Em formação

D2: Mecanismos de Ping-Pong Multi-Substrato - Biologia


Nesse mecanismo, um substrato se liga primeiro à enzima, seguido pela liberação do produto (P ). Normalmente, o produto (P ) é um fragmento do substrato original (A ). O resto do substrato é covalentemente ligado à enzima (E ), que é designada como (E '). Agora o segundo reagente, (B ), se liga e reage com o E 'e forma uma ligação covalente ao fragmento de (A ) ainda ligado à enzima, formando o produto (Q ). Isso agora é liberado e a enzima é restaurada à sua forma inicial, (E ). Isso representa um mecanismo de pingue-pongue. Um esquema de notação abreviado é mostrado abaixo para os mecanismos de pingue-pongue. Para esse mecanismo, os gráficos de Lineweaver-Burk em valores fixos variáveis ​​de (A ) e diferentes valores fixos de (B ) fornecem uma série de linhas paralelas.

Um exemplo de uma enzima de pingue-pongue é a proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular. Ele reage com o pequeno substrato p-initrofenilfosfato (A) que se liga à enzima covalentemente com a expulsão do produto P, o grupo de saída do p-nitrofenol. A água (B) então entra e ataca covalentemente a enzima, formando um aduto com o fosfato ligado covalentemente, liberando-o como fosfato inorgânico. Neste exemplo específico, no entanto, você não pode variar a concentração de água e seria impossível gerar os gráficos paralelos Lineweaver-Burk característicos da cinética de pingue-pongue.

Quais são os significados dos parâmetros cinéticos, (K_m ) e (V_m ), para mecanismos multisubstrato / multiproduto? Considere uma reação bi-bi sequencial aleatória para um caso "simples" em que a suposição de equilíbrio rápido define a ligação dos substratos (A ) e (B ).

Por inspeção, parece haver dois tipos de constantes de dissociação "eficazes" para o reagente (A ). Uma descreve a ligação de (A ) a E ( (K_ {ia} )) e a outra a ligação de (A ) a (EB ) ( (K_a )). Usando balanço de massa para (E ) e relacionamento que

[v_0 = k_ {cat} [EAB] ]

a seguinte equação de taxa inicial pode ser derivada.

Observe que Kib não aparece na equação final. Como pode ser? A resposta está no fato de que a concentração final de (EAB ) pode ser derivada do caminho (E ) para (EA ) para (EAB ) ou do caminho (E ) para (EB ) para (EAB ). Assumindo equilíbrio rápido,

[K_ {ia} K_b = K_ {ib} K_a. ]

A seguinte equação pode ser derivada do mecanismo bi-bi de pingue-pongue.

[v = dfrac {V_M AB} {K_bA + K_aB + AB} ]

Para simplificar, todas as equações cinéticas da enzima foram derivadas assumindo que nenhum produto está presente.


10.4: Sistemas Multi-Substrato

O modelo de cinética enzimática de Michaelis & ndashMenten foi derivado para reações de substrato único. As reações enzimáticas que requerem vários substratos e gerando vários produtos são mais comuns e gerando vários produtos são mais comuns do que a reação de substrato único. Nesses tipos de reações, todos os substratos envolvidos são ligados à enzima antes que ocorra a catálise da reação para liberar os produtos. As reações sequenciais podem ser ordenadas ou aleatórias. Em contraste com a cinética de Michealis-Menton, onde um complexo binário Enzima-Substrato é gerado no mecanismo ( ([ES] ), nas reações enzimáticas de bissubstrato, um complexo ternário da enzima e dois substratos é gerado:

As reações de bisubstrato são responsáveis ​​por

60% das reações enzimáticas conhecidas. As reações multi-substrato seguem equações de taxas complexas que descrevem como os substratos se ligam e em que sequência. A análise dessas reações é muito mais simples se a concentração de substrato (A ) for mantida constante e o substrato (B ) variado. Sob essas condições, a enzima se comporta como uma enzima de substrato único e um gráfico de (v ) por ([S] ) dá (K_M ) e (V_) constantes para o substrato B. Se um conjunto dessas medições for realizado em diferentes concentrações fixas de A, esses dados podem ser usados ​​para descobrir qual é o mecanismo da reação. Para uma enzima que pega dois substratos A e B e os transforma em dois produtos P e Q, existem dois tipos de mecanismo: complexo ternário e ping & ndashpong.

Como você resolve a cinética das enzimas desses sistemas mais complicados? A resposta é bastante direta. Você mantém um dos substratos (B, por exemplo) fixo e varia o outro substrato (A) e obtém um Series de gráficos hiperbólicos de (v_o ) vs (A ) em diferentes concentrações fixas de (B ). Isso daria uma série de gráficos lineares (1 / v ) vs. (1 / A ) duplo recíproco (gráficos Lineweaver-Burk) também. O padrão dos gráficos de Lineweaver-Burk depende de como os reagentes e produtos interagem com a enzima.


Enzimas de reparo de DNA: estrutura, biofísica e mecanismo

Nadine L. Samara,. Wei Yang, em Methods in Enzymology, 2017

Resumo

As estruturas dos complexos enzima-substrato / produto foram estudadas por mais de quatro décadas, mas foram limitadas a antes ou depois de uma reação química. Usando recentemente em cristal catálise combinada com difração de raios-X, descobrimos que muitas reações enzimáticas no metabolismo do ácido nucleico requerem cofatores de íons metálicos adicionais que não estão presentes no substrato ou estado do produto. Ao controlar os íons metálicos essenciais para a catálise, o em cristal abordagem revelou detalhes sem precedentes de intermediários de reação. Aqui, apresentamos protocolos usados ​​para estudos bem-sucedidos de DNA polimerases e ribonucleases dependentes de Mg 2 + que são aplicáveis ​​a análises de uma variedade de reações dependentes de íons metálicos.


Abordagens sem parâmetros para interpretar a resposta celular dinâmica

A resposta celular, como a sinalização celular, é parte integrante do processamento de informações em biologia. Após a estimulação do receptor, numerosas moléculas intracelulares são invocadas para desencadear a transcrição de genes para fins biológicos específicos, como crescimento, diferenciação, apoptose ou resposta imune. Quão complexas são essas máquinas especializadas e sofisticadas? A modelagem computacional é uma ferramenta importante para investigar comportamentos celulares dinâmicos. Aqui, foco em certos tipos de vias de sinalização chave que podem ser bem interpretadas usando regras físicas simples baseadas na lógica booleana e superposição linear de termos de resposta. A partir dos exemplos mostrados, é concebível que, para modelagem de rede em pequena escala, a topologia de reação, em vez de valores de parâmetro, seja crucial para a compreensão dos comportamentos celulares de toda a população. Para resposta em larga escala, as abordagens estatísticas não paramétricas têm se mostrado valiosas para revelar propriedades emergentes.

A interpretação dos processos celulares dinâmicos é indispensável para a pesquisa biológica. Especialmente nas últimas duas décadas, tem havido esforços tremendos com o objetivo de compreender redes biológicas complexas em diferentes tipos de células para vários tipos de estímulos ou perturbações e em condições de doença usando abordagens de biologia de sistemas. Que tipo de modelos precisamos para conceituar redes biológicas para interpretar ou prever respostas dinâmicas?

No início dos anos 1900, Victor Henri, Leonor Michaelis e Maud Menten investigaram exaustivamente as reações enzimáticas em vitro, e desenvolveram a equação da taxa hiperbólica que hoje popularmente chamamos de cinética enzimática de Michaelis-Menten. Esta é uma forma mais sofisticada de reação do tipo ação em massa, considerando a saturação da cinética em concentrações mais altas de substrato, em vez de um perfil cada vez maior para o último. Trabalhos subsequentes sobre este princípio básico levaram à extensão da cinética para representar cenários mais complexos, como ping-pong multi-substrato e mecanismos ternários complexos [1].

À medida que o desenvolvimento da capacidade de computação progrediu significativamente na década de 1960, houve numerosos esforços para modelar módulos de via biológica completos, como a glicólise, usando equações cinéticas de enzimas com o objetivo de estimar valores de parâmetros ajustando-se aos níveis de concentração de metabolitos em estado estacionário . No entanto, a abstração mais verdadeira da complexidade enzimática resultou em um dilema em que o aumento da precisão exigia um maior conhecimento de muitos parâmetros que eram muito difíceis de obter com precisão. Se os valores dos parâmetros não forem determinados com precisão, os modelos de reação enzimática não serão capazes de recapitular o resultado experimental razoavelmente bem.

