Em formação

Como prever os principais microRNAs que se ligam a 3'UTR de um gene específico


Eu gostaria de saber se alguem poderia me dizer

1) alguns dos programas online que irão prever os principais microRNAs que se ligam a 3'UTR de um gene específico (por exemplo, GAPDH).

Eu sou relativamente novo no campo.

obrigado


Você achará o TargetScan bastante útil. Você pode escolher entre várias espécies e simplesmente inserir um nome de gene. Ele então obterá o 3 'UTR, mostrará sua conservação entre as espécies (locais de ligação em uma área conservada são mais propensos a serem ativos), encontrará miRNAs que podem se ligar ao 3'UTR e, em seguida, dividi-los conforme se ligam a regiões altamente ou mal conservadas. Também categoriza os acertos de acordo com várias propriedades, como proximidade com o quadro de leitura aberto, caso você queira realizar algum tipo de filtragem por isso.

Editar: BTW, você pode querer pegar os miRNAs alvo e observar sua expressão em seu tecido de interesse. Essa é uma boa maneira de restringir ainda mais sua relevância.


MicroRNAs extracelulares: atores-chave para explorar os resultados da fertilização in vitro

MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA que modulam a regulação gênica pós-transcricional. Eles são freqüentemente usados ​​como biomarcadores não invasivos promissores para o diagnóstico precoce do câncer. No entanto, seus papéis na reprodução assistida ainda são desconhecidos.

Métodos

Este estudo prospectivo foi projetado para avaliar os perfis de expressão de sete miRNAs extracelulares (miR-7-5p, miR-202-5p, miR-378-3p, miR-224, miR-320a, miR-212-3p e miR- 21-5p) em fluido folicular humano (FF) para explorar os resultados da fertilização in vitro (FIV). De 255 mulheres, 145 eram sem síndrome dos ovários policísticos (SOP), e seus ativos ovarianos eram normais (NOR), enquanto 110 estavam com SOP normo-androgênica.

Resultados

A combinação de seis perfis de expressão de miRNAs FF discriminou entre mulheres com PCOS e NOR com uma sensibilidade de 79,2% e uma especificidade de 87,32% (AUC = 0,881 [0,61 0,92], p = 0,001). MiR-202-5p teve significativamente um nível de abundância mais baixo e miR-378-3p teve um nível de abundância alto em amostras FF agrupadas de pacientes tratadas com gonadotrofina menopáusica humana (hMG) do que aquelas tratadas com hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH) (p & lt 0,001). Nossos resultados mostraram que miRNA-320a foi significativamente diferente em embriões de alta qualidade versus embriões de não alta qualidade no dia 3 em pacientes NOR com uma sensibilidade de 80% e especificidade de 71%, (AUC = [0,753 (0,651 0,855)] , p = 0,001). Para a previsão do resultado clínico da gravidez, FF miRNA-21 exibiu alta sensibilidade (74,8%) e especificidade (83,7%) com o valor de AUC de 0,774 (0,682 0,865).

Conclusão

Conclusivamente, nossos resultados fornecem evidências de que miR-7-5p, miR-378-3p, miR-224, miR-212-3p foram uma expressão diferencialmente alta em pacientes normo-androgênicas com SOP do que em pacientes NOR. Enquanto o miRNA-320a foi significativamente diferente em embriões de alta qualidade versus embriões de não alta qualidade no dia 3 (p = 0,001). O nível de expressão de FF miR-212-3p foi significativamente relacionado à probabilidade de embriões se desenvolverem em um blastocisto de alta qualidade em pacientes com reserva ovariana normal.


Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão gênica ligando-se a regiões parcialmente complementares dentro do 3’UTR de seus genes alvo. Os métodos computacionais desempenham um papel importante na previsão do alvo e assumem que a "região de semente" do miRNA (nt 2 a 8) é necessária para o direcionamento funcional, mas normalmente identifica apenas ∼80% das ligações conhecidas. Estudos recentes destacaram um papel para todo o miRNA, sugerindo que uma metodologia mais flexível é necessária. Apresentamos uma nova abordagem para a predição de alvos de miRNA com base em Deep Learning (DL) que, em vez de incorporar qualquer conhecimento (como regiões de sementes), investiga todo o miRNA e os nucleotídeos de mRNA 3'TR para aprender um conjunto desinibido de descritores de recursos relacionados a o processo de segmentação. Coletamos mais de 150.000 miRNA: alvos gênicos de homo sapiens validados experimentalmente e os cruzamos com diferentes conjuntos de dados CLIP-Seq, CLASH e iPAR-CLIP para obter ∼20.000 miRNAs validados: sítios alvos exatos do gene. Usando esses dados, implementamos e treinamos uma rede neural profunda - composta de autoencoders e uma rede feed-forward - capaz de aprender automaticamente os recursos que descrevem as interações miRNA-mRNA e avaliar a funcionalidade. As previsões foram então refinadas usando informações como localização do site ou energia de acessibilidade do site. Em uma comparação usando conjuntos de dados independentes, nossa abordagem DL superou consistentemente os métodos de previsão existentes, reconhecendo a região de semente como uma característica comum no processo de direcionamento, mas também identificando o papel dos emparelhamentos fora desta região. A análise termodinâmica também sugere que a acessibilidade do site desempenha um papel na segmentação, mas não pode ser usada como um único indicador de funcionalidade. Dados e código-fonte disponíveis em: https://bitbucket.org/account/user/bipous/projects/MIRAW.


Identificação de ceRNAs

Métodos Computacionais

O conhecimento de números, tipos e posições precisos de MREs é muito importante para a identificação de ceRNAs. Embora vários algoritmos de previsão de alvos estejam disponíveis, muitos não são bem-sucedidos na identificação de todos os alvos importantes, pois os critérios de identificação de alvos ainda estão em evolução (Bartel, 2009). Tay et al. desenvolveram uma abordagem denominada enriquecimento MRE mutuamente direcionado (MuTaME), envolvendo análise computacional integrada e validação experimental (Tay et al., 2011). Os autores usaram o algoritmo de predição de alvo de miRNA Rna22 (Miranda et al., 2006) para gerar as pontuações MuTaME para os transcritos de codificação de proteínas em humanos. O programa MuTaME avalia um ceRNA potencial com base em (a) o número de miRNAs que são compartilhados entre as transcrições de interesse, (b) o número de MREs previstos na transcrição para um miRNA específico e o intervalo de sequência em que são representados, ( c) a distribuição dos MREs de um determinado miRNA na transcrição e (d) a relação entre o número total de MREs previstos em uma transcrição e o número total de miRNAs que reconhecem esses MREs. Usando o algoritmo de previsão MuTaME, Tay et al. (2011) demonstraram a associação física de miRNAs direcionados a PTEN com PTEN ceRNA CNOT6L.

