, which presumably represented the CRP-DNA complex. FIGO. 4 Primer extension analysis. Electrophoresis of the primer extension products was performed on a 6% polyacrylamide-8 M urea gel. Lanes C, T, A, and G represent the Sanger sequencing reactions. The transcriptional start sites are underlined. FIGO. 5 . DNase I footprinting assays. A labeled DNA probe was incubated with various amounts of purified His-CRP (lanes 1, 2, 3, 4, and 5 contained 0, 500, 1,000, 2,000, and 3,000 ng, respectively) and subjected to DNase I footprinting assay. Lanes G, A, T, and C represent the Sanger sequencing reactions. The protected region (bold line) is indicated on the right side of each gel. The DNA sequences of footprints are shown from the bottom (5′) to the top (3′). FIGO. 6 . Structural organization of CRP-activated pla e pst promoters. The top panels show the genomic organization of the pla e pst genes on the pPCP1 plasmid. Transcription/translation start sites, core promoter −10 and −35 elements, and CRP binding sites are depicted for each promoter in the bottom panels to give a map of CRP-promoter DNA interactions.