Em formação

Tentando extrair DNA com um kit incompleto


Quero fazer uma extração de DNA em amostras de solo e raiz usando um kit de placa de 96 poços.

Meu problema é que alguém examinou o kit e tirou a fita de vedação. Essa fita era usada para selar as placas para que pudessem ser agitadas e centrifugadas. Considerei usar uma fita semelhante de nossas reações qPCR, mas este seria um último recurso muito caro. Tentei encher um prato com água e cobri-lo com tiras de fita adesiva, mas a fita não fornece uma vedação boa o suficiente para o vórtice.

Estou me perguntando se alguém já passou por uma situação semelhante e se eles foram capazes de encontrar uma solução. Este kit em particular é o kit PowerSoil da MoBio, que não existe mais depois de ser adquirido pela Qiagen. Liguei para a Qiagen e eles não vendem a fita de vedação individualmente.

Obrigado


É a etapa de vórtice que está causando o problema. Mas você pode agitar manualmente, pipetando para cima e para baixo algumas vezes no poço. Em seguida, selar o topo da placa com parafilme para centrifugação.


Extraindo DNA com o tio Cecil

Blaine e Tracey me pediram para passar por aqui hoje e compartilhar com vocês "algo divertido". Bem, todos nós sabemos aonde isso pode levar.

Desta vez, não aprenderemos sobre foguetes. Estaremos aprendendo sobre algo muito menor - DNA.

A jornada de Blaine e Tracey através do DNA está registrada no volume 2. Mas se você ainda não chegou lá, eu recomendo fortemente este post sobre DNA.

Resumindo, o DNA é o que diz às nossas células o que fazer e como olhar. Ele reside no núcleo de uma célula, portanto, como você pode imaginar, é bem pequeno.

Na verdade, você normalmente precisa de um microscópio muito poderoso para ver o DNA por si mesmo. Isso a menos que você o extraia e o force a se juntar em uma massa gigante de DNA !!

Hoje, vou compartilhar com vocês um truque que aprendi na faculdade para tornar o DNA visível a olho nu. Sempre me faz sentir um pouco como um cientista louco, então tenho certeza de que vocês vão se divertir muito com isso.


O que você precisa para extração de DNA:

O que você faz:

1. Crie uma solução salina em um copo adicionando duas colheres de sal de laboratório a aproximadamente 25 ml de água destilada. Mexa até que o sal esteja completamente dissolvido.

2. Despeje a água salgada no copo de papel.

3. Sem engolir, beba um bocado da solução do copo de papel e agite para frente e para trás por pelo menos 30 segundos, ocasionalmente raspando os dentes na parte interna das bochechas. É melhor fazer isso com a boca limpa, ou seja, não logo após o almoço.

4. Cuspa a solução para bochechos de volta no copo. Em seguida, dobre o copo em uma espécie de bico e despeje a solução para bochechos no tubo de ensaio até que ela preencha cerca de meia polegada do fundo do tubo de ensaio.

5. Com cuidado, adicione duas gotas de sabonete líquido.

6. Inclinando o tubo de ensaio aproximadamente 45 graus, use a pipeta (ou conta-gotas no frasco de álcool) para adicionar 20 gotas do álcool resfriado de forma que deslize pelo tubo de ensaio sem perturbar a solução. Por ser menos denso, o álcool ficará sobre o enxaguatório bucal e a solução de sabão.

7. Coloque a tampa firmemente no tubo de ensaio e muito lenta e suavemente incline-o de cabeça para baixo e depois com o lado direito para cima três vezes. Faça com cuidado para não fazer bolhas.

8. Deixe o tubo de ensaio permanecer parado em uma posição vertical por um minuto. Neste ponto, você deve começar a ver um fio branco leitoso, possivelmente intercalado com bolhas, aparecer entre a solução e o álcool. Esse é o seu DNA! Após vários minutos, o DNA deve ser suspenso na camada de álcool.

9. Se desejar, insira seu espeto ou vareta de agitação no tubo de ensaio e enrole suavemente o DNA ao redor dele.

10. Para guardá-lo, raspe-o cuidadosamente no frasco pequeno com algumas gotas de álcool. Armazenado no freezer, você pode preservar seu DNA quase indefinidamente!