A fim de avaliar o alcance e o potencial das interações regulatórias mediadas por miRNA com um papel tumorigênico, um novo método de análise multivariada denominado Hermes foi desenvolvido (Sumazin et al., 2011). Hermes usa uma grande coleção de perfis de expressão de mRNA e miRNA obtidos das mesmas amostras de tumor para identificar moduladores da atividade de miRNA. Além disso, a fim de prever a rede ceRNA, o algoritmo HERMES também considera RNAs não codificantes. O programa usa informação mútua mútua e condicional para quantificar a dependência de uma variável sobre a outra variável, que neste caso é afetada por ceRNAs potenciais. Usando este programa, os autores foram capazes de prever as interações de esponja entre ceRNAs em um conjunto de dados de glioblastoma (Sumazin et al., 2011).

Nosso grupo posteriormente desenvolveu um banco de dados denominado & # x0201C banco de dados de RNA endógeno competitivo & # x0201D (ceRDB) que pode ajudar a identificar ceRNAs para um determinado mRNA. O programa examina a coocorrência de MREs nos mRNAs (3 & # x02032 UTRs) em todo o genoma para prever ceRNAs para um mRNA específico direcionado por miRNAs (Sarver e Subramanian, 2012). O banco de dados ceRNA finder está disponível em www.oncomir.umn.edu/cefinder. O programa usa mais de 50.000 interações humanas conservadas de miRNA-mRNA alvo obtidas a partir de previsões do Targetscan com uma matriz contendo 153 famílias de miRNA e 9448 mRNAs alvo. Para cada mRNA, as interações são pontuadas com base na soma do número total de sítios de ligação de miRNA para um determinado miRNA. As pontuações de interação com base na frequência de MRE são classificadas para prever os 50 principais ceRNAs potenciais para um gene de interesse.

Mais recentemente, um modelo matemático de ação de massa para determinar as condições ideais para a atividade de ceRNA na Vivo foi descrito pelo grupo Pandolfi & # x00027s (Ala et al., 2013). O programa modela matematicamente o ambiente de rede complexo no qual os ceRNAs podem funcionar com atividade ideal. Além disso, os autores descobriram que os ceRNAs respondem a modulações nos níveis de vários fatores de transcrição. Assim, a desregulação de um ceRNA pode ter um efeito dramático no ceRNA integrado e na rede transcricional. Além do modelo de ação em massa, também há vários outros sistemas de modelo relatados (Bosia et al., 2013 De Giorgio et al., 2013 Figliuzzi et al., 2013 Noorbakhsh et al., 2013). Linc2GO, um banco de dados de anotação de função de lincRNA (RNA não codificador intergênico longo) foi gerado recentemente para prever funções de lincRNA com base na hipótese de ceRNA (Liu et al., 2013a).

Os aspectos críticos da identificação do ceRNA são a co-expressão do ceRNA, a expressão de miRNAs que comumente têm como alvo os ceRNAs e a associação física (em parte determinada pela disponibilidade do sítio de ligação devido às estruturas secundárias do RNA) de miRNAs com os ceRNAs. Embora vários programas de predição de alvo de miRNA usem algoritmos para incluir correspondências de sequência de sementes, conservação evolutiva de sítios de ligação e estruturas secundárias de flanco (Bartel, 2009), eles se concentram predominantemente nas regiões 3 & # x02032UTR para prever a associação física entre miRNAs e genes alvo. Com base nas descobertas recentes de que pseudogenes, lncRNAs e RNAs circulares podem funcionar como ceRNAs, torna-se difícil determinar com precisão o espectro completo de todos os ceRNAs para um determinado gene de interesse, a menos que RNAs não codificantes sejam incluídos nos algoritmos de predição de alvo .

Métodos experimentais

Diversas técnicas bioquímicas também permitiram a identificação experimental e validação funcional de ceRNAs. Por exemplo, sequenciamento de alto rendimento de Argonaute de RNAs isolados por imunoprecipitação de reticulação (Ago HITS-CLIP), reticulação fotoativável reforçada com ribonucleosídeo e imunoprecipitação (PAR-CLIP) e imunoprecipitação de RNA são algumas plataformas que, ao fornecer uma pegada de todos os miRNAs fisicamente ligado a um determinado RNA, pode permitir a identificação de MREs e fornecerá insights sobre redes regulatórias de ceRNA (Thomas et al., 2010).


Circulando MicroRNAs para prever o risco de doenças metabólicas na população em geral?

A síndrome metabólica (SM) resulta do agrupamento de vários fatores de risco, incluindo obesidade central, resistência à insulina, dislipidemia e hipertensão. Estima-se que cerca de 20% a 25% da população adulta mundial tenha SM (1). Estima-se que a MetS confere um aumento de cinco vezes no risco de diabetes tipo 2 (T2D) nos próximos 5-10 anos (2). Tanto a SM quanto a T2D aumentam o risco de doenças cardiovasculares (DCV) (3). O diagnóstico de SM é complicado. Um teste simples não invasivo e barato que estratifica o risco da população em geral antes do início da SM permitiria estratégias de prevenção primária, especialmente modificações agressivas no estilo de vida e o monitoramento mais rigoroso dos indivíduos positivos para o preditor. Isso pode ter um impacto enorme em nossos sistemas nacionais de saúde, em última análise, desacelerando as epidemias de diabetes.

