Em formação

O que significa usar DMSO como um dissolvente em experiências de biologia?


Em muitas publicações de biologia, vi que o dimetilsulfóxido (DMSO) é usado para dissolver drogas. No entanto, os ensaios baseados em células ainda são realizados em meio à base de água, como RPMI ou PBS.

Minha pergunta é: se um composto não é solúvel em água, qual é o propósito de usar DMSO? Embora a droga possa ser dissolvida em DMSO puro, ela não precipitará após colocar o composto dissolvido em DMSO no meio de cultura?


Normalmente, esses compostos são dissolvidos em DMSO para fazer uma solução estoque concentrada (por exemplo, 1000x), que é então diluída no meio de cultura. Freqüentemente, o composto é solúvel em água nessa diluição mais baixa, mas não na concentração mais alta necessária para fazer um estoque. Às vezes, o composto tem baixa solubilidade em água e grande parte precipita. Isso ainda nos permite testar o efeito da fração que permanece solúvel.


Viabilidade celular

A viabilidade celular foi avaliada pelo ambiente redutor de células viáveis ​​que, após a entrada, converte a solução não fluorescente à base de resazurina em resofurina altamente fluorescente. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10 4 células por poço. As células foram tratadas com 0–72 h com 0–10 U / mL de EPO para viabilidade celular basal. Para o estudo de quimiorresistência, as células foram pré-tratadas com 1 U / mL de EPO por 4 h, em seguida, incubadas com cisplatina a 50 μM por 72 h. Ao final do tratamento, 10 μL do reagente Presto Blue (Thermo Fisher Scientific, EUA) foram adicionados a cada poço contendo 100 μL de meio. A placa foi então incubada por 30 min a 37 ° C, e a absorbância de cada poço foi medida em um leitor de microplaca (Varioscan, Thermo, EUA) a 590 nm. A viabilidade celular relativa foi calculada como a porcentagem de células não tratadas.


Quantas passagens esperar após reviver antes da experiência - (Dez / 10/2007)

Após o descongelamento das células, geralmente quantas passagens você deixa a célula crescer antes de usá-las para experimentos, por exemplo, transfecção? Às vezes, uso as células imediatamente após se tornarem confluentes.

Após o descongelamento das células, geralmente quantas passagens você permite que a célula cresça antes de usá-las para experimentos, por exemplo, transfecção? Às vezes, uso as células imediatamente após se tornarem confluentes.

Eu normalmente passaria minhas células pelo menos uma vez. Principalmente porque preciso de um número maior de células para meus experimentos, mas também para ter certeza de que as células estão adequadas após terem sido congeladas. Eu não acho que haja um padrão de ouro.

Kirsten
Aarhus University Hospital
Dinamarca

definitivamente pelo menos uma vez - eu usaria dois para tirar qualquer dúvida

Normalmente escolhemos dois. Você não gostaria de nenhum DMSO em seus experimentos

Obrigado pessoal pela sua resposta. Eu concordo com todos vocês. Vou esperar pelo menos uma passagem antes de usar as células para experimentos.

você obterá um crescimento melhor se remover o dmso um dia após o descongelamento, uma vez que as células tenham se conectado - basta substituir a mídia - sem necessidade de passagem

você obterá um crescimento melhor se remover o dmso um dia após o descongelamento, uma vez que as células tenham se conectado - apenas substitua a mídia - sem necessidade de passagem

Você também pode diluir as células descongeladas em mídia fresca (fria), girá-las por 10 min @ 800 rpm, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet novamente em mídia de 10 ml.

Após o descongelamento das células, geralmente quantas passagens você deixa a célula crescer antes de usá-las para experimentos, por exemplo, transfecção? Às vezes, uso as células imediatamente após se tornarem confluentes.

Você pode usar células após um degelo, não um problema. Tudo que você precisa fazer é lavar as células 2-3 vezes, o DMSO sai com bastante facilidade e rapidez, na minha experiência. Você pode passar as células apenas para se certificar de que elas se aclimatam, as proteínas são expressas ao máximo e assim por diante, mas eu não me preocuparia. Muitas pessoas usam células para ensaios diretamente do nitrogênio líquido. Existem algumas funções, particularmente para as células NK, que são atenuadas pelo processo de congelamento e descongelamento. Nada que você possa fazer provavelmente restaurará essa função.

Normalmente, passo duas vezes antes de fazer qualquer coisa, mas uma vez fiz um esforço de transfecção rápido no dia seguinte ao descongelamento das células CV-1. Foi bem.

você obterá um crescimento melhor se remover o dmso um dia após o descongelamento, uma vez que as células tenham se conectado - apenas substitua a mídia - sem necessidade de passagem

Você também pode diluir as células descongeladas em mídia fresca (fria), girá-las por 10 min @ 800 rpm, remover o sobrenadante e ressuspender o pellet novamente em mídia de 10 ml.

Esta é a resposta correta, mas não para a pergunta original. Eu concordo totalmente com você sobre a centrifugação em g baixo (por favor, não use RPM, pois isso não significa nada. Tem que ser em g).

Oh querido, eu e Dom brigamos novamente. Em nossos estudos, descobrimos ao longo dos anos que manter as células em meio DMSO + durante a noite é mais prejudicial às células do que centrifugar e reduzir a concentração de DMSO no Tempo 0.

