Em formação

Como obter uma lista de quinases que fosforilaram uma determinada proteína?


Estou analisando a proteína SF2 (também chamada de SRSF1). Na base de dados, é mostrado que esta proteína é frequentemente fosforilada no 189º resíduo de tirosina.

Eu quero saber quais proteínas podem ter fosforilado a proteína neste local. Existe uma maneira de descobrir isso usando bancos de dados? Que tal obter uma lista de proteínas que fosforilam o SF2 em qualquer local?


Eu também uso o PhosphoSitePlus. Eu o uso em combinação com o ELM, pois ele encontra motivos lineares e geralmente fornece um bom candidato genérico.

A literatura, se não. Verificar todos os homólogos próximos às vezes compensa.

Verificar bancos de dados de iteração de proteína como StringDB ou IntAct também pode ajudar, mas fica muito duvidoso -XL-MS (uma arma fumegante) é raro e não pega enzimas de baixa concentração como as quinases.

(Uma nota: esta pergunta deveria ter sido feita em bioinformática SO)


Cinases semelhantes a receptoras moldam a planta

Para gerar os vários tecidos e órgãos que constituem o corpo adulto, as plantas e os animais requerem divisões celulares formativas organizadas e especificações celulares corretas. Nas plantas, esses processos são controlados principalmente por fitohormônios e redes transcricionais. Recentemente, as vias de sinalização de cinase semelhantes a ligantes-receptor foram reveladas como reguladores adicionais potencialmente cruciais da especificação celular em plantas. Revisamos aqui a importância de tais cascatas de sinalização para o crescimento e desenvolvimento das plantas e discutimos, sempre que possível, semelhanças com cascatas bem investigadas em animais.


Predição

Em eucariotos, os resíduos de aminoácidos mais comumente fosforilados são serina, treonina e tirosina. Para ser fosforilado, o resíduo deve ser apresentado no contexto de um sítio de consenso que possa ser reconhecido pela quinase. Os locais de consenso para muitas quinases foram determinados empiricamente e publicados. Programas de computador baseados nesses locais de consenso são usados ​​para prever locais de fosforilação em potencial em outras proteínas. No entanto, as quinases reconhecem estruturas 3-d que nem sempre podem ser facilmente previstas por software de computador. Portanto, quaisquer locais de fosforilação previstos devem ser confirmados por meio de outros estudos.


2 CONTEÚDO DA BASE DE DADOS

PhosphoNetworks atualmente cobre KSRs em diferentes níveis. Primeiro, contém 24 046 em vitro KSRs (rawKSRs) identificados por microarray de proteínas. Essas relações refletem reações bioquímicas entre as quinases e seus substratos. No próximo nível, o banco de dados inclui 3656 KSRs (refKSRs) refinados, de alta confiança e fisiologicamente relevantes, que são filtrados por uma série de critérios para enriquecimento de KSRs que provavelmente ocorrem nas células. A qualidade dos KSRs foi extensivamente validada por experimentos de células transfectadas independentes (Newman et al., 2013). Finalmente, 744 KSRs com curadoria de literatura foram integrados aos 3656 refKSRs para gerar um conjunto de dados combinado (comKSR). Além dos KSRs, o banco de dados também inclui 300 motivos de fosforilação de consenso previstos para 284 quinases humanas (∼55% do quinoma humano). Para quinases de especificidade dupla, que fosforilam resíduos de serina / treonina e tirosina, dois tipos de motivos são previstos. A qualidade desses motivos previstos foi apoiada pelas comparações com motivos de outras fontes, como bibliotecas de peptídeos de varredura posicional ou outros métodos computacionais (Hutti et al., 2004 Mok et al., 2010 Newman et al., 2013).

Para criar um mapa de alta resolução de KSRs, integramos ainda os 300 motivos de fosforilação de consenso e locais de fosforilação determinados por espectrometria de massa (MS / MS) em substratos de cada quinase. Usando uma abordagem computacional, conectamos 230 quinases com 2591 locais de fosforilação em 652 proteínas de substrato.

Um resumo do conteúdo da PhosphoNetworks é mostrado na Tabela 1 e todos os dados estão disponíveis gratuitamente para todos os usuários acadêmicos em nosso site (http://phosphonetworks.org/download.html).

Tabela de resumo de dados em PhosphoNetworks

Modelo . Estatisticas .
rawKSR 24046 (K = 289, S = 1067)
refKSR 3656 (K = 255, S = 742)
comKSR 4375 (K = 255, S = 1139)
Motivo 300 (K = 284)
MS PhosSite 70422 (Sp = 48704, Tp = 15373, Yp = 6375)
K-S-PhosSite 4417 (K = 230, S = 652, FosSite = 2591)
Modelo . Estatisticas .
rawKSR 24046 (K = 289, S = 1067)
refKSR 3656 (K = 255, S = 742)
comKSR 4375 (K = 255, S = 1139)
Motivo 300 (K = 284)
MS PhosSite 70422 (Sp = 48704, Tp = 15373, Yp = 6375)
K-S-PhosSite 4417 (K = 230, S = 652, FosSite = 2591)

Observação: K, Quinase S, Substrato Sp, serina T fosforiladap, treonina Y fosforiladap, tirosina fosforilada.