MicroRNAs (miRNAs, ou miRs) são pequenas moléculas reguladoras de RNA não codificantes que inibem a expressão de uma infinidade de mRNAs, que têm como alvo dentro de suas células-mãe, mas também em outras células que alcançam por meio de diferentes mecanismos de transporte (4). Esses ônibus, incluindo lipoproteínas e vesículas extracelulares, protegem suas cargas da degradação e entregam miRNAs ativos de células para células, contribuindo para a comunicação célula a célula. Além disso, ao conferir resiliência aos miRNAs, os shuttles aumentam incidentalmente nossas possibilidades de desenvolver miRNAs em biomarcadores extracelulares. Entre muitas ações diferentes, os miRNAs são agora reconhecidos como reguladores do metabolismo de lipídios e glicose e envolvidos no desenvolvimento de doenças metabólicas e cardiovasculares (5,6). O miR-122 enriquecido com fígado (agora identificado como miR-122-5p) foi o primeiro miRNA a ser reconhecido funcionalmente associado a um fenótipo metabólico e, em particular, a regular o colesterol e o metabolismo lipídico (7–10). miR-33a / b também é importante para a regulação do colesterol (6).

Na edição de fevereiro da Diabetes, Willeit et al. (11) relataram que o miR-122 circulante está associado a variações no lipídio do plasma humano e apolipoproteoma, bem como à resistência à insulina, obesidade, SM, T2D e um perfil lipídico adverso geral. Os autores propõem que o miR-122 pode ser desenvolvido em um biomarcador preditivo para SMet de início recente e T2D. Em primeiro lugar, trabalhando a partir de seu biobanco de população geral do Estudo Bruneck, os autores descobriram que o miR-122 circulante está positivamente associado à SM e T2D, mas não à DCV. Em seguida, eles associaram o miR-122 circulante com lipídios direcionados, tipicamente acilos graxos monoinsaturados e saturados de triacilgliceróis e ésteres de colesterol e proteínas, principalmente apolipoproteínas, em perfis sanguíneos usando espingarda lipidômica e proteômica direcionada, o que permitiu a detecção de correlações adicionais. De interesse, miR-122 correlacionou-se positivamente com afamin, uma glicoproteína secretada de ligação à vitamina E transcrita principalmente no fígado, já associada com SM em um estudo populacional anterior que incluiu o biobanco de Bruneck (12). Em seguida, a equipe descobriu que a inibição do miR-122 diminuiu o colesterol circulante total em camundongos saudáveis, presumivelmente impulsionada por uma regulação negativa da proteína de ligação do elemento regulador de esterol 1 (Srebp1), que regula o metabolismo do colesterol hepático. Interessantemente, Srebp1 hospedeiros miR-33a gene e a inibição do miR-122 reduziram o nível hepático de miR-33, sugerindo uma interação regulatória nos dois miRNAs (11). O tratamento com anti-miR-122 também afetou os níveis hepáticos murinos de 11 proteínas ligadas ao metabolismo lipídico e diminuição da GTPase Rab27a, que é importante para a liberação de exossomos (as menores vesículas extracelulares endógenas descritas até agora) das células (13) (Fig. 1).

Resumo do desenho do estudo e resultados relatados em Willeit et al. (11). Acly, ATP citrato liase APO, apolipoproteína CPT1, carnitina palmitoiltransferase I HINT1, proteína de ligação de nucleotídeo da tríade de histidina 1 LRP1, proteína 1 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade Mttp, proteína de transferência de triglicerídeo microssomal TG, triglicerídeo.

Com este estudo, Willeit et al. (11) avançar nossa compreensão da biologia miR-122 por meio da combinação de vários dados "ômicos" - expressão de RNA, proteômica e lipidômica - em humanos e modelos celulares e murinos. O uso de lipidômica e proteômica direcionada para sangue humano, embora de escopo limitado, reduz a carga de vários testes estatísticos e concentra-se em endpoints clinicamente relevantes: apolipoproteínas e ácidos graxos. A equipe fornece evidências adicionais de que a relação entre o miR-122 e o metabolismo lipídico não é unidirecional. Na verdade, eles mostram níveis extracelulares de miR-122 reduzidos após o tratamento com estatina de hepatócitos em cultura, camundongos saudáveis ​​e pacientes com hipertensão (randomizados do estudo Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial [ASCOT], que tinha uma segunda hipótese primária de que a adição de estatina o tratamento anti-hipertensivo protegeria ainda mais contra desfechos de doença cardíaca coronária em indivíduos com hipertensão e colesterol total ≤6,5 mmol / L) (14).

O risco de uma pessoa de desenvolver MetS e / ou T2D resulta da interação entre fatores genéticos e ambientais. Nesse contexto, os miRNAs podem fornecer uma visão sobre os complexos mecanismos de regulação da expressão de genes endógenos em ação antes, durante e após o início da doença. Como tal, a variação do miRNA pode ser vista como a resposta integrativa dos sistemas à suscetibilidade genética do hospedeiro e aos efeitos ambientais e pode ser aproveitada para fins preditivos, diagnósticos e prognósticos. Em particular, uma vez validado, o miR-122 circulante parece ser um biomarcador funcional promissor, capaz de detectar mudanças no metabolismo hepático, bem como induzi-las. Em apoio a essa hipótese, uma associação de miR-122-5p com fígado gorduroso e metabolismo de lipoproteínas relacionado foi recentemente descrita em uma coorte da população geral finlandesa (15). Isso reforça o conceito de que o miR-122 circulante aumentado pode sinalizar um problema com o metabolismo do fígado e exigir análises laboratoriais e clínicas adicionais que vão além da rotina normal.