A resposta à pergunta original é. varia com diferentes linhas celulares e primárias. Como regra geral, pelo menos 1 ou 2 passagens são necessárias. Para células J774. as células mais fáceis e menos destrutíveis do mundo. você não precisa nem mesmo passá-los para experimentação.


Resultados

Microtissues 3D humanos (MTs) de um modelo cardíaco em maturação e um modelo hepático maduro foram expostos a meio de cultura com ou sem DMSO a 0,1% por duas semanas com pontos de amostragem em 2, 8, 72, 168, 240 e 336 horas. O proteoma (aproximadamente 2.000 proteínas medidas), o transcriptoma completo (incluindo miRNAs) e a metilação do genoma inteiro foram medidos em material obtido da mesma amostra. A Figura 1 contém uma visão geral gráfica do projeto experimental. A fim de obter uma primeira visão geral dos efeitos cross-omics induzidos por DMSO, quantidades de entidades diferencialmente alteradas (todas corrigidas para múltiplos testes usando FDR & lt0,05) são resumidas para cada plataforma. O número de entidades alteradas diferencialmente diferiu entre os tipos de tecido, com amostras cardíacas mostrando um efeito maior de DMSO do que hepático, com exceção de mRNAs. Esta diferença é especialmente perceptível para miRNAs e metilação do genoma. Como os dados de proteômica foram menos informativos devido à sua natureza parcial, esses resultados foram incluídos nos Dados Suplementares. Além disso, a análise de componente principal (PCA), usando médias de triplicados, para cada plataforma (Fig. 2 e dados suplementares) descreve diferenças claras entre 0,1% de DMSO exposto (DMSO) e amostras não tratadas (UNTR), com exceção de metilação em amostras hepáticas MTs.

Visão geral gráfica do projeto experimental combinado com o resumo das entidades diferenciais de cada método de análise. As informações específicas do tecido são representadas em laranja para cardíaco e verde para hepático. Além disso, as exposições são coloridas em azul e as plataformas de medição em roxo. Abreviaturas: h = horas mRNA = RNA mensageiro miRNA = microRNA.

PCAs representando diferenças entre DMSO e UNTR para todas as plataformas medidas. (uma) PCA de RNAs indica diferenças claras na expressão de RNA entre DMSO (triângulo) e UNTR (círculos). As amostras cardíacas (esquerda) são mais distintas do UNTR do que as hepáticas (direita). (b) PCA de miRNAs revela separação clara entre DMSO e UNTR em amostras cardíacas, enquanto as amostras hepáticas parecem mais suscetíveis à duração da exposição (conforme visto pelo padrão de cor que corresponde aos pontos de tempo específicos, consulte a legenda). (c) PCA de metilação do promotor indica diferenças entre DMSO e UNTR para amostras cardíacas, mas não para amostras hepáticas.

Para estudar os efeitos moleculares do DMSO, os processos celulares afetados foram analisados ​​usando o transcriptoma completo. Posteriormente, os efeitos específicos do tecido do DMSO na regulação da expressão gênica foram investigados por meio da análise de alterações nos miRNAs e na metilação do genoma.

Efeitos do DMSO nos processos celulares

Os efeitos do DMSO em mRNAs foram descritos por PCA (Fig. 2a, b). A separação clara entre UNTR e DMSO 0,1% indicou que o DMSO foi capaz de afetar os processos celulares, alterando a expressão gênica. A comparação entre DMSO e UNTR resultou em 2051 genes diferencialmente expressos (DEGs = FDR & lt0,05 dos quais 871 com | log2FC | & gt1) em MTs cardíacos e 2711 DEGs (dos quais 1879 com | log2FC | & gt1) em MTs hepáticos, dos quais 60,7 % e 62,9% DEGs foram regulados para baixo, respectivamente.

Análise do caminho de DEGs

Para identificar os processos celulares afetados pela exposição ao DMSO, DEGs foram usados ​​para análise de sobre-representação da via usando ConsensusPathDB 15 com o banco de dados Reactome com curadoria 16. As vias significativamente super-representadas (valor q & lt 0,05) foram ordenadas usando as conexões hierárquicas entre as (sub) vias obtidas a partir do Reactome Pathway Browser (Tabelas Suplementares 1,2). Um resumo contendo os níveis de via hierárquica mais elevados (doravante referidos como clusters) está incluído na Tabela 1 para MTs cardíacos e na Tabela 2 para MTs hepáticos.

Por meio da análise de caminhos em DEGs, 225 caminhos significativamente super-representados (valor q & lt 0,05) foram encontrados em MTs cardíacos, que corresponderam a 19 clusters (de um total de 25 clusters no Pathway Browser) e 167 caminhos correspondentes a 16 clusters em MTs hepáticas. Houve uma sobreposição substancial entre os tipos de tecido, com 60 caminhos e 15 clusters encontrados em ambos. Embora houvesse diferenças na magnitude do efeito do DMSO entre os tipos de tecido, os processos biológicos afetados pelo DMSO não parecem ser específicos do tecido.