Tabela de resumo de dados em PhosphoNetworks

Modelo . Estatisticas .
rawKSR 24046 (K = 289, S = 1067)
refKSR 3656 (K = 255, S = 742)
comKSR 4375 (K = 255, S = 1139)
Motivo 300 (K = 284)
MS PhosSite 70422 (Sp = 48704, Tp = 15373, Yp = 6375)
K-S-PhosSite 4417 (K = 230, S = 652, FosSite = 2591)
Modelo . Estatisticas .
rawKSR 24046 (K = 289, S = 1067)
refKSR 3656 (K = 255, S = 742)
comKSR 4375 (K = 255, S = 1139)
Motivo 300 (K = 284)
MS PhosSite 70422 (Sp = 48704, Tp = 15373, Yp = 6375)
K-S-PhosSite 4417 (K = 230, S = 652, FosSite = 2591)

Observação: K, Quinase S, Substrato Sp, serina T fosforiladap, treonina Y fosforiladap, tirosina fosforilada.


Notas de rodapé

↵ 1 M.B. e K.W.B. contribuíram igualmente para este trabalho.

↵ 2 Endereço atual: Departamento de Patologia Vegetal e Microbiologia, Iowa State University, Ames, IA 50011.

↵ 3 Endereço atual: Departamento de Biologia Vegetal e Microbiana, Universidade de Zurique, Zurique 8008, Suíça.

↵ 4 Endereço atual: Centro de Biologia Molecular de Plantas, Universidade de Tuebingen, Tuebingen 72074, Alemanha.

↵ 5 Endereço atual: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 11724.

↵ 6 Endereço atual: Departamento de Ciência de Plantas, Universidade McGill, Montreal, PQ H9X 3V9, Canadá.

Contribuições dos autores: M.B., K.W.B., S.C.H., e J.M. projetou a pesquisa M.B., K.W.B., A.J.D., D.R.H., A.T., C.A.S.T., e J.M. realizou a pesquisa M.B., K.W.B., D.R.H., D.C., K.E.D., e M.T. contribuiu com novos reagentes / ferramentas analíticas M.B., K.W.B., A.J.D., D.R.H., A.T., S.C.H. e J.M. analisou dados e M.B. e J.M. escreveu o artigo com a contribuição de todos os autores.

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Este artigo é uma submissão direta do PNAS. T.R. é um editor convidado a convite do Conselho Editorial.


DISCUSSÃO

As principais descobertas deste artigo são que duas proteínas quinases independentes de Ca 2+ da folha do espinafre, atualmente denominadas HRK-A e HRK-C, fosforilam e inativam não apenas a HMG-CoA redutase, mas também SPS e NR. Nossos resultados também fornecem evidências convincentes de que essas quinases representam membros da família SnRK1 relacionada a SNF1. Nossos resultados reúnem vários estudos anteriores da regulação da HMG-CoA redutase, SPS e NR via fosforilação por proteínas quinases independentes de Ca 2+ (Dale et al., 1995a McMichael et al., 1995a Douglas et al., 1997) . No entanto, nesses estudos anteriores, as proteínas quinases foram mal caracterizadas em termos moleculares e não estava claro se uma única proteína quinases poderia regular todas as três enzimas metabólicas. Embora mais trabalhos sejam necessários para provar que essas enzimas são alvos para as quinases SnRK1 in vivo, este trabalho mostra que as quinases SnRK1 podem potencialmente regular a síntese de isoprenóides e Suc e assimilação de nitrogênio para a biossíntese de aminoácidos e nucleotídeos. Estas são as três principais vias biossintéticas na planta, e é interessante notar que o homólogo SNF1 de mamífero, AMPK, também regula múltiplas vias biossintéticas em animais (Hardie e Carling, 1997 Hardie et al., 1998).

Usando peptídeos projetados como substratos para a subfamília da proteína quinase AMPK / SNF1, este estudo também mostra que a situação nas folhas de espinafre é mais complexa do que nas inflorescências de couve-flor (Ball et al., 1994). No último caso, apenas duas quinases peptídicas independentes de Ca 2+ foram definidas, HRK-A e HRK-B. HRK-A tinha uma subunidade catalítica de 58 kD, que reagiu de forma cruzada com um anticorpo criado contra um peptídeo conservado na subfamília SnRK1 vegetal (Ball et al., 1995) e tinha uma massa molecular nativa de 160 a 200 kD (Ball et al., 1994). Nestes e em vários outros aspectos, como posições de eluição em Mono-Q em NaCl e MgCl2 gradientes, especificidade de peptídeo, inativação por proteínas fosfatases e reativação por quinase quinase de mamífero (MacKintosh et al., 1992 Ball et al., 1994 Dale et al., 1995b), couve-flor e espinafre HRK-A são muito semelhantes. O espinafre HRK-B não apresentou reação cruzada com o anticorpo SnRK1 da planta e tinha uma massa molecular nativa de 45 kD: Nesse aspecto, parece ser semelhante à couve-flor HRK-B previamente definida (Ball et al., 1994).

