Em formação

Inserção de sequência de DNA sintético


Se eu tiver alguma sequência de DNA sintética (<= 20 bp de comprimento), há uma maneira de inserir essa sequência de forma confiável ao lado de algum motivo n-bp? Eu gostaria que isso fosse possível em humanos. Em caso afirmativo, há alguma restrição quanto ao tamanho de n?

Eu explorei o uso de CRISPR / Cas9 para esse fim, mas é limitado no sentido de que a sequência alvo de gRNA deve ser adjacente a uma sequência PAM. Tentativas foram feitas para resolver este problema (http://www.nature.com/nature/journal/v523/n7561/full/nature14592.html#affil-auth), mas eles ficam aquém da generalidade completa para n. Existem abordagens melhores?


Cientistas inventam novo método para a produção de DNA sintético

O PhD Alexander Sandahl, junto com o professor Kurt Gothelf, o professor Troels Skrydstrup e vários alunos dos grupos, desenvolveu um método para a produção eficiente e automatizada de ingredientes para a síntese de DNA. Crédito: Colourbox

Sequências curtas de DNA sintetizadas quimicamente são ingredientes extremamente importantes e com inúmeras utilizações em laboratórios de pesquisa, hospitais e na indústria, como no método de identificação de COVID-19. Os fosforamiditos são blocos de construção necessários na produção de sequências de DNA, mas são instáveis ​​e se rompem rapidamente. O PhD Alexander Sandahl (grupo do Professor Kurt Gothelf & # 8217s) desenvolveu, em colaboração com um pesquisador do grupo do Professor Troels Skrydstrup & # 8217s, uma nova maneira patenteada de fabricar de forma rápida e eficiente os blocos de construção instáveis ​​imediatamente antes de serem usados, e assim agilizar a produção de DNA.

As sequências de DNA produzidas também são chamadas de oligonucleotídeos. Eles são amplamente usados ​​para identificação de doenças, para a fabricação de medicamentos à base de oligonucleotídeos e para várias outras aplicações médicas e biotecnológicas.

A alta demanda por oligonucleotídeos, portanto, requer um método automatizado eficiente para sua produção química. Esse processo se baseia em fosforamiditos, que são compostos químicos que têm a desvantagem de serem instáveis, a menos que sejam armazenados a -20 graus Celsius ideais.

Os instrumentos usados ​​para a síntese de DNA não são capazes de resfriar os fosforamiditos e, conseqüentemente, é inevitável que alguns deles se degradem após serem adicionados ao instrumento.

Visão geral esquemática da estratégia de síntese de fosforamiditos em uma configuração baseada em fluxo. Crédito: Nature Commun 12, Artikel nr. 2760 (2021)

Evitando a degradação indesejada de ingredientes importantes

O professor Kurt Gothelf e o professor Troels Skrydstrup estão liderando um grupo de pesquisa em química orgânica, que trabalharam juntos para desenvolver uma tecnologia relativamente simples, mas eficiente, onde a produção de fosforamiditos pode ser automatizada e integrada diretamente no instrumento para a síntese de DNA.

Isso evita tanto a síntese manual destes, que normalmente demoraria até 12 horas, quanto o problema de armazenamento de fosforamiditos instáveis. O grupo Gothelf & # 8217s contribuiu com sua experiência em síntese automatizada de DNA e o grupo Skrydstrup & # 8217s contribuiu com seu know-how com reações químicas que ocorrem em líquidos fluindo continuamente (química de fluxo).

& # 8220Foi uma colaboração muito gratificante, que é precisamente um dos valores fundamentais da iNANO, & # 8221 diz Kurt Gothelf, que acrescenta & # 8220 e também gostaria de atribuir a Alexander Sandahl uma grande parte do crédito por este projeto tendo sucesso, pois estabeleceu a colaboração e desenvolveu e concretizou grande parte das ideias para o projeto. ”

Os resultados acabam de ser publicados na revista Nature Communications.

No método de produção de fosforamiditos, os nucleosídeos (materiais de partida) são lavados através de um material sólido (resina), que pode ser totalmente integrado em um processo automatizado no instrumento para a síntese de DNA. A resina garante que os nucleosídeos sejam fosforilados rapidamente, pelo que os nucleosídeos são convertidos em fosforamiditos em poucos minutos. Da resina, os fosforamiditos são automaticamente liberados para a parte do instrumento responsável pela síntese do DNA.

Isso evita a degradação dos fosforamiditos, pois eles são produzidos pela primeira vez pouco antes de serem usados ​​(sob demanda), de uma forma mais rápida e eficiente baseada em fluxo que pode ser potencialmente automatizada e operada por não químicos.

Referência: & # 8220Síntese sob demanda de fosforamidita & # 8221 por Alexander F. Sandahl, Thuy J. D. Nguyen, Rikke A. Hansen, Martin B. Johansen, Troels Skrydstrup e Kurt V. Gothelf, 12 de maio de 2021, Nature Communications.
DOI: 10.1038 / s41467-021-22945-z

A pesquisa é financiada pela Fundação Lundbeck, pela Fundação Novo Nordisk (CEMBID), pelo Fundo de Pesquisa Independente da Dinamarca e pela Fundação Nacional de Pesquisa Dinamarquesa (CADIAC).


Síntese da Biblioteca de DNA para Evolução Dirigida

Resumo ou TLDR & # 8211 Existem muitas abordagens diferentes disponíveis para fazer uma biblioteca de DNA & # 8211, que simplesmente é uma coleção de diferentes sequências de DNA contendo variações em uma ou mais posições. Cada método de geração de biblioteca lida de maneira diferente com uma série de parâmetros, como a localização das mutações e o número de variantes geradas. Na maioria das circunstâncias, é possível que vários métodos forneçam a mesma biblioteca com custos diferentes ou bibliotecas diferentes com o mesmo custo. O desafio passa a ser a escolha de um método adequado que forneça uma biblioteca adequada para o aplicativo em questão.

Uso de metáforas: Para tornar alguns dos conceitos mais acessíveis e para enfatizar diferenças específicas entre as abordagens, eu uso uma metáfora de conjunto de LEGO aqui. O kit original é o seu ponto de partida ou proteína do tipo selvagem e a evolução aqui está se concentrando na mudança de alguns dos tijolos no conjunto para que você obtenha um brinquedo diferente do seu conjunto inicial. Bibliotecas são as peças que você pode solicitar na loja LEGO, sendo os métodos como você pode solicitar essas peças. O custo nesta loja é definido pelo número de pedidos que você faz.

Uma das principais e mais fundamentais considerações na evolução direcionada é a biblioteca inicial. Por exemplo, o número de variantes dentro de uma biblioteca deve ser compatível com a abordagem usada na seleção para tornar a amostragem significativa: uma biblioteca que excede 1e10 (1 x 10 10) variantes não é efetivamente amostrada se uma plataforma de seleção for limitada em seu potencial para tela 1e5 variantes de cada vez. Em nossa analogia com o LEGO, isso seria o equivalente a apenas ter suas próprias mãos para testar as 10.000 peças sobressalentes que você encomendou.

No entanto, o tamanho da biblioteca (em relação à plataforma de seleção) é apenas um aspecto do que geralmente é descrito como qualidade da biblioteca. Bibliotecas de alta qualidade direcionam mutações para a região do DNA a ser selecionada (por exemplo, para o gene, não para o plasmídeo que carrega o gene alvo para evolução) e minimizam o número de variantes inativas (que, portanto, não contribuiriam para a seleção). Também minimiza a frequência do gene inicial (que, presumivelmente, não tem a função desejada) e minimiza vieses da amostragem do código genético (por exemplo, existem seis códons para a leucina, mas apenas um para a metionina). O último é importante porque contribui diretamente para o tamanho da biblioteca. Em nossa analogia com o LEGO, isso seria o equivalente a poder solicitar uma única cópia de todas as peças que correspondem ao espaço disponível, enquanto exclui a peça inicial que você está tentando substituir. Claramente, o cenário ideal na situação do LEGO seria pedir apenas a peça única que você deseja e esse é o objetivo do design de proteína racional & # 8211 um tópico para um blog diferente.

Na prática, nem sempre é tecnicamente possível ou economicamente viável obter bibliotecas perfeitas e é necessário algum compromisso. A abordagem mais comum e econômica para gerar bibliotecas de mutações contíguas é introduzir degenerescências em seus oligos. Isso significa que, em vez de ter um único oligonucleotídeo, você tem uma mistura de oligonucleotídeos que são incorporados estocasticamente por PCR para sintetizar a biblioteca. Por exemplo, um oligo degenerado, como NTT (degenerescências são representadas por letras padrão definidas pelas convenções IUPAC & # 8211 veja aqui) incluiria uma mistura de TTT, CTT, ATT e GTT isso resultaria em F , eu , eu ou V sendo incorporado na proteína resultante. Isso seria o equivalente a ser capaz de especificar que seu bloco deve ser fino e ter quatro pinos por dois de comprimento ao fazer o pedido: você terá blocos de cores diferentes que correspondem à sua descrição.

Para proteínas, em situações onde todos os aminoácidos podem ser considerados como possíveis substituições, uma degenerescência NNK é usado, resultando em 32 possibilidades para cobrir os 20 aminoácidos e 1 códon STOP. Isso seria equivalente a pedir cada peça de 2 pinos de largura disponível & # 8211 cores diferentes, comprimentos diferentes, espessuras diferentes. Segmentando várias posições com NNK aumenta rapidamente o tamanho da biblioteca, com uma biblioteca de 8 NNK contendo variantes de DNA 1.1e12 (32 ^ 8). Ainda assim, por causa da redundância do código genético, as variantes de DNA 1.1e12 amostram apenas 3.8e10 variantes de proteína (21 ^ 8) & # 8211, ou seja, quase 96% da biblioteca é redundante. Pior ainda, apenas cerca de 68% dessas proteínas 3.8e10 não incluirão um códon STOP (que em NNK está codificado como UAG) Portanto, isso seria o equivalente a pedir todas as peças na loja (como um único pedido) e você receberá 6 peças azuis para cada peça amarela. Agora você pode construir qualquer brinquedo, mas precisa separar uma caixa enorme.

Porque o NNK abordagem tem sido muito bem-sucedida tanto na academia quanto na indústria, pode ser enganoso pensar que é a melhor ou a única abordagem disponível para a síntese de bibliotecas de DNA. Se um único resíduo está sendo alvo de mutação, as combinações de oligos parcialmente degenerados têm se mostrado altamente eficazes - veja aqui. Ainda assim, as limitações da abordagem dos oligos degenerados começam a ser sentidas quando, apoiado pelo entendimento funcional, o projeto da biblioteca indica que apenas um subconjunto dos 20 aminoácidos possíveis precisa ser amostrado, ou que alguns aminoácidos devem ser mais frequentemente amostrados do que outros. Em outras palavras, é ótimo que você possa comprar todas as peças na loja LEGO, mas talvez não tenha tempo para testá-las todas. Torna-se mais eficiente ser capaz de descrever as peças específicas de que você precisa.

Por exemplo, se um linker flexível está sendo otimizado, é possível que o projeto favoreça a incorporação de resíduos pequenos, flexíveis e polares. Neste caso, uma degeneração como RST permitiria a cobertura de AGIR, GCT, AGT e GGT codificando respectivamente para T, A, S e G, que são os aminoácidos pequenos, flexíveis e polares. Também seria possível ajustar o grau de degenerescência durante a síntese de oligo, por exemplo, usando 75% G e 25% UMA em primeiro R posição, resultaria em um 3 (A e G) a 1 (T e S).

No entanto, o projeto pode exigir uma escolha mais específica de aminoácidos em uma determinada posição. Digamos que o requisito seja para um aminoácido contendo enxofre, ou seja, C ou M. Em tal situação, a degenerescência do oligonucleotídeo para fornecer os 2 aminoácidos desejados (WKS) trazem consigo dois aminoácidos "irrelevantes", F e R. Superficialmente, isso pode não parecer um problema, especialmente para em vitro plataformas de seleção que podem lidar com variantes 1e14 em uma única rodada de seleção.

