Em formação

Qual é a diferença entre desoxirribonucleases e enzimas de restrição?


Tanto as desoxirribonucleases (DNases) quanto as enzimas de restrição são endonucleases (algumas DNases podem ser exonucleases).

Ambos quebram as ligações entre os nucleotídeos. Portanto, qual é a diferença entre os dois?

Meu pensamento original era que as enzimas de restrição, ao contrário das DNases, cortam sequências específicas de DNA. Então, isso levanta a questão de se as enzimas de restrição são apenas uma categoria de DNases, mas não encontrei nenhuma fonte para apoiar isso. Além disso, de acordo com este artigo da Wikipedia:

Existem mais de 900 enzimas de restrição, algumas específicas de sequência e outras não ...

Isso desgasta ainda mais a distinção que criei entre os dois tipos de nucleases.


Este parágrafo de Lehninger Princípios de Bioquímica (na minha opinião o melhor livro de bioquímica) é muito didático:

DNA é degradado por nucleases

Para explicar a enzimologia da replicação do DNA, primeiro introduzimos as enzimas que degradam o DNA, em vez de sintetizá-lo. Essas enzimas são conhecidas como nucleases, ou DNases se forem específicos para DNA em vez de RNA. Cada célula contém várias nucleases diferentes, pertencentes a duas classes amplas: exonucleases e endonucleases. Exonucleases degradam os ácidos nucléicos de uma extremidade da molécula. Muitos operam apenas na direção 5 '→ 3' ou 3 '→ 5', removendo nucleotídeos apenas da extremidade 5 'ou 3', respectivamente, de uma fita de um ácido nucleico de fita dupla ou de um DNA de fita simples . Endonucleases pode começar a se degradar em locais internos específicos em uma fita ou molécula de ácido nucleico, reduzindo-a a fragmentos cada vez menores. Algumas exonucleases e endonucleases degradam apenas o DNA de fita simples. Existem algumas classes importantes de endonucleases que clivam apenas em sequências de nucleotídeos específicas (como o endonucleases de restrição que são tão importantes em biotecnologia; consulte o Capítulo 9, Fig. 9-3).

Podemos concluir que as endonucleases de restrição (ou enzimas de restrição) são um tipo de endonuclease e que as endonucleases são um tipo de DNAse. Portanto, todas as enzimas de restrição são DNAses, mas nem todos os DNAses são enzimas de restrição.

Além disso, podemos concluir que sua afirmação inicial ("Tanto as desoxirribonucleases (DNases) quanto as enzimas de restrição são endonucleases") está errado.

Para uma tabela mais completa, dê uma olhada em Biologia Molecular de Nucleases, página 18.

Fontes:

  • Lehninger, A., Nelson, D. e Cox, M. (2000). Princípios de bioquímica. Nova York: Worth Publishers.
  • Mishra, N. (1995). Biologia molecular de nucleases. Boca Raton [EUA]: CRC Press.

Estrutura do ácido nucléico e propriedades do DNA

23.6 Degradação de DNA

Nucleases

Uma variedade de enzimas quebram as ligações fosfodiéster em ácidos nucléicos desoxirribonucleases (DNases) clivar DNA e ribonucleases (RNases) clivar RNA. As DNases geralmente são específicas para DNA de fita simples ou dupla, embora algumas DNases possam clivar ambas. DNases podem atuar como exonucleases em que eles removem um nucleotídeo de cada vez da extremidade 3 & # x27 ou 5 & # x27 da fita. Outros DNases funcionam como endonucleases e são específicos para clivagem entre pares de bases particulares.

Enzimas de restrição

Uma importante classe de endonucleases de DNA são restrição enzimas (endonucleases de restrição) que reconhecem sequências específicas de bases no DNA (um sítio de restrição) e fazem dois cortes, um em cada fita que gera fragmentos de DNA de fita dupla. Os microrganismos usam suas enzimas de restrição para degradar qualquer DNA estranho que possa entrar na célula na forma de vírus, plasmídeos ou DNA nu. Centenas de diferentes enzimas de restrição foram isoladas de microrganismos; essas enzimas geralmente reconhecem sequências de quatro, seis, oito ou raramente mais bases que têm um eixo de simetria (Tabela 23-1). Os locais de restrição que possuem um eixo de simetria são chamados palíndromos, o que significa que o local de restrição pode ser girado 180 graus e a sequência de bases permanecerá a mesma.

TABELA 23-1. Algumas endonucleases de restrição e seus locais de clivagem *

As enzimas de restrição podem cortar o DNA de duas maneiras. Cada fita pode ser clivada ao longo do eixo de simetria, gerando fragmentos de DNA de fita dupla com extremidades rombas. Cortes simétricos alternados em torno do eixo de simetria geram fragmentos de DNA de fita dupla com extremidades coesivas de fita simples (Figura 23-11). Fragmentos de DNA com extremidades coesivas são úteis para a construção de novas moléculas de DNA, que é o objetivo de DNA recombinante (rDNA) tecnologia.