A análise do espinafre HRK-A e HRK-B foi complicada pela descoberta de que, após a fração I da coluna Mono-Q inicial (contendo HRK-B) parecia estar contaminada com uma grande quantidade de uma atividade (HRK-A ′) que parecia indistinguível do HRK-A. Embora o HRK-A ′ que foi recuperado por esses procedimentos pareça ser idêntico ao HRK-A na fração II da primeira coluna, ele não foi estudado posteriormente. Quinase (s) eluindo na fração III não foram observadas no estudo com inflorescências de couve-flor (Ball et al., 1994). A fração III era heterogênea em termos de atividade quinase e poderia ser resolvida em dois picos, HRK-C e HRK-D, usando uma coluna Mono-Q eluída com um MgCl2 gradiente (Fig. 2). No entanto, HRK-D foi uma atividade bastante menor e não foi estudado mais.

Os estudos subsequentes concentraram-se nas duas principais atividades da quinase peptídica, HRK-A e HRK-C. Propomos que HRK-A e HRK-C representam diferentes formas da subfamília SnRK1 quinase relacionada a AMPK / SNF1. A evidência para isso pode ser resumida da seguinte forma:

Primeiro, HRK-A e HRK-C fosforilam os peptídeos AMARA e SAMS comKm valores na faixa micromolar baixa. Ambos os peptídeos foram originalmente concebidos como substratos específicos para AMPK de mamífero (Davies et al., 1989 Dale et al., 1995b) e também são substratos bastante específicos para a proteína quinase SNF1 em S. cerevisiae (Wilson et al., 1996).

Em segundo lugar, usando variantes do peptídeo AMARA, tanto HRK-A quanto HRK-C parecem ter motivos de reconhecimento mínimo semelhantes aos de rato AMPK, levedura SNF1 e couve-flor HRK-A (Hyd-X-Basic-XX-Ser-XXX-Hyd , onde Hyd é um aminoácido com uma cadeia lateral hidrofóbica volumosa). Suas especificidades de peptídeo são discutidas em mais detalhes abaixo.

Em terceiro lugar, através do eluato de pelo menos duas colunas diferentes, as atividades de HRK-A e HRK-C se correlacionaram com o conteúdo de polipeptídeos de 58 kD detectáveis ​​por western blotting usando um anticorpo criado contra o peptídeo NIP. Embora a sequência NIP seja derivada da sequência de um SnRK1 de centeio (RKIN1 Alderson et al., 1991), 13 dos 15 resíduos também são conservados na cevada, Arabidopsis, tabaco e homólogos de batata. As sequências de DNA de toda a família SnRK1 atualmente clonada de plantas superiores prevêem produtos de proteína de 57 a 59 kD.

Quarto, as formas nativas de HRK-A e HRK-C têm massas moleculares aparentes por filtração em gel muito semelhantes às da AMPK de mamífero (Davies et al., 1994) e da couve-flor HRK-A (Ball et al., 1994).

Quinto, HRK-A e HRK-C são inativados por proteínas fosfatases e podem ser reativados pela proteína quinase a montante no sistema de mamíferos, isto é, AMPKK. Identificamos Thr-172 como o principal local fosforilado na AMPK pela AMPKK (Hawley et al., 1996). Este resíduo é conservado em todos os membros atualmente sequenciados da subfamília SnRK1 da planta, e a sequência ao seu redor também é altamente conservada entre animais, leveduras e plantas.

Embora pareçam comigrar em SDS-PAGE, os polipeptídeos de 58 kD em HRK-A e HRK-C podem representar isoformas distintas da subunidade catalítica da quinase SnRK1 do espinafre, análogas às isoformas α1 e α2 da AMPK de mamífero (Stapleton et al ., 1996). As holoenzimas HRK-A e HRK-C eluem das colunas Mono-Q em momentos diferentes usando dois protocolos de eluição diferentes (NaCl e MgCl2gradientes Figs. 1 e 2), parecem ser ligeiramente diferentes na massa molecular nativa (Fig. 3), diferem em suas suscetibilidades relativas à desfosforilação por PP2A e PP2C (Fig. 13) e têm diferenças sutis na especificidade para substratos peptídicos. Pelo menos duas sequências de DNA homólogas a Snf1 foram clonadas de cevada (Halford et al., 1992) e Arabidopsis (P. Lessard e M. Thomas, comunicação pessoal). Outra possibilidade é que HRK-A e HRK-C podem representar a mesma subunidade catalítica complexada com diferentes subunidades regulatórias ou o (s) mesmo (s) produto (s) gênico (s) sujeito a diferentes modificações pós-tradução. Sondas moleculares específicas são necessárias para distinguir entre essas várias possibilidades, que não são necessariamente mutuamente exclusivas.