A maioria, senão todos, os estudos que adotam em vitro experimentos determinam os valores dos parâmetros das espécies de reação para modelagem computacional de um ambiente artificial onde as espécies são deliberadamente purificadas de seus vizinhos fisiológicos. Isso porque, até hoje, o na Vivo os parâmetros cinéticos não podem ser medidos de forma confiável usando as tecnologias experimentais atuais. Notavelmente, tem havido vários relatórios que afirmam os parâmetros cinéticos determinados por meio de em vitro e na Vivo os experimentos podem diferir em várias ordens de magnitudes [2]. Como resultado, ao combinar esses erros no modelo, as previsões finais podem diferir em várias ordens de magnitude. Por exemplo, a concentração em estado estacionário do metabólito glicolítico 3-fosfoglicerato em Trypanosoma brucei foi subestimado por uma ordem de 7 [3].

A dificuldade de determinar com precisão os valores dos parâmetros levou ao desenvolvimento de abordagens não paramétricas, como a análise de equilíbrio de fluxo (FBA) [4]. Aqui, apenas as topologias de reação ou estequiometria da rede e os níveis de estado estacionário precisam ser conhecidos. As restrições são introduzidas pelos coeficientes estequiométricos no sistema para a otimização de certas funções biológicas, como o crescimento ou a produção de certos compostos. Embora o FBA exija a suposição de que as concentrações de metabólitos permaneçam em estados estáveis ​​para análise, ele foi usado com sucesso para interpretar funções fisiológicas importantes de uma célula viva. Por exemplo, Palsson e colegas verificaram experimentalmente sua previsão para a fonte primária de carbono e as taxas de consumo de oxigênio para o crescimento celular máximo em E. coli[5]. Então, por que esse método de estado estacionário simples, baseado na estequiometria de reações, faz previsões úteis? (Observe que o FBA requer que a topologia da rede seja amplamente conhecida, como é o caso das redes metabólicas. Para vias de sinalização, onde o papel detalhado de várias moléculas ainda está incompleto, o FBA tem aplicação limitada).

Em um trabalho pioneiro na compreensão da complexa dinâmica da quimiotaxia bacteriana, Leibler e colegas criaram um modelo de ação em massa de dois estados altamente simplificado de E. coli rede quimiotática [6]. Usando o modelo, e posteriormente com experimentos [7], eles mostraram que a precisão de adaptação da quimiotaxia bacteriana era insensível à grande variação dos valores de seus parâmetros de rede. Este mecanismo, portanto, permite E. coli para exibir um comportamento robusto para uma ampla gama de concentrações atrativas e repelentes. No entanto, ao mesmo tempo, outras propriedades, como tempo de adaptação e frequência de tombamento em estado estacionário, foram variáveis ​​para a concentração de estimulante. No geral, seu trabalho demonstrou que a propriedade de adaptação bacteriana é uma consequência da conectividade da rede e não requer a precisão dos valores dos parâmetros. Este trabalho é um marco miliário que indica que fenômenos biológicos complexos podem ser compreendidos por meio de modelos simples que não são sensíveis aos valores dos parâmetros.

A observação da simplicidade no que parece ser altamente dinâmico e complexo pode ter benefícios profundos na compreensão e controle das condições da doença. Nossa pesquisa se concentrou na dinâmica de sinalização celular da resposta imune inata e na sobrevivência das células cancerígenas. Na última década, adotamos abordagens de biologia de sistemas para estudar a sinalização do receptor toll-like (TLR) [8-10], a sinalização do fator de necrose tumoral (TNF) [11] e a sinalização do ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF (TRAIL) [12 ], da estimulação do receptor por meio de expressões gênicas a jusante, por meio de ativações de fatores de transcrição.

A estratégia era primeiro criar um modelo computacional dinâmico baseado nas atuais vias conhecidas de um processo de sinalização. Em seguida, a equação de resposta de primeira ordem (ação de massa) foi usada para representar cada reação ou processo de sinalização (ligação de proteína, formação de complexo, ubiquitinação, etc.). Posteriormente, os parâmetros do modelo foram escolhidos para se ajustar à dinâmica experimental do tipo selvagem e comparados com células mutantes para confiabilidade dos modelos e seus parâmetros [13]. Quando um único modelo é incapaz de simular várias condições experimentais, a topologia do modelo e # x02019s pode ser modificada, usando regras de resposta, de acordo com a lei de conservação do fluxo de sinalização [9-13]. Isso ocorre simplesmente porque ainda não possuímos conhecimento completo de todas as reações de sinalização ou moléculas envolvidas.

Notavelmente, para todos os processos de sinalização complexos que investigamos até agora, tivemos sucesso em prever novos recursos de sinalização, como intermediários ausentes, mecanismos de crosstalk, loops de feedback [8,11,12] e identificar novos alvos para controlar a resposta pró-inflamatória [11] e apoptose do câncer [12]. Todas as previsões foram validadas experimentalmente [9,11,14,15]. Então, por que os modelos simples que utilizam equações de resposta de primeira ordem são suficientes para produzir resultados perspicazes de um sistema complexo?

Em primeiro lugar, a principal razão para utilizarmos termos de primeira ordem é devido à observação experimental de ondas de resposta determinística de transdução de sinal dentro do período de investigações, geralmente até 1-2 & # x000a0h após a estimulação. Ou seja, a estimulação da população de células em uma placa com os respectivos ligantes resultou, em geral, na resposta de ativação dinâmica de proteínas intracelulares que se seguiram ao aumento gradual de seu estado inicial para atingir os níveis de ativação de pico e, subsequentemente, decair para seu estado original (Figura & # x000a0 1 A). Essas respostas são observadas para a primeira rodada de ondas de resposta de uma miríade de espécies de sinalização (Figura & # x000a0 1 B). Embora a cinética possa variar ligeiramente de amostra para amostra, os perfis de resposta média geral são muito bem reproduzíveis. Em outras palavras, independentemente de quão complexa uma topologia de sinalização possa ser, as respostas dinâmicas médias das espécies & # x02019 seguiram a formação determinística e as ondas de depleção [13,17,18].

A observação de ondas de resposta linear. A) Esquema de espécies de sinalização ativadas, como ligação de proteínas e expressões gênicas, em relação ao tempo após a formação e ondas de decaimento. O painel superior representa uma cascata linear simples com onda única. O painel inferior ilustra duas ondas lineares sobrepostas, como consequência de um termo adicional de formação de retardo de tempo. Isso pode surgir de mecanismos de feedback ou crosstalk. B) Dinâmica quantitativa de moléculas-chave na via de sinalização da insulina, mostrando dinâmica semelhante ao esquemático em A). Figuras adaptadas de [16]. C) Esquema da relação linear e tipo switch entre a concentração do fator de transcrição e as expressões gênicas.

Em segundo lugar, pode-se mostrar, teoricamente, que não importa quão complexo ou não linear seja o sistema de sinalização, a resposta dinâmica pode ser aproximada usando termos de primeira ordem se os níveis de perturbação forem pequenos. Considere a forma geral de uma equação cinética complexa: & # x02202 X & # x02202 t = F X. F pode ser qualquer função não linear constituída de termos de reação e difusão de espécies X. Em engenharia, para mudanças relativas e quando informações insuficientes estão disponíveis, tais sistemas são frequentemente linearizados cuidadosamente usando potência ou série Talyor (& # x02202 & # x003b4 X & # x02202 t = & # x02202 FX & # x02202 XX a & # x003b4 X + & # x02202 F 2 X 2! & # x02202 X 2 X a & # x003b4 X 2 + & # x02026, onde X & # x02009 = & # x02009X uma é o ponto de linearização). Dada uma pequena perturbação, os termos de ordem superior tornam-se menos significativos, deixando apenas o termo de primeira ordem como fator dominante. Observe que as técnicas de linearização são métodos aproximados para entender comportamentos gerais e, em muitos casos, não podem ser usadas para interpretar mecanismos detalhados de resposta.