Métodos

Cepas celulares e condições de crescimento

Culturas de Euglena Gracilis Z (SAG 1224-5 / 25), Euglena Hiemalis (CCAP 1224/35), e Euglena longa (CCAP 1204-17a) foram cultivadas estaticamente no meio Cramer-Myers (Cramer e Myers 1952), suplementado com etanol (0,8% v/v) e extrato de solo aquoso (1% v/v) As células foram cultivadas a 18 ° C sob exposição à luz branca (ciclo claro / escuro de 16: 8 h, ca. 27 μmol fótons m −2 s −1).

Teste de sensibilidade a antibióticos de difusão em disco

A fim de determinar a susceptibilidade aos antibióticos de organismos contaminantes, o teste de difusão em ágar foi realizado (Bauer et al. 1966). As culturas iniciais não axênicas de euglenídeos foram semeadas em Ágar Extrato de Levedura de Soja Triptona (TSYEA BTL) suplementado com anfotericina B (1% v/C Sigma). Em seguida, os discos de papel impregnados com antibiótico (Oxoid) foram colocados nas placas e incubados. Nossa experiência anterior mostrou que os antibióticos que afetam a síntese de DNA ou proteína, particularmente aqueles desenvolvidos recentemente, são mais letais para euglenídeos em concentrações mais baixas do que para seus contaminantes bacterianos e / ou fúngicos. Portanto, não foram considerados neste estudo. Vários agentes que inibem a síntese da parede celular bacteriana, como ampicilina (25 μg), cefotaxima (30 μg), fosfomicina (50 μg), gentamicina (30 μg), penicilina (25 μg), rifampicina (30 μg), trimetoprima (2,5 μg ) e vancomicina (30 μg), foram utilizados na triagem de antibióticos, como os menos nocivos para as células de euglenídeos. Cefotaxima e vancomicina - os compostos que geram as maiores zonas de inibição - foram escolhidos para o procedimento de purificação final.

Purificação de cultura

As culturas iniciais de euglenídeos foram mecanicamente pré-purificadas por centrifugação (2500 ×g, 30 s, TA) e lavagem com água destilada (cada vez que o sobrenadante foi descartado). O procedimento foi repetido enquanto a quantidade de bactérias observadas ao microscópio diminuía visivelmente. Essas culturas preparadas foram diluídas e semeadas em meio Cramer-Myers sólido suplementado com meio mineral (5% v/v) (Starr 1964), extrato de solo aquoso (5% v/v), e anfotericina B (1% v/C Sigma), e agarizado com TSYEA (1% v/C BTL). Para obter zonas com concentrações decrescentes de antibióticos, apenas dois discos, um para cada um dos compostos selecionados (cefotaxima e vancomicina, respectivamente), foram colocados nos lados opostos da placa (Figura S1 suplementar, material suplementar online). Crescido Euglena as colônias (visíveis ao microscópio como livres de bactérias e vivas) foram subsequentemente riscadas novamente no mesmo meio para purificação adicional. Para aumentar a capacidade de sobrevivência do Euglena células, os discos de antibióticos foram colocados nas placas a cada segunda passagem. O procedimento foi repetido até a obtenção das culturas de algas axênicas. Em seguida, foram transferidos para o meio líquido e monitorados constantemente quanto à presença de bactérias e fungos.

Protocolos de extração de DNA genômico

Cinco métodos de extração de DNA foram avaliados neste estudo. O DNA foi isolado de todas as três espécies (E. gracilis, E. longa, E. hiemalis) em pentaplicatas com cada protocolo de extração. As etapas experimentais iniciais permaneceram as mesmas em todos os casos. Um volume total de 10 mL de culturas líquidas na fase de crescimento logarítmico foi centrifugado (5000 ×g, 5 min, RT) e enxaguados três vezes com água sem nuclease para remover completamente os resíduos do meio de crescimento. Lavado Euglena as células foram então ressuspensas, divididas em alíquotas (1 mL) e centrifugadas. Em seguida, cada um dos pellets de células (± 50 mg) foi processado de acordo com os requisitos do método escolhido. Finalmente, o DNA foi eluído ou ressuspenso em 100 μL de água livre de nuclease (GE Healthcare).