Os resultados na Figura 5 mostram que o espinafre HRK-A e HRK-C reconhecem motivos de sequência primária em seus substratos que são semelhantes, embora não idênticos aos definidos anteriormente para AMPK de mamífero, levedura SNF1 e couve-flor HRK-A (Dale et al., 1995b). Ambos requerem uma cadeia lateral hidrofóbica volumosa na posição P-5 (ou seja, cinco resíduos N-terminal para o Ser fosforilado), uma vez que o peptídeo AGARAASAAALARRR era um substrato pobre. A ordem de preferência para resíduos hidrofóbicos específicos na posição P-5 foi Leu ≈ Ile & gt Met & gt Phe & gt Val para ambas as quinases. Ambas as quinases também preferiram uma cadeia lateral hidrofóbica volumosa na posição P + 4 (ou seja, quatro resíduos C-terminal para o Ser fosforilado), uma vez que o peptídeo AMARAASAAAGARRR era um substrato pobre, embora a substituição com Gly fosse muito mais deletéria para HRK-A do que era para HRK-C. Ambas as quinases funcionaram bem com Leu, Ile, Met ou Phe nesta posição, mas Val funcionou muito mal para HRK-A, embora fosse tolerado por HRK-C. Ambas as quinases também exigiam um resíduo básico na posição P-3, uma vez que o peptídeo AMAGAASAAALARRR era um substrato muito pobre. A ordem de preferência para ambas as quinases foi Arg & gt Lys & gt His. Outra diferença aparente entre as duas quinases era que HRK-C, mas não HRK-A, também fosforilaria o peptídeo AMRAAASAAALARRR, que tem um Arg na posição P-4 em vez da posição P-3. Nesse aspecto, a HRK-C é semelhante à AMPK de mamíferos e à HRK-A de couve-flor, embora todas as quinases AMPK / Snf1 prefiram que o resíduo básico esteja na posição P-3.

Nossos estudos mostram que as duas proteínas quinases relacionadas ao Snf1 (HRK-A e HRK-C) do espinafre também fosforilaram a Arabidopsis HMG-CoA redutase, uma enzima regulatória chave da biossíntese de isoprenóides. A fosforilação ocorre em um local (Ser-577) onde a fosforilação foi previamente mostrado para causar a inativação completa (Dale et al., 1995a). HRK-A e HRK-C também fosforilaram e inativaram o NR do espinafre, uma enzima chave da assimilação do nitrogênio. Embora o sítio fosforilado na NR não tenha sido determinado diretamente, o fato de que a fosforilação causou inativação, mas apenas na presença da proteína 14-3-3, sugere fortemente que ela ocorreu em Ser-543 (Douglas et al., 1995 Bachmann et al., 1996a, 1996b Moorhead et al., 1996 Su et al., 1996).

Motivo de reconhecimento de consenso para quinases SnRK1 (topo), alinhado com sequências em torno dos locais de fosforilação regulatórios em HMG-CoA redutases superiores, NR e SPS. As sequências foram obtidas nas bases de dados SWISS-PROT e EMBL. Os resíduos fosforilados estão em negrito e os resíduos básicos sublinhados em P-3 / P-4 estão sublinhados, os resíduos hidrofóbicos em P-5 e P + 4 estão em negrito. Quando uma espécie tem múltiplas isoformas, apenas uma é mostrada, embora as outras isoformas também estejam em conformidade com o motivo.

Motivo de reconhecimento de consenso para quinases SnRK1 (topo), alinhado com sequências em torno dos locais de fosforilação regulatórios em HMG-CoA redutases superiores, NR e SPS. As sequências foram obtidas nas bases de dados SWISS-PROT e EMBL. Os resíduos fosforilados estão em negrito e os resíduos básicos sublinhados em P-3 / P-4 estão sublinhados, os resíduos hidrofóbicos em P-5 e P + 4 estão em negrito. Quando uma espécie tem múltiplas isoformas, apenas uma é mostrada, embora as outras isoformas também estejam em conformidade com o motivo.