Considere, entretanto, uma biblioteca simples onde 8 posições estão sendo direcionadas para a triagem de C ou M. A biblioteca ideal representada apenas pelos aminoácidos necessários contém 2 ^ 8 (ou 256) variantes. A geração de tal biblioteca com iniciadores degenerados cria 4 ^ 8 (65.536) variantes - ou seja, a biblioteca desejada seria apenas 0,3% da biblioteca total. Outros exemplos podem ser facilmente explorados e sempre que a degenerescência incorpora uma variação não desejada, a qualidade da biblioteca é fortemente afetada. Em edições futuras, adicionarei aqui um código em Julia para permitir melhor essas comparações, mas também existem ferramentas online que podem ser usadas para otimizar oligos degenerados - veja aqui.

Em teoria, é possível gerar cada variante necessária realizando PCRs individuais com combinações de primer sendo usadas para entregar os mutantes exatos necessários - o equivalente a ser capaz de solicitar na loja LEGO as peças por seu número de peça. Para a biblioteca (C / M) x8 acima, um conjunto de 32 primers seria suficiente para gerar todas as combinações possíveis. As misturas de primer podem ser feitas e a biblioteca montada em um único PCR - com a biblioteca desejada sendo 100% da biblioteca total. Ainda assim, conforme a complexidade da biblioteca aumenta, também aumenta o número de primers necessários: um projeto para 4 aminoácidos amostrados em 8 resíduos pode exigir 512 primers, com um custo estimado de mais de EUR 2.000. Isso seria o equivalente a fazer 512 pedidos, cada um para o bloco específico de que você precisa.

Observação: Como a diversidade pode ser dividida entre dois primers (assumindo que eles estão sendo introduzidos por PCR), o projeto do primer pode ser otimizado com diversidade para os primeiros quatro resíduos em um primer e diversidade para os últimos quatro resíduos no segundo primer. Assumindo que os 4 resíduos não podem ser codificados com degenerescências, 256 (4x4x4x4) variantes de cada iniciador seriam necessárias para gerar a biblioteca.

No entanto, outras plataformas para síntese de biblioteca de DNA também existem: plataformas de síntese aditiva onde códons individuais são adicionados para gerar bibliotecas altamente personalizáveis ​​- veja aqui, aqui e aqui. Para o exemplo (C / M) x8 acima, tais metodologias exigiriam 8 ciclos de síntese, cada ciclo com dois blocos de construção individuais. Se uma maior diversidade de mutação for necessária (como no exemplo acima), as estratégias de síntese aditiva são mais escalonáveis ​​e permanecem econômicas (por exemplo, para os 4 aminoácidos, biblioteca de 8 resíduos, 4 blocos de construção repetidos em 8 ciclos gerariam a biblioteca). Isso equivaleria a você poder enviar uma foto do seu kit, destacando a peça que deseja substituir e a loja poder enviar uma de cada peça que caberia naquele espaço. Mesmo que os resultados sejam os mesmos de pedir várias peças, essa abordagem sempre resulta em um único pedido de sua loja de LEGO favorita.

As vantagens dos métodos baseados em síntese aditiva em relação aos métodos baseados em PCR tornam-se apenas mais pronunciadas à medida que a complexidade da biblioteca aumenta, particularmente se os projetos de biblioteca incorporarem tendências de amostragem para certos aminoácidos em certas posições, se o comprimento da biblioteca (ou bloco de construção) for variável e se o tamanho da biblioteca é uma variável importante a ser considerada.

Uma biblioteca mais extrema seria ABCDEFGH , onde cada letra representa um único aminoácido. Se bibliotecas de comprimento variável daquele motivo fazem parte do projeto (as razões para esse estilo de projeto de biblioteca e para essa abordagem não ser comumente adotada são um blog totalmente separado), a degenerescência ou múltiplos primers precisam ser considerados. Múltiplos iniciadores exigiriam 257 iniciadores para cobrir todas as combinações possíveis de 8, 7, 6 e assim por diante resíduos em tal biblioteca complexa. A degenerescência é possível, mas, conforme detalhado acima para sequências de comprimento único, invariavelmente comprometerá a qualidade da biblioteca: amostragem de mutações "indesejadas" em uma biblioteca em rápida expansão.

Na montagem InDel (que abrange tanto a montagem quanto a análise subsequente), desenvolvemos uma plataforma de síntese de biblioteca aditiva que, ao não selecionar 100% de incorporação dos blocos de construção, cria bibliotecas que variam em comprimento e composição. Para sintetizar bibliotecas de proteínas, como outras metodologias de síntese aditiva, os blocos de construção são simples e poucos: 20 blocos de construção são tudo o que é necessário para qualquer montagem baseada em ciclos de códon único.

Bibliotecas menores mostram todo o espaço de sequência fornecido pelos blocos de construção usados, bibliotecas maiores convergem para o programa de montagem. Em teoria, quanto mais restrito é o uso dos blocos de construção, mais a biblioteca parece o resultado de eventos naturais de inserção ou exclusão - daí o nome da plataforma. Então, para uma biblioteca Indel do formulário abc , para obter a sequência desejada de comprimento total, um programa de montagem como AABBCC seria usado. Com base nas eficiências de acoplamento de 20% por ciclo, 3% da montagem final seria o desejado abc Projeto. Seriam geradas variantes de aminoácidos 0 (uma deleção completa) e 6 (o programa de montagem completo), bem como bibliotecas de 1, 2, 3, 4 e 5 aminoácidos. Essa biblioteca de bibliotecas seria sintetizada em pouco mais de um dia.

Por PCR, depende imensamente se abc pode ser codificado em uma única degenerescência. Se puderem, com 7 primers é possível gerar uma biblioteca semelhante com sequências mais longas melhor representadas - assumindo, é claro, que o projeto da biblioteca consideraria uma variante como BBBBBB relevante. Na prática, muitos no campo acreditam que, à medida que você se afasta da sequência inicial, é menos provável que você isole uma variante funcional - veja aqui. Uma configuração de múltiplos primers pode fornecer uma biblioteca mais semelhante, e deve chegar a aproximadamente 78 primers.

Por outro lado, se UMA , B e C representam misturas de códons (incluindo também diferentes proporções de códons) ou blocos de construção de diferentes comprimentos (por exemplo, elementos de estrutura secundária), então os métodos baseados em PCR não podem competir com as abordagens de síntese aditiva - a qualidade das bibliotecas será (com toda a probabilidade) simplesmente muito baixo para a maioria das técnicas de seleção.

Para desenvolver e validar o InDel, nos concentramos na alça ômega na beta-lactamase. A enzima, responsável pela resistência à ampicilina (um antibiótico) em bactérias, é uma enzima comum bem caracterizada e facilmente analisável em microbiologia e um alvo modelo para evolução dirigida. A alça ômega é igualmente bem caracterizada por seu papel na especificidade do substrato e já havia se mostrado funcional em diferentes comprimentos. Juntos, isso o tornou um alvo adequado para desenvolver e validar a tecnologia (tanto a síntese quanto a análise subsequente). O loop ômega de tipo selvagem é DRWEPEL e sabíamos desde o início que um loop DRYYGEL projetado - veja aqui - nos daria um perfil de resistência a antibióticos diferente mensurável.

Nossa biblioteca foi montada conforme mostrado na figura abaixo:

Cada ciclo traz 50% de nossa sequência alvo e 50% de uma mistura de todos os 20 blocos de construção disponíveis. O objetivo era gerar dados ruidosos para também demonstrar o poder da plataforma de análise.

Esperava-se que a biblioteca de saída se parecesse com:

Simulação de montagem de biblioteca usando o programa de montagem descrito acima. Usando um modelo de simulação de montagem simples (em breve no GitHub), 100k sequências montadas foram geradas, usando a eficiência de incorporação mais precisa por ciclo que obtivemos no momento do envio

A biblioteca InDel mostrada acima é inclinada para sequências mais curtas do que o programa, como seria de esperar das incorporações incompletas por ciclo. Além disso, é fortemente inclinado para a vizinhança da sequência imediata da sequência alvo (mas sem alguns dos vieses que surgiriam em PCR propenso a erros). Comprimentos mais longos começam a se parecer cada vez mais com o programa de montagem (RRYYYYGGEE). Nesta simulação, o alvo pretendido (RYYGE) está presente em 0,01%. Isso significaria que em uma biblioteca 1e8 usual, seria esperado que a sequência alvo estivesse presente aproximadamente 10.000 vezes.

O PCR pode ser usado para montar uma família de bibliotecas do mesmo comprimento, mas quase invariavelmente terão perfis muito distintos. Por exemplo, se um puro (NNK) a estratégia x6 é usada, variantes de DNA 1.1e9 são geradas (representando proteínas 6.4e7) com a sequência alvo pretendida RYYGE compreendendo 0,00002% da sequência total com 17 cópias esperadas em uma biblioteca 1e8. Essa ocorrência rara já é um problema antes mesmo de bibliotecas de outros comprimentos serem geradas e adicionadas à biblioteca complexa. E aqui novamente a metáfora LEGO é útil, porque a seleção é pegar uma amostra aleatória de seus tijolos e ver se eles cabem no seu kit, se não, os tijolos voltam para a bolsa e você tenta novamente. Se sua caixa tiver 1e8 peças, encontrar uma de suas peças-alvo será muito mais fácil se houver 10.000 delas na caixa, em vez de 17.

Por outro lado, outros projetos de PCR são possíveis, por exemplo, onde em vez de NNK uma degenerescência parcial é usada. 70%C10%GAT 70%G10%AGIR K no primeiro resíduo criaria uma biblioteca tendenciosa para a incorporação de R (levaria a 52% da incorporação de R naquela posição com outros aminoácidos representados entre 0,5% e 7,5%). Essa abordagem levaria a uma biblioteca tendenciosa para a sequência alvo com RYYGE representando 0,1% da população. Outros vieses permaneceriam (e ainda pareceria diferente da biblioteca gerada pelo InDel) e em atualizações futuras irei fornecer uma comparação mais detalhada para este ponto, incluindo também uma comparação com PCR propenso a erros.

Essa mistura personalizada tem que ser feita manualmente ao sintetizar quimicamente os primers, levando a aumentos significativos no custo - por exemplo, a síntese dos 5 códons necessários para cobrir RYYGE no IDT chega a EUR 386,90 no RRP. Para obter os diferentes comprimentos, múltiplos primers (um total de 7 para cobrir bibliotecas entre 1 a 6 aminoácidos) seriam necessários e o custo total de geração de tal biblioteca seria superior a EUR 1.500. Estimamos que uma biblioteca InDel custe aproximadamente 150 euros.

No entanto, a precisão de montar uma biblioteca inicial para um determinado projeto depende se as informações usadas no projeto estão corretas (e não são limitadas por erros de anotação no banco de dados ou conhecimento incompleto da enzima alvo). Em casos abaixo do ideal, a amostragem além dos parâmetros do projeto pode render resultados se sua paciência, sorte e financiamento forem bons o suficiente.

Ainda assim, o poder do InDel não está na síntese de bibliotecas de loops, mesmo que tenhamos demonstrado seu potencial naquele sistema simples. Seu poder está na liberdade de combinar blocos de construção de qualquer comprimento, permitindo a síntese de sequências de ácido nucleico modulares complexas (por exemplo, vias metabólicas e nanoestruturas de DNA), bem como na montagem combinatória de genes de proteínas (por exemplo, proteínas de construção de elementos de estrutura secundária). Além disso, o pipeline de análise estabelecido com montagem InDel, permite o processamento rápido dos dados NGS desde a seleção e o isolamento de picos funcionais. Voltando à nossa analogia com o LEGO, isso seria o equivalente a você poder enviar uma foto do seu kit, destacando a peça que deseja substituir e a loja podendo enviar uma de cada peça que caberia naquele espaço, incluindo combinações de peças para lhe dar o ajuste. Juntamente com o pipeline de análise, o que você tem é uma maneira incrivelmente rápida de descobrir quais peças se encaixam melhor. É como ter uma loja de LEGO que pode ler sua mente. Essa é uma loja única de LEGO.