Algumas questões abertas precisarão ser abordadas em estudos futuros. Em primeiro lugar, dada a forte associação entre SM e T2D com DCV, é intrigante que miR-122 não possa ser associado a eventos cardiovasculares, que de outra forma foram registrados nos participantes do Estudo Bruneck (16). É possível que essas associações apareçam no trabalho com populações maiores. Em segundo lugar, Willeit et al. (11) especulam que o nível de miR-122 circulante depende da secreção hepática mediada por exossomo ao invés de refletir a expressão hepática de miR-122. De fato, o tratamento com estatina in vitro reduziu miR-122 no meio de cultura de hepatócitos, mas não intracelularmente. No entanto, em camundongos, a estatina reduziu o miR-122 tanto intra-hepático quanto circulante. O cálculo da razão de concentração de miR-122 entre exossomos e plasma / soro total teria ajudado a elucidar se as variações no miR-122 circulante nas amostras de Bruneck e ASCOT eram atribuíveis principalmente ao transporte de exossomos. Ressalta-se que o miR-122 também pode ser transportado via partículas de LDL (17), tornando seu nível circulante sensível a drogas hipolipemiantes. Terceiro, para avaliar melhor a causa e o significado das mudanças no miR-122 circulante, agora é essencial obter compreensão dos mecanismos que regulam sua transcrição e maturação e entender se as variantes genéticas ditam o nível e a função do miR-122. Quarto, a partir de um biomarcador prospectivo, definir a faixa de normalidade do miR-122 circulante para a população média é essencial. Nesse contexto, além de possíveis diferenças associadas à etnia, devemos levar em consideração que mesmo o consumo modesto de álcool aumenta o nível de miR-122 (18) e que miR-122 a transcrição no fígado do camundongo segue um ritmo circadiano (19), sugerindo a necessidade de controlar a flutuação do miR-122 ao longo de 24 h.

Em conclusão, o artigo de Willeit et al. (11) abre novas perspectivas para o estudo da regulação e detecção de perfis metabólicos e lipídicos por miRNAs. Outra perspectiva importante introduzida pelo estudo é a necessidade empírica de prestar mais atenção à comunicação célula a célula e à conversa cruzada entre órgãos distantes, o que exigirá a implementação de projetos experimentais específicos e estratégias aprimoradas de criação de perfil “ômicas” e estratégias de medicina de sistemas translacionais capaz de lidar com a complexidade dos perfis e sua regulamentação, mantendo-se diretamente relevante para a clínica. Além dos mecanismos, o próximo desafio translacional é provar que miRNAs são marcadores úteis e entender se eles são adequados para implementar estratégias de medicina de precisão.


Funções e locais de ligação potenciais de microRNAs nos genomas SARS-CoV-2, SARS-CoV e MERS-CoV

Entre os 39 miRNAs investigados, previu-se que 29 tinham locais de ligação dentro do genoma SARS-CoV-2 com base na complementaridade do local da semente (Tabela 2, Tabela suplementar S1 - consulte o material suplementar eletrônico). Um grande número desses locais de ligação foram previstos no ORF1ab, pois é a maior região do genoma, medindo cerca de 21 kb de comprimento, e codifica várias proteínas virais. Nenhum sítio de ligação de miRNA foi previsto nas UTRs SARS-CoV-2 e SARS-CoV. Isso sugere que os miRNAs investigados neste estudo podem não se ligar diretamente ao genoma viral para estabilizar ou promover a degradação do RNA viral, no entanto, os locais de ligação nas regiões codificantes podem ainda ser funcionais. Uma vez que apenas uma sequência genômica foi usada para avaliar cada vírus, as variações nos genomas virais que podem permitir locais de ligação de miRNA adicionais não foram capturadas. Além disso, o fato de que os sítios de ligação de miRNA nos genomas virais foram definidos como locais com 100% de complementaridade do sítio de semente é bastante restritivo, pois miRNAs são conhecidos por serem capazes de se ligar a sítios de maneira imperfeita [77]. Isso nos leva a acreditar que outros locais de ligação em potencial podem não ter sido representados. Além disso, esses miRNAs celulares, com ou sem sítios de ligação no genoma viral, ainda podem ter um papel na regulação de vias inflamatórias ou de sinalização no hospedeiro, como visto em outras infecções virais (Tabela 1). Em termos do genoma MERS-CoV, o miR-92 foi predito como alvo do 3′-UTR, enquanto o miR-130 e miR-199 foram preditos como alvo do 5 'UTR. Embora a regulação mediada por miRNA hospedeiro de MERS-CoV não seja bem explorada, é interessante notar que miR-199a foi previamente identificado para regular a expressão de TMPRSS2 no fígado, estômago e corpo uterino, uma vez que esta protease é crítica para SARS- CoV-2, SARS-CoV e entrada MERS-CoV nas células [78]. Portanto, após uma análise mais aprofundada e validação experimental para determinar se estes são verdadeiros sítios de ligação de miRNA, os papéis desses miRNAs na modulação da infecção por MERS-CoV, juntamente com outros vírus relacionados, podem ser explorados.

O número relativo e as localizações dos locais de ligação de miRNA potenciais no genoma também podem fornecer algumas informações sobre os papéis que esses miRNAs podem desempenhar durante as infecções virais. De nossa análise, descobriu-se que miR-16 tem o maior número total de locais de ligação em todos os três genomas virais, com 21 locais de ligação no genoma SAR-CoV, 15 locais de ligação no genoma SARS-CoV-2 e 14 locais de ligação locais no genoma MERS-CoV (Tabela 2, Fig. 4). O fato de que o alto número de sítios de ligação de miR-16 é comum entre todos os três HCoVs pode indicar que esses vírus desenvolveram mecanismos pró-virais que usam esse miRNA para aumentar sua propagação, conforme observado anteriormente no HCV [79]. Da mesma forma, miR-29 e miR-30 também foram encontrados para ter um grande número de locais de ligação potenciais, com dez locais de ligação, cada um previsto no genoma SARS-CoV-2. Em termos de infecção por SARS-CoV-2, identificamos ainda o miR-200 e o miR-24 como sendo de particular interesse, pois eles mostraram estar ligados à regulação de ACE2 e Furin, respectivamente (Fig. 5).

Número de sítios de ligação de miRNA previstos nos genomas SARS-CoV-2, SARS-CoV e MERS-CoV. Um mapa de calor indicando o número de locais de ligação previstos em cada genoma viral é apresentado (valores que variam de 0 a 21). Os locais de ligação foram previstos em locais com 100% de complementaridade com a sequência do local de semente de hsa-miRNA usando BLASTn. Os miRNAs são listados em ordem decrescente do número total de sítios de ligação previstos no genoma SARS-CoV-2. BLASTn Ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico de nucleotídeos, MERS-CoV Coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio, miRNA / miR- microRNA, SARS-CoV coronavírus da síndrome respiratória aguda grave, SARS-CoV-2 síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2

Representação esquemática de sítios de ligação de miRNA previstos no genoma SARS-CoV-2. A localização de potenciais sítios de ligação no genoma SARS-CoV-2 para selecionar miRNAs de interesse, incluindo os três principais miRNAs mais abundantes em células epiteliais de pulmão A549 (miR-16, miR-29 e miR-30), miR-24 e miR-200 são apresentados. miRNA / miR- microRNA, ORF quadro de leitura aberto, SARS-CoV-2 síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2, UTR região não traduzida


Resultados

Predição de alvos de miRNAs codificados por HCMV no genoma de HCMV.