O SPS também foi fosforilado e inativado por HRK-B e HRK-D, mas essas atividades menores permanecem mal caracterizadas no momento. Como relatado anteriormente (Huber e Huber, 1990), SPS parcialmente purificado de folhas de espinafre contém uma atividade associada que inativa a enzima de uma maneira dependente de ATP. Descobrimos que nossas preparações de SPS também continham atividades que fosforilavam tanto o peptídeo AMARA quanto o polipeptídeo de 130 kD. A atividade de inativação de SPS foi inibida pelo peptídeo AMARA, indicando que a quinase do peptídeo e as atividades de inativação de SPS dependentes de ATP podem ser funções da mesma proteína. Todas essas atividades copurificaram com SPS por meio de várias etapas de purificação convencionais. Passar a amostra através de AMP-agarose foi parcialmente eficaz na remoção do peptídeo / proteína quinase e as atividades de inativação de SPS (Fig. 8), mas a chave para a produção de uma preparação de SPS que estava essencialmente livre dessas atividades foi a descoberta de que o quinase (ões) endógena (s) foi (m) inativada (s) pelo tratamento com PP-2A. A identidade da (s) quinase (s) que contaminam as preparações de SPS ainda não é certa, mas pode corresponder a um ou ambos HRK-A e HRK-C, uma vez que eles também fosforilam os peptídeos AMARA e SP2 e são inativados por desfosforilação (Fig. 13) .

Na Figura 14, comparamos o motivo de reconhecimento de consenso para HRK-A e HRK-C com as sequências em torno de Ser-577 em HMG-CoA redutase, Ser-543 em NR e Ser-158 em SPS de várias espécies de plantas. É evidente que o motivo de reconhecimento é conservado em todas as sequências de HMG-CoA redutase, NR e SPS de planta superior atualmente nos bancos de dados de sequência. Isso dá mais suporte à ideia de que essas enzimas anabólicas podem ser alvos para as quinases SnRK1 in vivo.

É importante comparar nossos resultados com os de pesquisadores anteriores que purificaram parcialmente as quinases NR ou SPS da folha do espinafre. Usando um procedimento de extração diferente, que omitiu os inibidores da proteína fosfatase EDTA e EGTA, McMichael et al. (1995a) resolveram três quinases NR / SPS (picos I, II e III) por cromatografia em Resource-Q.Os picos I e II eram dependentes de Ca 2+ e, portanto, não relacionados às quinases descritas aqui. O pico III era independente de Ca 2+, SPS inativado com pouco ou nenhum efeito no NR e tinha uma massa molecular aparente de 150 kD na filtração em gel. Portanto, parece provável que o pico III correspondeu a HRK-A ou HRK-C, embora com base em sua posição de eluição no Resource-Q seja mais semelhante a HRK-C. Uma coisa que permanece obscura é por que o pico III foi relatado como tendo uma atividade de inativação de NR tão baixa (McMichael et al., 1995a).

Um estudo posterior de Douglas et al. (1997) facilita a comparação entre nosso trabalho e o de McMichael et al. (1995a). Eles extraíram folhas de espinafre em condições semelhantes às de McMichael et al. e sob condições que se assemelham mais às nossas (isto é, a presença de 50 m m NaF, EDTA e EGTA). Embora as etapas de purificação preliminares fossem um pouco diferentes das nossas, elas separaram as proteínas quinases em uma coluna Mono-Q usando tampões e gradientes semelhantes e resolveram três picos de atividade da proteína quinase (PKeu–PKIII) utilizando como substrato o peptídeo SP ou SAMS. Quando preparado na ausência de NaF, PKeu e PKII eram dependentes de Ca 2+ e, portanto, parecem corresponder aos picos I e II de McMichael et al. (1995a). PKIII foi Ca 2+ independente em todas as condições e parece corresponder ao nosso HRK-C e ao pico III de McMichael et al.

As semelhanças entre PKIII e HRK-C pode ser resumido da seguinte forma: (a) Eles fosforilam AMARA e SAMS, com o primeiro sendo o melhor substrato (b) eles fosforilam Arabidopsis HMG-CoA redutase em Ser-577 (c) eles eluem de Mono-Q na mesma concentração de sal (d) eles têm massas moleculares aparentes de aproximadamente 150 kD na cromatografia Superdex 200 e (e) ambos requerem um resíduo hidrofóbico na posição P + 4. Suspeitamos que não observamos nenhuma das proteínas quinases dependentes de Ca 2+ porque AMARA e SAMS são substratos relativamente pobres (Douglas et al., 1997). Douglas et al. (1997) também detectou um polipeptídeo de 58 kD em western blots de frações contendo PKIII usando um anticorpo criado contra uma proteína de fusão entre centeio SnRK1 e proteína de ligação à maltose. No entanto, o PKIII a atividade não comigrou exatamente com o polipeptídeo de 58 kD, enquanto em nosso estudo sim (usando o anticorpo do peptídeo NIP). Em nossa experiência, o anticorpo RKIN1-MBP era muito menos específico do que o anticorpo anti-peptídeo NIP usado aqui, e propomos que o polipeptídeo de 58 kD detectado usando o anticorpo anterior (Douglas et al., 1997) pode não estar relacionado ao atividade da proteína quinase detectada. HRK-C foi purificado mais extensivamente neste estudo do que PKIII e em nossa opinião a evidência neste artigo de que é um membro da família SnRK1 é mais forte do que a apresentada por Douglas et al. (1997).