O agrupamento mais significativamente afetado pelo DMSO é o agrupamento do “metabolismo” nas MTs hepáticas. Aqui, a maioria dos efeitos foram encontrados nas vias "ciclo do ácido cítrico e transporte respiratório de elétrons" (valor q: 3,5 * 10-10, 63 DEGs de 171 genes, 76,2% regulado para baixo), "metabolismo da glicose" (valor q: 9,9 * 10 −9, 36 DEGs de 77 genes, 80,5% regulado para baixo) e “metabolismo de lipídios e lipoproteínas” (valor q: 2,9 * 10 −6, 165 DEGs de 728 genes, 55,2% regulado para baixo). Mudanças no metabolismo de lipídios e lipoproteínas não foram detectadas em MTs cardíacos usando DEGs, mas efeitos semelhantes de DMSO foram observados para "ciclo do ácido cítrico e transporte de elétrons respiratórios" (valor q: 1,3 * 10-12, 58 DEGs de 171 genes, 65,5% regulado para baixo) e “metabolismo da glicose” (valor q: 2,8 * 10-3, 20 DEGs de 77 genes, 55,0% regulado para baixo), embora menos genes tenham sido regulados para baixo em MTs cardíacos em comparação com MTs hepáticos.

Outro cluster altamente afetado pelo tratamento com DMSO em ambos os tipos de tecido foi o “transporte mediado por vesículas”. Os efeitos do DMSO neste cluster foram detectados principalmente em processos relacionados ao transporte e secreção de proteínas mediadas por Golgi. Desse processo, o “transporte anterógrado ER-para-Golgi” foi o mais afetado (Cardíaco: valor q: 2,4 * 10 −6, 38 DEGs de 134 genes, 68,4% de regulação negativa Hepática: valor q: 1,0 * 10 - 5, 44 DEGs de 134 genes, 44,4% com regulação negativa). Esta via também fazia parte do agrupamento “metabolismo de proteínas”, que adicionalmente revelou efeitos de DMSO na “glicosilação ligada a N de asparagina” (Cardíaco: valor q: 2,1 * 10-6, 64 DEGs de 283 genes, 76,6% regulado para baixo Hepático: valor q: 1,2 * 10 -7, 83 DEGs de 283 genes, 54,8% de regulação negativa), que foram modificações de proteínas pós-transcricionais necessárias para o transporte de proteínas do RE para o Golgi 17.

Embora o conjunto de “respostas celulares ao estresse” tenha sido detectado em ambos os tipos de tecido, as vias super-representadas diferem. A “senescência celular” foi significativamente afetada em MTs cardíacos (valor q: 2,6 * 10 −4, tamanho da via: 192, 42 DEGs, 64,3% regulada para baixo), mas não detectada durante a análise da via em MTs hepáticas. Finalmente, clusters específicos cardíacos adicionais afetados por DMSO foram "ciclo celular", "reparo de DNA", "biogênese e manutenção de organelas", mas também o cluster altamente significativo (q & lt 0,01) de "organização da cromatina". Uma vez que as vias afetadas mais significativamente foram encontradas em ambos os tipos de tecido, isso indica ações robustas do DMSO.

Efeitos DMSO observados na regulação da expressão gênica e tradução

Vias relacionadas à regulação da expressão gênica e tradução já foram detectadas durante a análise da via de MTs cardíacas (Tabela 3). Embora essas vias não estivessem super-representadas nas MTs hepáticas, as quantidades de DEGs detectadas indicaram que o DMSO foi capaz de influenciar esses processos e pode induzir alterações biológicas no modelo celular.

Efeitos DMSO observados na regulação por microRNAs

A influência específica do tecido de DMSO foi observada nos dados de sequenciamento de miRNAs. De 1.105 miRNAs cardíacos sequenciados, 704 (= 63,7%) foram expressos diferencialmente (DE, FDR & lt0,05) com 59,5% mostrando regulação negativa. Além disso, o gráfico de PCA (Fig. 2c) revelou uma diferença clara entre os miRNAs dos grupos de tratamento. Em MTs hepáticos, de 1.033 miRNAs sequenciados, 186 (= 18%) eram DE com aproximadamente metade dos miRNAs sendo regulados positivamente (47,3%). Além disso, o gráfico de PCA não apenas revelou uma separação clara entre os miRNAs dos grupos de tratamento, mas também indicou um efeito dependente do tempo. Os dois componentes principais (tempo e dose) representaram juntos mais de 95% da variação total, deixando apenas um efeito menor para outros fatores.

Para investigar a fonte da diferença específica do tecido, as alterações da expressão gênica no processo de biogênese do miRNA foram investigadas com mais detalhes (Fig. 3). A biogênese do miRNA começa pela transcrição do miRNA primário transcrito pela polimerase II (um complexo de 11 subunidades) ou polimerase III (um complexo de 10 subunidades). Em MTs cardíacos, a polimerase II continha 1 genes regulados positivamente e 8 regulados negativamente. Em MTs hepáticos, 5 genes foram regulados para baixo e 1 foi regulado para cima. Embora menos genes tenham sido regulados para baixo nas MTs hepáticas, as alterações de dobra foram maiores em comparação com as MTs cardíacas. A clivagem do pri-miRNA em pré-miRNA não pareceu afetada pela exposição ao DMSO. DICER1 (que cliva pré-miRNAs) foi regulado para baixo em MTs cardíacos e regulado para cima em MTs hepáticos, mostrando uma diferença específica de tecido clara na resposta à exposição ao DMSO. Finalmente, AGO2 (que codifica o componente principal do miRNA-RISC) foi regulado para baixo em MTs cardíacos. As mudanças neste processo podem induzir diferenças no conteúdo de miRNA das células e, portanto, afetar sua função regulatória.