FIGURA 23-11. Dois tipos de cortes feitos por enzimas de restrição. As setas indicam os locais de clivagem. A linha tracejada é o eixo de simetria da sequência.

Uma vez que uma enzima de restrição reconhece uma sequência única, o número de cortes e o número de fragmentos de DNA depende do tamanho da molécula. Em geral, locais de restrição consistindo de quatro bases ocorrerão mais freqüentemente por acaso do que locais consistindo de seis ou oito bases. Assim, quatro cortadores irão gerar mais fragmentos do que seis cortadores que, por sua vez, irão gerar mais fragmentos do que oito cortadores.

Uma determinada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos para uma determinada molécula de DNA.

A Figura 23-12a mostra as posições dos locais de restrição no DNA do bacteriófago lambda (λ) para as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. Este arranjo de locais de restrição é conhecido como um mapa de restrição. A família de fragmentos gerados por uma ou mais enzimas de restrição é detectada por eletroforese em gel de agarose que separa as moléculas de DNA de acordo com seus pesos moleculares (Figura 23-12b).

FIGURA 23-12. (a) Mapas de restrição de λ DNA para nucleases EcoRI e BamHI. As barras verticais indicam os locais de corte. Os números superiores indicam a porcentagem do comprimento total do DNA medido a partir da extremidade do gene A da molécula. Os números inferiores são os comprimentos de cada fragmento, novamente expressos como porcentagem do comprimento total. (b) Eletroforetograma em gel de digestão de enzimas de restrição EcoRI e BamHI de DNA λ. As bandas rotuladas como “extremidades coerentes” contêm moléculas que consistem em dois fragmentos terminais, unidos pelas extremidades coesivas normais do DNA λ. Os números indicam fragmentos na ordem do maior 1 ao menor 6. As bandas 5 e 6 do digerir BamHI não são resolvidas.


Enzimas de restrição: tipos e # 038 exemplos

Uma das etapas mais importantes da biologia molecular, especialmente genética e análise molecular, é o isolamento do DNA do genoma humano e a produção de muitas cópias dele. Agora, essas cópias podem ser utilizadas para análises posteriores de qualquer tipo.

Um evento chave no desenvolvimento da metodologia de genética molecular foi a descoberta de Enzimas de Restrição, também conhecidas como Endonucleases de restrição.

Introdução

UMA enzima de restrição é um tipo de enzima nuclease que é capaz de clivar o DNA de fita dupla. As enzimas podem clivar o DNA aleatoriamente ou sequências específicas que são referidas como sites de restrição. Os sítios de reconhecimento são de origem palindrômica, ou seja, são as sequências que são lidas da mesma forma para a frente e para trás.

Essas enzimas de restrição são produzidas naturalmente pelas bactérias. As espécies bacterianas o utilizam como forma de mecanismo de defesa contra vírus. No entanto, nas bactérias, as enzimas de restrição estão presentes como parte de um sistema combinado denominado sistema de modificação de restrição. As espécies bacterianas modificam seu próprio DNA com a ajuda de enzimas que o metilam. Este processo particular de metilação do DNA bacteriano o protege da clivagem de suas próprias endonucleases de restrição.

Tipos

Existem dois tipos diferentes de enzimas de restrição:

  1. Exonucleases: as exonucleases de restrição são principalmente responsáveis ​​pela hidrólise dos nucleotídeos terminais da extremidade da molécula de DNA ou RNA, tanto na direção 5 'para 3' ou na direção 3 'para 5', por exemplo - exonuclease I, exonuclease II, etc.
  2. Endonuclease: endonucleases de restrição reconhecem sequências de bases específicas (locais de restrição) dentro da molécula de DNA ou RNA e catalisam a clivagem da ligação fosfodiéster interna para exEcoRI, Hind III, BamHI, etc.

História

A primeira enzima de restrição a ser descoberta foi Hind II no ano de 1970. Em 1978, Daniel Nathans, Werner Arber e Hamilton O. Smith receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina.

Nomenclatura da enzima de restrição

O próprio nome das enzimas de restrição consiste em três partes:

  1. Uma abreviatura do gênero e da espécie do organismo para 3 letras, por exemplo- Eco para Escherichia coli identificada pela primeira letra, E, do gênero e as duas primeiras letras, co, da espécie.
  2. É seguido por uma letra, número ou combinação de ambos para significar a linhagem da espécie.
  3. Um algarismo romano para indicar a ordem em que os diferentes sistemas de restrição-modificação foram encontrados no mesmo organismo ou cepa per se.