Propomos, portanto, que o pico III de SPS quinase (McMichael et al., 1995a) e o PKIII A quinase NR (Douglas et al., 1997) corresponde a HRK-C, que agora é firmemente identificada por nosso trabalho como membro da subfamília SnRK1. Além disso, há um segundo membro da subfamília na folha do espinafre (HRK-A), que parece não ter sido encontrado nesses estudos anteriores. HRK-A provavelmente não foi observado por McMichael et al. (1995a) porque é particularmente suscetível à desfosforilação por PP2A (Fig. 13), e porque eles não incluíram inibidores da proteína fosfatase durante a purificação. PKII de Douglas et al. (1997), que não foi estudado em detalhes, era apenas parcialmente dependente de Ca 2+ e pode representar uma mistura de HRK-A e uma quinase dependente de Ca 2+, provavelmente uma CDPK, como sugerido por Bachmann et al. (1996b).

Usando substratos peptídicos sintéticos, Huber e colaboradores (McMichael et al., 1995b dados não publicados citados por Huber e Huber [1996]) propuseram para o pico III o motivo de reconhecimento Basic-Hyd-X-Basic-XX-Ser: resíduos básicos em P− 6 e P − 3 (ou seja, seis e três resíduos a montante do Ser fosforilado) e um resíduo hidrofóbico em P − 5. Isso é semelhante, mas não idêntico ao motivo (Hyd-X-Basic-XX-Ser-XXX-Hyd) que definimos para couve-flor HRK-A e espinafre HRK-A / HRK-C, ou seja, resíduos hidrofóbicos em P-5 e P + 4, e um resíduo básico em P-3 (Dale et al., 1995b e este estudo). Esta aparente discrepância não indica necessariamente que o pico III e HRK-C são diferentes. Não abordamos especificamente o requisito de um resíduo básico na posição P-6. Embora o peptídeo AMARA tenha um Ala nesta posição, o que pode parecer indicar que um resíduo básico não era necessário, este é o terminal N do peptídeo e é possível que o grupo α-amino livre cumpra o requisito normal para um resíduo. É interessante que o peptídeo SAMS usado originalmente para testar as quinases relacionadas a AMPK de plantas (MacKintosh et al., 1992 Ball et al., 1994) tem um His em P-6, enquanto a maioria dos substratos naturais para AMPK de mamíferos também tem um resíduo básico nesta posição (Weekes et al., 1993). Toroser e Huber (1998), usando variantes do peptídeo SP2, relataram recentemente que uma quinase independente de Ca 2+ (pico III) de florzinhas de couve-flor que é provavelmente idêntica a HRK-A preferiu um resíduo básico na posição P-6. A aparente discrepância na necessidade de um resíduo hidrofóbico na posição P + 4 também pode ser mais aparente do que real. Embora HRK-A e HRK-C preferissem um resíduo hidrofóbico nesta posição, ele era apenas essencial para HRK-A (Fig. 5). McMichael et al. (1995b) abordam especificamente o requisito de um resíduo hidrofóbico nesta posição. Em qualquer caso, a sequência em torno de Ser-158 prevista por todos os DNAs SPS conhecidos (Fig. 14) está em conformidade com o nosso motivo e com aquele estabelecido por Huber e colaboradores.

McMichael et al. (1995b) relataram que a atividade da quinase de peptídeo de sua quinase de pico III foi 54% inibida por Glc-6-P 10 m m, o que implica que o último pode ser um regulador fisiológico de quinases SnRK1, bem como um ativador de SPS. Algumas preparações comerciais de Glc-6-P produziram uma inibição semelhante de HRK-A e HRK-C, mas outras não. Este efeito foi eventualmente rastreado para contaminantes no Glc-6-P, provavelmente íons Ba 2+. Embora não possamos ter certeza de que a preparação usada por McMichael et al. (1995b) foi contaminado de forma semelhante, o que mostra que é necessário cuidado ao utilizar fontes comerciais de Glc-6-P que não são purificadas posteriormente.

Outro tema que emerge de nosso estudo é que nenhum dos substratos de peptídeos ou proteínas atualmente disponíveis é específico para uma única proteína quinase e, portanto, sondas moleculares (por exemplo, anticorpos imunoprecipitantes) são necessárias para desenvolver ensaios específicos para quinases individuais. Estudos detalhados das funções fisiológicas dessas quinases são provavelmente prematuros até que tais ensaios específicos sejam desenvolvidos. Infelizmente, as abordagens bioquímicas (isto é, purificação de plantas) permanecem necessárias para estudar as funções bioquímicas dos membros da família SnRK1, porque a produção de quinases cataliticamente ativas a partir de DNAs de SnRK1 ainda não se provou bem-sucedida. Com base na experiência com o sistema AMPK de mamíferos (Dyck et al., 1996 Woods et al., 1996), isso ocorre provavelmente porque a coexpressão das subunidades β e γ acessórias (ainda não clonadas de plantas) é necessária para observar a atividade da quinase quando o DNA da subunidade catalítica (α) é expresso.


