Em formação

Como os primers se anelam ao ssDNA?


Em um protocolo do tipo PCR, o estágio de alta temperatura do ciclo fará com que o dsDNA desnature, bem como quaisquer primers recozidos. Na temperatura mais baixa, o dsDNA desnaturado permanecerá desnaturado. Até onde eu entendo, porém, os primers são recozidos novamente.

Minha pergunta é a seguinte: existem enzimas que catalisam esse recozimento ou isso acontece por acaso?


Sem enzima está envolvido no emparelhamento de bases (recozimento).

Esse faz acontece por chance, mas as chances são governadas por estequiométrico considerações.

A principal consideração é que o (baixo peso molecular) os primers são adicionados em alta concentração (maior do que a do DNA) e, portanto, têm uma chance maior de encontrar a região apropriada do DNA do que sua fita complementar. (Reanimação das fitas de DNA desnaturado posso ocorrer, mas não durante o período de tempo da PCR.)


Para os fins deste tutorial, discutiremos como adicionar novos locais de restrição ao MCS de um vetor vazio. No entanto, a técnica a seguir pode ser usada com a mesma facilidade para adicionar tags curtas ou shRNAs a qualquer vetor (o procedimento será simplesmente diferente em termos de projeto de primer).

Vamos supor que seu vetor favorito tenha um MCS relativamente limitado (BamHI - EcoRI - SalI) e você deseja expandir isso com a adição de NdeI, PacI, AscI e MfeI. Com a clonagem de sobreposição de oligo, você pode projetar um conjunto de oligos contendo seus locais de restrição desejados e adicioná-los ao seu vetor existente. São alguns dias de trabalho que valerão a pena nos anos que virão.


Montagem enzimática de fragmentos de DNA sobrepostos

São descritos três métodos para a montagem de múltiplas moléculas de DNA sobrepostas. Cada método compartilha a mesma abordagem básica: (i) uma exonuclease remove nucleotídeos das extremidades das moléculas de DNA de fita dupla (ds), expondo saliências de DNA de fita simples (ss) complementares que são especificamente recozidas (ii) as lacunas de ssDNA do as moléculas unidas são preenchidas pela DNA polimerase e os cortes são covalentemente selados pela DNA ligase. O primeiro método emprega a atividade 3'-exonuclease de T4 DNA polimerase (T4 pol), Taq DNA polimerase (Taq pol) e Taq DNA ligase (Taq lig) em uma reação termociclada em duas etapas. O segundo método usa 3'-exonuclease III (ExoIII), Taq pol ligada ao anticorpo e Taq lig em uma reação termociclada em uma etapa. O terceiro método emprega 5'-T5 exonuclease, Phusion® DNA polimerase e Taq lig em uma reação isotérmica de uma etapa e pode ser usado para montar ssDNA e dsDNA. Esses métodos de montagem podem ser usados ​​para construir perfeitamente genes sintéticos e naturais, caminhos genéticos e genomas inteiros e podem ser muito úteis para ferramentas de engenharia molecular.


Como posso superar os desafios associados ao recozimento por PCR?

Para ajudar a simplificar e economizar tempo em PCR, nós (Thermo Fisher Scientific) desenvolvemos novas polimerases de DNA Invitrogen Platinum com buffers de reação que permitem uma temperatura de recozimento universal de 60 ° C. Seus buffers são projetados com um componente de isostabilização, o que aumenta a estabilidade de duplexes primer-template durante a etapa de recozimento (Figura 3).

Figura 3. Ligação de primer em produtos de PCR Platinum com o tampão de anelamento universal. O componente isostabilizador permite a ligação específica dos primers ao molde de DNA, mesmo quando suas temperaturas de fusão diferem da temperatura de recozimento de 60 ° C.

Esta inovação do tampão de recozimento universal permite que você contorne o cálculo da temperatura de recozimento de cada conjunto de primer, sem comprometer o rendimento e a especificidade do PCR (Figura 4).