Para testar nossa hipótese de que miRNAs de herpesvírus podem inibir a expressão de genes virais necessários para a replicação lítica eficiente e, assim, favorecer a latência, perguntamos se miRNAs virais tinham potencial para alvejar 3 ′ UTRs virais. Em vez de listar todos os locais de ligação de miRNA potenciais conservados ou calcular pontuações com base em várias regras empíricas, nosso algoritmo usa uma combinação de expressões analíticas e simulações de Monte Carlo para determinar as probabilidades exatas de que os alvos de miRNA previstos ocorreriam por acaso. Usamos a suposição padrão de que a sequência 3 ′ UTR coevoluiu com a sequência do miRNA (20, 21) e a observação experimental de que a ligação do miRNA requer uma complementaridade perfeita de uma sequência "semente" perto da extremidade 5 ′ do miRNA para uma sequência no 3 ′ UTR (2). Esta semente é geralmente um heptâmero nas posições 2–8 da extremidade 5 'do miRNA. Como resultado da coevolução, o número de oligômeros reais presentes na UTR 3 ′ de um gene alvo será maior do que o número que apareceria por acaso em uma sequência aleatória com composição semelhante. O algoritmo prevê alvos de miRNA funcionais em duas etapas.

Primeiro, para cada par de miRNA-3 ′ UTR, calculamos uma probabilidade aproximada PVSH (P valor para teste de hipótese única) que apareceria por acaso na sequência aleatória o menor PVSH ou seja, é mais provável que determinado par seja biologicamente funcional. (Probabilidade PVSH é quase exato: a única aproximação é que assumimos independência entre oligômeros consecutivos.) Este procedimento por si só permite testar se um dado miRNA tem probabilidade de atingir um dado 3 ′ UTR e é análogo ao usado por Robins e Press (21).

Em segundo lugar, se estivermos interessados ​​em encontrar alvos funcionais de vários miRNAs entre vários 3 ′ UTRs, precisamos levar em consideração o teste de várias hipóteses. Fazemos isso realizando uma simulação de Monte Carlo em que calculamos a probabilidade PVMH (P valor para o teste de várias hipóteses) que os principais, digamos 10, pares miRNA-alvo em um genoma gerado aleatoriamente com propriedades semelhantes teriam seu PVSH menor do que os 10 pares principais de miRNA-alvo correspondentes no genoma real. Usamos essa abordagem em vez da agora padrão Análise de Taxa de Descoberta Falsa (FDR) de Benjamini e Hochberg (22) por causa da natureza discreta de nossos dados. Em nosso caso, a maioria dos PVSH os valores são 1 e, portanto, a análise de FDR não é aplicável porque requer uma distribuição bastante uniforme de PVSH exceto uma pequena super-representação em valores próximos a 0.

Detalhes e várias extensões do algoritmo, como a geração da sequência de fundo aleatória com base no modelo de Markov (MM), o cálculo da hipótese única e múltipla P valores, o uso de conservação (21) entre as cepas do vírus, e a escolha da sequência de sementes, são descritos em Materiais e métodos.

Aplicamos o algoritmo a todos os 3 ′ UTRs do genoma do HCMV e a Tabela 1 mostra os 10 pares miRNA-alvo mais prováveis ​​do total de 4896 pares possíveis de miRNA-3 ′ UTR. Para cada par, a tabela mostra a pontuação PVSH e a significância estatística PVMH de todas as previsões até este. Por exemplo, a 10ª predição de miRNA-alvo, miR-UL112-1 direcionado ao mRNA da proteína 1 transativadora IE (IE1, codificado pelo UL123 ORF, destacado), tem uma pontuação PVSH = 10 −2,21 = 0,0062 e PVMH = 0,125, o que significa que apenas 12,5% dos genomas gerados aleatoriamente têm os dez primeiros P valores melhores ou iguais a PVSH = 10 −2,21. Para os 25 pares de miRNA-alvo mais prováveis, consulte a Tabela 5 do SIC . Na verdade, o conjunto de dados nessa tabela sugere que as previsões mais significativas são as 10 principais listadas na Tabela 1 porque há um aumento acentuado no PVMH da 10ª à 11ª previsão: PVMH (10) = 0,125 e PVMH (11) = 0,309. Naturalmente, PVMH (k) aumenta em direção a 1 para maior k. Em nossa análise, exigimos que um alvo seja conservado em seis cepas sequenciadas de HCMV. Se a conservação entre as cepas não for levada em consideração, PVMH sugere que existem muitos alvos mais significativos (35 com PVMH & lt 0,20, ver Tabela SI 5C ) Por fim, o PVMH os valores listados na Tabela 1 são limites superiores conservadores porque consideramos todas as sequências publicadas de miRNAs potenciais detectados, embora vários sejam apenas pequenas variações entre si e alguns outros talvez não sejam miRNAs reais.

Os 10 principais pares de miRNA-alvo previstos em HCMV quando classificados por PVSH pontuação

A síntese da proteína HCMV IE1 é suprimida por miR-UL-112-1.

A inibição de qualquer um dos genes na Tabela 1 poderia potencialmente favorecer a latência, mas consideramos IE1 como um alvo principal, dado seu papel central no início da cascata transcricional de HCMV. O IE1 é um dos dois principais produtos do locus principal do IE do HCMV, sendo o outro o IE2. O IE1 e o IE2 são necessários para executar o programa de transcrição do vírus (23) e quase certamente influenciam a escolha entre latência e replicação lítica. Um vírus mutante incapaz de produzir uma proteína IE1 funcional se replica eficientemente somente após a infecção em uma multiplicidade de entrada alta (24) em multiplicidades mais baixas, ele falha em acumular níveis normais de mRNAs iniciais (25). Ele ativa a transcrição, pelo menos em parte, controlando as modificações das histonas (26).