Extração com kits comerciais de coluna de membrana de sílica

Dois kits fabricados comercialmente, projetados para purificação rápida de DNA genômico - DNeasy Blood & amp Tissue (Qiagen) e DNeasy Plant (Qiagen) - foram testados. No caso do kit DNeasy Blood & amp Tissue, foi aplicado o protocolo de coluna de rotação projetado para purificação de DNA total de sangue animal / células em cultura, enquanto no caso do kit DNeasy Plant, foi utilizado o protocolo TissueRuptor com nitrogênio líquido. Todas as etapas foram realizadas estritamente conforme descrito nas instruções fornecidas pelo fabricante. Em ambos os casos, a digestão de RNAse A em coluna (100 mg mL −1, 4 μL, 2 min, RT Qiagen) foi realizada.

Extração com fenol: clorofórmio

O DNA genômico foi isolado com precipitação de etanol padrão seguindo fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (24: 25: 1 v/v AppliChem), de acordo com o protocolo previamente descrito, embora ligeiramente modificado (Psifidi et al. 2010 Green e Sambrook 2017). Especificamente, 1 mL de tampão de lise contendo Tris HCl 10 mM (pH = 7,5), EDTA 1 mM, NaCl 50 mM, SDS a 0,2% (v/C), e 1 mg de proteinase K (Qiagen) foi usado para digerir Euglena células durante 1,5 h a 56 ° C. A extração do lisado foi realizada duas vezes com 1 mL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (24: 25: 1 v/v AppliChem). Após a primeira etapa de extração, a fase aquosa foi tratada com RNAse A (100 mg mL −1, 4 μL Qiagen) e incubada a 37 ° C por 30 min com mistura periódica e suave. Posteriormente, a extração foi repetida. Em seguida, foram adicionados 2,5 volumes de etanol absoluto (AppliChem) e 0,1 volume de acetato de sódio 3 M (pH = 5,2) e o DNA foi precipitado a -20 ° C durante 1,5 h. A amostra foi girada em 12.000 ×g, 10 min, TA, e o sedimento de DNA foi lavado duas vezes com etanol a 70%. Finalmente, o sedimento foi seco ao ar e ressuspenso em água sem nuclease.

Extração com método tradicional CTAB

O isolamento de DNA de brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB AppliChem) foi realizado estritamente conforme descrito em outro lugar (Allen et al. 2006). Os volumes de reagentes utilizados foram reduzidos de acordo com a quantidade do Euglena biomassa.

Extração com método CTAB modificado

O protocolo de extração rápida de DNA baseado em CTAB (Healey et al. 2014) foi ligeiramente modificado. Antes do isolamento adequado, os sedimentos celulares foram lavados com DMSO: acetonitrila gelado (1: 1 v/v AppliChem). Esta etapa foi introduzida para perfurar a película (e para facilitar a penetração do tampão de lise nas células), bem como para remover os pigmentos fotossintéticos, polissacarídeos e ésteres de cera que impedem o isolamento e purificação dos ácidos nucleicos (Rosenberg 1967 Mederic et al . 1987 Barsanti et al. 2001 del Campo et al. 2010 Healey et al. 2014). Além disso, o tratamento com RNAse A (100 mg mL −1, 4 μL Qiagen) foi estendido para 30 min em comparação com as diretrizes fornecidas por Healey et al. (2014).

Avaliação de integridade de DNA

A integridade das amostras de DNA obtidas usando cada método de extração testado foi examinada por meio de eletroforese em gel padrão (Psifidi et al. 2015). Em detalhes, 5 μL de cada extrato de DNA foram analisados ​​em um gel de agarose 1,5% corado com 0,5% de Midori Green (Nippon), executado em tampão TAE 1 ×. As bandas de DNA foram visualizadas usando o transiluminador ChemiDoc UV (Bio-Rad).