Figura 4.Amplificação por PCR com alta especificidade e rendimento usando uma temperatura de anelamento universal de 60 ° C. Conjuntos de iniciadores com uma faixa de temperaturas de anelamento foram usados ​​para amplificar 12 alvos em DNA genômico humano com uma temperatura de anelamento de 60 ° C usando Platinum SuperFi II DNA Polymerase. As temperaturas de recozimento indicadas foram calculadas usando o Tm calculadora para Platinum SuperFi DNA Polymerase. Marcador de peso molecular (M): Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder.


Animações

Laboratório Cold Spring Harbor - Dolan DNA Learning Center

1. Técnica de Southern Blotting Clique no link a seguir para ver uma animação da técnica de Southern Blotting relacionada às informações descritas e às ilustrações mostradas nos materiais acima.

2. Southern Blot: Animação de Raven, Johnson, Losos, & amp Singer, Biology, 7ª edição, 2005 Veja a seguinte animação narrada para ter uma visão geral simulada sobre as etapas de laboratório envolvidas na realização de um Southern blot. Ao clicar no link abaixo, você será levado a uma lista de animações de biologia molecular.

Veja a animação narrada intitulada “Southern Blot”.

Parte c


4. Discussão

O desenvolvimento do sistema CRISPR / Cas9 nos permitiu manipular diretamente o genoma em zigotos de camundongo com eficiências extremamente altas, realizando as gerações ultrarrápidas de uma etapa de linhagens de camundongos geneticamente modificados sem células-tronco embrionárias. Após essa notável mudança de paradigma na transgênese de camundongos, os métodos de preparação para DNAs de doadores longos ainda precisam ser refinados.

Neste estudo, otimizamos o método de fosfo-PCR para obter doadores de ssDNA longos altamente puros, adequados para gerações de camundongos knock-in. Embora a utilidade de doadores de ssDNA longos preparados por este método em experimentos de células em cultura tenha sido relatada anteriormente [30,31], nosso na Vivo estudo demonstrou a aplicabilidade desta estratégia para zigotos de camundongos pela primeira vez com um número suficiente de exemplos práticos.

A principal vantagem do método de fosfo-PCR está em seus procedimentos simples e rápidos, sem trabalhos de RNA ou etapas de desnaturação do DNA. Enquanto os métodos de produção de ssDNA longos relatados anteriormente, como o ivTRT [8,10,12] ou o método de endonuclease de corte [9,11] requerem separações eletroforéticas e extrações de gel para purificar o ssDNA acompanhado de uma grande quantidade de perda de DNA, o fosfo O método -PCR só precisa de colunas de rotação para a purificação. Esse mérito é particularmente importante quando conseguimos preparar doadores de ssDNA longos concentrados para eletroporação. Além disso, o comprimento máximo para a produção de ssDNA longo nesta estratégia pode ser maior do que no ivTRT (aproximadamente 1500 bases) por causa da maior fidelidade da enzima PCR em comparação com o rigor de duas enzimas usadas no ivTRT, a saber, T7 RNA polimerase e transcriptase reversa [8]. Na verdade, poderíamos produzir intactamente ssDNA de 2699 bases de comprimento para inserir corretamente o cassete do gene de 2160 bp no Oxtr locus usando esta estratégia (Oxtr-T2A-iCre-ERTT2 na Tabela 1 e Tabela 2). Em relação à precisão das sequências de ssDNA, o método de endonuclease de nicking com base em plasmídeo garante a mais alta qualidade porque o método está livre de erros enzimáticos e nucleases e reações colaterais # x02019 [9]. No entanto, sua primeira etapa para determinar a enzima de corte apropriada para a clonagem de GOI no vetor e sua última etapa com a separação / extração do gel pode ser um desafio para iniciantes. O método de fosfo-PCR fornece, assim, uma nova escolha prática para preparar facilmente doadores de ssDNA longos com precisão e rendimento suficientes para o knock-in do cassete de gene.