Esclarecimento: não sou o primeiro a considerar a importância da qualidade das bibliotecas de DNA e as versões atualizadas desta postagem incluirão pelo menos parte da literatura relevante que aborda as questões levantadas aqui. Em última análise, este é um problema matemático que faz parte da rotina dos cientistas que trabalham em evolução dirigida e que pode ter um grande impacto no sucesso de um projeto.


Inserção de sequência de DNA sintético - Biologia

por Bill Sardi por Bill Sardi

No Admirável Mundo Novo da biologia desconhecida, tudo vai bem? Onde os biólogos irão parar em seu frenesi sem direção para adquirir conhecimento científico básico?

A última moda entre os biólogos é chamada de biologia sintética. O pequeno grupo que se autodenomina biólogos sintéticos já está se contorcendo com a ideia de regulamentação, temendo que limites atrapalhem seus esforços para alcançar objetivos ainda indefinidos. Toda a ideia da biologia sintética é melhorar a natureza, mas há muitos jargões saindo da boca desses biólogos que fazem o mais ávido fã da ciência começar a questionar o que está acontecendo.

Biólogos sintéticos afirmam que pretendem criar organismos de bioengenharia que podem produzir produtos farmacêuticos, detectar produtos químicos tóxicos, decompor poluentes, reparar genes defeituosos, destruir células cancerosas. & # 8221 [The New Atlantis, Spring, 2006] Esses são objetivos louváveis. Mas há um lado negro na direção que estão tomando.

Não é que os humanos não modifiquem a natureza e transformem os sistemas biológicos. O cruzamento de melancias para produzir variedades sem sementes, ou enxertia de variedades de flores para criar, por exemplo, novas cores de rosas, já foi realizado sem hesitação ou prejuízo. O trabalho de Gregor Mendel e # 8217 (1823 e mdash84 DC), que começou com o cruzamento de variedades de brotos de ervilha, continua até hoje. Mas foi além disso.

Os biólogos sintéticos estendem seu trabalho até mesmo além das preocupações com alimentos geneticamente modificados (OGM). Eles querem projetar novas fitas de DNA em sequências que resultem em vírus totalmente feitos pelo homem, nenhuma parte sendo derivada de sequências de DNA encontradas na natureza.

Lembre-se de que, mesmo com os regulamentos em vigor, os alimentos OGM & # 8220Franken & # 8221 se infiltraram na cadeia alimentar. Mesmo com os regulamentos em vigor, as abelhas fazem a polinização cruzada das safras OGM com variedades naturais. Alimentos OGM foram desenvolvidos com uma boa intenção, para desenvolver plantações que resistem ao ataque de insetos, mas podem resultar na perturbação da cadeia alimentar. Pesquisadores britânicos recentemente contaram menos abelhas e borboletas em plantações de OGM. [Proceedings Biology Science 2005 Mar 7 272 (1562): 463 & mdash74] Apesar da objeção pública, soja e milho OGM têm sido consumidos por humanos sem a devida rotulagem e notificação. Os sistemas biológicos recém-projetados feitos por biólogos sintéticos serão secretamente liberados para uso, assim como o OGM? Os vírus podem ser usados ​​como vetores (veículos) para vacinar secretamente as populações humanas.

O que os biólogos sintéticos propõem é mais ultrajante e perigoso do que os cultivos OGM, e é mais fácil para eles contornar quaisquer regras e regulamentos. Os biólogos sintéticos trabalham em laboratórios escondidos, não em campos de cultivo ao ar livre. Eles podem fazer um pedido para construir vírus totalmente novos a partir do DNA sintético, simplesmente solicitando o DNA viral de uma empresa de síntese genética. [Nature, 25 de maio de 2006]

Os biólogos sintéticos são formados por um grupo de não mais do que cerca de 500 atualmente. Eles querem usar pedaços de DNA, chamados de & # 8220bio-bricks, & # 8221 para construir pseudo-organismos que podem crescer e agir (até mesmo se replicar) de maneiras mais precisamente controladas & mdash criando & # 8220máquinas & # 8221 que não são & # 8220 exatamente como qualquer coisa encontrada na natureza, & # 8221 explica Alex Steffen em um blog científico online [5 de maio de 2004].

Oh, os biólogos sintéticos não vão criar o blob & mdash bem, pelo menos ainda não. Eles afirmam que vão se policiar, limitando principalmente sua atividade para alterar cadeias curtas de DNA em vírus, que são partes do DNA que só podem se replicar dentro de células hospedeiras vivas. Mas os biólogos sintéticos podem ter outras agendas. Eles se referem a & # 8220redesign a vida & # 8221 para & # 8220 gerar sistemas químicos que apóiam a evolução darwiniana. & # 8221 Embora, eles revelem que pretendem criar & # 8220a ponte entre a vida e a não-vida, & # 8221 de acordo com dois químicos de a Universidade da Flórida, que se contam entre as fileiras dos biólogos sintéticos. [Nature Reviews Genetics, julho de 2005]

O que os biólogos sintéticos querem provar?

O que exatamente os dois químicos acima mencionados da Universidade da Flórida querem dizer com isso? Eles pretendem utilizar a biologia sintética, por exemplo, para evoluir artificialmente os humanos a partir do DNA do chimpanzé? Afinal, a primeira comparação abrangente dos projetos genéticos de humanos e chimpanzés mostra que esses primatas compartilham uma identidade perfeita com 96% das sequências de DNA humano. [Nature 1 de setembro de 2005]

Na verdade, a descoberta do DNA por James Watson e Francis Crick em 1953 foi considerada o próprio mecanismo por trás da evolução darwiniana. [Nature 25 de abril de 1953, pp. 737 & mdash738, Nature 30 de maio de 1953, pp. 964 & mdash967] Watson e Crick alegaram que seu objetivo era destronar a teoria tradicional de que um Criador produziu vida e provar que a vida foi criada e controlada pelo DNA. A descoberta do DNA foi até chamada de & # 8220 o oitavo dia da criação. & # 8221 [Judson, Horace Freeland, O oitavo dia da criação: os criadores da revolução na biologia. Simon and Schuster, New York, 1979]. Francis Crick, em uma entrevista em 2003, disse que seu desgosto pela religião foi um de seus principais motivos no trabalho que levou à sensacional descoberta de 1953. & # 8220A hipótese de deus está bastante desacreditada & # 8221 disse Crick. [Telegraph (Londres), 20 de março de 2003]

O problema é que as substituições de novas proteínas que ocorrem ao longo do tempo na escada de nucleotídeos que compreendem os genes nunca foram capazes de demonstrar a produção de uma nova espécie. As alterações no DNA descrevem características e variações naturais, como a coloração das asas das borboletas ou as diferenças nos bicos dos pássaros observadas por Charles Darwin durante sua estada nas Ilhas Galpagos em 1800. A genética mendeliana é freqüentemente retratada de forma inadequada como evidência da evolução darwiniana. Possivelmente, biólogos sintéticos esperam provar que podem criar vida e demonstrar de forma conclusiva a evolução pela primeira vez.

Relembrando o experimento Miller / Urey

O objetivo da biologia sintética & # 8217s de & # 8220 criar vida & # 8221 remonta ao experimento de laboratório de Stanley L. Miller e Harold C. Urey em 1953 na Universidade de Chicago. Miller e Urey tentaram criar os blocos de construção da vida, aminoácidos, a partir de uma mistura de gases (amônia, metano, hidrogênio) e água, estimulados por uma corrente elétrica que simulava raios atmosféricos, todos considerados comuns na Terra primitiva. Seu experimento, para recriar os blocos de construção da vida & # 8217s a partir de uma & # 8220 sopa primordial & # 8221, foi um fracasso e é frequentemente considerado mitologia científica, já que mesmo que compostos orgânicos pudessem ser criados e formas de vida real emanassem, um alto teor de metano- ambiente de amônia teria matado qualquer matéria viva. [Science 31 de julho de 130: 245 & mdash512, 1959] No entanto, a Universidade de Chicago celebrou o 50º aniversário do experimento Miller / Urey em 2003. Estranhamente, a biologia moderna nunca repetiu o experimento Miller / Urey para verificar suas conclusões.

Um tipo diferente de playground genético

Existe uma diferença entre engenharia genética e biologia sintética. O primeiro envolve a inserção de genes existentes em outra espécie. Por exemplo, peixes que brilham no escuro foram criados pela inserção de um gene que produz uma substância química fluorescente em sua pele.

O que os biólogos sintéticos propõem é criar novos genomas a partir de um conjunto de partes genéticas. Eles querem criar genes que ainda não existem na natureza e não podem ter certeza de como funcionarão até implantá-los em sistemas vivos.

Por enquanto, os biólogos sintéticos estão limitados a redesenhar organismos com genomas pequenos, como o Mycoplasma genitalium, que possui o menor genoma bacteriano conhecido (482 genes codificadores de proteínas). Mas é aí que as coisas se tornam preocupantes.

A área mais fácil de manipulação biológica são os vírus. Essas são formas de vida extremamente pequenas e simples, feitas apenas de uma casca de proteína e um genoma. Um vírus se reproduz inserindo seu genoma nas células de outras formas de vida. À medida que essas células se duplicam, o mesmo ocorre com o vírus. Por exemplo, cientistas dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças sintetizaram o vírus da gripe espanhola, responsável pela pandemia de gripe de 1918. Eles foram capazes de alterar seu genoma e torná-lo 39.000 vezes mais virulento do que qualquer outro vírus da gripe! [Science (T. M. Tumpey et al.) 310, 77 & mdash80 2005] E se este vírus escapar do laboratório?

A biologia sintética é como projetar uma arma que disparará em direções desconhecidas. Jonathan B. Tucker e Raymond A. Zilinskas, escrevendo em New Atlantis, afirmam que os sistemas de bioengenharia permanecem & # 8220 ruidosos & # 8221 ou seja, imprevisíveis. Eles citam Drew Endy, do MIT, que afirma que a biologia sintética ainda é incapaz de prever com precisão como um novo circuito genético se comportará dentro de uma célula viva. Os biólogos sintéticos propõem criar formas de vida de novo, isto é, pela primeira vez. Não existe um modelo animal onde esses novos sistemas biológicos possam ser testados que possam prever como eles se comportariam em humanos.

Público mais preocupado com cientistas de laboratório do que com terroristas biológicos

Markus Schmidt, da Áustria, escrevendo na Nature Magazine, diz que o público tem mais medo de que as formas de vida potencialmente problemáticas sejam acidentalmente liberadas dos laboratórios do que que algum terrorista biológico as liberte para propósitos nefastos. [Nature 441: 29 de junho de 2006]

A aplicação incorreta mais provável da biologia sintética envolve a recriação de vírus patogênicos conhecidos em laboratório. Esses vírus podem ser um problema, mesmo se uma pessoa for geneticamente resistente e tiver sido imunizada recentemente.

Os vírus escaparam de laboratórios de alta biossegurança. Em 2003, um vírus SARS escapou acidentalmente de um laboratório de biossegurança de nível 3 em Cingapura e, em 2004, outras duas fugas ocorreram de tais laboratórios em Pequim. [Nature 437, 794 & mdash795 & mdash 6 de outubro de 2005]

O recente ataque de antraz por entrega postal foi rastreado geneticamente a uma cepa desenvolvida em um laboratório militar no Instituto de Pesquisa Médica para Doenças Infecciosas do Exército dos EUA em Fort Detrick (USAMRIID), Maryland. [Serviço de notícias New Scientist, 9 de maio de 2002] A investigação parou por aí e não prosseguiu.

Nature Magazine diz & # 8220a capacidade das sociedades humanas de modificar e transformar sistemas biológicos aumentará mais neste século do que nos cem séculos desde o início da agricultura. & # 8221 [Nature 441, 25 de maio de 2006] Quais são os chances de um vírus letal escapar? É um pesadelo imaginário suficiente para alguns biólogos exigirem que todos esses experimentos sejam abandonados. Por que arriscar, eles perguntam?