Classificação de endonucleases de restrição

Com base nos tipos de sequências identificadas, na natureza dos cortes feitos no DNA e na estrutura da enzima, existem três classes:

  1. Enzimas de restrição tipo I,
  2. Enzimas de restrição do tipo II, e
  3. Enzimas de restrição do tipo III.

UMA. Enzimas de restrição tipo I

  • As enzimas de restrição do tipo I possuem atividades de restrição e modificação. Neste caso, a restrição dependerá do estado de metilação da sequência de DNA alvo.
  • A clivagem ocorre a quase 1000 pares de bases de distância do local de restrição.
  • A estrutura do site de reconhecimento é assimétrica. É composto por 2 partes. Uma parte do local de reconhecimento é composta por 3-4 nucleotídeos, enquanto a outra contém 4-5 nucleotídeos. As duas partes são separadas por um espaçador não específico de cerca de 6-8 nucleotídeos.
  • Para sua função, as enzimas de restrição do tipo I requerem S-adenosilmetionina (SAM), ATP e Mg 2+
  • Eles são compostos por 3 subunidades, uma subunidade de especificidade que determina o local de reconhecimento, uma subunidade de restrição e uma subunidade de modificação.

B. Enzimas de restrição do tipo II

  • Duas enzimas separadas medeiam a restrição e modificação. Doravante, o DNA pode ser clivado na ausência de enzimas modificadoras. Embora a sequência alvo identificada pelas duas enzimas seja a mesma, elas podem ser purificadas separadamente uma da outra.
  • Os nucleotídeos são clivados apenas no local de restrição. A sequência de reconhecimento é rotacionalmente simétrica, chamada de sequência palindrômica. O sítio palindrômico específico pode ser contínuo (por exemplo, KpnI identifica a sequência 5´-GGTACC-3´) ou não contínuo (por exemplo, BstEII reconhece a sequência 5´-GGTNACC-3´, onde N pode ser qualquer nucleotídeo)
  • Estes requerem Mg 2+ como cofator, mas não ATP.
  • Eles são necessários no mapeamento genético e na reconstrução do DNA in vitro apenas porque identificam locais específicos e clivam apenas nesses locais.

Como eles trabalham:

  • As enzimas de restrição do tipo II estabelecem primeiro contato não específico com o DNA e se ligam a eles na forma de dímeros.
  • A sequência alvo é então detectada por uma combinação de dois processos. A enzima se difunde linearmente / desliza ao longo da sequência de DNA em distâncias curtas ou salta / pula em longas distâncias.
  • Uma vez que a sequência alvo é localizada, várias mudanças conformacionais ocorrem na enzima, bem como no DNA. Essas mudanças conformacionais, por sua vez, ativam o centro catalítico.
  • A ligação fosfodiéster é hidrolisada e o produto é liberado.

Estruturas de formas livres, não específicas e específicas de BamHI ligadas ao DNA

C. Enzima de restrição tipo III

  • As enzimas do tipo III reconhecem e metilam a mesma sequência de DNA. No entanto, eles separam quase 24-26 pares de bases.
  • Eles são compostos por duas subunidades diferentes. O reconhecimento e a modificação do DNA são realizados pela primeira subunidade- & # 8216M & # 8217 e a atividade da nuclease é processada pela outra subunidade ‘R’.
  • A clivagem do DNA é auxiliada pelo ATP, bem como pelo Mg 2+, enquanto o SAM é responsável por estimular a clivagem.
  • Apenas uma das fitas de DNA é clivada. No entanto, para quebrar o DNA de fita dupla, são necessários dois locais de reconhecimento em direções opostas.

Atividade Estelar

Algumas enzimas de restrição são capazes de clivar locais de reconhecimento que são semelhantes, mas não idênticos à sequência de reconhecimento definida em condições de reação não padrão (baixa força iônica, alto pH).

Isosquizômeros, Neosquizômeros e Isocaudômeros

  • Isosquizômeros são as enzimas de restrição que reconhecem e clivam no mesmo local de reconhecimento. Por exemplo, SphI (CGTAC / G) e BbuI (CGTAC / G) são isosquizômeros um do outro.
  • Neosquizômeros são as enzimas de restrição que reconhecem o mesmo local e têm um padrão de clivagem diferente. Por exemplo, SmaI (GGG / CCC) e XmaI (G / GGCCC) são neoesquizômeros um do outro.
  • Isocaudômeros são as enzimas de restrição que reconhecem sequências ligeiramente diferentes, mas produzem os mesmos fins. Por exemplo, tanto Sau3a quanto BamHI renderizam uma extremidade pegajosa 5'-GATC-3 ', embora ambos tenham sequências de reconhecimento diferentes.