Efeito do DMSO no processo de silenciamento de genes por RNAs. DEGs na biogênese de miRNA. O processo completo é dividido em subprocessos (ovais roxos) e representando genes envolvidos (retângulos azuis) e DEGs detectados para amostras cardíacas (retângulos laranja) e hepáticas (retângulos verdes).

Em MTs cardíacos, os genes regulados negativamente na biogênese de miRNA poderiam explicar a quantidade extremamente alta de miRNA DE regulado negativamente e indicar desregulação extrema do silenciamento de genes por miRNAs. Em MTs hepáticos, onde a única alteração significativa foi a regulação positiva de DICER1 (Tabela 3), a biogênese do miRNA não foi interrompida pela exposição ao DMSO.

Para obter uma indicação dos efeitos do DMSO no silenciamento de genes por miRNAs, o banco de dados miRTarBase 18, contendo interações microRNA-alvo (MTI) validadas experimentalmente, foi usado para obter alvos gênicos de miRNAs DE detectados. Incluímos apenas MTIs com evidências fortes (validados por ensaio repórter, Western blot ou qPCR). Dos 704 miRNAs cardíacos DE, apenas 281 (= 40%) puderam ser encontrados no banco de dados, resultando em um total de 2.051 alvos gênicos potencialmente afetados por alterações induzidas por DMSO no silenciamento do gene miRNA. Para MTs hepáticos, alvos para 106 DE miRNAs (= 57%) foram obtidos, com um total de 545 genes potencialmente afetados. Os alvos genéticos obtidos foram usados ​​para visualizar as vias super-representadas usando o Reactome Pathway Browser (Fig. 3 suplementar). Inesperadamente, as vias super-representadas estavam localizadas nos mesmos aglomerados para ambos os tipos de tecido. A maioria dos efeitos foram observados para “Transdução de Sinal”, “Sistema Imunológico” e “Expressão Gênica”. No entanto, a desregulação extrema de MTs cardíacos e informações limitadas sobre MTIs está tornando irrelevante qualquer análise downstream no suposto mRNA afetado.

Efeitos DMSO observados na epigenética

A fim de avaliar as alterações epigenéticas introduzidas pelo DMSO, nos concentramos na metilação do DNA em todo o genoma. A análise da via de expressão do gene cardíaco revelou desregulação das vias de metilação do DNA. Metiltransferases DNMT1, um fator chave para a manutenção da metilação do DNA, e DNMT3A, facilitando ambos de novo e manutenção da metilação do DNA, foram regulados positivamente enquanto TET1, que desempenha um papel fundamental na desmetilação ativa, foi regulada para baixo em TMs cardíacos (Fig. 4a). A regulação positiva de escritores epigenéticos e a regulação negativa de borrachas após o tratamento com DMSO apontaram para a hipermetilação genômica, que potencialmente reduziu a atividade transcricional. Em contraste, na análise da via hepática, não foi observada desregulação da metilação do DNA. Observe que, em ambos os tipos de tecido, evidências de transcrição para desregulação de outros mecanismos epigenéticos relacionados foram observadas, como metilação de histonas, onde 16 genes e 13 genes foram diferencialmente expressos em MTs cardíacos e hepáticos, respectivamente.

Regulação epigenética da expressão gênica. (uma) DEGs envolvidos na metilação do DNA. O processo é dividido em subprocessos (ovais roxos) e representando genes envolvidos (retângulos azuis) e DEGs detectados para amostras cardíacas (retângulos laranja) e hepáticas (retângulos verdes). (b) Enriquecimento relativo de DMRs (DMSO vs UNTR, FDR 5%) dentro de características genômicas. Para cada recurso, o número de DMRs sobrepostos sobre o número total de janelas testadas para o respectivo recurso é representado. Em comparação com todas as regiões genômicas, as regiões hipermetiladas são enriquecidas para satélites, repetições simples e CGIs distais aos promotores sem evidência regulatória conhecida e as regiões hipometiladas são enriquecidas para repetições simples.

O perfil de metilação do genoma inteiro por MeDIP-seq revelou 66.178 regiões diferencialmente metiladas (DMRs q-value & lt 0,05) em MTs cardíacos. Essas alterações afetaram 1,1% do genoma coberto. Em linha com as mudanças transcricionais observadas de escritores e apagadores de metilação do DNA, 71% dos DMRs corresponderam ao ganho de metilação (46.984 regiões hipermetiladas vs 19.194 regiões hipometiladas). Em contraste, em MTs hepáticos, nenhum DMR passou na correção para testes múltiplos. Além disso, o gráfico de PCA (Fig. 2d) indicou uma diferença entre os grupos de tratamento em MTs cardíacos, mas não em MTs hepáticos. Juntos, este impacto específico do tecido ilustrado do DMSO no metiloma em MTs cardíacos em maturação, enquanto os MTs hepáticos maduros pareciam não afetados.