Culpe os biohackers

Quem está pensando em usar biologia sintética & mdash os & # 8220 mocinhos & # 8221 ou & # 8220 caras malvados? & # 8221 Bem, & # 8217 não é tão fácil estereotipar terroristas biológicos como sendo da Al Qaeda. As notícias já querem culpar qualquer lançamento futuro de formas de vida sintéticas em & # 8220biohackers, & # 8221 quem quer que seja. [EE Times: Especialistas temem que a biologia sintética possa gerar biohackers, 29 de junho de 2006] Na verdade, como afirmado anteriormente, as novas formas de vida da biologia sintética e # 8217s poderiam encontrar seu caminho fora do laboratório, não por intenção, mas por engano.

Um artigo da Arms Control Today diz: & # 8220Células sintéticas vivas provavelmente serão feitas na próxima década, patógenos sintéticos mais eficazes do que patógenos naturais selvagens ou geneticamente modificados serão possíveis algum tempo depois & # 8230 Esses patógenos celulares sintéticos poderiam ser projetados para serem contagiosos ou letal ou incapacitante. & # 8221 [Nova Atlântida, primavera de 2006] Observe que esta declaração provém de uma revista militar, falando sobre guerra biológica, não de um jornal científico que fala sobre a genética sendo usada para melhorar a vida humana. Os potenciais aspectos negativos e prejudiciais da engenharia genética superam em muito qualquer benefício imaginado. Centenas de descobertas genéticas que beneficiariam a humanidade poderiam ser negadas por um deslize em um laboratório.

O projeto de demonstração inicial

A fim de introduzir a biologia sintética e obter a aprovação pública, o projeto inicial apresentado é desenvolver uma forma sintética de artemisinina, uma molécula produzida pela planta absinto que cresce naturalmente no sudeste da Ásia. Embora a artemisinina seja um remédio muito barato para a malária, os biólogos sintéticos afirmam que ainda é caro (custo estimado em US $ 1 bilhão para abastecer 70% das vítimas da malária em todo o mundo), então eles querem fazê-lo sinteticamente.

A Fundação Bill & amp Melinda Gates liberou uma doação de US $ 42,5 milhões para a produção de artemisinina sintética. Mas esta não é a verdadeira biologia sintética. Eles estariam criando a mesma molécula. É uma maneira secreta de obter aceitação pública para as coisas que estão sob a bandeira da biologia sintética. Além disso, a Fundação Bill & amp Melinda Gates está mais parecendo uma frente sem fins lucrativos para pesquisa e desenvolvimento de vacinas e medicamentos que eventualmente farão bilhões de dólares em escala mundial.

Considere dois cursos de biologia sintética. Uma delas é a atual agenda predominante para limitar o tamanho das populações humanas. Outra é o prolongamento da vida.

Vamos considerar o segundo uso da biologia sintética primeiro & mdash para prolongar a expectativa de vida humana. Uma maneira de os biólogos fazerem isso é reinserir em óvulos fertilizados humanos (ovos) a sequência do gene para a síntese de uma enzima chamada gulonolactona oxidase (GLO), de modo que a descendência humana possa sintetizar continuamente a vitamina C como a maioria dos outros mamíferos.

Isso deveria ser uma prioridade entre os biólogos, já que os humanos carregam um gene disfuncional para essa enzima, que desativa a síntese da vitamina C no fígado, tornando os humanos totalmente dependentes de doses insignificantes de vitamina C na dieta para prevenir o escorbuto. Surpreendentemente, há apenas 142 relatórios publicados sobre GLO no amplo e crescente banco de dados da National Library of Medicine. Os biólogos demonstraram pouco interesse neste tópico.

Os seres humanos foram descritos como uma espécie mutante devido à sua incapacidade de produzir vitamina C. A maioria dos mamíferos tem o gene intacto para a síntese de GLO e produzem quantidades diárias generosas do metabólito ascorbato do fígado (vitamina C), cerca de 20 miligramas por libra de peso corporal ( equivalente a 3.200 miligramas para um ser humano de 70 quilos / 160 libras).A restauração desse hormônio / vitamina ausente foi proposta por Irwin Stone na década de 1970 para criar & # 8220 uma subespécie humana nova e mais robusta, de vida mais longa e resistente. & # 8221 [Medical Hypotheses 5: 711 & mdash21, 1979]

Quatro enzimas são necessárias para a conversão do açúcar no sangue em ascorbato (vitamina C). Há muito tempo, na história da humanidade, o gene que controla a quarta enzima, a gulonolactona oxidase, caiu em ruínas. A injeção da enzima GLO em cobaias, que sofrem as mesmas dificuldades que os humanos e não podem sintetizar ascorbato, produz vitamina C. [Nutrition Reviews 1982 Out 40 (10): 310 & mdash1] Os efeitos dessa mutação e da deficiência de vitamina não são apenas limitados a sintomas de escorbuto evidente (sangramento nas gengivas, dores nas articulações, fadiga, cicatrização deficiente de feridas). Por exemplo, sem o fornecimento de vitamina C suplementar,

800 miligramas de equivalente humano em uma cobaia, esse animal invariavelmente desenvolverá doenças cardiovasculares e morrerá prematuramente.

Toda a estrutura do gene GLO humano, que é semelhante em estrutura e origem a um gene em outra espécie, foi divulgada por uma pesquisa auxiliada por computador. Os geneticistas da Universidade de Wakayama, no Japão, sabem como corrigir esse erro genético.

Aqui está a descrição do problema:

Apenas cinco exons (a proteína que codifica a sequência de DNA de um gene), em comparação com 12 exons que constituem o gene funcional GLO de rato, permanecem no genoma humano. Uma comparação desses exons com aqueles de suas contrapartes funcionais em ratos mostra que existem duas deleções de nucleotídeo único (um nucleotídeo é uma subunidade de DNA como adenina, guanina, timina ou citosina), uma deleção de nucleotídeo tripla e uma inserção de nucleotídeo único na sequência humana. Quando comparada em termos de códons (uma sequência específica de três bases de DNA em um gene), a sequência humana tem uma deleção de um único aminoácido, dois códons de parada e dois códons aberrantes sem um nucleotídeo, além de muitas substituições de aminoácidos. [Journal Nutrition Science Vitaminology 49: 315 & mdash19, 2003]

Além disso, pesquisadores da Universidade de Kyoto no Japão inseriram com sucesso o gene GLO ausente ou disfuncional em ovos fertilizados de peixes medaka com tendência ao escorbuto, produzindo descendentes que podem sintetizar vitamina C. [Biochemical Biophysical Research Communications 223: 650 & mdash53, 1996]

Então, por que não há prioridade entre os biólogos sintéticos para restaurar a principal falha biológica humana que tem atormentado a humanidade por séculos? A falta de entusiasmo expresso pela reinserção de um gene GLO funcional no genoma humano permanece inexplicada. Talvez seja porque a perda do gene GLO não se encaixa nas teorias darwinianas preconcebidas de que a humanidade evoluiu progressivamente de espécies inferiores. Essa mutação genética teria tornado o Homo sapiens menos capaz de sobreviver. Quem realmente sabe por que essa preocupação principal não teve precedência nas fileiras dos biólogos sintéticos? Acredita-se que a restauração do gene GLO prolongaria a vida humana por muitas décadas além da expectativa de vida atual. Possivelmente, a agenda prevalecente para controlar o tamanho da população humana mundial & # 8217 explicaria a ausência de um projeto de inserção do gene GLO nas pranchetas dos biólogos.

Curso No. 2 para biologia sintética

Agora pondere como a biologia sintética poderia ser empregada para abordar a agenda de controle populacional. O desenvolvimento & # 8220 acidental & # 8221 de um vírus mortal que escapa de um laboratório é um cenário que vem à mente. Foi dito que a natureza já manteve o tamanho das populações humanas sob controle, desencadeando pragas periodicamente, e que as doenças antigas precisam ser reintroduzidas, de acordo com a teoria darwiniana de & # 8220survival of the fittest. & # 8221 É interessante notar que, uma vez que os humanos adquiriram o conhecimento de como manipular o genoma de germes patogênicos, ouvimos falar de retrovírus e vírus mutantes que podem varrer a Terra e potencialmente matar milhões, talvez bilhões. Não há mutação natural que explique por que os vírus estão saltando dos animais para os humanos pela primeira vez na história.

Esforços secretos de controle da população já em andamento

Enormes esforços abertos para controlar o tamanho da população mundial estão em andamento, que incluem controle de natalidade, adiamento do casamento, aceitação do casamento gay, limitação do tamanho da família, aborto, maior independência das mulheres, etc. No entanto, há suspeitas de que esforços encobertos para controlar a população tamanho já estão em andamento. Por que as clínicas de fertilidade abundam hoje, quando não eram necessárias décadas atrás?

Por exemplo, a recente descoberta de que a redução do colesterol não melhora significativamente a expectativa de vida faz com que se pergunte por que o controle do colesterol é uma agenda pública tão amplamente promovida. [Journal Hypertension 23: 1803 & mdash8, 2005] Pode surpreendê-lo saber que um relatório no Journal of the Pharmaceutical Society of Japan apela ao abandono da teoria do colesterol nas doenças cardíacas. [Journal Pharmaceutical Society Japan -YAKUGAKU ZASSHI, Volume 125 (11), páginas 833 e mdash852, 2005]

A gordura dietética e o colesterol são precursores da síntese de estrogênio e testosterona, hormônios sexuais necessários para a fertilidade e virilidade. Camundongos fêmeas com formas alteradas de colesterol HDL são inférteis. [Journal Clinical Investigation 2001 Dec 108 (11): 1717 & mdash22] A redução do colesterol pode diminuir os níveis hormonais. O programa público de controle do colesterol, mesmo entre jovens adultos férteis com baixo risco de doenças cardiovasculares, é apenas um programa oculto de controle populacional?

O esforço para inserir flúor no abastecimento público de água potável também pode ser um método secreto de controle populacional.

O fato de que especialistas confiáveis ​​expressaram suas objeções científicas à fluoretação, que as nações europeias proíbem a fluoretação do abastecimento de água e o fato de que as pessoas que cresceram com água fluoretada têm, em média, apenas 1/2 de um enchimento a menos por vida do que as pessoas que não bebem água fluoretada [Chemical and Engineering News, 8 de maio de 1989], faz com que se pergunte, por que os EUA fluoretam o abastecimento de água potável? Objeções científicas à fluoretação por David R. Hill, Professor Emérito, The University of Calgary, Alberta, Canadá, e Robert J. Carton, PhD, ex-cientista da EPA, podem ser vistas online.

Uma única microdose de flúor injetada em ratos albinos machos adultos causa a interrupção da produção de espermatozoides e a ausência de espermatozoides nos testículos. [Reproductive Toxicology 1991 5 (6): 505 & mdash12] No entanto, os índices de acasalamento, fertilidade e sobrevivência de roedores não são afetados por altos níveis de flúor na água potável. [Food Chemistry Toxicology 2001 Jun 39 (6): 601 & mdash13] Mas os roedores sintetizam sua própria vitamina C como um hormônio que os humanos não fazem e, portanto, têm proteção natural contra os efeitos deletérios do flúor. O fornecimento de vitamina C suplementar reverte os efeitos adversos do flúor nos espermatozoides masculinos. [International Journal Fertility Menopausal Studies 1994 Nov-Dez 39 (6): 337 & mdash46]

Esforços secretos de controle populacional podem explicar o esforço atual para limitar a dosagem de vitaminas em suplementos dietéticos (CODEX-Organização Mundial da Saúde). Níveis reduzidos de vitamina C prejudicam a produção de esperma em humanos do sexo masculino. [West African Journal Medicine 2004 Out-Dec 23 (4): 290 & mdash3] Suplementos vitamínicos prolongam o período de fertilidade em animais. [British Poultry Science 2005 Jun 46 (3): 366 & mdash73] Limitações na dosagem de vitaminas em suplementos alimentares podem afetar adversamente as taxas de fertilidade em populações humanas.

A biologia sintética seria similarmente empregada em tentativas secretas de controlar o tamanho das populações humanas?