Padrões de clivagem

Os padrões de clivagem de HindIII, SmaI, EcoRI e BamHI são descritos a seguir. A maioria das enzimas reconhece sequências com 4 a 6 pares de bases de comprimento. No entanto, eles também podem ter até 8 pares de bases de comprimento.

O processo de clivagem do DNA pela enzima de restrição culmina com a formação de extremidades pegajosas ou cegas.

Os fragmentos de extremidades cegas podem ser unidos ao fragmento de DNA apenas com a ajuda de ligantes e adaptadores.


O que são enzimas de restrição?

Uma enzima de restrição, mais comumente referida como endonuclease de restrição, tem a capacidade de clivar moléculas de DNA em pequenos fragmentos. O processo de clivagem ocorre próximo ou em um local especial de reconhecimento da molécula de DNA, denominado local de restrição. Um local de reconhecimento é normalmente composto de 4-8 pares de bases. Dependendo do local de clivagem, as enzimas de restrição podem ser de quatro (04) tipos diferentes: Tipo I, Tipo II, Tipo III e Tipo IV. Além do local de clivagem, fatores como composição, necessidade de co-fatores e a condição da sequência alvo são levados em consideração ao diferenciar enzimas de restrição em quatro grupos.

Durante a clivagem de moléculas de DNA, o local de clivagem pode estar no próprio local de restrição ou a uma distância do local de restrição. As enzimas de restrição criam duas incisões através de cada estrutura de açúcar-fosfato na dupla hélice do DNA.

Figura 02: Enzimas de restrição

As enzimas de restrição são encontradas principalmente em Achaea e bactérias. Eles utilizam essas enzimas como mecanismo de defesa contra os vírus invasores. As enzimas de restrição clivam o DNA estranho (patogênico), mas não seu próprio DNA. Seu próprio DNA é protegido por uma enzima conhecida como metiltransferase, que faz modificações no DNA do hospedeiro e evita a clivagem.

A enzima de restrição do tipo I possui um local de clivagem que está longe do local de reconhecimento. O funcionamento da enzima requer ATP e a proteína S-adenosil-L-metionina. A enzima de restrição do tipo I é considerada multifuncional devido à presença de atividades de restrição e metilase. As enzimas de restrição do tipo II clivam dentro do próprio local de reconhecimento ou a uma distância mais próxima dele. Requer apenas magnésio (Mg) para sua função. As enzimas de restrição do tipo II têm apenas uma função e são independentes da metilase.


Qual é a diferença entre uma enzima de restrição e CRISPR?

CRISPR Cas9 é uma enzima de restrição. Existem muitos tipos de enzimas de restrição, e cada uma corta o DNA em um local específico. CRISPR é o nome de uma família de sequências de DNA encontradas no DNA de muitos procariotos que CRISPR Cas9 pode clivar, tornando-se um marcador útil para muitas coisas.

Pense no DNA como uma corrente feita de diferentes cadeados. As enzimas de restrição são as chaves. Cada chave pode abrir uma fechadura. CRISPR é uma marca de fechadura, uma marca que possui uma chave mestra para todas as fechaduras denominada CRISPR Cas9. Em qualquer lugar ao longo desta cadeia que você encontrar um bloqueio CRISPR, você pode usar a proteína Cas9 para abri-lo.

Esta é a única resposta correta. Cas9 é uma enzima de restrição do tipo V.

muito obrigado isso ajudou muito eu estava tentando encontrar a diferença no google e trouxe o seu comentário obrigado

Recortes incontroláveis ​​que procuram uma sequência definida em qualquer lugar versus uma quebra controlada em um ponto de sequência específico usando um guia.

A enzima de restrição procura uma determinada sequência, sempre que a encontra, não importa onde irá cortar em torno dela, nada adicionado ou removido. Como não é controlado, você pode cortar as coisas que não deseja, os buffers e a temperatura podem ajudar aqui.

Em vez disso, o CRISPR depende de uma sequência de RNA (RNA guia) complementar ao alvo, quando o guia se liga, o CRISPR faz uma quebra de fita dupla, trazendo erros de sequência como inserções e deleções, no entanto, isso pode ser explicado com uma fita de substituição.

ahhh ok então isso é o que torna o CRISPR melhor para a modificação genética, certo? É mais preciso

Geralmente, quando estamos falando sobre & # x27enzimas de restrição & # x27, estamos nos referindo às históricas que reconhecem uma única sequência, geralmente 6 ou 8 nucleotídeos. Eles são programados para cortar apenas uma única sequência (embora essa sequência possa aparecer em muitos lugares). Se você ouvir sobre & quotEcoR1 & quot ou engenharia genética, é provável que esteja ouvindo sobre essas & # x27Tipo II & # x27 enzimas de restrição.