Gerar doadores de ssDNA longos à vontade evita a construção de vetores de direcionamento com braços de homologia relativamente longos (cerca de 2 kb em ambos os lados). De acordo com o relatório anterior, os braços de homologia de 55 & # x02013105 em ambos os lados são suficientes para que doadores de ssDNA longos produzam camundongos knock-in [12]. Começamos a incluir os braços de homologia de aproximadamente 300 bases de comprimento porque a instrução do fabricante & # x02019s indicou a possível poda não intencional de ambos os lados devido às reações colaterais de exonucleases & # x02019 [24]. No entanto, o comprimento de ssDNAs & # x02019 longos resultantes estava quase intacto (Figura 3 B), e 230 & # x02013340 homologias de base foram suficientes para gerações de camundongos knock-in (Tabela 2). Mesmo quando reduzimos o comprimento do braço de homologia para 100 & # x02013150 bases, os doadores de ssDNA longos através do método de fosfo-PCR poderiam funcionar suficientemente como modelos de knock-in (Tbr2-T2A-d2EGFP na Tabela 2 e Pax6-mCitrine na Figura 4 A). Portanto, recomendamos projetar o comprimento do braço de homologia dependendo da disponibilidade dos primers adequados para a enzima PCR de alta fidelidade para produzir produtos únicos claros (os detalhes são descritos nas Informações Suplementares 1).

Aqui, apresentamos duas opções, o emprego de kit comercialmente disponível ou a produção manual. A vantagem do kit comercial está em sua produtividade estável sem a necessidade de calibração. Isso provavelmente se deve ao fato de que algum tipo de intensificador para reações de exonuclease pode estar contido na Mistura de Strandase. Por outro lado, a combinação manual de Lambda exonuclease e Exonuclease III, que propusemos neste estudo, pode reduzir amplamente o custo, e o ssDNA resultante tem qualidades suficientes para geração de mouse knock-in (Pcdhb19-T2A-EGFP na Tabela 1 e Tabela 2). No entanto, recomendamos ajustar rigorosamente o tempo de reação da Exonuclease III dependendo do comprimento do ssDNA porque o ssDNA produzido manualmente tende a ser ligeiramente mais curto do que o produzido pelo kit (Figura 3 B).

Também confirmamos que os doadores de ssDNA longo derivados de fosfo-PCR poderiam ser utilizados para eletroporação (Figura 4 e Figura S2). As eficiências de knock-in desses dois experimentos foram de 10,0 & # x0201314,2%, que estavam dentro de nossa faixa de experimentos de knock-in mediados por microinjeção (5,9 & # x0201340,0% de 12 experimentos na Tabela 2). Embora precisemos de exemplos mais práticos para comparar a eficácia da eletroporação com os da microinjeção, o método de eletroporação pode fornecer uma escolha muito mais fácil para os pesquisadores.

É importante notar que observamos inesperadamente que doadores de ssDNA longos ocasionalmente induziam inserções incompletas. Por exemplo, na Figura 4 C e na Figura S2B, alguns embriões diferentes daqueles com o alelo knock-in preciso produziram os produtos de PCR mais curtos ou mais longos. As frequências dos alelos incompletamente editados com doadores de ssDNA longos tenderam a ser mais altas do que aquelas com vetores de direcionamento. As causas potenciais para essas inserções incompletas podem depender das diferenças nas vias de reparo do DNA entre HR e SST-R. Portanto, recomendamos a verificação cuidadosa do alelo knock-in pelo sequenciamento completo fora dos braços de homologia.

Embora o método de fosfo-PCR tenha deixado alguns pontos a serem aprimorados, ainda é suficiente para na Vivo edição do genoma para gerar recombinase Cre / Flp, Cre induzível dependente de ligante ou linhas de expressão de repórter fluorescente porque poderíamos obter pelo menos um animal knock-in de um experimento como uma taxa satisfatória para uso prático. Incidentalmente, não percebemos nenhuma evidência de qualquer ssDNAs longos potencialmente inibindo a atividade de CRISPR-Cas9 ou diminuindo o número de filhotes nascidos após a microinjeção.