Para muitas pessoas, a ideia de criar vida em laboratório parece ficção científica. No entanto, alguns cientistas sintéticos agora afirmam que estão prestes a fazer isso. Suponha por um momento que, no interesse da ciência básica, os biólogos sintéticos desejam apenas testar hipóteses para confirmar a teoria da evolução darwiniana. Isso parece bastante inocente. No entanto, mesmo que os biólogos sintéticos possam criar um novo vírus de novo, ou seja, do zero, isso ainda não cria uma forma de vida complexa nem explica como os aminoácidos (proteínas) vieram a ser formados ou organizados no DNA.

Paul Davies é um professor visitante do Imperial College Life, descreveu o desafio em uma edição de 2002 do Guardian (Reino Unido). Davies diz que a vida, como a conhecemos agora, não é uma questão mágica. Não é algo que possa ser incubado em laboratórios de química. & # 8220Ele não pode ser evocado infundindo matéria com energia, como um raio de eletricidade, & agrave la Dr Frankenstein. & # 8221 Nenhuma força vital pode ser adicionada às moléculas para criar vida.

O Professor Davies explica desta forma:

& # 8220 Em vez disso, a célula viva é mais bem vista como um supercomputador & mdash, um sistema de processamento e replicação de informações de complexidade surpreendente. O DNA não é uma molécula especial que dá vida, mas um banco de dados genético que transmite suas informações por meio de um código matemático. A maior parte do funcionamento da célula é melhor descrita, não em termos de material & mdash hardware & mdash, mas como informação ou software. Tentar ganhar vida misturando produtos químicos em um tubo de ensaio é como soldar interruptores e fios na tentativa de produzir o Windows 98. Não funcionará porque aborda o problema no nível conceitual errado. & # 8221

Bill Gates, fundador da Microsoft, comentou que & # 8220DNA é como um programa de software, só que muito mais complexo do que qualquer coisa que & # 8217 já concebemos. & # 8221

Em 2002, Craig Venter, um pioneiro envolvido no projeto do genoma humano, anunciou sua intenção de criar uma nova forma de vida. Venter planeja desmontar e reconstruir o genoma do Mycoplasma genitalium, um micróbio primitivo que habita o trato genital.

O professor Davies sugere que não prendamos a respiração por causa disso. Ele diz:

& # 8220Mas isso não está tornando a vida, tanto quanto reorganizá-la. Mesmo uma simples bactéria é um vasto conjunto de moléculas elaboradamente elaboradas, muitas delas elaboradamente customizadas. Embora essas moléculas especializadas não sejam vivas, são produtos de seres vivos. Os cientistas fazem uso deles em seus remendos microbianos. Em outras palavras, eles usam os produtos de organismos vivos para refazer organismos vivos. Eles ainda estão longe de serem capazes de montar uma célula viva a partir do zero. & # 8221

Davies termina seu artigo perguntando: & # 8220Como a natureza fabricou o primeiro processador digital de informações do mundo & # 8217 & tirou a célula viva original do caos cego de moléculas desordenadas? Como o hardware molecular conseguiu escrever seu próprio software? & # 8221


Reconhecimentos

Os autores pedem desculpas aos colegas pelo trabalho que eles não puderam citar devido a limitações de espaço. Eles agradecem a H. Wang pelos comentários críticos sobre o manuscrito. Pesquisa de biologia sintética no laboratório de M.F. é apoiado pelo European Research Council (ERC ProNet advanced grant no. 321381) e pelo Centro Nacional Suíço de Competência em Pesquisa (NCCR) Molecular Systems Engineering.

Informação do revisor

Nature Reviews Molecular Cell Biology agradece J. Collins, P. Silver e o (s) outro (s) revisor (es) anônimo (s) por sua contribuição para a revisão por pares deste trabalho.


Inserção de sequência de DNA sintético - Biologia

SAN DIEGO - 27 de abril de 2021 - Codex DNA, Inc., criadores do sistema BioXp ™, um instrumento de bancada totalmente automatizado que permite inúmeros fluxos de trabalho de biologia sintética, anunciou hoje o lançamento de um fluxo de trabalho de mRNA para a estação de trabalho BioXp ™ que permite aos cientistas gerar mRNA sintético de uma sequência de DNA em uma única corrida durante a noite.

A construção de mRNA emergiu como um sistema altamente atrativo para o desenvolvimento tanto de terapêuticas quanto de vacinas, com centenas desses projetos atualmente em vários estágios de desenvolvimento. No entanto, as etapas necessárias para construir mRNA são numerosas, demoradas e muitas vezes repletas de dificuldades. As opções atuais para a síntese de mRNA rápida e em pequena escala necessária nesses projetos provaram ser um grande gargalo, levando dias, semanas ou meses para serem concluídas. O novo kit de síntese de mRNA de pequena escala BioXp ™ do Codex DNA ajuda a aliviar muitos desses gargalos, pois contém todos os reagentes Gibson Assembly ™ necessários para fazer microgramas de mRNA sintético biologicamente ativo usando fragmentos de genes corrigidos de erros sintetizados de novo (modelo de mRNA) em uma única corrida durante a noite.

“O objetivo da nossa pesquisa é desenvolver novos mRNA terapêuticos para doenças genéticas raras. Estamos empenhados em fazê-lo de forma rápida e eficaz, no entanto, somos limitados pela grande quantidade de tempo que leva desde a concepção até a avaliação da nova terapêutica. Acreditamos que a solução do Codex DNA diminuirá muito esse tempo, ajudando-nos a conquistar nosso objetivo de fornecer terapias que mudam vidas rapidamente. ” disse Boris Resnick, Cientista II, Terapia e Pesquisa de mRNA da Ultragenyx.

“Vacinas de mRNA e terapêuticas demonstraram benefícios para pacientes com uma ampla gama de doenças, incluindo várias doenças infecciosas como COVID-19, e até mesmo câncer”, disse Todd R. Nelson, PhD, CEO da Codex DNA. “Oferecer um fluxo de trabalho para sintetizar mRNA no sistema BioXp ™ reduz significativamente o tempo de resposta de dias ou semanas para uma execução noturna e aumenta o rendimento e a escala, trazendo uma nova esperança para resolver as limitações atuais das opções preventivas e terapêuticas disponíveis hoje.”

Esta solução foi projetada para oferecer os seguintes benefícios:

  • Síntese sob demanda de mRNA biologicamente ativo personalizado pronto para uso direto em fluxos de trabalho downstream
  • Flexibilidade de formato em aplicações de DNA e mRNA
  • Fluxo de trabalho guiado por mRNA mais rápido e escalonável
  • Capacidade de construir genes, mRNA e clones em uma ampla gama de tamanhos e complexidade
  • Otimizado para velocidade, previsibilidade e reprodutibilidade do processo de design-construção-teste de biologia sintética

A Codex DNA desenvolveu sistemas BioXp ™, incluindo o sistema BioXp ™ 3250 atual, kits BioXp ™ para gerar uma ampla gama de formatos de DNA e mRNA sintéticos e reagentes de bancada que complementam os aplicativos e soluções de fluxo de trabalho automatizado de biologia sintética.

Sobre Codex DNA
Criadores do sistema BioXp ™, uma plataforma de biologia sintética totalmente automatizada com as mãos livres e a metodologia Gibson Assembly® padrão da indústria, o Codex DNA capacita os pesquisadores com as ferramentas de que precisam para projetar, codificar e sintetizar DNA de forma rápida e segura. O Codex DNA está acelerando os avanços nos campos da medicina personalizada, engenharia de anticorpos, desenvolvimento de vacinas, descoberta de medicamentos e armazenamento de DNA.


Métodos de inserção de DNA direcionado em plantas

Nesta seção, fornecemos uma visão geral histórica dos métodos de inserção de DNA direcionado em plantas e alguns exemplos para cada método. Para uma lista mais abrangente dos relatórios publicados de inserção de DNA direcionado em plantas, recomendamos aos leitores Apêndice SI, Tabela S1.

Recombinação homóloga sem auxílio.

Pesquisas pioneiras na década de 1980 em células de mamíferos demonstraram que o DNA exógeno pode ser direcionado a locais específicos dentro do genoma do hospedeiro em baixa frequência por meio de recombinação homóloga (HR) (12 ⇓ ⇓ –15). Essas descobertas inspiraram a primeira demonstração de inserção de DNA direcionada na planta modelo de tabaco por Paszkowski et al., Em 1988 (16). Os pesquisadores isolaram protoplastos (Quadro 1) de linhagens de tabaco carregando um gene marcador selecionável parcialmente excluído e eletroporaram esses protoplastos com DNA que codifica o gene marcador carregando uma exclusão diferente (16). Como as duas deleções não se sobrepõem, a HR entre o DNA genômico e o DNA do doador restaurou a função do gene marcador (16). A eficiência estimada de HR neste estudo foi de 0,5 a 4,2 × 10 −4 (16), que foi comparável à frequência de HR relatada em células de mamíferos na mesma época (15, 17). Estudos semelhantes em tabaco e Arabidopsis inserção de DNA direcionada baseada em HR documentada com eficiências semelhantes (18 ⇓ ⇓ –21).

Os pesquisadores relataram que as estratégias de inserção de DNA direcionadas baseadas em RH geralmente resultam em eventos de RH inautênticos (21 ⇓ ⇓ –24). Para enriquecer os verdadeiros eventos de inserção direcionados mediados por HR, dois tipos de sistemas de seleção positivo-negativo foram estabelecidos. No primeiro sistema, Risseeuw et al. gerou plantas de tabaco receptoras carregando o gene marcador selecionável negativo codA, que codifica uma citosina desaminase e confere letalidade na presença do composto químico 5-fluorocitosina (25). Os pesquisadores eletroporaram protoplastos derivados dessas plantas receptoras com um plasmídeo para induzir HR da maneira desejada, que inseriria um gene marcador de resistência à canamicina e simultaneamente interromperia codA (25). Ao aplicar canamicina e 5-fluorocitosina ao mesmo tempo, a eficiência da inserção direcionada foi aumentada para 5,7 × 10-3 (25). No entanto, porque este sistema de seleção positivo-negativo dependia da presença do codA gene no local alvo, não é aplicável a outros alvos genômicos. Em um segundo sistema desenvolvido por Terada et al., Em 2002, um plasmídeo de seleção dupla carrega um gene marcador selecionável positivo (Caixa 1) flanqueado por uma sequência homóloga ao alvo genômico e um gene da toxina diftérica fora da região homóloga como um marcador negativo conferindo letalidade (26). O HR desejado resultaria na inserção direcionada de apenas o gene do marcador selecionável positivo, enquanto a integração aleatória do DNA entregue no genoma do hospedeiro resultaria na inserção de ambos os marcadores selecionáveis ​​positivos e negativos (26). Esta abordagem foi usada para gerar mutantes de inserção em dois loci em arroz com 1 a 2% de eficiência (26, 27).

A superexpressão de genes conhecidos por aumentar a HR também pode promover a inserção de DNA direcionado de alta eficiência em plantas. Por exemplo, em 2005, Shaked et al. relataram que a expressão constitutiva do gene de remodelação da cromatina promotora de HR de levedura Sensível à radiação 54 (ScRAD54) no Arabidopsis aumentou a eficiência da inserção de DNA direcionado em uma a duas ordens de magnitude sem alterar os fenótipos (28). Notavelmente, a inserção continha um gene de proteína fluorescente verde sem promotor (GFP) sem qualquer gene marcador selecionável, o que sugere que qualquer sequência de nucleotídeos pode ser usada como a inserção neste método (28).

Por causa da baixa frequência de HR intrínseca, a maioria dos métodos iniciais de inserção de DNA direcionado que dependia exclusivamente desse processo intrínseco eram ineficientes e não podem ser amplamente aplicados em plantas. Para superar a ineficiência, outros métodos foram desenvolvidos posteriormente, os quais são descritos nas seções a seguir.

Métodos Baseados em Recombinase.