Referências

Grebe TW, Stock JB: The histidine protein kinase superfamily. Adv Microb Physiol. 1999, 41: 139-227. A primeira classificação completa de famílias de HPK e reguladores de resposta com base em alinhamentos e motivos de sequência.

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Leonardo MR, Forst S: Reexame do papel do domínio periplasmático de EnvZ na detecção de sinais de osmolaridade em Escherichia coli. Mol Microbiol. 1996, 22: 405-413. 10.1046 / j.1365-2958.1996.1271487.x. Este artigo relata a descoberta surpreendente de que o domínio periplasmático do HPK EnvZ pode ser completamente substituído sem interrupção do osmossensor, sugerindo que o EnvZ detecta por um mecanismo diferente da ligação ao ligante.

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Maddock JR, Shapiro L: localização polar do complexo quimiorreceptor no Escherichia coli célula. Ciência. 1993, 259: 1717-1723. Um artigo importante relatando a descoberta de que os receptores de quimiotaxia estão localizados em grupos no pólo celular.

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Manual de preparação de proteínas

Saiba mais sobre como dessalinizar, trocar tampão, concentrar e / ou remover contaminantes de amostras de proteínas, imunoprecipitação e outros métodos de purificação e limpeza de proteínas usando várias ferramentas de biologia de proteínas da Thermo Scientific neste manual de 32 páginas.

  • Imunoprecipitação (IP), co-IP e cromatina-IP
  • Etiquetas de purificação de proteína recombinante
  • Dialise amostras de proteína com segurança usando cassetes e dispositivos de diálise Slide-A-Lyzer
  • Dessalinizar rapidamente as amostras com alta recuperação de proteína usando colunas e placas de dessalinização spin Zeba
  • Extraia com eficiência contaminantes específicos usando resinas otimizadas para remoção de detergente ou endotoxina
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As interações de proteínas são fundamentalmente caracterizadas como estáveis ​​ou transitórias, e ambos os tipos de interações podem ser fortes ou fracas. Interações estáveis ​​são aquelas associadas a proteínas que são purificadas como complexos de múltiplas subunidades, e as subunidades desses complexos podem ser idênticas ou diferentes. A hemoglobina e a polimerase do núcleo do RNA são exemplos de interações de múltiplas subunidades que formam complexos estáveis.

Espera-se que as interações transitórias controlem a maioria dos processos celulares. Como o nome indica, as interações transitórias são temporárias por natureza e normalmente requerem um conjunto de condições que promovem a interação, como fosforilação, mudanças conformacionais ou localização em áreas discretas da célula. As interações transitórias podem ser fortes ou fracas, e rápidas ou lentas. Enquanto em contato com seus parceiros de ligação, proteínas que interagem transitoriamente estão envolvidas em uma ampla gama de processos celulares, incluindo modificação de proteínas, transporte, dobramento, sinalização, apoptose e ciclo celular. O exemplo a seguir fornece uma ilustração de interações de proteínas que regulam os processos apoptóticos e anti-apoptóticos.


Forte interação proteína-proteína BAD. Painel A: Gel SDS-PAGE corado com Coomassie de BAD-GST-HA-6xHIS leve e pesado recombinante purificado a partir de lisados ​​HeLa IVT (L), usando resina de glutationa (E1) e resina de cobalto (E2) afinidade em tandem. O fluxo direto (FT) de cada coluna é indicado. Painel B: Esquema de fosforilação BAD e interações de proteínas durante a sobrevivência e morte celular (ou seja, apoptose). Painel C: cobertura da sequência da proteína BAD mostrando locais de fosforilação de consenso Akt identificados (caixa vermelha). Painel D: espectros de MS de peptídeo BAD HSSYPAGTEDDEGmGEEPSPFr marcado com isótopo estável.

As proteínas se ligam umas às outras por meio de uma combinação de ligações hidrofóbicas, forças de van der Waals e pontes salinas em domínios de ligação específicos em cada proteína. Esses domínios podem ser pequenas fendas de ligação ou grandes superfícies e podem ter apenas alguns peptídeos de comprimento ou abranger centenas de aminoácidos. A força da ligação é influenciada pelo tamanho do domínio de ligação. Um exemplo de um domínio de superfície comum que facilita as interações proteína-proteína estáveis ​​é o zíper de leucina, que consiste em hélices α em cada proteína que se ligam umas às outras de forma paralela por meio da ligação hidrofóbica de resíduos de leucina regularmente espaçados em cada α -hélice que se projeta entre as cadeias peptídicas helicoidais adjacentes. Devido ao empacotamento molecular compacto, os zíperes de leucina fornecem ligação estável para complexos multiproteicos, embora todos os zíperes de leucina não se liguem de forma idêntica devido aos aminoácidos não leucina na hélice α que podem reduzir o empacotamento molecular e, portanto, a força do interação.