Geralmente, linhas de driver de recombinase Cre / Flp, exemplificadas pela Dcx-T2A-iCre A linha gerada na Figura 2 pode ser empregada para o sistema de manipulação de genes espaço-temporal [32,33], que desenvolvemos anteriormente, em combinação com os vetores virais dependentes de recombinase. Essas estratégias optogenéticas podem contribuir para a análise sistemática das mudanças dinâmicas da regulação gênica nas células.

Nossos protocolos simples e rápidos propostos aqui poderiam, portanto, ser a primeira escolha para produzir facilmente doadores de ssDNA longos sem erros com uma maneira econômica no laboratório, e as linhas de knock-in de cassete de gene funcional resultantes devem acelerar a pesquisa biológica.


Pergunta sobre primers de DNA e PCR.

I & # x27m estudando PCR e replicação de DNA etc para um curso de biotecnologia e I & # x27m me perguntando por que os primers não estão sendo replicados em uma reação de PCR. Pelo que eu sei, os primers são apenas pequenos pedaços de DNA que complementam a fita que você está tentando replicar, da qual você adiciona muito. Uma das condições para um bom primer é que ele não deve ser complementar a si mesmo ou ser um palíndromo etc. Mas não vejo por que os dNTPs não se anexariam ao primer e formariam um & # x27primer & # x27 complementar. Eu acho que isso não seria tão ruim se você adicionar dNTPs suficientes porque toda vez que você desnaturar novamente você & # x27d obterá o antigo de volta e estes & # x27 primers complementares & # x27 às vezes seriam replicados também, então eu acho que a quantidade de primers livres não & # x27t mude tanto assim. Contanto que você tenha dNTPs suficientes. O estranho é que eu não vi nenhuma menção a isso no curso e pesquisar no Google também não ajudou muito. Além disso, e se a & # x27 cartilha complementar & # x27 encontrar uma peça que pode anexar no DNA, então isso iria bagunçar bastante, não?

Eu enviei isso para a química também, eu & # x27m não tenho muita certeza de a qual pertence.


Como os primers se anelam ao ssDNA? - Biologia

O recozimento de fita simples (SSA) é um processo que é iniciado quando uma quebra de fita dupla é feita entre duas sequências repetidas orientadas na mesma direção. As regiões de fita simples são criadas adjacentes à quebra que se estendem às sequências repetidas de modo que as fitas complementares possam se anelar umas às outras. Este intermediário recozido pode ser processado digerindo as caudas de fita simples e preenchendo as lacunas.

Evidências para SSA em leveduras foram observadas quando se descobriu que a endonuclease HO poderia estimular eventos de deleções entre ura3 sequências na Vivo. Os produtos de crossover recíproco não puderam ser identificados pela análise de hibridização Southern, sugerindo um processo não conservador, como SSA. Posteriormente, esses eventos de deleção foram caracterizados e observou-se que, à medida que as sequências repetidas eram afastadas, as deleções ocorriam com menos frequência e surgiam em momentos posteriores. Isso é consistente com a proposta de que leva mais tempo para uma nuclease alcançar repetições localizadas mais longe de um DSB.

Também consistente com o modelo SSA foi a observação de que, se várias repetições estiverem presentes, as deleções ocorrem preferencialmente entre as repetições mais próximas do intervalo. Neste experimento, um DSB causou preferencialmente uma deleção entre B e C em vez de A e C.

O recozimento de fita única também foi caracterizado em vários outros aspectos. Medimos sua dependência de homologia e mostramos que a formação do produto aumenta com o aumento da homologia. O patamar de formação do produto atingiu cerca de 400 bp e a menor homologia que testamos foi de 29 bp, que se recombinou a um nível de 0,1%. Curiosamente, se uma repetição estiver imediatamente adjacente ao DSB, tão pouco quanto 10 bp podem ser usados ​​em uma frequência muito eficiente. Também separamos as repetições em até 25 kb e ainda obtemos um reparo eficiente por eventos de exclusão SSA. Esse processo leva 6 horas, durante as quais as células interrompem seu ciclo celular até que o DSB possa ser reparado. Este experimento sugere que as caudas permanecem relativamente estáveis ​​durante este tempo.