Recombinases reconhecem sequências de nucleotídeos específicas conhecidas como sítios de recombinação e ativam a troca de DNA (29). O posicionamento relativo dos dois locais de recombinação determina o resultado da recombinação (Apêndice SI, Fig. S1UMA) Quando os locais de recombinação correspondentes estão presentes no alvo genômico e no DNA doador que transporta a sequência de nucleotídeos a ser inserida, a recombinase correspondente pode catalisar a inserção direcionada do DNA doador no alvo genômico (Apêndice SI, FIG.S1 B e C) No início da década de 1990, vários sistemas de recombinase foram desenvolvidos para inserção de genes específicos do local (30), como o bacteriófago Cre-Salmão defumado sistema (31), o alvo de reconhecimento de flipase-flipase de levedura (FLP-FRT) sistema (32), e o local de recombinação de recombinase de levedura (R-RS) sistema (33). Eles foram explorados por cientistas de plantas para integrar fragmentos de DNA em alvos genômicos definidos com locais de recombinação apropriados.

Como essas reações de recombinação são reversíveis na presença da recombinase, o DNA inserido pode ser excisado do alvo genômico (34) (Apêndice SI, Fig. S1UMA) Isso cria um desafio para o uso de sistemas de recombinase para integração estável de DNA no alvo. Em 1995, Albert et al. modificou o Cre-Salmão defumado sistema para prevenir eficazmente a reversão da inserção de DNA catalisada por recombinase em plantas de tabaco (35). Primeiro, as sequências de nucleotídeos de Salmão defumado os locais foram alterados para que a reação de recombinação favoreça fortemente uma direção (35). Em segundo lugar, eles desenvolveram estratégias nas quais a quantidade de Cre recombinase é reduzida após a inserção de DNA pretendida (35). Com essas melhorias, uma alta proporção de plantas de tabaco regeneradas carregava uma inserção de cópia única no alvo genômico designado (35). Exemplos adicionais de inserção de gene direcionado que levam à restauração de um gene marcador usando sistemas de recombinase foram relatados no tabaco (6, 36), Arabidopsis (37 ⇓ -39), soja (40), arroz (41, 42) e milho (43). Esses estudos demonstraram que os sistemas de recombinase podem ser usados ​​para induzir a inserção de genes direcionados em diversas espécies de plantas.

Foram feitas melhorias adicionais na inserção de genes direcionados à base de recombinase em plantas. Os sistemas de seleção positivo-negativo têm sido empregados em métodos de inserção de genes baseados em recombinase para enriquecer os eventos de inserção no alvo. Por exemplo, o gene de biossíntese de citocinina isopentil transferase (ipt) ou o gene da citosina desaminase codA têm sido utilizados como genes marcadores selecionáveis ​​negativos porque codificam proteínas que matam o tecido da planta sob as condições seletivas adequadas (36, 38). Nessas configurações experimentais, a inserção indesejada do plasmídeo doador em locais genômicos aleatórios introduziria o gene marcador negativo no genoma da planta e aboliria a célula hospedeira (36, 38). Além de adotar um sistema de seleção positivo-negativo, Nanto et al. em 2005, também colocou locais de recombinação especiais no DNA do doador que promovem a excisão e remoção do doador integrado aleatoriamente, mas não a inserção de DNA no alvo (36). Com essas melhorias, a eficiência geral da segmentação atingiu 3% (36). Além disso, as melhorias nas técnicas de transformação de plantas também aumentaram a eficiência geral da inserção de genes direcionados à base de recombinase. Por exemplo, Anand et al. em 2019 aplicou um FLP- otimizadoFRT sistema e o Wus2-Bbm método de transformação de milho (44), alcançando a inserção de DNA alvo com uma eficiência de 7% no milho (43).

Os métodos de inserção de genes baseados em recombinases podem ser eficientes, mas invariavelmente dependem da disponibilidade de linhas receptoras que transportam locais de recombinação pré-integrados. Os alvos genômicos disponíveis para inserção de DNA são, portanto, limitados. Esta limitação pode ser superada usando ferramentas de inserção de genes mais recentes (discutidas abaixo) para colocar locais de recombinação em uma ampla gama de locais genômicos como bases de aterrissagem para inserção de DNA direcionada adicional usando métodos baseados em recombinase (45).

Métodos baseados em reparo de DNA.

A modificação do genoma em um determinado alvo pode ser introduzida em frequências relativamente altas durante o reparo de quebras de fita dupla de DNA (DSBs) (46). Os mecanismos celulares para reparar os DSBs podem ser classificados, grosso modo, em união de extremidades (EJ) e HR (47, 48). A via EJ é ainda dividida em junção de extremidade não homóloga (NHEJ) e junção de extremidade mediada por microhomologia (MMEJ, também conhecida como EJ alternativa) (47). Durante o NHEJ, as duas extremidades quebradas são reunidas diretamente, às vezes acompanhadas por modificações de sequência nas extremidades da junção, principalmente na forma de pequenas inserções ou deleções (49). Ao contrário do NHEJ, o MMEJ envolve o alinhamento de sequências de microhomologia (geralmente menos de 16 nucleotídeos [nt] de comprimento) presentes em ambas as extremidades do DNA antes da união e geralmente resulta na deleção da sequência de nucleotídeos entre as duas microhomologias (50). Em contraste, a via de reparo de HR é geralmente considerada livre de erros e requer homologia mais longa (geralmente & gt20 nt) em ambas as extremidades do DNA (47). HR é raro em comparação com EJ, especialmente em células somáticas de plantas (51, 52). NHEJ é amplamente considerado como a via de reparo mais prevalente em plantas. NHEJ, MMEJ e HR foram todos explorados com sucesso para a inserção de DNA direcionada de rotina (Apêndice SI, Fig. S2) em células de mamíferos (53, 54). Em plantas, a maioria dos exemplos relatados de inserção de genes direcionados por meio de reparo de DNA baseou-se no HR. Houve apenas alguns exemplos de inserção de genes direcionados em plantas por meio de NHEJ. Discutiremos exemplos associados a ambas as vias de reparo neste artigo. Notavelmente, um estudo recente em arroz sugere que as eficiências de deleção de sequência resultante de MMEJ e NHEJ são comparáveis, com a eficiência de MMEJ amplamente influenciada pela disponibilidade de microhomologias perto do DSB (55). Isso indica que o MMEJ tem potencial para ser explorado para a inserção de genes direcionados em plantas no futuro.

A geração de DSBs em alvos genômicos definidos é crucial para a inserção eficiente de DNA nesses locais. Nucleases dirigidas ao local (SDNs) são enzimas capazes de induzir DSBs em alvos genômicos com sequências de nucleotídeos específicas (51, 56). Nesta seção, destacamos exemplos de inserção de DNA direcionado em plantas alcançadas usando quatro plataformas SDN principais: meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativador transcricional (TALENs) e CRISPR-Cas. Não incluímos exemplos de substituição de sequência mediada por SDN em nossa discussão, para a qual os leitores são direcionados a duas análises abrangentes (51, 57).

Meganucleases.

As meganucleases (também conhecidas como endonucleases homing) são encontradas naturalmente em um grande número de organismos procarióticos e eucarióticos. Eles clivam seletivamente o DNA em alvos genômicos com sequências de nucleotídeos específicas de 14 pares de bases (pb) a 40 pb (58). A especificidade de segmentação relativamente alta os tornou candidatos promissores como ferramentas de engenharia de genoma na década de 1990.

Em 1993 e 1996, Puchta et al. demonstraram que DSBs gerados pela meganuclease de levedura I-SceI pode aumentar a frequência de HR em um locus específico em mais de duas ordens de magnitude nas células do tabaco (59, 60). No estudo de 1996, os pesquisadores estabeleceram um sistema de ensaio no tabaco em que a inserção de DNA direcionada por HR ativaria um gene marcador selecionável (60). Entrega codificada do DNA do doador com uma codificação de plasmídeo I-SceI, que reconheceu o alvo de inserção, aumentou a eficiência de HR de 10 −5 para mais de 10 −3 (60). Em um estudo subsequente das junções de reparo resultantes, Agrobacterium- Codificação de DNA entregue I-SceI foi encontrado para integrar ocasionalmente no alvo de clivagem genômica de I-SceI (61). Essa descoberta levou à aplicação de meganucleases para inserir Agrobacterium-DNA entregue em alvos designados no genoma da planta (62, 63). O uso de meganucleases para inserção de DNA direcionado também foi demonstrado em milho (64) e cevada (65) por meio do recurso à função de um gene marcador selecionável.

A confiança em um local existente no genoma que corresponda à especificidade da sequência da nuclease impõe restrições à aplicação de meganucleases para a inserção de genes direcionados em plantas. Devido a esta limitação, as meganucleases foram amplamente substituídas por novas ferramentas moleculares (discutidas abaixo).

ZFNs são nucleases quiméricas criadas pela fusão de um domínio de ligação de DNA e um domínio de clivagem de DNA não específico, tipicamente derivado da endonuclease FokI (66). O domínio de ligação ao DNA consiste em várias repetições de dedo de zinco, cada uma reconhecendo um tripleto de nucleotídeo distinto. Ao combinar várias repetições de dedo de zinco, o domínio de ligação ao DNA pode ser programado para reconhecer uma sequência de nucleotídeos específica de 9 a 18 bases (67). Porque o FokO domínio I só pode cortar o DNA quando dimerizado, um par de ZFNs que reconhece locais próximos são usados ​​para cortar o DNA no alvo genômico pretendido (68). Em comparação com as meganucleases, as ZFNs são SDNs mais flexíveis porque podem ser programadas para atingir qualquer localização genômica.

O uso de ZFNs na inserção de DNA direcionado em plantas foi demonstrado pela primeira vez em 2005 por Wright et al. no tabaco (69). Os pesquisadores codeliveram DNA que codifica um ZFN e um modelo de reparo de doador em células de tabaco para reparar um gene repórter defeituoso que havia sido previamente integrado ao genoma do tabaco (69). A clivagem no gene repórter defeituoso pelo ZFN aumentou HR entre o alvo e o molde de reparo, resultando na inserção de um fragmento de DNA de 600 pb, restaurando a função do gene repórter (69). Este estudo de prova de conceito mostrou que ZFNs podem ser usados ​​em plantas para induzir HR e inserção de DNA direcionada. Shukla et al. em 2009 usou ZFNs para inserir um gene de tolerância a herbicida dentro do gene metabólico do milho inositol-1,3,4,5,6-pentacisfosfato 2-quinase (IPK1), interrompendo sua função (70). Essa inserção direcionada conferiu tolerância ao herbicida e reduziu o acúmulo de fitato, um componente nas sementes que pode promover deficiências minerais em humanos ao prejudicar a absorção de ferro, zinco e cálcio (70).

Empilhar várias características em um único locus é frequentemente desejável porque reduz muito os esforços de reprodução. Para tanto, Ainley et al. em 2013, demonstrou o uso iterativo da inserção de genes direcionados mediada por ZFN por meio de HR em milho para empilhar vários genes marcadores em um único local (71). Construindo no mesmo sistema, Kumar et al. em 2015, desenvolveu um sistema que simultaneamente troca marcadores selecionáveis ​​e integra novos genes de características no milho, permitindo que genes de características não marcadores sejam empilhados (72). Uma estratégia semelhante de empilhamento de genes baseada em NHEJ pelo uso iterativo da inserção de genes direcionados mediada por ZFN também foi proposta no tabaco e Arabidopsis (73). Em outro esforço de empilhar genes em um alvo genômico designado em plantas, Bonawitz et al. em 2019, demonstrou a inserção direcionada de um fragmento de DNA de 16,2 kb carregando quatro transgenes no genoma da soja usando ZFNs (74).

Os ZFNs são altamente programáveis: os aminoácidos do domínio do dedo de zinco podem ser ajustados para uma variedade de alvos genômicos. Portanto, a aplicação de ZFNs não depende da criação de linhas de plantas receptoras carregando locais de destino pré-introduzidos. Repetições de dedo de zinco específicas foram desenvolvidas para a maioria dos trigêmeos de nucleotídeos (75). No entanto, a combinação modular dessas repetições para uma ZFN específica de sequência eficaz requer triagem laboriosa e otimização (75).

TALENs.