A fim de analisar os efeitos regulatórios dos DMRs, as regiões foram anotadas com características regulatórias conhecidas, como promotores, ilhas CpG (CGIs), sítios de ligação do fator de transcrição (TFBS) e diferentes classes de elementos repetitivos (Fig. 4b). Ambas as regiões hipo e hipermetiladas enriqueceram classes específicas de repetição, como satélites (odds ratio de hiper / hipometilação: 4,4 / 2,4) e repetições simples (hiper / hipometilação 6,0 / 9,4 odds ratio), enquanto elementos repetitivos em geral não foram enriquecidos. O efeito do DMSO na suprarregulação de DNMTs e subsequente hipermetilação de sequências repetidas estava de acordo com achados anteriores em corpos embrióides de camundongo 19. Como esperado, as regiões hipermetiladas também foram altamente enriquecidas em CGIs sem evidência regulatória, por ex. não se sobrepondo com TFBS e distal aos locais de início da transcrição. A razão de chances dessas regiões sobre o genoma foi de 5,5. Embora CGIs em geral tenham uma razão de chances de 3,2, não houve enriquecimento de CGIs sobrepondo TFBS conhecidos em promotores, as regiões com o melhor potencial regulatório estudado. Assim como as regiões promotoras, outras características, como exons, íntrons e TFBS, foram afetadas pela hipermetilação em aproximadamente as chances do fundo genômico capturado (Fig. 4b). Embora tenhamos encontrado exemplos específicos onde a hipermetilação do promotor co-ocorre com a repressão transcricional, nenhuma correlação global entre a metilação diferencial do promotor e a expressão do gene foi observada. Apenas 148 dos 1.436 genes (10,3%) apresentando promotores hipermetilados foram regulados negativamente em MTs cardíacos tratados com DMSO. 86 dos genes (6%) foram superexpressos, ao contrário do efeito repressivo esperado da metilação.

Tomados em conjunto, nossos dados implicaram uma influência fundamental do DMSO na metilação do DNA em MTs cardíacos, mas não em MTs hepáticos. As alterações induzidas afetaram preferencialmente satélites e repetições simples, bem como CGIs distais aos promotores sem evidências regulatórias conhecidas. A expressão de genes vizinhos não foi significativamente correlacionada às diferenças de metilação. Concluímos, portanto, que a repressão transcricional por hipermetilação do promotor não foi o efeito regulador primário das marcas de metilação alteradas, mas os resultados indicam uma interrupção global dos mecanismos de metilação do DNA.


Protocolo de vídeo de criopreservação de linhas de células de mamíferos

Para mais protocolos de vídeo, visite nossa biblioteca de protocolos de vídeo aqui.

Materiais e Reagentes

  • Criotubos de 1–2 mL
  • Unidade de congelamento CoolCell® (BioCision)
  • Congelando mídia

Criopreservação

Identifique os frascos criogênicos com a data, o nome do pesquisador, o número da célula, o número da passagem e o tipo de célula (e qualquer outra informação útil, por exemplo, modificações genéticas).

Se as células são aderentes, remova o meio de cultura de células, lave em PBS, adicione tripsina suficiente para cobrir as células e incube por aproximadamente 2 min em uma incubadora a 37 ° C. Ressuspender em meio de cultura de células e transferir para um tubo Falcon de 50 mL.

Se as células estiverem em suspensão, basta transferir o volume desejado diretamente para um tubo Falcon de 50 mL.

Conte as células usando um hemocitômetro para determinar sua viabilidade. A viabilidade celular deve ser de pelo menos 75% para criopreservação.

Centrifugue por 5 min a 1.000 rpm em temperatura ambiente.

Prepare a mídia de congelamento (Tabela 1).

Observe que o DMSO não é adequado para todos os tipos de células, portanto, o glicerol pode ser usado como alternativa.

Remova o sobrenadante (guarde-o, pois é necessário para a mídia de congelamento, consulte a Tabela 1) e solte o pellet com cuidado.

Adicione mídia de congelamento para a densidade celular necessária. Para células de mamíferos, geralmente é 1.000.000 / mL de meio de congelamento. As células não devem estar em temperatura ambiente em meio de congelamento por mais de 10 min.

Alíquota de 1 mL em criotubos e prenda as tampas.

Transfira os frascos criogênicos para uma CoolCell (em temperatura ambiente) e coloque em um freezer a -80 ° C. O CoolCell garantirá que a temperatura diminua continuamente em 1 ° C / minuto.

Após aproximadamente 24 h, remova os criotubos do CoolCell e transfira para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

Use o sobrenadante da etapa de centrifugação (etapa 7).

Misture bem e aqueça a 37 ° C antes de usar.

Tabela 1. Diferentes tipos de meios de congelamento para linhas de células de mamíferos

Descongelamento de linhas celulares congeladas

  1. Remova o criotubo do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque em banho-maria a 37 ° C até aproximadamente 80% do degelo (não descongele em temperatura ambiente). Isso não deve demorar mais de 1 minuto.
  2. Usando uma pipeta, transfira o conteúdo do frasco para um tubo Falcon de 15 mL contendo cerca de 10 mL de meio de cultura pré-aquecido.
  3. Centrifugue a 500–1.000 rpm por 5 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda na quantidade adequada de meio de cultura de células.
  4. Transfira as células para um recipiente de cultura e transfira para uma incubadora a 37 ° C.

FAQs

Por que não posso deixar as células descongelarem em temperatura ambiente?

Geralmente, as células devem ser descongeladas o mais rápido possível, acima da temperatura ambiente. Isso ocorre porque um processo de descongelamento lento pode danificar as células.

O meio de congelamento contém agentes crioprotetores essenciais, como dimetilsulfóxido (DMSO), para prevenir a formação de cristais de gelo intracelulares e extracelulares que podem danificar a membrana celular e seus componentes. O DMSO tem a desvantagem de ser citotóxico e, portanto, as células devem ser descongeladas a uma velocidade mais rápida do que é possível à temperatura ambiente, a fim de facilitar a rápida diluição e remoção do DMSO do ambiente imediato das células.