À luz desta hipótese de resposta linear, é digno de nota citar as recentes descobertas de dois trabalhos relevantes, que estudaram as relações entre os fatores de transcrição e expressões gênicas na resposta ao estresse induzido por TNF [19] e superexpresso de Msn2 [20]. Coletivamente, eles descobriram que o aumento da concentração do fator de transcrição resultou em expressões gênicas graduais que seguiram aproximadamente uma relação linear (Figura & # x000a0 1 C). Embora seja conhecido que muitos fatores de transcrição produzem relacionamento tipo switch ou digital devido à cooperatividade na ligação ao DNA, os fatores de transcrição de resposta ao estresse apresentam comportamento gradativo simples. Essa descoberta pode justificar que certos processos celulares essenciais, como a resposta imune, podem ser guiados por uma resposta linear por meio de cascatas de sinalização. Tomados em conjunto, parece que a resposta linear, como um princípio governante, é a chave para invocar uma resposta precisa e ótima quando as células vivas enfrentam ameaças imediatas.

Em outros estudos, mesmo sem a necessidade de saber a resposta graduada, as abordagens de estado binário (ON / OFF) produziram resultados fascinantes na compreensão da sinalização celular. Um estudo notável desenvolveu modelagem de rede booleana discreta para investigar o mecanismo de sobrevivência de linfócitos T citotóxicos (CTL) na leucemia de linfócitos grandes granulares de células T (T-LGL) [21]. Loughran e colegas criaram um modelo de sinalização de sobrevivência T-LGL com 58 nós, representando espécies moleculares, e 123 bordas, representando interações causais entre as espécies. Usando o modelo, eles identificaram as interações mais significativas para ativar CTL no estado de doença em comparação com o normal. Experimentos subsequentes confirmaram suas previsões de modelo.

É concebível que a chegada a abordagens sem parâmetros pode ser irreal no reino dos sistemas complexos, onde fatores não lineares e efeitos estocásticos podem causar até mesmo uma pequena variação nas perturbações para produzir diversos resultados multiestáveis ​​ou padrões oscilatórios. Esse é o caso observado para decisões de destino celular, onde um único ovo fertilizado pode se diversificar em linhagens celulares distintas ou uma bactéria é capaz de mudar o destino sob condição de deficiência de nutrientes [22]. Para modelar tal complexidade, possivelmente a teoria dos sistemas dinâmicos adotando equações não lineares pode ser usada [23]. Além disso, para a compreensão de comportamentos de auto-organização, como relógios / ritmos biológicos, padrões espaciais, bifurcação de Hopf ou outras dinâmicas não lineares, Goodwin, Brusselator e Lotka & # x02013 equações de Volterra foram amplamente adotadas [24-26]. No entanto, esses modelos requerem a precisão dos valores dos parâmetros e, na maioria das vezes, reproduzem apenas o comportamento geral de respostas biológicas complexas em uma condição (tipo selvagem).

Outra questão a considerar é a escala das redes. Até agora, os módulos biológicos ou modelagem de rede que foram usados ​​com sucesso consistem em espécies moleculares que são relativamente pequenas, da ordem de dezenas ou algumas centenas. No entanto, o sistema vivo invoca a resposta de milhares de espécies e esses estudos em grande escala provavelmente requerem abordagens diferentes. Uma estratégia comum usada para lidar com os efeitos em grande escala é usar técnicas estatísticas que investigam regressão ou correlação entre espécies e amostras, ou aplicar técnicas de agrupamento para identificar grupos de genes com comportamentos temporais ou funcionais semelhantes [27,28]. Esses métodos têm sido fundamentais para revelar comportamentos emergentes, por exemplo, a observação de oscilações coletivas de numerosos genes de ciclo metabólico específicos independentes do ciclo celular em Saccharomyces cerevisiae[29,30], e a dinâmica de expressão coletiva em todo o genoma, incluindo genes modestamente expressos, para a resposta imune inata [31,32] e diferenciação de células de neutrófilos [33,34]. Para classificar tipos distintos de câncer para terapia direcionada, mapas de auto-organização em dados de expressão gênica de alta dimensão têm sido altamente úteis [35]. Assim, trabalhos estatísticos não paramétricos em conjuntos de dados de expressão gênica de alto rendimento têm sido cruciais para mostrar comportamentos auto-organizados emergentes em populações de células.

No futuro, circuitos booleanos autônomos não paramétricos, que recentemente foram mostrados para gerar caos, com múltiplos estados atratores através de loops de feedback retardado em propagação de sinal físico [36,37], também podem ser investigados para sistemas biológicos. Estes poderiam, especialmente, ser valiosos para a aplicação de sinalização celular relacionada a decisões de destino de células não lineares ou formação de doenças.


Referências

Aldridge P, Metzger M, Geider K (1997) Genetics of sorbitol metabolism in Erwinia amylovora e sua influência na virulência bacteriana. Mol Gen Genet 256: 611-619

Ancona V, Chatnaparat T, Zhao Y (2015) Aspartato conservado e resíduos de lisina de RcsB são necessários para a biossíntese de amilovorana, virulência e ligação de DNA em Erwinia amylovora. Mol Gen Genomics 290: 1265-1276

Aumuller T, Jahreis G, Fischer G, Schiene-Fischer C (2010) Role of prolyl cis / trans isomers in cyclophilin-assistido Pseudomonas Syringae Ativação da protease AvrRpt2. Bioquímica 49: 1042–1052

Bartho JD, Bellini D, Wuerges J, Demitri N, Toccafondi M, Schmitt AO, Zhao Y, Walsh MA, Benini S (2017) A estrutura cristalina de Erwinia amylovora AmyR, um membro da família de proteínas YbjN, mostra semelhança com as chaperonas de secreção do tipo III, mas sugere funções celulares diferentes. PLoS One 12: e0176049

Bartho JD, Demitri N, Bellini D, Flachowsky H, Peil A, Walsh MA, Benini S (2019) A estrutura de Erwinia amylovora AvrRpt2 fornece uma visão sobre a maturação da proteína e resistência induzida ao fogo bacteriano por Malus x robusta 5. J Struct Biol 206: 233–242

Benini S, Toccafondi M, Rejzek M, Musiani F, Wagstaff BA, Wuerges J, Cianci M, Field RA (2017) Glucose-1-fosfato uridililtransferase de Erwinia amylovora: atividade, estrutura e especificidade do substrato. Biochim Biophys Acta 1865: 1348–1357

Bereswill S, Geider K (1997) Characterization of the rcsB gene de Erwinia amylovora e sua influência na síntese de exoploysaccharide e virulência do patógeno da queima do fogo. J Bacteriol 179: 1354–1361

Berman H, Henrick K, Nakamura H (2003) Anunciando o Banco Mundial de Dados de Proteínas. Nat Struct Biol 10: 980

Borruso L, Salomone-Stagni M, Polsinelli I, Schmitt AO, Benini S (2017) Conservação de Erwinia amylovora genes relevantes para a patogenicidade entre Erwinia genomas. Arch Microbiol 199: 1335–1344

Bugert P, Geider K (1995) Molecular analysis of the ams operon necessário para a síntese de exopolissacarídeo de Erwinia amylovora. Mol Microbiol 15: 917–933

Bugert P, Geider K (1997) Characterization of the amsI produto do gene como uma fosfatase ácida de baixo peso molecular que controla a síntese de exopolissacarídeos de Erwinia amylovora. FEBS Lett 400: 252–256

Burley SK, Berman HM, Bhikadiya C, Bi C, Chen L, Di Costanzo L, Christie C, Dalenberg K, Duarte JM, Dutta S, Feng Z, Ghosh S, Goodsell DS, Green RK, Guranovic V, Guzenko D, Hudson BP, Kalro T, Liang Y, Lowe R, Namkoong H, Peisach E, Periskova I, Prlic A, Randle C, Rose A, Rose P, Sala R, Sekharan M, Shao C, Tan L, Tao YP, Valasatava Y, Voigt M, Westbrook J, Woo J, Yang H, Young J, Zhuravleva M, Zardecki C (2019) Banco de dados de proteínas RCSB: estruturas macromoleculares biológicas que permitem a pesquisa e a educação em biologia fundamental, biomedicina, biotecnologia e energia. Ácidos nucléicos Res 47: D464-D474

Caputi L, Cianci M, Benini S (2013a) Clonagem, expressão, purificação, cristalização e análise preliminar de raios-X de EaLsc, uma levansucrase de Erwinia amylovora. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 69: 570–573

Caputi L, Nepogodiev SA, Malnoy M, Rejzek M, Field RA, Benini S (2013b) Caracterização biomolecular da levansucrase de Erwinia amylovora, um biocatalisador promissor para a síntese de frutooligossacarídeos. J Agric Food Chem 61: 12265–12273