A mágica do Cas9 é que ele é & # x27com base em cassetes & # x27 - se você fornecer um RNA companheiro (que é feito de acordo com algumas regras, mas BASICAMENTE pode direcionar qualquer sequência), então qualquer que seja A sequência de DNA corresponde ao RNA que receberá um corte. Além disso, o & # x27alvo de correspondência & # x27 para Cas9 é relativamente grande, tanto que você pode ter como alvo um único gene no 1 bilhão de nucleotídeos do DNA humano. Nem sempre é perfeito, mas isso é outra história.

FORMALMENTE, os humanos optaram por classificá-la como um tipo particular da enorme e diversa família de máquinas de corte de DNA, portanto, dizendo que & # x27 é & # x27 uma enzima de restrição também é correta, mas é um tipo muito distinto com propriedades e potencial incríveis .

obrigado por esclarecer lol eu aprendi um pouco sobre isso na escola, mas eles não deixaram claro que cas9 também era uma enzima de restrição. Eles meio que ensinam isso como uma coisa totalmente separada lol, mas sim, isso faz sentido :))

Crispr significa repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas e agrupadas. Eles são sequências de DNA encontradas em procariotos (bactérias) que contêm as mesmas sequências encontradas em vírus que atacam essas bactérias. As bactérias irão detectar essas sequências palindrômicas em um DNA de vírus invasor & # x27s e adicioná-las ao seu próprio DNA nessas sequências nítidas. A bactéria então os usa como uma espécie de índice, e a proteína Cas-9 (proteína associada a crispr # 9) usa essas sequências para encontrar e cortar DNA viral que coincide com aqueles encontrados nas sequências crispr # x27s. É fascinante, um tipo de defesa imunológica adaptativa para uma bactéria individual. Se você observar como a vida multicelular luta e se adapta às infecções, há paralelos. Alguns podem considerar isso uma espécie de evolução convergente.

Uma enzima de restrição é qualquer enzima que corta o DNA que encontra. Eles utilizam sequências palindrômicas para identificar locais onde podem trabalhar. Cas-9 é um tipo de enzimas de restrição, mas existem muitas mais. Cas-9 é muito poderoso, entretanto, pois pode ser usado para qualquer sequência palíndrômica.


O que é DNA ligase?

As extremidades pegajosas dos fragmentos produzidos por enzimas de restrição são úteis em um ambiente de laboratório. Eles podem ser usados ​​para juntar fragmentos de DNA de diferentes fontes e diferentes organismos. Os fragmentos são mantidos juntos por ligações de hidrogênio. De uma perspectiva química, as ligações de hidrogênio são atrações fracas e não são permanentes. Usando outro tipo de enzima, no entanto, as ligações podem se tornar permanentes.

A DNA ligase é uma enzima muito importante que atua tanto na replicação quanto no reparo do DNA de uma célula. Ele funciona ajudando na união das fitas de DNA. Ele age catalisando uma ligação fosfodiéster. Esta ligação é uma ligação covalente, muito mais forte do que a ligação de hidrogênio mencionada e capaz de manter os diferentes fragmentos juntos. Quando diferentes fontes são usadas, o DNA recombinante resultante que é produzido tem uma nova combinação de genes.


Qual é a diferença entre a digestão única e a dupla digestão ao discutir as enzimas de restrição?

NOTA: nesta resposta, para RE's (Enzimas de Restrição) leia Endonucleases.

NOTA 2: Presumo que você esteja familiarizado com a impressão digital de DNA. Se não, veja aqui e aqui.

REs são altamente específicos para a sequência de DNA que eles unem: é quase invariavelmente uma sequência palindrômica predeterminada.
Por exemplo, Hin DIII fará apenas um corte na sequência:

5 '# - & gt # A #color (red) / # AGCTT # - & gt # 3'
3 '# larr # TTCGA #color (vermelho) / # A # larr # 5'

A quantidade de bases neste palindorme é 6.
Não vou entrar em análise estatística, mas é seguro assumir que isso resultará em menos cortes do que, por exemplo, a atividade de Sau3A:

5 '# - & gt # ---- #color (red) / # GATC ---- # - & gt # 3'
3 '# larr # ---- CTAG #color (red) / # ---- # larr # 5'

Se você tiver uma quantidade de DNA (nuclear total), digamos, de um humano para "impressão digital", digerir (splicing ou corte) com Sau3A pode não levar ao resultado desejado: você obterá muitos fragmentos pequenos resultando em um "esfregaço" ininteligível em sua placa de gel de eletroforese.

Cortar com Hin DIII resultará em algumas bandas grandes que podem ser reveladoras, mas você gostaria de ter mais certeza.

Portanto, corte com DUAS enzimas de restrição diferentes, como uma mistura de Hin DIII (5 '# - & gt # A #color (vermelho) / # AGCTT # - & gt # 3') e EcoR1 (5 '# - & gt # G #color (vermelho) / # AATTC # - & gt # 3 ') pode resolver o problema.