O processo de congelamento lento (-1ºC por minuto) também ajuda a prevenir a formação de cristais de gelo intracelulares, permitindo efluxo suficiente de água antes do congelamento. O descongelamento rápido das células serve ao propósito adicional de evitar que quaisquer cristais que se formaram durante o processo de congelamento danifiquem a membrana celular ou seus componentes.

​​ Por quanto tempo posso armazenar células criopreservadas?

As células congeladas de acordo com os protocolos podem ser mantidas por vários anos em nitrogênio líquido. Idealmente, as células congeladas não devem ser armazenadas a -80 ºC por longos períodos (até uma semana) e devem ser transferidas para nitrogênio líquido sempre que possível. Armazenar células a -80ºC por longos períodos pode comprometer a viabilidade celular.

Achou este protocolo útil? Veja nosso protocolo de contagem de células.


Vídeo: descongelando células

Este vídeo apresenta a melhor maneira de descongelar células sem prejudicá-las nesse processo estressante. Nossos cientistas demonstram como transferir cuidadosamente as células do armazenamento em nitrogênio líquido para a incubadora.

O protocolo a seguir descreve um Procedimento geral para descongelar células criopreservadas. Para protocolos detalhados, consulte sempre o folheto do produto específico da célula.

  1. Remova o criotubo contendo as células congeladas do armazenamento de nitrogênio líquido e imediatamente coloque-o em banho-maria a 37 ° C.
  2. Descongele rapidamente as células (& lt 1 minuto) girando suavemente o frasco no banho-maria a 37 ° C até que haja apenas um pequeno pedaço de gelo no frasco.
  3. Transfira o frasco para uma capela de fluxo laminar. Antes de abrir, limpe o exterior do frasco com etanol a 70%.
  4. Transfira a quantidade desejada de meio de crescimento completo pré-aquecido apropriado para sua linha celular gota a gota no tubo de centrifugação contendo as células descongeladas.
  5. Centrifugue a suspensão de células a aproximadamente 200 × g por 5–10 minutos. A velocidade real de centrifugação e a duração variam dependendo do tipo de célula.
  6. Após a centrifugação, verifique a clareza do sobrenadante e a visibilidade de um pellet completo. Decantar assepticamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
  7. Ressuspenda suavemente as células em meio de crescimento completo e transfira-as para o recipiente de cultura apropriado e para o ambiente de cultura recomendado.

Observação: O tamanho apropriado do frasco depende do número de células congeladas no criotubo, e o ambiente de cultura varia de acordo com a célula e o tipo de meio.


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O que é ultrassonografia para diagnóstico médico?

A ultrassonografia para diagnóstico médico, também conhecida como ultrassom, revolucionou o campo da medicina. Ele oferece uma oportunidade única no diagnóstico, avaliação e tratamento de doenças e condições médicas sem o uso de cirurgia, injeção de corantes ou radiação. A ultrassonografia para diagnóstico médico é uma ferramenta de diagnóstico por imagem médica não invasiva e não tóxica, na qual ondas sonoras de alta frequência são usadas para produzir imagens do corpo humano. O ultrassom é prontamente usado para obter imagens do coração, do fluxo sanguíneo e dos órgãos abdominais, bem como do feto em desenvolvimento e dos órgãos reprodutivos masculino / feminino. Mas o ultrassom se tornou uma ferramenta crítica de saúde além da radiologia, obstetrícia / ginecologia, vascular e cardiologia. Ele agora é usado em áreas como medicina de emergência, ortopedia, medicina esportiva, oftalmologia, reumatologia, medicina da dor, terapia intensiva e muito mais. A profissão cresceu rapidamente nos últimos 20 anos e espera-se que as carreiras em ultrassonografia para diagnóstico médico continuem a crescer nas próximas décadas. A avaliação do mercado de trabalho, os avanços na tecnologia médica e uma pesquisa com os empregadores atuais indicam uma forte demanda por ultrassonografistas bem treinados.

Como se tornar um ultrassonografista médico de diagnóstico

Nosso diploma de ultrassonografia para diagnóstico médico é um programa de quatro anos que inclui um estágio clínico de um ano. A RIT é uma das poucas faculdades com programas de ultrassom nos EUA que levam ao bacharelado em ultrassonografia para diagnóstico médico.

O programa de ultrassom da RIT oferece educação abrangente em ultrassom. O programa começa com uma base sólida em biologia, anatomia e fisiologia humana e anatomia transversal humana. Os cursos de ultrassonografia incluem extensas palestras didáticas com ultrassom de imersão completa em nossa suíte de ultrassom de última geração, onde os alunos têm instruções práticas em instrumentação de ultrassom e habilidades de ultrassonografia e técnicas para avaliação vascular, obstetrícia, ginecologia e abdominal e ultra-sonografia de pequenas peças. Esses cursos ocorrem antes de um estágio clínico de um ano, onde os alunos trabalham em uma variedade de ambientes de cuidados de saúde (hospitais, centros ambulatoriais, consultórios médicos, etc.), onde concluem seus estudos de ultrassonografia com mentores, médicos e outros profissionais médicos . Os cursos de assistência ao paciente e artes liberais complementam seus estudos. Além do desenvolvimento de habilidades de digitalização e diagnóstico que se concentram na relevância para a prática clínica, o programa também enfatiza as habilidades em administração, liderança e pesquisa. Você estará preparado para carreiras em ultrassonografia para diagnóstico médico e áreas médicas relacionadas, bem como para a faculdade de medicina e programas de pós-graduação em ciências da saúde. Este é um programa que oferece educação em ultrassonografia médica abrangente e de alta qualidade. Você se formará bem preparado, bem treinado e muito procurado no local de trabalho.