Caselli A, Paoli P, Santi A, Mugnaioni C, Toti A, Camici G, Cirri P (2016) Proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular: funções multifacetadas de uma enzima conservada evolutivamente. Biochim Biophys Acta 1864: 1339–1355

Cavalli A, Salvatella X, Dobson CM, Vendruscolo M (2007) Protein structure structure from NMR chemical shifts. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 9615–9620

Challis GL, Naismith JH (2004) Structural aspect of non-ribosomal peptide biosynthesis. Curr Opin Struct Biol 14: 748-756

Chambert R, Treboul G, Dedonder R (1974) Estudos cinéticos de levansucrase de Bacillus subtilis. Eur J Biochem 41: 285–300

Chen X, Shen D, Zhou B (2006) Análise da mutação sensível à temperatura de Escherichia coli pantotenato quinase revela YbjN como um possível estabilizador de proteína. Biochem Biophys Res Commun 345: 834-842

Chisholm ST, Dahlbeck D, Krishnamurthy N, Dia B, Sjolander K, Staskawicz, BJ (2005) Molecular characterization of proteolytic clivage sites of the Pseudomonas syringae effector AvrRpt2. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (6): 2087–2092

Coaker G, Zhu G, Ding Z, Van Doren SR, Staskawicz B (2006) Ciclofilina eucariótica como um interruptor molecular para ativação efetora. Mol Microbiol 61: 1485–1496

Dellagi A, Brisset MN, Paulin JP, Expert D (1998) Dual role of desferrioxamine in Erwinia amylovora patogenicidade. Mol Plant-Microbe Interact 11: 734-742

Denu JM, Dixon JE (1995) Um mecanismo catalítico para as fosfatases específicas duplas. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 5910–5914

Denu JM, Lohse DL, Vijayalakshmi J, Saper MA, Dixon JE (1996) Visualization of intermediário e estruturas de estado de transição em catálise de proteína-tirosina fosfatase. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 2493–2498

Evans B, Tishmack PA, Pokalsky C, Zhang M, Van Etten RL (1996) Site-oriented mutagenesis, kinetic, and mirroscopic studies of the P-loop residues numa proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular. Bioquímica 35: 13609-13617

Feistner GJ (1995) síntese de proferrioxamina em Erwinia amylovora em resposta à alimentação de precursor ou hidroxilisina: perfil metabólico com espectrometria de massa por cromatografia líquida-eletrospray. Biometals 8: 318-327

Feistner GJ, Stahl DC, Gabrik AH (1993) Proferrioxamine siderophores of Erwinia amylovora. Um estudo de espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida capilar / eletrospray. Org Mass Spectrom 28: 163-175

Franceschini S, Fedkenheuer M, Vogelaar NJ, Robinson HH, Sobrado P, Mattevi A (2012) Structural insight no mecanismo de ativação de oxigênio e seletividade de substrato de monooxigenases N-hidroxilantes dependentes de flavina. Bioquímica 51: 7043–7045

Geier G, Geider K (1993) Caracterização e influência na virulência do gene levansucrase do patógeno fireblight Erwinia amylovora. Physiol Mol Plant Pathol 42: 387-404

Grabowski M, Niedzialkowska E, Zimmerman MD, Minor W (2016) The impact of estrutural genomics: the first quindecennial. J Struct Funct Genom 17: 1-16

Gross M, Geier G, Rudolph K, Geider K (1992) Levan e levansucrase sintetizada pelo patógeno fireblight Erwinia amylovora. Physiol Mol Plant Pathol 40: 371–381

Henikoff S, Wallace JC, Brown JP (1990) Finding protein similarities with nucleotide sequence base de dados. Métodos Enzymol 183: 111-132

Humm A, Fritsche E, Steinbacher S (1997a) Estrutura e mecanismo de reação de L-arginina: glicina amidinotransferase. Biol Chem 378: 193-197

Humm A, Fritsche E, Steinbacher S, Huber R (1997b) Estrutura cristalina e mecanismo da L-arginina humana: glicina amidinotransferase: uma enzima mitocondrial envolvida na biossíntese de creatina. EMBO J 16: 3373–3385

Jin P, Wood MD, Wu Y, Xie Z, Katagiri F (2003) Cleavage of the Pseudomonas Syringae O efetor tipo III AvrRpt2 requer um fator (s) de hospedeiro comum entre os eucariotos e é importante para a localização de AvrRpt2 na célula hospedeira. Plant Physiol 133: 1072–1082

Kelm O, Kiecker C, Geider K, Bernhard F (1997) Interação das proteínas reguladoras RcsA e RcsB com o promotor do operon para a biossíntese de amilovorano em Erwinia amylovora. Mol Gen Genet 256: 72-83

Khan MA, Zhao Y, Korban SS (2012) Mecanismos moleculares de patogênese e resistência ao patógeno bacteriano Erwinia amylovora, agente causal da doença queimadura de fogo em Rosaceae. Plant Mol Biol Rep 30: 247-260

Kim H, Choi J, Kim T, Lokanath NK, Ha SC, Suh SW, Hwang HY, Kim KK (2010) Base estrutural para o mecanismo de reação da pirofosforilase UDP-glicose. Mol Cells 29: 397-405

Koczan JM, McGrath MJ, Zhao Y, Sundin GW (2009) Contribuição de Erwinia amylovora exopolissacarídeos amilovoran e Levan na formação de biofilme: implicações na patogenicidade. Phytopathology 99: 1237-1244

Krissinel E (2010) Contatos de cristal como soluções de docking da natureza. J Comput Chem 31: 133-143

Krissinel E, Henrick K (2004) Secondary-structure matching (SSM), uma nova ferramenta para o alinhamento rápido da estrutura da proteína em três dimensões. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60: 2256–2268

Kube M, Migdoll AM, Gehring I, Heitmann K, Mayer Y, Kuhl H, Knaust F, Geider K, Reinhardt R (2010) Comparação do genoma das bactérias epífitas Erwinia billingiae e Erwinia tasmaniensis com o patógeno da pera Erwinia pyrifoliae. BMC Genomics 11

Lammens W, Le Roy K, Schroeven L, Van Laere A, Rabijns A, Van den Ende W (2009) Structural insights sobre glicosídeo hidrolase família 32 e 68 enzimas: implicações funcionais. J Exp Bot 60 (3): 727-740

Langlotz C, Schollmeyer M, Coplin DL, Nimtz M, Geider K (2011) Biossíntese das unidades de repetição dos exopolissacarídeos amilovorano de Erwinia amylovora e stewartan de Pantoea stewartii. Physiol Mol Plant Pathol 75: 163-169

Lohou D, Lonjon F, Genin S, Vailleau F (2013) Tipo III chaperones & amp co em patógenos de plantas bacterianas: um conjunto de guarda-costas especializados mediando entrega efetor. Front Plant Sci 4: 435

Mansfield J, Genin S, Magori S, Citovsky V, Sriariyanum M, Ronald P, Dow M, Verdier V, Beer SV, Machado MA, Toth I, Salmond G, Foster GD (2012) Top 10 bactérias patogênicas de plantas na patologia molecular de plantas . Mol Plant Pathol 13: 614-629

Metzger M, Bellemann P, Bugert P, Geider K (1994) Genetics of galactose metabolism of Erwinia amylovora e sua influência na síntese de polissacarídeos e virulência do patógeno da queima do fogo. J Bacteriol 176: 450–459

Muench SP, Antonyuk SV, Hasnain SS (2019) O kit de ferramentas em expansão para biologia estrutural: síncrotrons, lasers de raios-X e cryoEM. IUCrJ 6: 167-177

Nimtz M, Mort A, Domke T, Wray V, Zhang Y, Qiu F, Coplin D, Geider K (1996) Structure of amylovoran, the capsular exopolysaccharide from the fire blight pathogen Erwinia amylovora. Carbohydr Res 287: 59-76

Oh CS, Kim JF, Beer SV (2005) The Hrp pathogenicity island of Erwinia amylovora e identificação de três novos genes necessários para infecção sistêmica. Mol Plant Pathol 6: 125-138

Olucha J, Lamb AL (2011) Mechanistic and structure studies of the N-hydroxylating flavoprotein monooxygenases. Bioorg Chem 39: 171-177