Como ZFNs, TALENs são enzimas de corte de DNA quiméricas resultantes da fusão de um domínio de ligação de DNA altamente modular e o FokDomínio de nuclease I (76, 77). O domínio de ligação ao DNA de um TALEN se origina dos efetores semelhantes ao ativador da transcrição (TAL) do patógeno da planta bacteriana Xanthomonas e consiste em até cerca de 30 repetições quase idênticas (78, 79). Dentro de cada repetição, dois aminoácidos variáveis ​​ditam o reconhecimento de uma base particular em uma sequência de DNA (80). Ao juntar várias repetições, um domínio de ligação ao DNA que reconhece um trecho específico de DNA é gerado (80). Um par de TALENs que reconhecem alvos genômicos nas proximidades pode levar à dimerização do FokI domínio de nuclease e induzir um DSB (76, 77). Os TALENs podem ser projetados para atingir virtualmente qualquer sequência de DNA de uma maneira relativamente simples (77), o que dá a essa tecnologia flexibilidade adicional em comparação com os ZFNs. Notavelmente, TALENs é a primeira técnica de edição de genoma usada para facilitar imunoterapias, desativando genes imunes que, de outra forma, fariam com que as células imunes infundidas atacassem o paciente (81). Dois bebês com leucemia foram tratados com sucesso com esta abordagem terapêutica (82), demonstrando a precisão dos TALENs na edição do genoma.

Em 2013, Voytas e colegas de trabalho relataram a inserção in-frame de uma proteína fluorescente amarela (YFP) gene repórter em um gene endógeno em protoplastos de tabaco por codelivering um plasmídeo que codifica TALENs e um plasmídeo modelo de reparo (83). Embora nenhuma fluorescência tenha sido observada quando o plasmídeo doador foi entregue sozinho, cerca de 14% das células tratadas com ambos os plasmídeos produziram a fluorescência, indicando a inserção de gene direcionado de alta eficiência por meio de HR (83). O mesmo grupo de pesquisa também usou TALENs em tomate para inserir um elemento constitutivo 35S promotor a montante do gene de síntese de antocianina ANT1, que levou ao acúmulo da antocianina do pigmento em plantas de tomate regeneradas (84). Neste estudo, as sequências de DNA que codificam os TALENs e o modelo de reparo foram colocados em um replicon viral, que aumenta no número de cópias quando entregue (84, 85). TALENs também foram usados ​​para demonstrar a inserção de genes direcionados em batata usando o método de entrega baseado em replicon viral, restaurando a atividade de um gene marcador selecionável ou um gene repórter (86). Apesar da exigência de engenharia de proteínas para cada alvo distinto, a tecnologia TALENs ainda é valiosa para a engenharia do genoma da planta por causa de sua programabilidade, eficiência e especificidade do alvo (87).

CRISPR-Cas.

A plataforma CRISPR-Cas se origina de um sistema imunológico adaptativo procariótico, que fornece proteção contra vírus invasores, cortando o ácido nucleico viral (88). Estabelecido pela primeira vez em 2012 como uma ferramenta molecular para cortar DNA com sequências de nucleotídeos específicas (89), o sistema CRISPR-Cas normalmente consiste em uma nuclease Cas e uma molécula de RNA guia, que direciona o Cas para gerar DSBs em alvos genômicos com um nucleotídeo definido sequência (90). Desde o relatório do protótipo de nuclease Cas Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) (91), numerosas nucleases Cas de ocorrência natural ou projetadas com várias características foram descobertas (92, 93). O reconhecimento do alvo por uma nuclease Cas é governado pelo emparelhamento de bases Watson-Crick entre a seção programável de um RNA guia e o alvo genômico (89). A especificidade de reconhecimento pode ser facilmente alterada modificando a região variável do RNA guia, o que torna o CRISPR-Cas uma ferramenta altamente programável. A tecnologia foi adotada em uma ampla gama de aplicações (94, 95), incluindo a inserção de genes direcionados em muitas espécies de plantas (96).

Em 2012, Puchta e colegas descreveram uma estratégia para a inserção de genes direcionados em Arabidopsis conhecido como in planta direcionamento de gene (IPGT) (97). Durante o IPGT, um SDN expresso transgenicamente corta simultaneamente o alvo de inserção pretendido no genoma do hospedeiro e um doador cromossômico transgênico, liberando o DNA do doador e causando sua inserção no alvo genômico pretendido (97). Em 2014, o mesmo grupo demonstrou o uso do CRISPR-Cas para IPGT em Arabidopsis inserindo um gene marcador selecionável em um locus endógeno (98). Neste estudo, os pesquisadores primeiro entregaram o gene CRISPR-Cas e o DNA do doador às plantas por Agrobacterium como um locus T-DNA transgênico para iniciar IPGT (98). Depois de identificar as plantas que carregam a inserção direcionada pretendida, o T-DNA original foi removido do genoma por meio de segregação genética (98). Com uma estratégia de entrega ligeiramente diferente, Zhao et al. em 2016 cotransformado Arabidopsis plantas com duas separadas Agrobacterium cepas, que carregavam a maquinaria CRISPR-Cas e o doador, respectivamente, e induziam IPGT causando a inserção de um gene repórter GFP em um locus endógeno (99). Embora a eficiência de inserção relatada fosse baixa (& lt1%), o DNA inserido no alvo pretendido não continha nenhum gene marcador selecionável, tornando a estratégia aplicável à inserção direcionada de virtualmente qualquer sequência de DNA (99). Para aumentar a eficiência da inserção direcionada de DNA livre de marcadores, Miki et al. em 2018 relatou o uso de uma abordagem de transformação sequencial em Arabidopsis para induzir IPGT (100). Na primeira rodada de transformação, uma linha de planta expressando de forma estável Cas9 foi gerado como a linha parental (100). Na segunda rodada de transformação, o T-DNA transportando o RNA guia e um doador GFP foi entregue ao Cas9-expressando linha parental por Agrobacterium para induzir IPGT (100). Com esse método, os pesquisadores aumentaram a frequência de inserção para 6 a 9% sem o uso de seleção química (100). As inserções de T-DNA podem ser posteriormente removidas das plantas que transportam a inserção de DNA desejada por meio de segregação genética.

A quantidade de DNA doador entregue afeta a eficiência da inserção direcionada. Usando um Agrobacterium-sistema de replicon viral fornecido (85) para enriquecer o DNA do doador pode aumentar a eficiência da inserção de genes direcionados mediada por CRISPR-Cas, conforme demonstrado em tomate (84, 101), batata (86), trigo (102, 103) e arroz (104). Alternativamente, o bombardeio de partículas, que entrega cópias maiores de moléculas de DNA às células vegetais do que Agrobacterium faz, foi empregada para codeliver o maquinário CRISPR-Cas e o modelo de reparo em tecidos vegetais. As inserções direcionadas de genes marcadores selecionáveis ​​por bombardeio de partículas foram alcançadas em milho (105), soja (106) e arroz (107).

A inserção direcionada de DNA livre de marcador foi relatada em arroz (108 ⇓ ⇓ -111) e milho (112) usando métodos de entrega baseados em bombardeio de partículas. Li et al. em 2016 aproveitou a via de reparo NHEJ relativamente mais eficiente para inserir um fragmento de DNA no íntron do gene do arroz endógeno EPSPS, que codifica a EPSP sintase, o alvo do herbicida comum glifosato (108). O DNA inserido alterou a sequência de aminoácidos do produto do gene, o que levou à tolerância ao herbicida no arroz (108). As mutações nas extremidades da junção imperfeita foram incorporadas nas regiões não traduzidas do íntron e, portanto, não afetariam a sequência de codificação da proteína (108). Em outro exemplo, nossa equipe explorou o mecanismo de reparo NHEJ para inserir um fragmento de DNA que codifica dois genes envolvidos na biossíntese de carotenóides em alvos genômicos de arroz específicos, que foram pré-avaliados por sua capacidade de acomodar mutações de grande evento sem alterar o desempenho da planta (109). Demonstramos a inserção direcionada deste cassete de biossíntese de carotenóides em dois alvos genômicos independentes e obtivemos arroz biofortificado sem penalidade de rendimento observável (109). Shi et al. em 2017 aplicou CRISPR-Cas para inserir um promotor ativo na frente de um gene endógeno de milho por HR para aumentar sua expressão (112). Aumento da expressão do gene alvo ARGOS8 levou a um rendimento de grãos significativamente melhorado em ambientes de estresse hídrico no campo (112). Recentemente, Lu et al. em 2020 demonstrou que a eficiência da inserção do gene mediada por NHEJ no arroz pode ser aumentada em uma ordem de magnitude quando o DNA doador linear carrega duas modificações químicas específicas em suas extremidades, incluindo fosforilação e ligações de fosforotioato (111).Os pesquisadores também desenvolveram uma estratégia de substituição de sequência baseada em reparo dirigido por homologia (HDR), baseada no método de inserção de genes de alta frequência (111). Notavelmente, os métodos relatados nesses estudos não dependem da seleção química da inserção de DNA. Em princípio, eles podem ser usados ​​para a inserção específica do local de qualquer sequência de DNA.


Quinta-feira, 22 de agosto de 2013

Derrubando o parasita causador da malária

Visar a capacidade do parasita da malária & # 8217s de produzir uma molécula contendo ferro, o heme, pode ajudar a criar uma vacina contra a doença e também levar a novas terapias medicamentosas para bloquear a infecção e a transmissão, de acordo com a pesquisa de uma equipe de cientistas indianos publicada recentemente em PLOS Pathogens.

No curso de seu complexo ciclo de vida, o parasita é capaz de acessar o heme quando infecta os glóbulos vermelhos e engole a hemoglobina que essas células contêm. A hemoglobina é a molécula que possibilita aos glóbulos vermelhos transportar oxigênio pelo corpo.

O trabalho realizado duas décadas atrás no laboratório G. Padmanabhan & # 8217s no Instituto Indiano de Ciência (IISc) em Bangalore levou à descoberta de que, no entanto, o parasita da malária humana também pode sintetizar heme. As enzimas envolvidas no complexo processo de várias etapas usado pelo parasita para fazer isso foram posteriormente trabalhadas.

Agora, experimentos realizados por uma equipe de cientistas do IISc e do Instituto Nacional de Pesquisa da Malária mostraram que ter a capacidade de sintetizar heme era & # 8220absolutamente essencial & # 8221 para o desenvolvimento do parasita & # 8217s em mosquitos, bem como nos estágios iniciais de infecção quando invade o fígado.

Quando o parasita unicelular consome a hemoglobina encontrada nas células vermelhas, as grandes quantidades de heme geradas como consequência são tóxicas para o organismo. Ele supera o problema transformando o heme em um pigmento insolúvel, o haemozoin. No entanto, o parasita precisa do heme para as proteínas que contêm ferro, conhecidas como citocromos, que são essenciais para sua própria produção de energia.

& # 8220A questão que surge é se o parasita depende da biossíntese de heme de novo ou heme da hemoglobina ou uma combinação de ambos para fazer citocromos mitocondriais, & # 8221 observou Viswanathan Arun Nagaraj, um Ramanujan Fellow no IISc, e seus colegas no papel.

Para ajudar a responder a essa pergunta, os cientistas recorreram ao Plasmodium berghei, um parasita da malária que infecta ratos. O P. berghei foi geneticamente modificado de modo que dois genes para enzimas que o parasita precisava para sintetizar o heme foram eliminados. Os cientistas conseguiram mostrar que, embora grande parte do heme da degradação da hemoglobina acabou como hemozoína, parte dele também foi incorporada aos citocromos do parasita.

Então, por meio de experimentos usando o parasita humano da malária, Plasmodium falciparum, eles descobriram que o heme sintetizado pelo parasita enquanto estava nas células vermelhas entrava nos citocromos, bem como no pigmento hemozoína.

Pode ser que a capacidade de sintetizar o heme fosse crítica para o parasita em situações em que ele não conseguia acessar o heme do hospedeiro, como quando um indivíduo infectado tinha anemia falciforme, disse o Prof. Padmanabhan, que é co-autor do o papel.

Os cientistas encontraram & # 8220 prova clara & # 8221 de que a síntese do heme foi vital para o desenvolvimento do parasita nos mosquitos. Os parasitas incapazes de produzir heme não deram origem à sua forma infecciosa, conhecida como esporozoítos, nas glândulas salivares do inseto & # 8217s.