Pureza e rendimento do DNA

Para cada um dos procedimentos de extração aplicados, a concentração e a pureza do DNA recuperado foram avaliadas espectrofotometricamente com o NanoFotômetro NP80 (Implen). Um abdômen260/280 razão foi usada para avaliar a contaminação de proteína enquanto um Abs260/230 razão foi usada para determinar a contaminação de solventes orgânicos. Posteriormente, para cada espécie / método de isolamento, uma amostra (com os melhores parâmetros) foi selecionada com base nos valores de absorbância e submetida a medidas fluorimétricas. A concentração do DNA nessas amostras foi examinada posteriormente usando o Ensaio de DNA de alta sensibilidade implementado pelo fluorômetro Qubit 3.0 (Thermo Scientific). Cada vez, 1,5 μL (absorbância) ou 1 μL (fluorescência) de amostra de DNA (ou água sem nuclease como uma solução em branco) foi usado durante a avaliação da amostra. Cada medição foi realizada duas vezes e os valores obtidos foram calculados. O rendimento total de DNA foi calculado com base na concentração de DNA derivada do NanoFotômetro e os resultados do Qubit calculados juntamente com o volume total do extrato de DNA.

Aplicação do DNA isolado em sequenciamento de alto rendimento

Com base nos valores médios dos parâmetros acima, dos cinco métodos de extração testados, o mais eficaz e robusto foi selecionado. A fim de avaliar sua aplicação na construção e sequenciamento da biblioteca NGS, isolados únicos de E. hiemalis e E. longa, que exibiram parâmetros ótimos de concentração e qualidade, foram escolhidos para manipulações posteriores. O DNA preparado para o sequenciamento foi armazenado em - 20 ° C por no máximo alguns dias, evitando sua exposição a amplitudes de temperatura.

A preparação de uma biblioteca de leituras de pares (PE150) foi realizada externamente usando NEBNext DNA Library Prep Master Mix Set para Illumina (NEB) e sequenciada comercialmente em um instrumento HiSeq4000 (Genomed, Varsóvia, Polônia). A qualidade da biblioteca de DNA foi avaliada usando um 2100 Bioanalyzer (Agilent). Além disso, a qualidade das leituras de sequenciamento bruto após o corte (remoção de adaptadores de biblioteca) foi analisada usando o software FastQC (Andrews 2010).


Indiana Jane deve ter permissão para trabalhar com cada osso. Quando ela está pronta para extrair o DNA, ela corta um pequeno pedaço de osso ou dente e o transforma em pó. Parece um pouco com farinha com que você pode assar.

O osso deve ser cortado antes de ser esmagado para análise do pó ósseo. Clique para mais detalhes.

No pó ósseo estão milhões de células ósseas e milhões de células de outros organismos, incluindo bactérias e parasitas. Uma cópia do DNA está localizada dentro de cada célula.

No pó ósseo existe uma mistura de sujeira, células ósseas e células de bactérias, parasitas ou outros micróbios. Imagem de Maria Nieves-Colón.

Em seguida, ela precisa abrir as paredes celulares para que o DNA se espalhe. Uma enzima especial faz esse trabalho. É muito parecido com quebrar um ovo em uma tigela, exceto que tudo é microscópico.

Mas o DNA não é a única coisa dentro de uma célula. Quando as paredes das células estão rachadas, outras partes das células também saem. Para separar o DNA das outras partes da célula, a próxima etapa é a limpeza. Indiana Jane deve capturar apenas o DNA, mas deixar toda a “sujeira” para trás.

Quando o DNA está limpo, ele está pronto para análise. Indiana Jane espera que tenhamos capturado mais do que DNA humano. É aqui que ela espera que o DNA do micróbio esteja.


Explorar protocolos de extração de ácido nucléico por tipo de amostra

O Manual Técnico fornecido com cada kit contém protocolos recomendados para tipos específicos de amostra. Continuamos testando tipos de amostra adicionais e publicamos os resultados como notas de aplicação curtas. Pesquise nosso banco de dados de notas de aplicação para seu tipo de amostra específico de interesse para encontrar protocolos para métodos manuais, Maxwell ou baseados em placas.

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Antes de começar

  • O RNA não é tão estável quanto o DNA e é suscetível à degradação pelo calor, RNases e outras enzimas.

* Dica Profissional * Sempre use luvas e, sempre que possível, mantenha a amostra de RNA e os reagentes frios e trabalhe rapidamente para reduzir a degradação do RNA.