Oppermann U, Enchimento C, Hult M, Shafqat N, Wu X, Lindh M, Shafqat J, Nordling E, Kallberg Y, Persson B, Jornvall H (2003) Desidrogenases / redutases de cadeia curta (SDR): a atualização de 2002. Chem Biol Interact 143-144: 247-253

Persson B, Kallberg Y (2013) Classificação e nomenclatura da superfamília das desidrogenases / redutases de cadeia curta (SDRs). Chem Biol Interact 202: 111-115

Philippsen A, Schirmer T, Stein MA, Giffhorn F, Stetefeld J (2005) Structure of zinc-independent sorbitol deshydrogenase from Rhodobacter sphaeroides com resolução de 2,4 Å. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61: 374–379

Polsinelli I, Borruso L, Caliandro R, Triboli L, Esposito A, Benini S (2019a) Uma análise de todo o genoma da absorção de ferro mediada por desferrioxamina em Erwinia spp. revela genes exclusivos das cepas infectantes de Rosaceae. Sci Rep 9: 2818

Polsinelli I, Caliandro R, Salomone-Stagni M, Demitri N, Rejzek M, Field RA, Benini S (2019b) Comparison of the levansucrase from the epiphyte Erwinia tasmaniensis vs its homologue from the phytopathogen Erwinia amylovora. Int J Biol Macromol 127:496–501

Pristovsek P, Sengupta K, Lohr F, Schafer B, von Trebra MW, Ruterjans H, Bernhard F (2003) Structural analysis of the DNA-binding domain of the Erwinia amylovora RcsB protein and its interaction with the RcsAB box. J Biol Chem 278:17752–17759

Rout MP, Sali A (2019) Principles for integrative structural biology studies. Cell 177:1384–1403

Salomone-Stagni M, Musiani F, Benini S (2016) Characterization and 1.57 Å resolution structure of the key fire blight phosphatase AmsI from Erwinia amylovora. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 72:903–910

Salomone-Stagni M, Bartho JD, Kalita E, Rejzek M, Field RA, Bellini D, Walsh MA, Benini S (2018a) Structural and functional analysis of Erwinia amylovora SrlD. The first crystal structure of a sorbitol-6-phosphate 2-dehydrogenase. J Struct Biol 203:109–119

Salomone-Stagni M, Bartho JD, Polsinelli I, Bellini D, Walsh MA, Demitri N, Benini S (2018b) A complete structural characterization of the desferrioxamine E biosynthetic pathway from the fire blight pathogen Erwinia amylovora. J Struct Biol 202:236–249

Schropfer S, Bottcher C, Wohner T, Richter K, Norelli J, Rikkerink EHA, Hanke MV, Flachowsky H (2018) A single effector protein, AvrRpt2EA, a partir de Erwinia amylovora can cause fire blight disease symptoms and induces a salicylic acid-dependent defense response. Mol Plant-Microbe Interact 31:1179–1191

Setser JW, Heemstra JR, Walsh CT, Drennan CL (2014) Crystallographic evidence of drastic conformational changes in the active site of a flavin-dependent N-hydroxylase. Biochemistry 53:6063–6077

Shanker S, Schaefer GK, Barnhart BK, Wallace-Kneale VL, Chang D, Coyle TJ, Metzler DA, Huang J, Lawton JA (2017) The virulence-associated protein HsvA from the fire blight pathogen Erwinia amylovora is a polyamine amidinotransferase. J Biol Chem 292:21366–21380

Smits TH, Duffy B (2011) Genomics of iron acquisition in the plant pathogen Erwinia amylovora: insights in the biosynthetic pathway of the siderophore desferrioxamine E. Arch Microbiol 193:693–699

Smits TH, Rezzonico F, Kamber T, Blom J, Goesmann A, Frey JE, Duffy B (2010) Complete genome sequence of the fire blight pathogen Erwinia amylovora CFBP 1430 and comparison to other Erwinia spp. Mol Plant-Microbe Interact 23:384–393

Strube CP, Homann A, Gamer M, Jahn D, Seibel J, Heinz DW (2011) Polysaccharide synthesis of the levansucrase SacB from Bacillus megaterium is controlled by distinct surface motifs. J Biol Chem 286:17593–17600

Temel DB, Dutta K, Alphonse S, Nourikyan J, Grangeasse C, Ghose R (2013) Regulatory interactions between a bacterial tyrosine kinase and its cognate phosphatase. J Biol Chem 288:15212–15228

Toccafondi M, Cianci M, Benini S (2014) Expression, purification, crystallization, and preliminary X-ray analysis of glucose-1-phosphate uridylyltransferase (GalU) from Erwinia amylovora. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 70:1249–1251

Unligil UM, Rini JM (2000) Glycosyltransferase structure and mechanism. Curr Opin Struct Biol 10:510–517

van Berkel WJ, Kamerbeek NM, Fraaije MW (2006) Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts. J Biotechnol 124:670–689

Vanneste JL (1995) Erwinia amylovora. In: Singh US, Singh RP, Kohmoto K (eds) Pathogenesis and host specificity in plant diseases: Histopathological. Biochemical, Genetic and molecular bases, pp 21–46

Vogt I, Wohner T, Richter K, Flachowsky H, Sundin GW, Wensing A, Savory EA, Geider K, Day B, Hanke MV, Peil A (2013) Gene-for-gene relationship in the host-pathogen system Malus x robusta 5-Erwinia amylovora. New Phytol 197:1262–1275

Vrancken K, Holtappels M, Schoofs H, Deckers T, Valcke R (2013) Pathogenicity and infection strategies of the fire blight pathogen Erwinia amylovora in Rosaceae: state of the art. Microbiology 159:823–832

Wagstaff BA, Rejzek M, Pesnot T, Tedaldi LM, Caputi L, O'Neill EC, Benini S, Wagner GK, Field RA (2015) Enzymatic synthesis of nucleobase-modified UDP-sugars: scope and limitations. Carbohydr Res 404:17–25

Wang D, Korban SS, Zhao Y (2009) The Rcs phosphorelay system is essential for pathogenicity in Erwinia amylovora. Mol Plant Pathol 10:277–290

Wang D, Korban SS, Pusey PL, Zhao Y (2012) AmyR is a novel negative regulator of amylovoran production in Erwinia amylovora. PLoS One 7:e45038

Wehland M, Kiecker C, Coplin DL, Kelm O, Saenger W, Bernhard F (1999) Identification of a RcsA/RcsB recognition motif in the promoters of exopolysaccharide biosynthetic operons from Erwinia amylovora e Pantoea stewartii subspecies stewartii. J Biol Chem 274:3300–3307

Wuerges J, Caputi L, Cianci M, Boivin S, Meijers R, Benini S (2015) The crystal structure of Erwinia amylovora levansucrase provides a snapshot of the products of sucrose hydrolysis trapped into the active site. J Struct Biol 191:290–298

Zhao Y, Blumer SE, Sundin GW (2005) Identification of Erwinia amylovora genes induced during infection of immature pear tissue. J Bacteriol 187:8088–8103

Zhao Y, He SY, Sundin GW (2006) The Erwinia amylovora avrRpt2EA gene contributes to virulence on pear and AvrRpt2EA is recognized by Arabidopsis RPS2 when expressed in Pseudomonas Syringae. Mol Plant-Microbe Interact 19:644–654

Zimmermann MH, Ziegler H (1975) List of all sugars and sugar alcohols in sieve-tube exudates. In: Pirson A, Zimmermann MH (eds) Encyclopedia of plant physiology. Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, pp 480–503


Resumo

d -2-Hydroxyglutarate dehydrogenase from Pseudomonas aeruginosa PAO1 (PaD2HGDH) catalyzes the oxidation of d -2-hydroxyglutarate to 2-ketoglutarate, which is a necessary step in the serine biosynthetic pathway. The dependence of P. aeruginosa sobre PaD2HGDH makes the enzyme a potential therapeutic target against P. aeruginosa. In this study, recombinant His-tagged PaD2HGDH was expressed and purified to high levels from gene PA0317, which was previously annotated as an FAD-binding PCMH-type domain-containing protein. The enzyme cofactor was identified as FAD with fluorescence emission after phosphodiesterase treatment and with mass spectrometry analysis. PaD2HGDH had a kcat value of 11 s –1 and a Km value of 60 μM with d -2-hydroxyglutarate at pH 7.4 and 25 °C. The enzyme was also active with d -malate but did not react with molecular oxygen. Steady-state kinetics with d -malate and phenazine methosulfate as an electron acceptor established a mechanism that was consistent with ping-pong bi-bi steady-state kinetics at pH 7.4. A comparison of the kcat/Km values with d -2-hydroxyglutarate and d -malate suggested that the C5 carboxylate of d -2-hydroxyglutarate is important for the substrate specificity of the enzyme. Other homologues of the enzyme have been previously grouped in the VAO/PMCH family of flavoproteins. PaD2HGDH shares fully conserved residues with other α-hydroxy acid oxidizing enzymes, and these conserved residues are found in the active site of the PaD2HDGH homology model. An Enzyme Function Initiative-Enzyme Similarity Tool Sequence Similarity Network analysis suggests a functional difference between PaD2HGDH and human D2HGDH, and no relationship with VAO. A phylogenetic tree analysis of PaD2HGDH, VAO, and human D2HGDH establishes genetic diversity among these enzymes.