RAD52. SSA requer vários produtos de genes que também são necessários para outros tipos de ensaios de recombinação. O Rad52p, por exemplo, é necessário para a maioria, senão todos os tipos de processos de recombinação, incluindo SSA. Rad52 mostrou ser uma proteína de ligação de DNA que pode recozer ssDNA em vitro e na sua ausência o Rad51 não consegue se ligar às caudas de DNA de fita simples. O Rad52 isolado de humanos possui a capacidade de se ligar às extremidades do DNA. Enquanto RAD52 é claramente necessário para SSA usando ura3 e leu2 substratos, foi relatado que RAD52 não é necessário para eventos SSA localizados dentro da matriz de DNA ribossomal (100 repetições de uma sequência de 9 kb) e é parcialmente necessário para SSA dentro de um CUP1 matriz de repetições. Sugerimos que grandes quantidades de homologia podem compensar as deficiências criadas por rad52 mutações.

RAD59. Um homólogo de RAD52, RAD59, também é necessário para SSA. Mutantes Rad59 foram isolados em um rad51 antecedentes e com base em sua relação em alguns ensaios de epistasia, pode definir duas vias de recombinação. Tendo em vista sua homologia com RAD52, verificou-se que a superexpressão de RAD52 poderia compensar certas deficiências de rad59. O Rad59 purificado possui propriedades de ligação ao DNA e atividade de recozimento de fitas.

RPA . Outro fator de ligação ao DNA, o complexo RPA, é necessário para SSA. Um alelo de RPA1, rpa1-t11, é parcialmente defeituoso para SSA, mas ainda é capaz de desempenhar seu papel na replicação do DNA, pois as células parecem crescer normalmente. O defeito é mais aparente quando as repetições no substrato SSA são pequenas.

RAD50, MRE11, XRS2, RAD51, RAD54, RAD55 e RAD57. Curiosamente, o Rad51 não é necessário para o SSA. Rad51 é o homólogo do gene recA bacteriano e é necessário para a conversão gênica induzida por DSB. Rad51 pode estar envolvido na invasão ou troca de fitas e, portanto, não se espera que desempenhe um papel na SSA, onde duas fitas interagem entrelaçando-se uma em torno da outra. Rad54, Rad55 e Rad57 também não são necessários para SSA, embora sejam necessários para a conversão gênica induzida por DSB. Outro gene RAD, RAD50, é parcialmente necessário para SSA. Rad50 forma um complexo com Mre11 e Xrs2. Exclusões de rad50 ou xrs2 retardar a formação de DNA de fita simples e reduzir a quantidade de produto formado.

Proteínas de reparo incompatíveis e RAD1-RAD10. As proteínas de reparo de incompatibilidade Msh2 e Msh3, bem como Rad1 e Rad10 são necessárias para SSA eficiente e parecem ser necessárias para remover as caudas 3 'não homólogas do intermediário recozido. Um ensaio de conversão de gene desenvolvido para testar a capacidade de vários mutantes para remover sequências não homólogas adjacentes ao DSB implica que esses quatro genes são necessários para a remoção da cauda não homóloga. Vários grupos de pesquisa mostraram que Msh2 e Msh3 formam um complexo na Vivo e têm uma forte preferência por reconhecer estruturas & quotloop-out & quot, tais como aquelas formadas por erros de replicação de deslocamento de quadro. Msh2 foi implicado na ligação a estruturas palindrômicas formadas durante a recombinação meiótica na Vivo e também demonstrou se ligar a junções de feriados em vitro. Com base nessas observações, propusemos que Msh2 e Msh3 se ligam à junção ramificada entre o DNA de fita simples e dupla. O complexo estabiliza o intermediário recozido e / ou sinaliza a endonuclease Rad1-Rad10 para clivar a cauda de fita simples. Msh2 e Msh3 são dispensáveis ​​se o comprimento da homologia for grande (1 kb), sugerindo que eles podem atuar para estabilizar junções onde as repetições são pequenas (0,2 kb).