Dois domínios de homologia Src (SH), SH2 e SH3, são exemplos de domínios de ligação transitória comuns que ligam sequências peptídicas curtas e são comumente encontrados em proteínas de sinalização. O domínio SH2 reconhece sequências de peptídeos com resíduos de tirosina fosforilados, que geralmente são indicativos de ativação de proteínas. Os domínios SH2 desempenham um papel fundamental na sinalização do receptor do fator de crescimento, durante a qual a fosforilação do receptor mediada por ligante em resíduos de tirosina recruta efetores a jusante que reconhecem esses resíduos por meio de seus domínios SH2. O domínio SH3 geralmente reconhece sequências de peptídeos ricos em prolina e é comumente usado por quinases, fosfolipases e GTPases para identificar proteínas alvo. Embora ambos os domínios SH2 e SH3 geralmente se liguem a esses motivos, a especificidade para interações de proteínas distintas é ditada por resíduos de aminoácidos vizinhos no respectivo motivo.

O resultado de duas ou mais proteínas que interagem com um objetivo funcional específico pode ser demonstrado de várias maneiras diferentes. Os efeitos mensuráveis ​​das interações de proteínas foram descritos da seguinte forma:

  • Alteram as propriedades cinéticas das enzimas, que podem ser o resultado de mudanças sutis na ligação ao substrato ou efeitos alostéricos
  • Permitir a canalização de substrato movendo um substrato entre domínios ou subunidades, resultando em um produto final pretendido
  • Crie um novo local de ligação, normalmente para pequenas moléculas efetoras
  • Inativar ou destruir uma proteína
  • Alterar a especificidade de uma proteína para seu substrato por meio da interação com diferentes parceiros de ligação, por exemplo, demonstrar uma nova função que nenhuma proteína pode exibir sozinha
  • Desempenhar um papel regulador em um evento upstream ou downstream

Normalmente, uma combinação de técnicas é necessária para validar, caracterizar e confirmar as interações de proteínas. Proteínas previamente desconhecidas podem ser descobertas por sua associação com uma ou mais proteínas conhecidas. A análise de interação de proteínas também pode revelar papéis funcionais únicos e imprevistos para proteínas bem conhecidas. A descoberta ou verificação de uma interação é o primeiro passo no caminho para entender onde, como e em que condições essas proteínas interagem na Vivo e as implicações funcionais dessas interações.

Embora os vários métodos e abordagens para estudar as interações proteína-proteína sejam numerosos demais para serem descritos aqui, a tabela abaixo e o restante desta seção se concentram em métodos comuns para analisar as interações proteína-proteína e os tipos de interações que podem ser estudados usando cada método . Em resumo, as interações proteína-proteína estáveis ​​são mais fáceis de isolar por métodos físicos como co-imunoprecipitação e ensaios pull-down porque o complexo de proteínas não se desmonta com o tempo. As interações fracas ou transitórias podem ser identificadas usando esses métodos, primeiro pela reticulação covalente das proteínas para congelar a interação durante o co-IP ou pull-down. Alternativamente, a reticulação, junto com a transferência de rótulo e análise de blot far – western, pode ser realizada independentemente de outros métodos para identificar as interações proteína-proteína.

Métodos comuns para analisar os vários tipos de interações de proteínas

MétodoInterações proteína-proteína
Co-imunoprecipitação (co-IP)Estável ou forte
Ensaio de pull-downEstável ou forte
Análise de interação de proteína de reticulaçãoTransiente ou fraco
Análise de interação de proteína de transferência de rótuloTransitório ou fraco
Análise de blot far-westernModeradamente estável

Co-imunoprecipitação (co-IP) é uma técnica popular para descoberta de interação de proteínas. Co-IP é conduzido essencialmente da mesma maneira que uma imunoprecipitação (IP) de uma única proteína, exceto que a proteína alvo precipitada pelo anticorpo, também chamada de "isca", é usada para co-precipitar um complexo parceiro de ligação / proteína , ou "presa", de um lisado. Essencialmente, a proteína de interação é ligada ao antígeno alvo, que é ligado pelo anticorpo que é imobilizado ao suporte. Proteínas imunoprecipitadas e seus parceiros de ligação são comumente detectados por eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e análise de western blot. A suposição geralmente feita quando as proteínas associadas são co-precipitadas é que essas proteínas estão relacionadas à função do antígeno alvo no nível celular. Esta é apenas uma suposição, no entanto, que está sujeita a uma verificação posterior.

Co-imunoprecipitação de ciclina B e Cdk1. As esferas magnéticas da Thermo Scientific Pierce Protein A / G ligam-se ao anticorpo Cdk1 complexado com Cdk1. A ciclina B está ligada ao Cdk1 e é capturada junto com seu parceiro de ligação.


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