1 resposta 1

The issue with Michaelis menten curves, is that they presume only one pathway the enzyme can act by. Therefore if an enzyme has multiple pathways the presumptions fail. An example of this is monoamine oxidase, (Ramsay, R. R., Olivieri, A. & Holt, A. An improved approach to steady-state analysis of monoamine oxidases. J. Neural Transm. 118, 1003–1019 (2011).) This paper has the enzyme specific kinetics for monoamine oxidase - the development of the models is incredibly complicated but if you look at the equations you can see how there are multiple pathways.

They also presume only one substrate, so multi-susbtrate reactions need to have the kinetics modified as such. For that the mechanism are: Ping-pong, ternary- ordered and random, all of which impact on the kinetics.If the concentration of the intermediate complex is presumed not to change with time, then another model is the Briggs-Haldane model, known as quasi-steady state kinetics.

Then there are the kinetic models for inhibition. Of which the michaelis menten, where the kinetics vary according to how the inhibitors binds. But as is seen with the above MAO paper, can vary depending on the pathways and binding affinities. If an enzyme is irreversible then the kinetics also differ (Mcdonald, A. G. & Dublin, T. C. Enzymes : Irreversible Inhibition. 1–17 (2012). doi:10.1002/9780470015902.a0000601.pub2).

It is also worth noting, it is better to use non-linear regression to analyze kinetics as linearizing the data can lead to calculation errors (despite admittedly being the easier and clearer option).


Need for Different Kinetic Mechanisms

Enzymatic reactions proceed through a series of steps. These steps can shed light on the enzyme’s properties. Some enzymes have single-substrate molecules, such as hammerhead ribozymes (Murray et al. 2002) or proteases (Vitte 2015) According to the RNA world hypothesis, the early evolution of life depended on some RNA sequences catalysing the type of polymerisation needed for RNA replication (Benner 1989). Simple kinetic mechanisms are thought to have evolved first in ribozymes or protease enzymes (Murray et al. 2002 Vitte 2015). Single-substrate kinetic mechanisms are thought to represent the first steps in evolutionary processes (Johnston et al. 2001). In reality, most enzymes have complex active centres and have more than one substrate and more than one product. The complex biological activity of enzymes requires extraordinarily complex machinery, and the activity proceeds via very complex reactions. Enzymes that can catalyse complex reactions have multiple substrates and complex enzyme kinetic mechanisms. For enzymes with two substrates, the binding of these substrates can occur through two mechanisms: a sequential mechanism and a non-sequential mechanism. If the substrate forms an enzyme–substrate complex before a reaction takes place, the products that are released are called ‘sequential’. Sequential mechanisms have displacement reaction both substrates bind to the enzyme and then reaction begins and proceeds to form products which are then released from the enzyme. Sequential mechanisms consist of three subgroups: random, ordered and Theorell–Chance types. In random mechanisms, any substrate can bind first to the enzyme, and any product can be produced. Theorell–Chance mechanism in which there is an obligatory order of substrate association and product release without the accumulation of the ternary complex. In ordered mechanisms, substrates are added and products are produced in a specific order. Non-sequential mechanism is also known as the “ping-pong” mechanism is characterised by the change of the enzyme into an intermediate form. The reaction proceeds with the release of one or more products between the additions of two substrates. This mechanism is also called the double placement reaction and common in group transfer. One key character of this reaction is the existence of a substituted enzyme intermediate, in which the enzyme is temporarily modified. The possible evolutionary order of these kinetic mechanisms is given in Fig. 1 (Murray et al. 2002 Vitte 2015 Benner 1989 Wang and Wu 2007 Zuccotti et al. 2001 McClard et al. 2006 Yu et al. 2014 Freist and Sternbach 1984 Celeste et al. 2012 Kim and Kang 1994 Menefee and Zeczycki 2014 Vergnolle et al. 2013).

Possible evolutionary order of kinetic mechanisms. The figure schematically shows the going from principal para fundo represents an evolutionary advance of kinetic mechanisms both of complexity and time

Two or more enzymes (or multiple forms of the same enzyme) catalyse the same reaction. The substrate concentration determines the velocity of the enzyme reaction (Nagao et al. 2014 Wolfe 2005). In random-reaction mechanisms, the order in which the substrates bind does not matter. In ordered reactions, one substrate must bind the enzyme before the second substrate is able to bind (Segel 1975). The Theorell–Chance catalytic mechanism, also known as ‘hit-and-run’, is a specific type of ordered mechanism. The main difference between the Theorell–Chance mechanism and the ordered bi–bi mechanism is that the concentration of EAB and EPQ complexes is essentially zero (A and B are the substrates and P and Q the products and EAB is enzyme–substrate complex and EPQ is the enzyme product complex) (Segel 1975 Zhang et al. 2014). Sequential kinetics can be distinguished from ping-pong kinetic mechanisms by the formation and release of one product before the binding of the second substrate.

In random mechanism, there is no obligatory binding sequence and this makes the reaction mechanism much more complex. Therefore, we may predict/explain that ordered bi–bi evolve into random bi–bi catalytic mechanisms (Segel 1975). It has been suggested that promiscuous activities are common because the evolution of a perfectly specific active site is both difficult and unnecessary (Copley 2015). The non-sequential mechanism, also known as the ping-pong mechanism, does not require both substrates to bind before releasing the first product. The name refers to the way in which the enzyme bounces back and forth from an intermediate state to its standard state (Segel 1975). For example, in the aminoacylation of tRNAIle, there are four different orders of substrate addition and product release that take place via sequential ordered ter–ter, rapid equilibrium sequential random ter–ter, random bi–uni uni–bi ping-pong and bi–bi uni–uni ping-pong, with a rapid equilibrium segment, mechanisms. tRNAVal is aminoacylated in rapid equilibrium random ter–ter order via a bi–bi uni–uni ping-pong mechanism with a rapid equilibrium segment and via two bi–uni uni–bi ping-pong mechanisms. It is assumed that assay conditions can be regarded as a stepwise approximation of physiological conditions and that considerable changes in error rates, up to one order of magnitude, may be possible in vivo (Freist and Sternbach 1984). Numerous steady-state kinetic studies have examined the complex catalytic reaction mechanism of multifunctional enzymes, such as pyruvate carboxylase. This enzyme catalyses reactions through a non-classical sequential bi–bi uni–uni reaction mechanism (Menefee and Zeczycki 2014). However, in experiments of another multifunctional enzyme, enzyme fatty acyl-AMP ligase FadD33, the researchers clearly demonstrated that catalysis proceeded via a bi uni–uni bi ping-pong kinetic mechanism (Vergnolle et al. 2013). N10-formyltetrahydrofolate synthetase is a folate enzyme that catalyses the formylation of tetrahydrofolate in an ATP-dependent manner, specifically, via a random bi uni–uni bi ping-pong ter–ter mechanism (Celeste et al. 2012). Malonyl-CoA synthetase catalyses the formation of malonyl-CoA directly from malonate and CoA, with hydrolysis of ATP into AMP and pyrophosphate (PPi). The catalytic mechanism of malonyl-CoA synthetase was investigated in steady-state kinetics and initial-velocity and product inhibition studies with AMP and PPi. The results strongly pointed to an ordered bi uni–uni bi ping-pong ter–ter system as the most probable steady-state kinetic mechanism of malonyl-CoA synthetase (Kim and Kang 1994).