* Dica Profissional * Mantenha a área de trabalho, o equipamento e os reagentes livres de RNase (use uma solução de descontaminação RNase, como RNaseZap & reg ou RNase AWAY & reg).

Última atualização: 10 de abril de 2020


Extração de DNA

Nosso laboratório está usando o kit de extração Plant DNeasy da Qiagen para a maioria das extrações de DNA. Testamos esse kit em relação a vários outros métodos (incluindo o descrito abaixo) e descobrimos que é o método mais simples que fornece DNA limpo de alta qualidade (nota). No entanto, também usamos um protocolo de isolamento de DNA CTAB modificado (descrito abaixo) que é adequado para algodão e outras plantas com abundantes polissacarídeos e polifenólicos amp.

Este protocolo é modificado a partir do procedimento relatado por Tel-Zur, N. et al. em Plant Biology Reporter (1999, vol. 17, pp. 249-54). Produziu DNA de alta qualidade de várias espécies malváceas, incluindo Gossypioides kirkii, uma espécie muito recalcitrante para DNA, e de velhas fibras de algodão. O tampão de extração é responsável por se livrar de muitos componentes celulares, mas retém os núcleos das organelas que também se abrem após a sua introdução. O tampão CTAB com alto teor de sal separa especificamente o DNA de outras substâncias, como proteínas. Sarkosyl é um detergente e, portanto, rompe as membranas. Fenol e clorofórmio são removedores de proteínas.

Reagentes e Soluções

  • Tampão de extração: Tris-HCl 100 mM em pH 8,0, contendo sorbitol 0,35 M, EDTA 5 mM em pH 8,0 e 2-mercaptoetanol a 1% (adicionado logo antes de nós) (manter a solução inteira gelada)
  • Tampão CTAB de alto sal: 50 mM Tris-HCl em pH 8,0, contendo 4M NaCl, 1,8% CTAB (brometo de alquiltrimetilamônio misto) e 25 mM EDTA em pH 8,0
  • Sarkosyl (solução aquosa a 30%)
  • Clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1)
  • Isopropanol (100%)
  • Tampão TE, solução 1´
  • RNase A (10 mg / mL)
  • Acetato de sódio (3M, a pH 5,2)
  • Fenol
  • Fenol: clorofórmio (1: 1 feito logo antes de usar)
  • Clorofórmio
  • Etanol (70% e 100%, ambos frio)

1. Moa 1-2 g de tecido fresco com almofariz e pilão em nitrogênio líquido.

2. Transfira o pó para tubos de 50 mL e adicione 20 mL de tampão de extração gelado. Misture e / ou inverta os tubos suavemente por cerca de 5 minutos.

3. Centrifugue os tubos a 4 ° C, 5000g (

6200 rpm) por 10 minutos. [Usamos uma centrífuga de mesa IEC Centra MP4R equipada com rotor modelo 801 (ângulo fixo de 6 posições de 45 °)].

5. Adicione mais 20 mL de tampão de extração gelado e lave por aproximadamente 5 minutos como antes.

6. Centrifugue como na etapa # 3.

8. Adicione 5 mL de tampão de extração gelado e misture delicadamente como antes.

9. Adicionar 3,5 mL do tampão CTAB com alto teor de sal e 0,3 mL de sarcosil a 30%. Incubar em um shaker (50-60 rpm) por 1 a 1 hora e meia.

10. Extrair com clorofórmio. [Nota: Faça isso adicionando um volume igual de clorofórmio e misturando suavemente. Agite suavemente e centrifugue a 5000g por 10 minutos. Você notará a formação de três camadas: uma fase superior (fase aquosa), uma interfase fina e uma fase inferior. A fase que você deseja coletar é a fase superior, que contém o seu DNA. A interfase contém remanescentes das células e várias porcarias. A fase inferior será composta principalmente por clorofórmio, proteínas e um composto de compostos bioquímicos. Ao pipetar a fase superior, não seja ganancioso - é especialmente importante não pegar nenhuma das fases intermediárias ou inferiores. É melhor deixar um pouco da fase superior para trás do que tentar obter até a última gota e arriscar pegar algumas das outras camadas e contaminar sua amostra.]