No entanto, você pode ter problemas com isso: o DNA é bastante inerte e robusto, mas os REs não são. Uma vez que são extraídos de diferentes organismos (bactérias), cada ER terá seu próprio ambiente ótimo dentro da célula hospedeira. Portanto, cada ER terá sua própria mistura tampão ideal (pense no pH, se nada mais), e é aí que está o problema.

Embora no laboratório tenha sido descoberto que a maioria dos ERs estão bastante satisfeitos com os tampões baseados em TRIS (Tris-Hidroximetil AminoMetano), como TBE (Tris / Borato / EDTA), cada ER precisará de ajustes no buffer escolhido para a atividade ideal. Outros fatores, como temperatura, também podem ter influência.

Portanto, se as duas ERs são compatíveis com buffer, você pode fazer uma digestão dupla de uma vez, mas dependendo da compatibilidade das duas ERs de escolha, pode ser necessário fazê-lo em duas fases: interromper a reação da primeira digestão (calor -shock), purifique o DNA-digerir, então faça a segunda digestão.

Mas como até o momento em que escrevo, mais de 3.000 REs foram identificados e mais de 600 estão disponíveis comercialmente, não cabe a mim fornecer uma lista exaustiva de combinações.

Na década de 80, obtivemos a maioria dos nossos REs de qualquer Bethesda labs (EUA), New England Biolabs (EUA) ou Boehringer Ingelheim (Alemanha), e eles podem fornecer uma lista de REs compatíveis e seus buffers para dupla digestão.


O que são enzimas de restrição do tipo II?

As enzimas de restrição do tipo II contêm duas subunidades idênticas em sua estrutura. Os homodímeros são formados por enzimas de restrição do tipo II com os locais de reconhecimento. Os locais de reconhecimento são tipicamente palindrômicos e não são divididos. Tem um comprimento de 4-8 pares de bases. Ao contrário do tipo I, o local de clivagem da enzima de restrição Tipo II está presente no local de reconhecimento ou presente a uma curta distância do local de reconhecimento.

Figura 02: Enzimas de restrição do tipo II

Estas enzimas de restrição são bioquimicamente significativas e estão amplamente disponíveis comercialmente. Para sua ativação, necessita apenas de Mg 2+. Não tem atividade de metilação e apenas desempenha a função de atividade de restrição. Essas enzimas de restrição se ligam às moléculas de DNA como homodímeros e têm a capacidade de reconhecer sequências de DNA simétricas, bem como sequências assimétricas.


Qual é a diferença entre extremidades adesivas e extremidades cegas?

As enzimas de restrição cortam o DNA de fita dupla pela metade. Dependendo da enzima de restrição, o corte pode resultar em um extremidade pegajosa ou uma fim abrupto. Pontas pegajosas são mais úteis na clonagem molecular porque garantem que o fragmento de DNA humano seja inserido no plasmídeo na direção certa.

Da mesma forma, para que são utilizadas as pontas cegas? Pontas cegas não tem saliência. Eles não podem corresponder tão especificamente quanto o DNA com pegajosa termina no entanto, eles podem ser úteis quando pegajosos termina não pode ser usado. SmaI é uma enzima de restrição que faz pontas cegas.

Além disso, para saber qual é a diferença entre pontas cegas e quizlet de pontas pegajosas?

Pontas pegajosas são quando as enzimas fazem cortes escalonados no duas vertentes. Cortes que não são diretamente opostos um ao outro. Pontas pegajosas são mais úteis em rDNA porque podem ser usados ​​para unir dois diferente pedaços de DNA que foram cortados pela mesma enzima de restrição.

Como você converte pontas cegas em pontas pegajosas?

Cego e pontas pegajosas pode ser inter convertido adicionando locais cognitivos de restrição ou removendo alguns deles. Fim abrupto estão convertido em extremidade pegajosa antes da clonagem.


Enzimas de restrição no DNA: modo de ação e seus tipos

Leia este artigo para aprender sobre as enzimas de restrição e seu modo de ação. E também descreve diferentes tipos de enzimas de restrição. Os tipos são: (1) Tipo I (2) Tipo II e (3) Tipo III.

As enzimas de restrição são enzimas de corte de DNA encontradas nas bactérias (e colhidas delas para uso). Como eles cortam dentro da molécula, são freqüentemente chamados de endonucleases de restrição.