Enzyme kinetic mechanisms are specific to their substrates because of their functional specificity. Determining enzyme functions is essential for a thorough understanding of cellular processes. The functional specificity of an enzyme can change dramatically following the mutation of a small number of residues. Information about these critical residues can potentially help discriminate enzyme functions (Nagao et al. 2014). In a previous study, researchers added glycerol to their activity assay buffer, and this molecule ‘glycerol’ caused a decrease in both K m e K eu values with respect to the enzyme’s substrate. They attributed this finding to glycerol causing a conformational change in the enzyme, resulting in tighter binding of the enzyme’s substrate and its product (Kulaksiz-Erkmen et al. 2012).

Multienzyme complexes and multifunctional proteins may confer a kinetic advantage by channelling reaction intermediates between consecutive enzymes and reducing the transient time for the establishment of steady states (Easterby 1989). Therefore, various enzymes with different catalytic functions may come together and make big complex machines or complex enzymatic reaction fabrics. One such enzyme is fungal fatty acid synthase, which has played a key role in the evolution of complex multi-enzymes. It has 48 functional domains, which are embedded in a matrix of scaffolding elements (Bukhari et al. 2014). Mechanism pathways for multi-substrate multi-product enzyme-catalysed reactions can become very complex and lead to kinetic models comprising several terms (Bornadel et al. 2013) or quite simple terms, such as random, sequential binding mechanisms (Burke et al. 2013). The most important thing is more than one enzyme come together to improve the productivity and reduce the cost of various processes. The most important point to remember is that more than one enzyme is required to produce any product.

Reaction mechanisms are diverse substrate specificity is achieved by a diversity of not only substrate recognition, but also hydrolysis mechanisms (Arimori et al. 2011). However, it is difficult to predict which bi–bi substrate enzyme kinetic mechanisms emerged first. From an evolutionary perspective, the random mechanism may be much more evolved than the ordered bi–bi mechanisms. In the ordered mechanism, the binding of the first substrate to the enzyme’s active site causes a conformational change, which is required for binding the second substrate. Alternatively, the second substrate binds directly to the first substrate. If the active site of the enzyme contains various catalytic functional groups, then the substrate selectivity of this enzyme will decrease, enabling it to interact easily with various substrates, such as GST enzymes. Cytochrome p450 and GST enzymes have broad substrate specificity. They are responsible for the metabolism of non-physiological substances, such as xenobiotics. Cytochrome P450 enzymes catalyse the metabolism of a wide variety of naturally occurring and foreign compounds, via a ping-pong bi–bi mechanism. GST enzymes from humans and other sources display a random mechanism in which the combination of the enzyme with one substrate does not influence its affinity for the other (Hollenberg 1992 Breton et al. 2000 Caccuri et al. 2001 Bowman et al. 2007 Wang et al. 2011 Kolawole et al. 2011). Enzymes with promiscuous activities are also likely to have a long evolutionary history (Copley 2015).


1 Introduction

Chemical synthesis of complex organic molecules for drug development has benefited immensely from recent developments in flow chemistry and automation. 1 In this respect, the use of microfluidic devices is highly advantageous as it simplifies the precise adjustment and control of essential reaction parameters, such as temperature and diffusion-based mixing efficacy, and it also allows the separation of incompatible reaction steps. 2 In this area of research, the spatial compartmentalization and cascading of reaction steps are increasingly exploited for chemical transformations in microfluidic reactors. 3 Here the synthesis of drugs with multiple stereocenters is a prime example of how cascaded biocatalytic 4 or chemoenzymatic 5 reaction sequences can be used for efficient, scalable production processes. 6

For effective implementation of continuous flow processes, however, the integration of biocatalysts into microfluidic devices is still a major challenge. 7 The immobilization of whole cells or isolated enzymes can be achieved by a plethora of methods, ranging from non-specific physisorption to the use of sophisticated chemical methods, which are often based on genetically-encoded tag systems, such as the (His6)-tag. 8 Likewise, tag systems used for purification, e. g., streptavidin-binding peptide (SBP), 9 or cell biology research (e. g., SpyTag/SpyCatcher, 10 SNAP-Tag, 11 HaloTag 12 ) are being exploited for flow-through biocatalysis. Indeed, the use of fusion proteins decorated with such tag systems has led to the establishment of ‘self-immobilizing biocatalysts’ that can be used in continuous microfluidic processes with high efficiency and specificity. 13 The self-assembled immobilization of such fusion proteins can, for example, be achieved on magnetic beads with a high level of control over stoichiometry and geometric alignment by single-point immobilization. 14 The further integration of such enzyme-functionalized magnetic nano- and microparticles into flow-through reactors enables a variety of applications, ranging from sensors 15 and lab-on-a-chip systems 16 to continuous flow-through reactors for biocatalysis. 13a, 13b, 17

The use of immobilized enzymes in flow-through systems allows the biocatalysis process to be carried out in a heterogeneous catalysis regime, often in a packed-bed reactor format. For an optimization of such systems, it would be desirable to model the process em sílico, in order to gain a better understanding of the biotechnological process and to enable its economic optimization with reduced experiments and resources. However, it is still difficult to describe and simulate coupled enzyme reactions that occur in a microfluidic setup with an overflown, porous, catalytically active bed due to the high complexity of such systems.

The detailed simulation of the reactor performance in such a system requires mathematical models for the enzymatic processes, which depend on kinetic models for the distinctive chemical conversions. Mathematical descriptions of enzyme kinetics, in particular Michaelis and Menten kinetics, 18 have led to the range of today's methodologies, such as canonical, approximate and mechanistic rate formalisms. 19 However, Michaelis-Menten kinetics assumes constant, excess concentrations of co-substrates, and these conditions are usually not present inside microfluidic packed-bed reactors. For instance, Lilly et al. found decreased Michaelis-Menten Km values for increased flow rates and therefore made estimations on enzyme kinetic parameters in continuous-flow systems. 20 In addition, for enzymes using two substrates, multi-substrate laws such as bi-bi mechanisms must be considered, which are divided into sequential mechanisms (ordered or random binding) and the ping-pong mechanism. 21

In order to implement such mechanistic reaction kinetics into packed-bed reactors containing porous particles, several mathematical models have been developed in earlier works. 22 However, these works focused on investigations of packed bed reactors with particle diameters larger than 300 μm operated by perfusion through the packed bed. To expand this methodological repertoire to complex, multi-substrate enzymatic reactions, we here describe a new model for a plug flow reactor consisting of a porous bed of compact, uniform particles functionalized with an immobilized reductase which is overflowed with an aqueous mobile phase containing an enzymatic NADPH cofactor regeneration system. We show that through the synergy of experiment and mathematical modeling, the behavior of the reaction system can be predicted, thereby reducing the number of experiments as well as the material consumption for optimizing the catalytic performance of the system.


Referências

Ficicioglu C, Thomas N, Yager C et al. Duarte (DG) galactosemia: a pilot study of biochemical and neurodevelopmental assessment in children detected by newborn screening. Mol Genet Metab 200895:206–212.

Brenner C . Hint, Fhit, and GalT: function, structure, evolution, and mechanism of three branches of the histidine triad superfamily of nucleotide hydrolases and transferases. Biochemistry 200241:9003–9014.

Frey PA . The Leloir pathway: a mechanistic imperative for three enzymes to change the stereochemical configuration of a single carbon in galactose. FASEB J 199610:461–470.

Calderon FR, Phansalkar AR, Crockett DK, Miller M, Mao R . Mutation database for the galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT) gene. Hum Mutat 200728:939–943.

Tyfield L, Reichardt J, Fridovich-Keil J et al. Classical galactosemia and mutations at the galactose-1-phosphate uridyl transferase (GALT) gene. Hum Mutat 199913:417–430.

Lai K, Elsas LJ . Structure-function analyses of a common mutation in blacks with transferase-deficiency galactosemia. Mol Genet Metab 200174::264–272.

Goldstein N, Cohen Y, Pode-Shakked B et al, The GALT rush: high carrier frequency of an unusual deletion mutation of the GALT gene in the Ashkenazi population Mol Genet Metab 2011102:157–160.

Coffee B, Hjelm LN, DeLorenzo A, Courtney EM, Yu C, Muralidharan K . Characterization of an unusual deletion of the galactose-1-phosphate uridyl transferase (GALT) gene. Genet Med 20068:635–640.

Crushell E, Chukwu J, Mayne P, Blatny J, Treacy EP . Negative screening tests in classical galactosaemia caused by S135L homozygosity. J Inherit Metab Dis 200932:412–415.