Também usamos o SSA como uma ferramenta para estudar o reparo de incompatibilidade. Para fazer isso, introduzimos incompatibilidades entre as sequências repetidas de modo que as proteínas de reparo de incompatibilidade irão reparar o heteroduplex para uma ou outra sequência. As proteínas de reparo de incompatibilidade também levarão a uma redução na quantidade de produto formado em um processo denominado rejeição de heteroduplex. Muitos modelos podem ser imaginados; talvez o mais fácil seja imaginar que uma nuclease extirpa as incompatibilidades, mas prossegue longe demais e destrói o intermediário.

Analisamos quais proteínas de reparo de incompatibilidade são importantes para esse reparo de incompatibilidade e rejeição de heteroduplex, e descobrimos que Msh6 e Msh2 são importantes para ambos os processos. o mutL homólogos, PMS1, MLH1, MLH2 e MLH3 também são importantes para ambos os processos, mas a situação parece ser mais complexa devido a alguma redundância aparente entre os componentes.


Rejeição heteroduplex por meio do desenrolamento do fio. Pode-se imaginar várias maneiras pelas quais a rejeição do heteroduplex pode ocorrer. Por exemplo, um mecanismo pode ser semelhante ao reparo de incompatibilidade e envolver a excisão de pares de bases incompatíveis. Se a excisão for extensa, o intermediário SSA seria destruído. O intermediário SSA também seria destruído, se duas excisões começassem em fios diferentes. Um modelo alternativo propõe que os fios sejam desenrolados para que possam buscar uma melhor combinação.

Para explorar essas possibilidades, fizemos duas cepas contendo três repetições que podem resultar em dois produtos SSA. Quando as repetições são idênticas, ambos os produtos são feitos em níveis aproximadamente iguais. Quando as heterologias são introduzidas na repetição do meio, a recombinação com aquela repetição diminui e a outra aumenta.


As viabilidades gerais das duas cepas são quase iguais. Isto é importante uma vez que os modelos de "destruição" prevêem uma diminuição na viabilidade quando as heterologias estão presentes. Por outro lado, o modelo & quotunwinding & quot prevê viabilidades iguais, se os fios desenrolados não forem destruídos e forem capazes de buscar uma combinação mais perfeita.

Apoiando este modelo, foi a descoberta de que a deleção do gene da helicase Sgs1 causou uma perda de rejeição do heteroduplex. Os níveis de produto usando repetições incompatíveis se aproximaram dos substratos com repetições idênticas. Curiosamente, enquanto os mutantes com sgs1 são defeituosos na rejeição do heteroduplex, eles não são defeituosos no reparo de incompatibilidade, indicando que são vias separáveis. A perda da helicase Srs2 não teve efeito na rejeição do heteroduplex. Da mesma forma, a perda da nuclease ExoI não teve efeito.

Papel Biológico. Uma questão frequentemente levantada é por que os organismos desenvolveriam um mecanismo de reparo que exclui material genético que pode ser essencial para a sobrevivência? Uma possibilidade é que o SSA seja bem adequado para reparar DSBs que ocorrem em matrizes em tandem de sequências, como as encontradas no locus de rDNA. Um DSB iniciaria SSA resultando em um evento de deleção de genes redundantes que podem ser restaurados por mecanismos que normalmente mantêm o número de cópias das matrizes. Os experimentos acima sugerem que a rejeição do heteroduplex fornece outro meio de manter a homogeneidade das matrizes em tandem, além do reparo de incompatibilidade.

Outra consideração é que o SSA é apenas um dos vários mecanismos que podem reparar um DSB. SSA oferece uma maneira de uma célula possivelmente sobreviver, se a conversão do gene for muito lenta ou não for uma opção.


Princípio de PCR

Onde,
C: quantidade final de DNA
C0: quantidade inicial de DNA
E: eficiência
n: número de ciclos
s: declive da fase exponencial.