Uma enzima de restrição reconhece e corta o DNA apenas em uma sequência particular de nucleotídeos. Por exemplo, a bactéria Hemophilus aegypticus produz uma enzima chamada Haelll que corta o DNA sempre que encontra a sequência

O corte é feito entre G e C adjacentes. Esta sequência particular ocorre em 11 locais na molécula de DNA circular do vírus phiX174. Assim, o tratamento deste DNA com a enzima produz 11 fragmentos, cada um com um comprimento e sequência de nucleotídeos precisos. Esses fragmentos podem ser separados uns dos outros e a sequência de cada um determinada. Haelll e Alul cortaram em linha reta através da dupla hélice produzindo extremidades & # 8220 sem corte & # 8221. No entanto, muitas enzimas de restrição cortam de forma compensada.

As extremidades do corte têm um pedaço saliente de DNA de fita simples. Elas são chamadas de & # 8220 extremidades pegajosas & # 8221 porque são capazes de formar pares de bases com qualquer molécula de DNA que contenha a extremidade adesiva complementar (Fig. 13.16). Qualquer outra fonte de DNA tratada com a mesma enzima produzirá tais moléculas. Misturadas, essas moléculas podem se juntar umas às outras pelo emparelhamento de bases entre suas extremidades adesivas.

A união pode ser tornada permanente por outra enzima, a DNA ligase, que forma ligações covalentes ao longo da espinha dorsal de cada fita. O resultado é uma molécula de DNA recombinante (rDNA). Como as sequências de reconhecimento e os locais de clivagem diferem entre as enzimas de restrição, o comprimento e a sequência exata de uma extremidade pegajosa & # 8220 overhang & # 8221, bem como se é a extremidade 5 & # 8242 ou a extremidade 3 & # 8242 que se projeta, depende em que enzima o produziu. O emparelhamento de bases entre saliências com sequências complementares permite que dois fragmentos sejam unidos ou & # 8220splicados & # 8221 por uma ligase de DNA.

Um fragmento de extremidade pegajosa pode ser ligado não apenas ao fragmento do qual foi originalmente clivado, mas também a qualquer outro fragmento com uma extremidade pegajosa compatível. A extremidade pegajosa também é chamada de extremidade coesa ou extremidade complementar em algumas referências.

Se uma enzima de restrição tem um palíndromo não degenerado (a sequência em uma fita lê a mesma na mesma direção na fita complementar, por exemplo, GTAATG não é uma sequência de DNA palindrômica, mas GTATAC é, GTATAC é complementar a CATATG) local de clivagem, todos as extremidades que produz são compatíveis. As extremidades produzidas por diferentes enzimas também podem ser compatíveis.

Nomeação:

As enzimas de restrição são nomeadas com base nas bactérias nas quais são isoladas da seguinte maneira:

I Identificado pela primeira vez o ID de pedido & # 8217d em bactéria

Padrões de corte de DNA por enzimas de restrição:

A enzima corta assimetricamente dentro do local de reconhecimento de modo que um segmento de fita simples curta se estenda das extremidades 5 e # 8242. BamHI corta dessa maneira.

Novamente, vemos um corte assimétrico dentro do local de reconhecimento, mas o resultado é uma saliência de fita única das duas extremidades 3 & # 8242. Kpnl corta desta maneira.

As enzimas que cortam em locais precisamente opostos nas duas fitas de DNA geram extremidades cegas sem saliências. Smal é um exemplo de enzima que gera extremidades cegas.

As saliências 5 & # 8242 ou 3 & # 8242 geradas por enzimas que cortam assimetricamente são chamadas de extremidades pegajosas ou extremidades coesivas, porque elas irão facilmente aderir ou recozer com seu parceiro por emparelhamento de base.

Modo de ação:

Uma enzima de restrição (ou endonuclease de restrição) é uma enzima que corta o DNA de fita dupla (Tabela 13.4). A enzima faz duas incisões, uma através de cada estrutura de açúcar-fosfato (ou seja, cada fita) da dupla hélice sem danificar as bases nitrogenadas.

As ligações químicas que as enzimas clivam podem ser reformadas por outras enzimas conhecidas como ligases, de modo que fragmentos de restrição esculpidos em diferentes cromossomos ou genes possam ser unidos, desde que suas extremidades sejam complementares.

Muitos dos procedimentos de biologia molecular e engenharia genética dependem de enzimas de restrição. O termo restrição vem do fato de que essas enzimas foram descobertas em cepas de E. coli que pareciam restringir a infecção por certos bacteriófagos.

Portanto, acredita-se que as enzimas de restrição sejam um mecanismo desenvolvido pelas bactérias para resistir ao ataque viral e ajudar na remoção das sequências virais. Eles fazem parte do que é chamado de sistema de modificação de restrição. O Prêmio Nobel de Medicina de 1978 foi concedido a Daniel Nathans, Werner Arber e Hamilton Smith pela descoberta de endonucleases de restrição, levando ao desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante.