Elsas LJ, Langley S, Steele E et al. Galactosemia: a strategy to identify new biochemical phenotypes and molecular genotypes. Am J Hum Genet 199556:630–639.

Carney AE, Sanders RD, Garza KR et al. Origins, distribution and expression of the Duarte-2 (D2) allele of galactose-1-phosphate uridylyltransferase. Hum Mol Genet 200918:1624–1632.

Fridovich-Keil JL, Gambello MJ, Singh RH, Sharer JD. Duarte variant galactosemia. In: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH et al., (eds). GeneReviews. University of Washington: Seattle, WA, 1993.

Langley SD, Lai K, Dembure PP, Hjelm LN, Elsas LJ . Molecular basis for Duarte and Los Angeles variant galactosemia. Am J Hum Genet 199760:366–372.

Thoden JB, Timson DJ, Reece RJ, Holden HM . Molecular structure of human galactokinase: implications for type II galactosemia. J Biol Chem 2005280:9662–9670.

Bergsma DJ, Ai Y, Skach WR et al. Fine structure of the human galactokinase GALK1 gene. Genome Res 19966:980–985.

Timson DJ, Reece RJ . Functional analysis of disease-causing mutations in human galactokinase. Eur J Biochem 2003270:1767–1774.

Timson DJ . The structural and molecular biology of type III galactosemia. IUBMB Life 200658:83–89.

Berry GT. Classic galactosemia and clinical variant galactosemia. In: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH et al, (eds). GeneReviews. University of Washington: Seattle, WA, 1993.

Webb AL, Singh RH, Kennedy MJ, Elsas LJ . Verbal dyspraxia and galactosemia. Pediatr Res 200353:396–402.

Ficicioglu C, Hussa C, Gallagher PR, Thomas N, Yager C . Monitoring of biochemical status in children with Duarte galactosemia: utility of galactose, galactitol, galactonate, and galactose 1-phosphate. Clin Chem 201056:1177–1182.

Lynch ME, Potter NL, Coles CD, Fridovich-Keil JL . Developmental outcomes of school-age children with Duarte galactosemia: a pilot study. JIMD Rep 201519:75–84.

Powell KK, Van Naarden Braun K, Singh RH, Shapira SK, Olney RS, Yeargin-Allsopp M . Long-term speech and language developmental issues among children with Duarte galactosemia. Genet Med 200911:874–879.

Welling L, Bernstein LE, Berry GT et al. International clinical guideline for the management of classical galactosemia: diagnosis, treatment, and follow-up. J Inherit Metab Dis 201640:171–176.

Hennermann JB, Schadewaldt P, Vetter B, Shin YS, Monch E, Klein J . Features and outcome of galactokinase deficiency in children diagnosed by newborn screening. J Inherit Metab Dis 201134:399–407.

Bosch AM, Bakker HD, van Gennip AH, van Kempen JV, Wanders RJ, Wijburg FA . Clinical features of galactokinase deficiency: a review of the literature. J Inherit Metab Dis 200225:629–634.

Fridovich-Keil J, Bean L, He M, Schroer R. Epimerase deficiency galactosemia. In: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH et al, (eds). GeneReviews. University of Washington: Seattle, WA, 1993.

Committee on Genetics Kaye CI Committee on Genetics Committee on Genetics Accurso F et al. Newborn screening fact sheets. Pediatria 2006118:e934–963.

Kobayashi K, Saheki T, Song YZ. Citrin deficiency. In: Pagon RA, Adam MP, Ardinger HH et al, (eds). GeneReviews. University of Washington: Seattle, WA, 1993.

Peduto A, Spada M, Alluto A, La Dolcetta M, Ponzone A, Santer R . A novel mutation in the GLUT2 gene in a patient with Fanconi-Bickel syndrome detected by neonatal screening for galactosaemia. J Inherit Metab Dis 200427:279–280.

Beutler E, Baluda MC . Improved method for measuring galactose-I-phosphate uridyl transferase activity of erythrocytes. Clin Chim Acta 196613:369–379.

Adam BW, Hall EM, Sternberg M et al. The stability of markers in dried-blood spots for recommended newborn screening disorders in the United States. Clin Biochem 201144:1445–1450.

Sartippour MR, Doroudian R, Frampton G et al. Identification of galactose-1-phosphate uridyl transferase gene common mutations in dried blood spots. Clin Chim Acta 2014436:298–302.

Fujimoto A, Okano Y, Miyagi T, Isshiki G, Oura T . Quantitative Beutler test for newborn mass screening of galactosemia using a fluorometric microplate reader. Clin Chem 200046:806–810.

Sokol RJ, McCabe ER, Kotzer AM, Langendoerfer SI . Pitfalls in diagnosing galactosemia: false negative newborn screening following red blood cell transfusion. J Pediatr Gastroenterol Nutr 19898:266–268.

Therrell BL Jr., Lloyd-Puryear MA, Camp KM, Mann MY . Inborn errors of metabolism identified via newborn screening: ten-year incidence data and costs of nutritional interventions for research agenda planning. Mol Genet Metab 2014113:14–26.

Li Y, Ptolemy AS, Harmonay L, Kellogg M, Berry GT . Quantification of galactose-1-phosphate uridyltransferase enzyme activity by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 201056:772–780.

Lai K, Langley SD, Dembure PP, Hjelm LN, Elsas LJ 2nd . Duarte allele impairs biostability of galactose-1-phosphate uridyltransferase in human lymphoblasts. Hum Mutat 199811:28–38.

Centers for Disease Control and Prevention. Good laboratory practices for biochemical genetic testing and newborn screening for inherited metabolic disorders. MMWR Recomm Rep 201261:1–44.

Clinical and Laboratory Standards Institute Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory Approved GuidelineTerceira edição. CLSI Document EP28-A3CWayne, PA,, 2010.

De Bruyn CH, Raymakers C, Wensing A, Oei TL . Galactose-1-phosphate uridyltransferase activities in erythrocytes from a patient with galactosemia: discrepancy between two methods. Clin Chim Acta 197778:145–150.

Xu YK, Kaufman FR, Donnell GN, Ng WG . Radiochemical assay of minute quantities of galactose-1-phosphate uridyltransferase activity in erythrocytes and leukocytes of galactosemia patients. Clin Chim Acta 1995235:125–136.

Ko DH, Jun SH, Park HD et al. Multiplex enzyme assay for galactosemia using ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clin Chem 201056:764–771.

Li Y, Ptolemy AS, Harmonay L, Kellogg M, Berry GT . Ultra fast and sensitive liquid chromatography tandem mass spectrometry based assay for galactose-1-phosphate uridylyltransferase and galactokinase deficiencies. Mol Genet Metab 2011102:33–40.

Chen J, Meyers GA, Bennett MJ . An interference-free two-step enzyme assay with UPLC-tandem mass spectrometric product measurement for the clinical diagnosis of uridine diphosphate galactose-4-epimerase deficiency. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2014959:5–9.

Pesce MA, Bodourian SH, Nicholson JF . A new microfluorometric method for the measurement of galactose-1-phosphate in erythrocytes. Clin Chim Acta 1982118:177–189.

Chen J, Yager C, Reynolds R, Palmieri M, Segal S . Erythrocyte galactose 1-phosphate quantified by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 200248:604–612.

Schadewaldt P, Kamalanathan L, Hammen HW, Wendel U . Stable-isotope dilution analysis of galactose metabolites in human erythrocytes. Rapid Commun Mass Spectrom 200317:2833–2838.

Ficicioglu C, Yager C, Segal S . Galactitol and galactonate in red blood cells of children with the Duarte/galactosemia genotype. Mol Genet Metab 200584:152–159.

Berry GT, Nissim I, Lin Z, Mazur AT, Gibson JB, Segal S . Endogenous synthesis of galactose in normal men and patients with hereditary galactosaemia. Lanceta 1995346:1073–1074.

Berry GT, Nissim I, Gibson JB et al. Quantitative assessment of whole body galactose metabolism in galactosemic patients. Eur J Pediatr 1997156 (suppl 1):S43–49.

Palmieri M, Mazur A, Berry GT et al. Urine and plasma galactitol in patients with galactose-1-phosphate uridyltransferase deficiency galactosemia. Metabolismo 199948:1294–1302.

Richards S, Aziz N, Bale S et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med 201517:405–424.


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