11. Adicionar 2/3 (v / v) de isopropanol frio. Inverta várias vezes.(* Este é um ponto de parada potencial. Depois de adicionar o isopropanol, armazene a 4 ° C durante a noite ou durante o intervalo do dia.)

12. Centrifugue a 5000g por 10 minutos.

13. Decante a solução, deixando o pellet para trás. Adicione mL de etanol 70% frio e agite para misturar os componentes. Centrifugue a 5000g por 5 minutos.

14. Decante a solução, deixando o pellet para trás. Seque o pellet por 30 minutos em uma capela ou de cabeça para baixo em uma toalha de papel na bancada.

15. Adicione 500 uL de tampão TE 1´ e dissolva o pellet em banho-maria (até 60 ° C). Transfira os fluidos para tubos de microcentrífuga de 1,7 mL.

16. Adicione 5-10 uL de RNase A e incube em temperatura ambiente ou 37 ° C por 30-60 minutos.

17. Adicione 500 uL de fenol, misture completamente por inversão ou vortex suave e centrifugue a 10.000g (

12.400 rpm) por 10 minutos. [Nesta e nas demais etapas de centrifugação, usamos uma centrífuga Eppendorf 5417c com um rotor F45-30-11. A velocidade máxima deste modelo é de 20.817 rpm.] Extraia a fase superior (aquosa) e transfira para um novo conjunto de tubos de microcentrífuga. Tenha o mesmo cuidado que na etapa 10.

18. Adicione 500 uL de fenol: clorofórmio (1: 1, antes de usar), misture completamente por inversão ou vórtex suave e centrifugue a 10.000g (

12.400 rpm) por 10 minutos. Extraia a fase superior (aquosa) e transfira para um novo conjunto de tubos de microcentrífuga. Tenha o mesmo cuidado que na etapa 10.

19. Adicione 500 uL de clorofórmio, misture completamente por inversão ou vortex suave e centrifugue a 10.000g (

12.400 rpm) por 10 minutos. Extraia a fase superior (aquosa) e transfira para um novo conjunto de tubos de microcentrífuga. Seja extremamente cuidadoso para não pipetar qualquer fase intermediária ou inferior nesta extração específica!

20. Adicionar 2 volumes de etanol a 100% gelado combinado com 1/10 de volume de acetato de sódio. Armazene a -20 ° C por 30 minutos.

21. Centrifugue os tubos na velocidade mais alta por 15 minutos. Isso vai sedimentar o DNA.

22. Adicione 300 uL de etanol 70% frio e deixe o tubo em temperatura ambiente por 30-60 minutos.

23. Centrifugue a 5000g por 5 minutos.

24. Seque o pellet. [Usamos uma centrífuga a vácuo (speed-vac) com ou sem aquecimento.]

25. Dissolva o pellet em água ou TE (dependendo do tamanho, cerca de 200-300uL de solvente). [Se você espera baixo rendimento, use apenas 50-100 uL de solvente.]

Protocolo atualizado em dezembro de 2001. Muito obrigado a todos aqueles que contribuíram.


  • Você pode tentar essas etapas para purificar o DNA de muitas outras coisas vivas. Pegue um pouco de aveia ou kiwis da cozinha e tente novamente! Quais alimentos fornecem mais DNA?
  • Se você tiver acesso a uma escala de miligramas (chamada de equilíbrio), poderá medir a quantidade de DNA obtida (chamada de rendimento). Basta pesar seu espeto de bambu usando miligramas antes e depois da purificação do DNA. Em seguida, subtraia o peso inicial do peso final para obter o rendimento final em miligramas (mg).
  • Compare seu rendimento em miligramas (mg) sob várias condições experimentais:
    • Comece com diferentes quantidades de morangos & mdashis mais melhor?
    • Mude alguns dos componentes do seu kit e outros detergentes funcionarão melhor?
    • Comece com materiais diferentes e mdashare existem outras fontes de DNA com rendimentos mais elevados?
    Sim, eu fiz este projeto! Faça login (ou crie uma conta gratuita) para nos informar como as coisas correram.

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