O primeiro uso prático de seu trabalho foi a manipulação da bactéria E. coli para produzir insulina humana para diabéticos. A capacidade de produzir moléculas de DNA recombinante não só revolucionou o estudo da genética, mas lançou as bases para grande parte da indústria de biotecnologia. A disponibilidade de insulina humana (para diabéticos), fator VIII humano (para homens com hemofilia A) e outras proteínas usadas na terapia humana foram possibilitadas pelo DNA recombinante.

Tipos de enzimas de restrição:

As enzimas de restrição são classificadas bioquimicamente em três tipos. Estes são designados como Tipo I, Tipo II e Tipo III. Um tipo principal de enzimas do Tipo II é às vezes referido como enzimas do Tipo IV.

Nos sistemas tipo I e III, ambas as atividades de metilase e restrição são realizadas por um único grande complexo enzimático. Embora essas enzimas reconheçam sequências de DNA específicas, os locais de clivagem real estão a distâncias variáveis ​​desses locais de reconhecimento e podem estar a centenas de bases de distância. Ambos requerem ATP para seu funcionamento adequado.

As enzimas de restrição do tipo I produzem clivagem do DNA após a translocação do DNA, o que as torna importantes motores moleculares. A clivagem do DNA parece ocorrer após o bloqueio da atividade de translocação (geralmente após a colisão com outra enzima de translocação Tipo R-M, mas também devido a outros fatores).

These enzymes read the methylation status of their recognition sequence, compare the methylation status of two adenines within the recognition sequence, and if both adenines are un-methylated (a signal that the DNA is non-host DNA), the enzyme undergoes a conformational switch that turns the enzyme into a molecular motor and endonuclease.

However, if either one of the adenines is methylated (a signal that the DNA is host DNA) then the enzyme acts as a maintenance methylase and methylates the other adenine. In Type II systems, the restriction enzyme is independent of its methylase, and cleavage occurs at very specific sites that are within or close to the recognition sequence. The vast majority of known restriction enzymes are of type II, and it is these that find the most use as laboratory tools. They produce discrete bands during gel electrophoresis, and are useful for DNA analysis and gene cloning. The first to be discovered and utilized was EcoRI, which is staggered and its recognition sequence is 5′-GAATTC-3′.

Type II enzymes are further classified according to their recognition site. Most type II enzymes cut palindromic DNA sequences, while type IIa enzymes recognise non-palindromic sequences and cleave outside of the recognition site, and type lIb enzymes cut sequences twice at both sites outside the recognition sequence. Type lIs enzymes cleave the DNA at a considerable offset from the recognition sequence. The most common type II enzymes are those like HhaI, HindIII and NotI that cleave DNA within their recognition sequences.

Restriction enzymes usually occur in combination with one or two modification enzymes (DNA-methyltransferases) that protect the cell’s own DNA from cleavage by the restriction enzyme.

Modification enzymes recognize the same DNA sequence as the restriction enzyme that they accompany, but instead of cleaving the sequence, they methylate one of the bases in each of the DNA strands. The methyl groups protrude into the major groove of DNA at the binding site and prevent the restriction enzyme from acting upon it.

Together, a restriction enzyme and its “cognate” modification enzyme(s) form a restriction-modification (R-M) system. In some R-M systems the restriction enzyme and the modification enzyme(s) are separate proteins that act independently of each other. In other systems, the two activities occur as separate subunits, or as separate domains, of a larger, combined, restriction-and-modification enzyme.

Restriction Enzymes as Tools:

Recognition sequences typically are only four to twelve nucleotides long. Because there are only so many ways to arrange the four nucleotides—A,C,G and T–into a four or eight or twelve nucleotide sequence, recognition sequences tend to “crop up” by chance in any long sequence. Furthermore, restriction enzymes specific to hundreds of distinct sequences have been identified and synthesized for sale to laboratories.

As a result, potential “restriction sites” appear in almost any gene owr chromosome. Meanwhile, the sequences of some artificial plasmids include a “linker” that contains dozens of restriction enzyme recognition sequences within a very short segment of DNA. So no matter the context in which a gene naturally appears, there is probably a pair of restriction enzymes that can cut it out, and which will produce ends that enable the gene to be spliced into a “plasmid”.

Another use of restriction enzymes can be to find specific SNPs. If a restriction enzyme can be found such that it cuts only one possible allele of a section of DNA (that is, the alternate nucleotide of the SNP causes the restriction site to no longer exist within the section of DNA), this restriction enzyme can be used to genotype the sample without completely sequencing it. The sample is first run in a restriction digest to cut the DNA, and then gel electrophoresis is performed on this digest.

If the sample is homozygous for the common allele, the result will be two bands of DNA, because the cut will have occurred at the restriction site. If the sample is homozygous for the rarer allele, the sample will show only one band, because it will not have been cut. If the sample is heterozygous at that SNP, there will be three bands of DNA. This is an example of restriction mapping.


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