O algoritmo previu um único sítio de ligação para miR-UL112-1 dentro do 99 nucleotídeo 3 ′ UTR do mRNA de IE1. Para testar a previsão de que miR-UL112-1 inibe a tradução da proteína IE1, preparamos duas construções repórter. O primeiro continha IE1 3 ′ UTR de tipo selvagem a jusante da região de codificação de luciferase e o segundo continha um derivado de 3 ′ UTR sem a sequência de semente de 7 nucleotídeos prevista para ser o alvo do miRNA (Fig. 1 UMA, sequência sombreada). As células HEK293T foram co-transfectadas com quantidades definidas de plasmídeos repórter e quantidades crescentes de um plasmídeo efetor que expressa a sequência em gancho do precursor miR-UL112-1. O miRNA induziu uma redução estatisticamente significativa na expressão de luciferase do repórter com um tipo selvagem IE1 3 ′ UTR (repressão máxima = ≈60%), mas não da 3 ′ UTR modificada sem a sequência de semente (Fig. 1 B), argumentando que miR-UL112-1 tem como alvo a sequência semente dentro do IE1 3 ′ UTR para reduzir a tradução ou degradar o RNA.

miR-UL112-1 inibe a expressão de um mRNA repórter contendo o IE1 3 ′ UTR. (UMA) O sítio de ligação de miR-UL112-1 previsto dentro do locus principal IE de HCMV. No topo do diagrama, os mRNAs emendados que codificam IE1 e IE2 são representados com o exon 1 não codificador (Ex1) mostrado como uma caixa aberta e os exons codificadores (Ex2-5) descritos como caixas cinza. IE1 e IE2 compartilham Ex2 e Ex3. Os locais PolyA e a localização do local de ligação miR-UL112-1 no 3 ′ UTR (cabeça de alfinete cinza) são mostrados. Na parte inferior do diagrama, a sequência IE1 3 ′ UTR é expandida e o pareamento de bases putativo de miRNA / mRNA é representado. A caixa cinza denota nucleotídeos dentro da sequência de sementes de miRNA. (B) Ensaio de repórter para a função miR-UL112-1. As células 293T foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão de luciferase de pirilampo contendo o tipo selvagem (cinza claro) ou mutante IE1 3 ′ UTR (cinza escuro), bem como um Renilla controle interno da luciferase. As células foram adicionalmente co-transfectadas com as quantidades indicadas de um plasmídeo que expressa miR-UL112-1 e as misturas de transfecção foram equilibradas com o plasmídeo de expressão sem uma inserção. Firefly luciferase units were normalized to Renilla luciferase. The luciferase units are shown relative to the amount of luciferase from the reporter construct in the absence of miRNA expression plasmids. Asterisks denote P values <0.05 as determined by the Student's t test.

We next generated three viruses to test whether miR-UL112-1 targets IE1 expression within an HCMV-infected cell. The first, BFXdlIE1cis − , lacks the 7-nt seed sequence within the IE1 3′ UTR that is targeted by the miRNA. The second, BFXsub112-1 − , is unable to express the miRNA. The miR-UL112-1 precursor is encoded on the DNA strand opposite UL114, and disruption of this ORF inhibits virus replication (27, 28). Consequently, we substituted 12 nucleotides within the miR-UL112-1 precursor sequence while maintaining the coding sequence of the UL114 ORF (Fig. 2 UMA) The miR-UL112-1 mutation was repaired in the final virus, BFXsub112-1r, to control for potential off-target mutations. The viruses grew normally in fibroblasts (Fig. 2 B) We also monitored accumulation of miR-UL112-1 by quantitative RT-PCR. The miRNA accumulated to a detectable level between 8–12 h after infection with wild-type virus and then increased as the infection progressed (Fig. 2 C) No miR-UL112-1 was detected at 48 h after infection with BFXsub112-1 − , a time at which the miRNA was readily detected in cells infected with the other viruses (Fig. 2 D).

BFXsubUL112-1 − and BFXdlIE1cis − grow with wild-type kinetics. (UMA) The nucleotides mutated in the BFXsubUL112-1 − (112-1 − ) relative to BFXwt (WT) are shown with gray lines and the complement of the mature miRNA is shaded within the WT sequence. The substituted nucleotides in 112-1 − conserves the amino acid sequence (shown above and below nucleotide sequences) of the UL114 gene. (B) MRC-5 fibroblasts were infected at a multiplicity of 0.1 pfu/cell with WT, 112-1 − , BFXsub112-1r (112-1r, a revertant of 112-1 − ) or BFXdlIE1cis − (IE1cis − , lacks the 7-nucleotide seed sequence in IE1 mRNA). Virus (IU, infectious units) was assayed at the indicated times. (C) qRT-PCR with a miR-UL112-1 specific probe was used to detect the accumulation of the miRNA in WT-infected MRC5 fibroblasts over time. miR-UL112-1 levels were normalized to the expression of a cellular small nucleolar RNA, hsn6B. M, mock infected. (D) Accumulation of miR-112-1 was assayed by qRT-PCR at 48 hpi with the indicated viruses and normalized to hsn6B expression. The 112-1 − virus had miRNA levels similar to mock infected cells.

To determine whether IE1 protein levels were affected by the expression of miR-UL112-1, we prepared extracts from infected cells after a 1-h 35 S-labeling period at 6, 24 and 48 hpi with wild-type or mutant viruses. We did not monitor cells later than 48 hpi, even though the miRNA accumulated to higher levels at 72 hpi (Fig. 2 UMA), because infected cells show severe cytopathic effect at the later time. We first examined the steady state levels of several proteins by Western blot assay (Fig. 3 A Top) Tubulin levels, which are not altered by infection, provided a precise measure of the amount of cellular protein analyzed in each sample and the accumulation of the late HCMV protein, pp28, confirmed that all infections progressed normally. We monitored IE1 steady state levels, but little difference was evident after infection with wild-type and mutant viruses. This was not surprising, because IE1 protein has a >20-h half life, and it accumulates to a high level before the miRNA is available.