Aplique Seu Conhecimento

Com uma abordagem prática rigorosa, juntamente com uma ênfase colocada na aprendizagem experiencial, você ganhará uma riqueza de experiência aplicando o que aprendeu em palestras em sala de aula e experiências de laboratório para uma variedade de situações da vida real. Um corpo docente dedicado está comprometido e apaixonado por sua educação e está totalmente comprometido com o desenvolvimento de ultrassonografistas e líderes excepcionais.

Graduates are prepared to pursue a variety of careers in diagnostic medical sonography, nationally and internationally, in medical, industrial, and educational settings. Graduates can be found in a wide range of supervisory and administrative positions in hospitals, clinics, private physicians’ offices, teaching, research, sales, and industry. Graduates also can work as freelance sonographers or for mobile services.

Medical Community Support

Our diagnostic medical sonography degree benefits from a comprehensive, supportive medical community comprised of highly-trained radiologists, physicians, sonologists, sonographers, and echocardiographers that guide, educate, and train our students. Many of these professionals are involved in teaching our students both on-campus and at off-campus clinical sites. Our partner clinical sites also employ many of our graduates. Through these interactions, you are exposed to generous and dedicated health care professionals who will enhance your education through professional development, increase your awareness of community needs, and share a sense of cooperative spirit in which medicine is practiced. In addition, many of our clinical instructors, echocardiographers, and sonographers are alumni of our program and are familiar with the standards, expectations, and rigor of the ultrasound program. Learn more about the program's affiliated faculty.

Ultrasound Program Outcomes and Attrition Rate

RIT’s diagnostic medical sonography degree has exceptional passing rates on the national examinations:

The program has a very low attrition rate (0%) and a retention rate of 100%. Job placement is also 100%.

Additional Sonography Education Opportunities

In addition to the bachelor of science in diagnostic medical sonography, RIT also offers two diagnostic medical sonography certificate programs: a certificate in diagnostic medical sonography and a certificate in echocardiography (cardiac ultrasound). Both of these options are not only designed to meet the growing needs of the national and international medical communities but also the needs of individuals who:

  • Hold a degree in the life sciences and other closely related degrees who are interested in that may be approved by the program director. Additional pre-requisite course work may be required for any type and level of degree.
  • Have a current, active license or registry in an area of medical or allied health sciences, some examples of medical or allied health sciences areas include respiratory therapy, nuclear medicine, physical therapy, radiography (x-rays), nursing, and more. Any of the more than 200 medical or allied health sciences fields also will be considered.

Sonography as a Pre-Med Option

Being accepted into a medical graduate program requires certain qualifications, including completing prerequisite courses, a strong academic record, acquiring pertinent experiences in the field, and developing key intrapersonal and interpersonal qualities. The Premedical and Health Professions Advisory Program works with all students on an individual basis to help them become competitive candidates for admission to graduate programs in the medical and health professions.

The diagnostic medical sonography degree has assisted students in entering the worlds of medicine and dentistry. With the addition of a few courses, and without extending your time at RIT, the ultrasound program can prepare you for medical, dental, or other graduate school programs in the medical or health sciences. Graduates of the ultrasound program have gone on to become physicians, dentists, chiropractors, and more. Learn more about how diagnostic medical sonography degree can be used as a pre-med option.

Sonography Education Resources

Program Policy and Procedures Handbook/Technical Standards
Please refer to these two documents for more information:

Prospective students are invited to view the diagnostic medical sonography program brochure.

Accelerated 4+1 MBA

An accelerated 4+1 MBA option is available to students enrolled in any of RIT’s undergraduate programs. RIT’s Combined Accelerated Pathways can help you prepare for your future faster by enabling you to earn both a bachelor’s and an MBA in as little as five years of study.

We safely invite you to campus for small group tours and information sessions.

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Nanotoxicity and regulatory aspects in musculoskeletal regeneration

2.3 Methods to determine the compatibility

Biocompatibility of nanomaterial has gained considerable attention to measure the nanomaterial safety during drug delivery applications. To ensure their biocompatibility, nanomaterial should be stable in physiological environments. There are several methods that are predominantly utilized to determine the compatibility of a nanoparticle (NP). Three major methods have been focused on the compatibility determination of NP, including in vitro cell viability assay, in vitro hemolysis assay, and in vivo zebrafish toxicity studies.

2.3.1 In vitro cell viability assay

Cell viability or cytotoxicity of the NPs may be characterized by in vitro cell culture models. The MTT assay is frequently used to provide preliminary information of the performance of NPs in vitro [132] . Cells are treated with known concentrations of synthesized bare NPs to determine the in vitro cytocompatibility or cell viability. The IC50 concentration is a criterion to evaluate cell line compatibility and the inhibitory concentration for NPs. The choice of cell line for a particular study on cytotoxicity depends upon the disease targeted.