Durante a etapa de desnaturação, o dsDNA derrete abrindo para ssDNA, e todas as reações enzimáticas param (ou seja, a extensão de um ciclo anterior). Para a desnaturação do DNA, a temperatura é geralmente elevada para 93-96 & degC, quebrando as ligações H e, portanto, aumentando o número de bases não emparelhadas. A temperatura na qual metade do dsDNA é de fita simples é conhecida como temperatura de fusão, Tm. O tipo de solvente, a concentração de sal e o pH influenciam o processo de desnaturação. A concentração de G / C e T / A também pode afetar o Tm valor. As sequências de DNA ricas em G / C têm maior Tm valores em comparação com aqueles ricos em T / A. A segunda fase, isto é, o emparelhamento de iniciadores com ssDNA, ocorre a temperaturas mais próximas de seu Tm (geralmente 55-65 e degC) e é denominado como temperatura de recozimento (Tuma) Os oligonucleotídeos usados ​​como iniciadores consistem tipicamente em sequências relativamente curtas (15-25 nt) complementares aos locais de reconhecimento, flanqueando o segmento do DNA alvo a ser amplificado. Uma vez que a temperatura é reduzida, as duas cadeias de ssDNA complementares tendem a re-hibridizar em uma molécula de dsDNA. Nesta fase, as ligações iônicas são formadas e quebradas constantemente entre o primer de fita simples e o molde de fita simples. Se os primários se recozem adequadamente ao molde, a ligação iônica é forte o suficiente entre o molde e o primer para estabilizar a estrutura de fita dupla nascente e permitir que a polimerase se fixe e comece a copiar o molde. A fase de extensão é realizada através da sequência alvo usando uma polimerase de DNA estável ao calor na presença de dNTPs e MgCl2, resultando em uma duplicação do material alvo inicial. Esta enzima tem atividade de polimerase de DNA 5 '- & gt 3', isto é, adiciona dNTPs de 5 'a 3', lendo o modelo de 3 'a 5'. Quando os primers foram estendidos algumas bases, eles possuem uma atração iônica mais forte para o modelo, o que reduz a probabilidade de desvinculação. A duração da etapa de extensão pode ser aumentada se a região do DNA a ser amplificado for longa (& gt 1000 bp), no entanto, para a maioria dos experimentos de PCR, 1 min é suficiente para obter uma extensão completa.

Após cada ciclo, as fitas de DNA recém-sintetizadas podem servir como molde no próximo ciclo. O principal produto desta reação exponencial é um segmento de ds-DNA cujos terminais são definidos pelos terminais 5 'dos ​​2 primers e cujo comprimento é definido pela distância entre os primers. Os produtos de uma primeira rodada de amplificação bem-sucedida são moléculas de DNA de tamanho heterogêneo, cujos comprimentos podem exceder a distância entre os locais de ligação dos dois primers. Na segunda rodada, essas moléculas geram fitas de DNA de comprimento definido que se acumularão de forma exponencial nas rodadas posteriores de amplificação e formarão os produtos dominantes da reação.

Assim, a amplificação, como um número final de cópias da sequência alvo, é expressa pela seguinte equação:

Onde,
n é o número de ciclos
2n é o primeiro produto obtido após o primeiro ciclo e o segundo produto obtido após o segundo ciclo com comprimento indefinido.
x é o número de cópias do modelo original.

Potencialmente, após 30 ciclos de PCR, haverá cerca de 23 amplificação de 30 vezes, assumindo 100% de eficiência durante cada ciclo. A eficiência de um PCR varia de modelo para modelo e de acordo com o grau de otimização que foi realizado.

a partir de Rodr & iacuteguez-L & aacutezaro, D. e Hern & aacutendez, M. (2013). Introdução ao PCR em tempo real publicado em Real-Time PCR in Food Science: Current Technology and Applications. D. Rodriguez-Lazaro, ed. (Norfolk, Reino Unido: Caister Academic Press). ISBN: 978-1-908230-15-7.