Viruses that lack miR-UL112-1 or its binding site synthesize more IE1 protein. (UMA) MRC5 fibroblasts were mock-infected (M) or infected with BFXwt (WT), BFXsub112-1 − (112-1 − ), BFXsub112-1r (112-1r), or BFXdlIE1cis − (IE1cis − ). Cells were 35 S-labeled for 1 h before harvesting at the indicated times after infection. Lysates were prepared and analyzed by Western blot for IE1, the late virus-coded pp28 or tubulin (Upper) or immunoprecipitation followed by electrophoresis for 35 S-labeled IE1 (Lower) The experiment shown is a representative of 6 independent immunoprecipitations. (B Top) Quantification of 35 S-labeled IE1 relative to tubulin. IE1 protein levels were quantified by phosphorimager analysis of immunoprecipated complexes from two independent experiments, each of which was analyzed by three independent immunoprecipitations, such as that displayed in A Lower. The levels of IE1 protein were normalized to tubulin levels from the Western blot in UMA. The mutant and revertant viruses are normalized to WT levels for each time point. P values were determined by the Student's t test. (B Middle) Quantification of IE1 RNA relative to UL37 RNA by qRT-PCR. Mutant and repaired viruses are normalized to WT levels for each time point. (Lower) ratio IE1 protein (from Top) to IE1 RNA (from Middle).

Next, IE1 was immunoprecipitated from extracts and subjected to electrophoresis to identify protein synthesized during each 1-h labeling period (Fig. 3 A Bottom) The rate of IE1 synthesis was substantially greater at 6 hpi than at later times for all viruses, and this is expected because the promoter responsible for the production of IE1 mRNA is repressed late after infection (29, 30). Radioactivity in the IE1-specific band was quantified relative to the level of tubulin, and Fig. 3 B Top presents the results of two independent experiments, each analyzed by performing three independent immunoprecipitations. At 6 and 24 hpi, we did not observe an effect attributable to miR-UL112-1 activity, consistent with the observation that the miRNA is not detected at 6 hpi and relatively little is present at 24 hpi. In contrast, at 48 hpi, when the miRNA has accumulated to higher levels, the miR-UL112-1-deficient and the IE1 target site-deficient mutants exhibited statistically significant increases (≈2-fold) in IE1 protein synthesis relative to the wild-type and revertant viruses.

At each time protein extracts were prepared, total RNA was isolated from a duplicate sample, and the amount of IE1 RNA was determined relative to the level of an independent IE RNA (UL37) by quantitative RT-PCR. IE1 RNA levels varied little among the viruses (Fig. 3 B Middle), arguing that the miRNA does not significantly alter the stability of IE1 mRNA and supporting the conclusion that the changes in IE1 protein levels result from the inhibition of translation. The ratio of IE1 protein to RNA was calculated (Fig. 3 B Lower), confirming a significant increase in protein synthesis when either the miRNA or its target site is disrupted.

Predictions of Targets for miRNAs Coded by Other Herpesviruses.

Encouraged by the experimental verification of our prediction in HCMV, we applied the algorithm to an analysis of three additional human herpesviruses. HSV-1, EBV, and KSHV each proved to encode miRNAs predicted to inhibit the expression of viral proteins, including IE proteins. Table 2 displays the rank of the IE-targeting miRNAs among all possible miRNA–3′ UTR pairs (the total number is equal to the number of 3′ UTRs times the number of miRNAs). The rank is again based on the P value PVSH computed according to the local first order MM or the global third order MM. ICP0 in HSV-1, BZLF1 and BRLF1 in EBV, and Zta and Rta in KSHV are among the virus-specific targets most likely to be targeted by virus-coded miRNAs (top 0.5–2% of virus-specific targets). The BZLF1/BRLF1 3′ UTR of EBV is predicted to be targeted by two miRNAs.

Whole genome ranks for predicted miRNA-IE target pairs in four herpesviruses

SI Tables 3–6 show three additional pieces of information for each virus: First, there is a list (SI Tables 3UMA–6UMA ) for each miRNA of the total actual and predicted number of binding sites across all 3′ UTRs with associated P value. miRNAs with smaller P value are more likely to regulate some (unspecified) viral genes. The total number of functional binding sites for miRNAs can be estimated from the difference of the total numbers of actual and predicted seed binding sites (21). It is reassuring that this number is always positive, regardless of the virus or the MM used. Second, there is a list (SI Tables 3B–6B ) of the top 25 3′ UTR targets, sorted according to the P value based on the total actual and predicted binding-site counts across all miRNAs. 3′ UTRs with small P value are likely to be regulated by some combination of viral miRNAs. Third, there is a list (SI Tables 3C–6C ) of the top 25 miRNA-3′ UTR pairs. Pairs with small P value are most likely to be functional pairs. The ranks of the IE genes in Table 2 are derived from this list.

Besides the IE genes, the top predicted miRNA targets include many genes involved in viral DNA replication as well as several inhibitors of apoptosis and other genes involved in immune evasion. Brief descriptions of the predicted targets in these functional groups are summarized in SI Table 7.


MATERIALS AND METHODS

Animais

For the miRNA profiling study, male Sprague–Dawley rats weighting 290–330 g were used and maintained on the AIN-76A diet containing 0.4% NaCl (Dyets). To study the effect of salt intake on miR-192 expression, Sprague–Dawley rats were fed with the Basal Diet 5755 (0.24% sodium TestDiet) and then switched to Low Sodium Diet 5881 (0.03% sodium TestDiet). For the miR-192 knockdown studies, we used CD-1 mice, maintained on the 0.4% NaCl diet or a 4% NaCl diet (Dyets). For chronic monitoring of urine output and water intake, mice were housed in metabolic cages (Lab Products Inc.). Animal protocols were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee.

Isolation of nephron segments

Left kidney was perfused with cold dissection solution, followed by digestion solution. The kidney cortex and outer medulla were separated and incubated in digestion solution. Digested tissue was microdissected under a stereomicroscope. See Supplementary Data for more details.

MiRNA isolation

Isolated nephron segments from three rats were pooled together and miRNAs were isolated using the RT 2 qPCR-Grade miRNA Isolation Kit (SA Biosciences).

Real-time PCR miRNA array

We used RT 2 miRNA PCR Array System (SA Biosciences) and followed the manufacturer’s protocol ( 13). Three arrays were run for every nephron segment, each containing pooled samples from three rats (nine rats in total). Relative expression results were normalized across plates according to the total expression of all miRNAs on each plate.