2.3.2 In vitro hemolysis assay

Nanosized drug carriers are highly recommended (from internationally recognized standard ISO-10993) to test their biocompatibility against blood cells [133] . The hemolysis assay is performed to test the hemolytic activity of the NPs by studying their effect on erythrocytes. If the material is highly compatible with blood cells (especially red blood cells, RBCs), it should not produce any morphological changes, and thus the medium remains colorless due to the coagulation property of blood cells [134] . However, in the presence of toxic materials, hemolysis occurs through the disintegration of RBCs that completely turns the medium into red color.

2.3.3 In vivo zebrafish embryo toxicity

Zebrafish is an appropriate animal model used extensively in the fields of developmental biology and medical sciences including toxicology [135, 136] . The model is highly useful since zebrafish and humans have similar characteristics and are genetically similar in early embryonic development and disease processes [137] . Peixe-zebra (Danio rerio) is small in size, has high fecundity, is inexpensive, and is relatively easy to maintain, and their developmental stages are fast.


Overview of creating artificial cell competency

The first protocol for artificial transformation of E. coli was published by Mandel and Higa in 1970 [3]. The procedure showed increased permeability of the bacterial cells to DNA after treatment with calcium (Ca 2+ ) and brief exposure to an elevated temperature, known as heat shock. This method became the basis for chemical transformation. In 1983, Douglas Hanahan published an improved method to prepare competent cells, where optimal conditions and media for bacterial growth and transformation were identified for higher transformation efficiency [4].

As an alternate approach to chemical transformation, an electrical field can be applied to the cells to enhance the uptake of DNA, a method known as electroporation (Figura 2) In 1982, Neumann et al. reported introduction of foreign DNA into mouse cells by short pulses of high-voltage electric fields [5]. Such electric fields are believed to increase the cell’s membrane potential, thereby inducing transient permeability to charged molecules like DNA. In 1988, transformation of E. coli cells by electroporation was published [6].

Figure 2. Chemical transformation vs. electroporation.


Calculating Concentrations for PCR

i) Oligonucleotide primers are generally supplied as "so many OD units/ml" - but what does this mean, in terms of mg/ml, or mmol/ml, etc?

Dado: a primer is Y nucleotides (nt) long

Dado: the MW of ssDNA is (330 daltons per nt) x (length in nt) (Sambrook et al., 1989 p. C.1)

Dado: the concentration of primer (=ssDNA) producing an OD of 1 at 254 nm in a 1 cm cuvette, is 37 ug/ml

Então: the MW of the primer is 330.Y daltons

E: X OD/ml = 37.X ug/ml = 37.X mg/l = 37.X /330.Y mM = 37.X.1000/330.Y uM

Por exemplo:

B 88/77 primer - a 17-mer oligodeoxynucleotide - as supplied is 12.6 OD units/ml. We need to make a 5 uM stock solution for PCR.

MW: 17 x 330 = 5610

Concentração: 12.6 OD x 37 ug/ml = 466 ug/ml = 466 mg/l = 0.466 g/l

Molarity: 0.466/5610 = 0.000083 Molar = 83 uM

Therefore: we need 5 ul of oligo stock solution in 83 ul (+78 ul water) to make a 5 uM solution (if 1 ul in 83 ul gives a 1 uM soln. )

ii) Calculation of amounts for PCR reactions: if we need a final concentration of 0.5 uM oligo in the PCR reaction mix (final volume 50 ul), we add 5 ul of 5 uM stock to the reaction mix (1/10 final dilution).

B) Nucleotides:

Stocks of nucleotides for PCR (or other procedure) are NEARLY ALWAYS dNTP s (deoxynucleotides), and concentrations is almost always given in EACH dNTP: that is, the given concentration is EACH nucleotide in the mix, NÃO the total concentration. This means that a 2.5 mM dNTP mix for PCR contains 2.5 mM of EACH dNTP, and 10 mM TOTAL dNTPs.

Exemplo:

i) Make up a 2.5 mM stock solution of dNTPs from stock 100 mM individual dNTPs, supplied by Promega:

  • FIRST mix equal volumes of each nucleotide (eg: 50 ul): this gives you 200 ul of 25 mM mixed dNTPs (Remember: concn. expressed in EACH dNTP).
  • THEN dilute this (or aliquot) 1/10 with WATER - aliquot into 100 ul amounts and freeze.

ii) Prepare a 1 mM stock of dNTPs with dTTP substituted to 10% (w/w) by digoxigenin-11-dUTP (DIG-dUTP) for use as a labelling mix for PCR labelling of PCR products:

  • DIG-dUTP supplied (by Boehringer Mannheim) at 25 nmol/25ul = 1 umol/ml = 1mM final concentration of DIG-dUTP must be 1/10th that of other nucleotides, and [DIG-dUTP] + [dTTP] must = [any other dNTP]. Therefore to get a 1 mM dNTP stock one must dilute DIG-dUTP stock 1/10.
  • FIRST dilute separate 100 mM dNTP stocks to 10 mM (eg. 5 ul to 50 ul, in water).
  • THEN mix equal volumes (eg. 10 ul) of 10 mM dCTP, dGTP and dATP stock, and 9/10ths volume of dTTP (9 ul). Add equal volume (eg. 10 ul) of of 1 mM DIG-dUTP.
  • THEN add water to 10 vol (=100 ul add 51 ul): final concentration each dNTP = 1 mM final concn DIG-dUTP = 0.1 mM, and of dTTP = 0.9 mM.

iii) USE mix made above at 50 uM each dNTP in a PCR reaction mix, final volume 25ul:


Assista o vídeo: Experiências de Biologia- Profª Gisele Rezende (Novembro 2021).