F. COMPARAÇÃO DE DNA

A sequência de DNA de cada indivíduo deve ser diferente de todos os outros indivíduos no mundo (com exceção de gêmeos idênticos). A diferença deve ser menor do que a diferença entre um humano e um chimpanzé, que são 98,5% idênticos. Digamos que cada um deles tenha sequências de DNA que são 99,9% idênticas em comparação com alguns "humanos normais". Dado que temos cerca de 4 bilhões de pares de bases de DNA, isso significa que somos todos diferentes em cerca de 0,001 x 4.000.000.000, o que equivale a cerca de 4 milhões de pares de bases diferentes. Isso significa que, em média, temos uma diferença de nucleotídeos para cada 1000 pares de bases de DNA. Alguns deles estão em genes, mas a maioria provavelmente está entre o DNA, e muitos mostraram estar agrupados em áreas de DNA altamente repetitivo nas extremidades dos cromossomos (chamados telômeros) e no meio (chamados centrômeros).

Agora, lembre-se de que seus locais de enzimas de restrição também estão espalhados aleatoriamente ao longo do DNA. Se algumas das diferenças no DNA entre os indivíduos ocorrem dentro das sequências onde o DNA é clivado por enzimas de restrição, então, em alguns indivíduos, uma determinada enzima não clivará no local usual, mas em um local mais distal. Portanto, o tamanho dos fragmentos da enzima de restrição deve ser diferente para cada pessoa. O DNA de cada pessoa, quando cortado por uma bateria de enzimas de restrição, deve dar origem a um conjunto único de fragmentos de DNA de tamanhos exclusivos para aquele indivíduo. O DNA de cada pessoa tem um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) exclusivo. Como você poderia detectar esse polimorfismo?

Você já sabe como cortar uma amostra de DNA com enzimas de restrição e depois separar os fragmentos em um gel de agarose. Uma etapa adicional é necessária, no entanto, uma vez que milhares de fragmentos poderiam aparecer no gel, que seriam observados como um grande esfregaço contínuo. Se, no entanto, cada fragmento pudesse ser reagido com um conjunto de pequenas sondas de DNA radioativas que são complementares a certas seções altamente polimórficas de DNA (como DNA teleomérico) e então visualizado, apenas alguns conjuntos de bandas discretas seriam observados no gel de agarose . Essas bandas discretas seriam diferentes das bandas de DNA vistas no gene de outro indivíduo tratado da mesma maneira. Essa técnica é chamada de Southern Blotting e funciona como mostrado abaixo. Os fragmentos de DNA são submetidos à eletroforese em um gel de agarose. Os fragmentos de DNA ds são desenrolados por aquecimento e, em seguida, um pedaço de papel de filtro de nitrocelulose é colocado no topo do gel. O DNA do gel é transferido para o papel de filtro. Em seguida, uma pequena sonda de oligonucleotídeo radioativo, complementar a um sítio polimórfico no DNA, é adicionada ao papel. Liga-se apenas ao fragmento contendo DNA complementar à sonda. O papel de filtro é seco e um pedaço de filme de raios X é colocado sobre a folha. Também corrido no gel, e transferido para a folha, é um conjunto de fragmentos radioativos (que não são complementares à sonda), que servem como um conjunto de marcadores para garantir que a eletroforese em gel e transferência para o papel de filtro foi correta. Esta técnica é mostrada na próxima página, junto com uma análise RFLP de uma família particular.

Quando essa técnica é usada em casos forenses (como o julgamento OJ Simpson) ou em casos de paternidade, é chamada de impressão digital de DNA. Com as técnicas atuais, os investigadores podem afirmar inequivocamente que as chances de um determinado padrão não pertencer a um suspeito estão na faixa de um milhão para um. O filme de raio-x mostrado abaixo é uma cópia de evidências forenses reais obtidas em um caso de estupro. São mostrados os resultados do Southern blot do suspeito 1, do suspeito 2, da vítima e das evidências forenses. Analise os dados.

Figura: ANÁLISE FORENSE DE BLOT / PCR SUL - POLIMORFISMO DE COMPRIMENTO DE FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO


Assista o vídeo: Como diluir seus primers adequadamente (Dezembro 2021).