Taqman real-time PCR

Expression levels of several miRNA and mRNA were measured using real-time PCR with Taqman chemistry (Applied Biosystems) as described previously ( 13–15).

Protein database

The database of proteins that are segment-specific was compiled from original articles and two textbooks (Brenner and Rector: The Kidney, Saunders, 8th edition Koeppen and Stanton: Renal Physiology, Elsevier, 4th edition).

Selection of possible miRNA-target pairs

miRNA-target pairs were selected based on two criteria: (i) sequence characteristics (based on miRNA target prediction tools) and (ii) reciprocal expression of a miRNA and its predicted target protein in two nephron segments ( 16). Three prediction tools were used: TargetScan v5.1 (http://www.targetscan.org/), MicroCosm Targets v5 (http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/) and microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do).

Western blot

Western blot was performed using primary antibodies obtained from Santa Cruz Biotechnology ( 17, 18).

Na + /K + -ATPase activity assay in crude membrane fractions

The assay was performed as described previously ( 19, 20). See Supplementary Data for more details.

3′-UTR and P+5′-UTR reporter constructs

Reporter gene vectors, containing the 3′-UTR or the promoter region and 5′-UTR (P+5′-UTR) of a miRNA target gene, were constructed as previously described ( 13–15). The UTR of the gene of interest was identified and amplified from rat genomic DNA. Primer sequences are listed in Supplementary Data . The PCR product was inserted into pMIR-REPORT vector (Ambion), adjacent to the 3′-end or 5′-end of the luciferase reporter gene for the 3′-UTR or P+5′-UTR assay, respectively.

3′-UTR-mutation, P+5′-UTR-mutation and P+5′-UTR-deletion constructs

Site-directed mutagenesis was performed with the QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), following the protocol suggested by the company ( 21). Primers used for introducing mutations/deletions are listed in Supplementary Data . The 3′-UTR-mutation construct had mutations introduced at nucleotides +143 to +145 relative to the first nucleotide in the 3′-UTR. The P+5′-UTR construct included the sequence ∼1 kb upstream of the transcription start site and the subsequent 5′-UTR of the Atp1b1 gene. Deletion and mutation were introduced at nucleotides −386 to −391 and −387 to −389, respectively, where +1 is the translation initiation site.

UTR reporter assay

The assay was performed as described previously ( 13–15). HeLa or 3T3-L1 cells cultured in 96-well plates were co-transfected with the UTR reporter construct (100 ng per well), a pMIR-REPORT β-gal plasmid (50 ng per well) and pre-miR or control oligonucleotides (10 pmol per well). Twenty-four hours after transfection, luminescence from luciferase and β-galactosidase were measured. β-Galactosidase activity was used to normalize luciferase signals. See Supplementary Data for more details.

Atp1b1 promoter construct and promoter activity assay

We followed the previously described approach ( 21). The 1-kb sequence upstream of the transcription start site of the Atp1b1 gene was inserted into the pGL4.81 vector containing Renilla luciferase gene (Promega). Human renal epithelial cells cultured in 96-well plates were transfected with the Atp1b1 promoter-pGL4.81 vector, the pGL2-control vector and pre-miR oligonucleotides, as described earlier. Twenty-four hours after transfection, luciferase activity was measured. pGL2 control containing the firefly luciferase gene was used to normalize the Renilla luciferase. See Supplementary Data for more details.

In vitro e in vivo use of oligonucleotides

Anti-miR and pre-miR oligonucleotides from Ambion were used for suppression and over-expression of miRNAs in vitro, respectively. Cells were transfected with pre-miR-192, anti-miR-192 or other oligonucleotides and their respective controls (at 100 nM unless otherwise indicated), using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 24 or 48 h, cells were collected for analysis. Locked nucleic acid (LNA)-modified anti-miR oligonucleotides from Exiqon were used for in vivo suppression and delivered by intraperitoneal (i.p.) injection (10 mg/kg body weight) ( 14).

Statistics

miRNA expression profiles in glomeruli, PCT and mTAL were analyzed using one-way ANOVA. t-Test was used to compare expressions in PCT and mTAL and analyze the UTR assays, the miR-192 suppression/over-expression experiments and the miR-192 and Atp1b1 expressions in the in vivo studies. Two-way ANOVA was used for comparison of urine output and water intake in mouse studies. P < 0.05 was considered significant. Data are presented as mean ± SEM.


MicroRNA Target Gene Luciferase Reporter Constructs

• Functional analysis - monitor miRNA-mediated regulation of target genes in cells
• Quantitative assay - miRNA-mediated regulation quantitatively measured through repression of firefly luciferase gene expression
• Stable cell lines - the vectors can be used for establishing stable cells expressing the reporters

microRNAs regulate gene expression by targeting messenger RNAs at specific sites in the 3´ UTR to induce the cleavage of the targets or inhibit translation. The interaction of a miRNA with its targets is mediated by RNA-induced silencing complex (RISC). RISC-mediated interaction between a mature miRNA and its binding site depends on sequence complementarities between miRNA and its targets and the total number of binding sites in a given 3´ UTR.
Numerous important regulatory genes have been found to be regulated by miRNAs, such as Ras by let-7, Bcl-2 by miR-15 and miR-16, ERa by miR206, TPM1 by miR-21, and PTEN by miR-19a. Luciferase reporter-based cellular assays are employed to monitor the regulation of these genes by miRNAs.

Signosis miR-Luc Target Reporter Vectors
pLuc-3´ UTR reporter vectors are a series of firefly luciferase-based reporter constructs for monitoring miRNA-mediated regulation of target genes in cells. Each vector contains the CMV promoter, the firefly luciferase gene, the 3´ UTR of a target gene, and a SV40 terminator sequence. When a miRNA is expressed and binds to the 3´ UTR, it results in repression of luciferase gene expression. Therefore, miRNA-mediated regulation of a specific target can be monitored through luciferase activity. When two samples are compared by measuring the activities of luciferase, the difference can be identified and the regulation dissected.


Author information

Affiliations

Department of Radiation Oncology, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Nawgen LLC, St. Louis, MO, USA

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Contributions

XW and WL designed the study and carried out the research. Both authors have read and approved the final version of the manuscript.

Corresponding author


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