O P. berghei geneticamente modificado, que tinha um gene para a síntese do heme eliminado, poderia fazer o heme e produzir esporozoítos quando a molécula intermediária ausente fosse fornecida. No entanto, esses esporozoítos, sem a capacidade de gerar heme, não foram capazes de infectar camundongos.

Eliminar os genes para a síntese do heme pode ser uma forma de produzir esporozoítos geneticamente atenuados que podem servir como um candidato a vacina contra a malária, de acordo com o Dr. Nagaraj. Pesquisas publicadas recentemente mostraram que os esporozoítos atenuados podem ser uma vacina extremamente eficaz contra a malária.

O que os pacientes dizem funciona para a psoríase

Pessoas que vivem com psoríase relataram que alguns dos tratamentos mais eficazes para a pele incluem intervenções simples, como luz solar, água salgada e evitar o estresse.

Isso é de acordo com um novo estudo da CureTogether, um recurso gratuito de propriedade da 23andMe que permite que as pessoas compartilhem informações sobre sua saúde e tratamentos.
A psoríase é uma das doenças autoimunes mais prevalentes nos Estados Unidos, afetando cerca de sete milhões de americanos e 125 milhões em todo o mundo. A condição é caracterizada por manchas de pele escamosa e coceira. Em sua forma leve, a psoríase pode ser apenas um incômodo, mas os casos graves podem ser dolorosos, desfigurantes e debilitantes.
Encontrar o tratamento certo pode ser difícil, então CureTogether pediu às pessoas que vivem com psoríase para avaliar a eficácia de 34 tratamentos diferentes relatados por pacientes.
Os participantes do estudo disseram que descobriram que fototerapia, injeções de cortisona, nadar no oceano e luz solar estavam entre os mais eficazes, além de evitar o estresse e os gatilhos e os medicamentos Dovonex e T-Gel. Por outro lado, alguns tratamentos comuns, como banhos de aveia, sais de Epsom e vitamina D, estavam entre os menos eficazes, de acordo com o estudo.

De onde vieram esses dados? Este é o resultado de um estudo CureTogether de quatro anos sobre Psoríase, no qual 275 pessoas que vivem com a doença compartilharam informações sobre seus sintomas e quais tratamentos funcionaram melhor para elas. Gostaríamos de agradecer a todos os que participaram. E assim como eles compartilharam suas experiências com tratamentos, nós & # 8217 estamos compartilhando livre e abertamente os resultados do estudo de psoríase.
Isso faz parte de uma série regular de resultados de pesquisas do CureTogether. Os resultados da pesquisa do CureTogether & # 8217s são diferentes daqueles feitos pela 23andMe, que analisa as associações genéticas com doenças, características e resposta a medicamentos. Mas, à medida que continuamos nosso trabalho com a comunidade CureTogether, 23andMe espera incorporar mais desse tipo de informação auto-relatada em nossa própria pesquisa. O CureTogether apresenta suas descobertas exatamente como são & # 8212 dados relatados pelo paciente & # 8212 para estimular a discussão e gerar novos insights para pesquisas futuras.
Por favor, tweet, blog ou passe adiante para qualquer pessoa que possa se beneficiar ou esteja interessada em Psoríase. Obrigado!

Tratamentos avaliados mais eficazes para psoríase
1. Fototerapia UVB
2. Injeção de cortisona
3. Água salgada / oceano
4. Luz solar
5. Corticosteroides tópicos
6. Evite gatilhos
7. Evite o estresse
8. Dovonex
9. Fototerapia UVA
10. T-Gel

Leia o artigo completo aqui:

Este artigo pertence e é totalmente creditado a 23andme.

A Batalha do er..bulge..explicada

Todos nós conhecemos pessoas que podem comer o que quiserem, não malhar e, ainda assim, não ganhar um quilo. Enquanto isso, comer apenas um hambúrguer ou perder apenas uma sessão de cardio pode pesar muito mais sobre os outros (trocadilho intencional). Sem dúvida, muitas das diferenças que observamos no ganho de peso e sua relação com a ingestão de alimentos e exercícios são devidas à genética.

Nick Furlotte e Shirley Wu escrevi um artigo impressionante sobre por que isso acontece.

Eles abordam questões-chave como:
Como o fast food e os exercícios afetam o peso em média?
Por que você deve se preocupar se você é maçã ou pêra
Mais razão para fazer exercícios

Adicionando genética à imagem
Então, como nossa genética influencia tudo isso? Sabemos que certos fatores genéticos predispõem à obesidade, enquanto outros podem proteger contra ela. Mas um estudo recente publicado na PLOS Genetics adiciona uma reviravolta. Os pesquisadores mostraram que um conjunto de 12 fatores genéticos conhecidos por estar associados à obesidade teve menos efeito em pessoas que se exercitavam mais e um efeito maior em pessoas que não se exercitavam com tanta frequência.
Examinamos a mesma ideia usando os dados de nossos clientes e encontramos resultados semelhantes. Em mulheres que não praticam exercícios, os fatores de risco genéticos foram associados a pesar 1,4 quilo a mais do que a média, enquanto as mulheres que se exercitaram pesaram apenas 0,75 quilos a mais para cada fator de risco. Em outras palavras, o estilo de vida pode realmente influenciar o efeito que nosso DNA tem sobre nosso peso.
Como o tamanho da indústria de perda de peso atesta, o peso e a obesidade são problemas muito desafiadores. Mas com mais dados, seremos capazes de desvendar a relação entre ingestão alimentar, exercícios, genética e ganho de peso ainda mais, esperançosamente levando a estratégias de peso saudáveis ​​mais personalizadas e eficazes.

Você pode ler o artigo completo aqui


Síntese química de DNA: vantagens, possibilidades, etc.

Síntese gênica combina a síntese química de moléculas de DNA com abordagens tradicionais da biologia molecular. Um modelo de DNA é produzido em vitro por uma de uma variedade de técnicas para concatenar oligonucleotídeos. A construção do gene resultante é então clonada em um vetor de plasmídeo e amplificada em microrganismos, geralmente especializados Escherichia coli cepas de laboratório.

Mais notavelmente, a síntese de genes dá aos pesquisadores a liberdade de gerar qualquer gene na ausência de genômico ou cDNA, simplesmente com base em sequências geradas ou disponíveis eletronicamente. Estendendo a capacidade da tecnologia de síntese de oligonucleotídeos, a síntese de genes é o método de escolha para a criação de novos genes e montagem de genomas artificiais.

  • Defina com precisão a sequência de que você precisa!
  • Altere as especificidades e atividades da enzima de forma mais rápida e fácil, especificando e projetando exatamente os resíduos de aminoácidos que contribuem para o centro catalítico ou domínios de ligação ao ligante. Isso geralmente melhora as propriedades ou o desempenho da enzima.
  • Domínios aleatórios combinando domínios de proteínas funcionais de diferentes origens e de diferentes organismos. Isso também pode ser usado para gerar vacinas multiuso, combinando epítopos de origens diferentes em uma proteína alvo.
  • Supere as limitações do viés de uso de códons.
  • Anexe ou insira sinais de localização para direcionar sua proteína / ácido nucléico para compartimentos específicos ou a via secretora. Isso abre caminhos para a engenharia de vias metabólicas em novos compartimentos.
  • Anexe ou modifique os domínios de interação proteína-proteína para direcionar sua proteína a compartimentos de reação específicos.
  • Remoção de estruturas secundárias e regiões repetidas.
  • Ajuste do conteúdo de GC para controlar a taxa de transcrição / tradução (por exemplo, agrupamentos de códons lentos para dobramento correto) ou a função de um gene.
  • Os locais de reconhecimento para proteínas de ligação ao DNA (fatores de transcrição, proteínas de ligação do intensificador, enzimas de restrição) podem ser projetados para uso em ensaios de mudança de mobilidade em gel (EMSA) ou pegada de DNAse I.
  • Genes-alvo mutantes - com substituições aleatórias em uma ou mais posições - podem ter grande impacto em várias abordagens diagnósticas.
  • Anexo de marcas de reconhecimento ou purificação para marcação in vivo e para purificação por afinidade facilitada.
  • Inserção de locais de clivagem de protease.
  • Remoção ou adição de locais de reconhecimento para enzimas restritivas de DNA.
  • Sequências naturais de DNA disponíveis apenas em formato digital.
  • Sondas de hibridização longas que não estavam fisicamente disponíveis.
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O Estudo do Hastings Center

Um estudo encomendado pela Fundação Alfred P Sloan foi desenhado para avaliar os riscos e efeitos que a biologia sintética poderia acarretar, tais como: a possível questão de biossegurança e biossegurança, questão ambiental, em conflitos de direitos de propriedade intelectual e possíveis questões teológicas. O relatório foi publicado por meio do The Hastings Center, instituição dedicada à pesquisa em bioética (7). Os autores incluíram Michele Garfinkel, analista de política do J Craig Venter Institute, Drew Endy, biólogo sintético da Universidade de Stanford, Gerald Epstein, pesquisador sênior de ciência e segurança do Centro de Estudos Estratégicos e Internacionais, e Robert Friedman, Diretor Adjunto do Instituto J Craig Venter. A combinação dessas pessoas com amplas experiências e conhecimentos tornou este relatório bastante valioso para o público e outros cientistas.

Eles começaram com a questão da biossegurança e biossegurança, na qual primeiro identificaram tecnologias-chave, como síntese de DNA e síntese de genes, entre as mais importantes para enfocar (7). Essas técnicas permitem que os cientistas produzam peças artificiais de DNA de qualquer comprimento e sequência. Eles descobriram que as tecnologias atuais não são suficientes para representar uma grande ameaça para realmente produzir e distribuir algumas sequências de DNA prejudiciais. No entanto, eles alertaram que dentro de 5 a 10 anos, a tecnologia seria suficientemente eficiente para produzir pedaços grandes de DNA o suficiente para ser uma preocupação. Eles sugeriram coisas como examinar as sequências que as empresas produzem quanto ao potencial de serem prejudiciais. Na verdade, empresas como a Codon Devices já implementam procedimentos como esse rastreamento para garantir que não estejam produzindo sequências de DNA maliciosas.

O impacto ambiental foi avaliado a seguir e a conclusão básica foi que provavelmente todos os alimentos ou organismos comestíveis criados sinteticamente precisarão passar pelos mesmos regulamentos a que todos os outros organismos geneticamente modificados já estão sujeitos. A EPA, a FDA e o Departamento de Agricultura já regulamentam a introdução de alimentos modificados, medicamentos etc., portanto, eles provavelmente também lidarão com esses novos organismos. Além do impacto ambiental da introdução de novos organismos, há um negócio e propriedade associados a essas introduções. A aquisição de propriedade intelectual (PI) e patentes sobre esses novos organismos sem dúvida será grande e as empresas trabalharão para agir rapidamente para obter o máximo de PI possível. Este aspecto do debate e do campo emergente tem o potencial de impedir seu avanço se instituições e empresas detiverem patentes e não estiverem dispostas a trabalhar umas com as outras. Pode ocorrer uma situação onde um anticommons é criado onde muitos proprietários de patentes bloqueiam as ações uns dos outros ou um matagal de patentes se desenvolve onde uma pessoa interessada em fazer pesquisa precisa receber licenças de múltiplos proprietários de patentes (7).

A questão final abordada pelo estudo, e possivelmente a mais importante para o debate público em geral, é a questão filosófica ou teológica. Os objetivos de muitos dos cientistas da genômica sintética é criar um genoma mínimo e desenvolver e projetar organismos completamente novos. Esses esforços podem, de fato, também servir para mudar a definição de vida ao mesmo tempo. Os cientistas que foram questionados sobre as questões morais e éticas sobre a construção de um genoma mínimo não o consideraram eticamente impróprio. É claro que há pessoas que discordam de que essa é uma coisa moralmente aceitável de se buscar, por mais pouca pesquisa e esforço adicionais tenham sido colocados para determinar exatamente o que deveria ser feito, provavelmente porque o cientista a favor disso tem mais poder e voz no matéria do que os dissidentes.


Assista o vídeo: SEQUENCIAMENTO DNA (Dezembro 2021).