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11.3: Usando produtos químicos para controlar microorganismos - Biologia


objetivos de aprendizado

  • Compreenda e compare vários produtos químicos usados ​​para controlar o crescimento microbiano, incluindo seus usos, vantagens e desvantagens, estrutura química e modo de ação

Além dos métodos físicos de controle microbiano, os produtos químicos também são usados ​​para controlar o crescimento microbiano. Uma ampla variedade de produtos químicos pode ser usada como desinfetantes ou anti-sépticos. Ao escolher qual usar, é importante considerar o tipo de micróbio visado; quão limpo o item precisa ser; o efeito do desinfetante na integridade do item; sua segurança para animais, humanos e meio ambiente; sua despesa; e sua facilidade de uso. Esta seção descreve a variedade de produtos químicos usados ​​como desinfetantes e anti-sépticos, incluindo seus mecanismos de ação e usos comuns.

Fenólicos

Em 1800, os cientistas começaram a fazer experiências com uma variedade de produtos químicos para desinfecção. Na década de 1860, o cirurgião britânico Joseph Lister (1827–1912) começou a usar ácido carbólico, conhecido como fenol, como desinfetante para o tratamento de feridas cirúrgicas. Em 1879, o trabalho de Lister inspirou o químico americano Joseph Lawrence (1836–1909) a desenvolver Listerine, uma mistura à base de álcool de vários compostos relacionados que ainda é usado hoje como um anti-séptico oral. Hoje, o ácido carbólico não é mais usado como desinfetante cirúrgico porque é irritante para a pele, mas os compostos químicos encontrados em anti-sépticos bucais e pastilhas para garganta são chamados de fenólicos.

Quimicamente, o fenol consiste em um anel de benzeno com um grupo –OH, e os fenólicos são compostos que possuem esse grupo como parte de sua estrutura química (Figura ( PageIndex {1} )). Fenólicos como o timol e o eucaliptol ocorrem naturalmente nas plantas. Outros fenólicos podem ser derivados do creosoto, um componente do alcatrão de carvão. Os fenólicos tendem a ser estáveis, persistentes nas superfícies e menos tóxicos do que o fenol. Eles inibem o crescimento microbiano desnaturando as proteínas e rompendo as membranas.

Desde a época de Lister, vários compostos fenólicos têm sido usados ​​para controlar o crescimento microbiano. Fenólicos como cresóis (fenóis metilados) e o-fenilfenol eram ingredientes ativos em várias formulações de Lysol desde a sua invenção em 1889. o-fenilfenol também era comumente usado na agricultura para controlar o crescimento de bactérias e fungos em colheitas, especialmente frutas cítricas, mas sua o uso nos Estados Unidos agora é muito mais limitado. O bisfenol hexaclorofeno, um desinfetante, é o ingrediente ativo do pHisoHex, um detergente de limpeza tópico amplamente utilizado para a lavagem das mãos em hospitais. pHisoHex é particularmente eficaz contra bactérias gram-positivas, incluindo aquelas que causam infecções cutâneas estafilocócicas e estreptocócicas. pHisoHex era usado anteriormente para dar banho em bebês, mas essa prática foi descontinuada porque foi demonstrado que a exposição ao hexaclorofeno pode levar a problemas neurológicos.

O triclosan é outro composto de bisfenol que teve ampla aplicação em produtos antibacterianos nas últimas décadas. Inicialmente usado em pastas de dente, o triclosan agora é comumente usado em sabonetes para as mãos e é frequentemente impregnado em uma ampla variedade de outros produtos, incluindo tábuas de corte, facas, cortinas de chuveiro, roupas e concreto, para torná-los antimicrobianos. É particularmente eficaz contra bactérias gram-positivas na pele, bem como certas bactérias gram-negativas e leveduras.1

Triclosan: Antibacterial Overkill?

Sabonetes para as mãos e outros produtos de limpeza são frequentemente comercializados como “antibacterianos”, sugerindo que fornecem um nível de limpeza superior ao dos sabonetes e produtos de limpeza convencionais. Mas os ingredientes antibacterianos desses produtos são realmente seguros e eficazes?

Cerca de 75% dos sabonetes líquidos antibacterianos e 30% dos sabonetes em barra contêm o triclosan químico, um fenólico (Figura ( PageIndex {2} )).2 O triclosan bloqueia uma enzima na via de biossíntese de ácidos graxos bacterianos que não é encontrada na via humana comparável. Embora o uso de triclosan em casa tenha aumentado drasticamente durante a década de 1990, mais de 40 anos de pesquisas do FDA não trouxeram evidências conclusivas de que a lavagem com produtos contendo triclosan oferece maiores benefícios à saúde em comparação com a lavagem com sabonete tradicional. Embora alguns estudos indiquem que menos bactérias podem permanecer nas mãos de uma pessoa após a lavagem com sabonete à base de triclosan, em comparação com o sabonete tradicional, nenhuma evidência aponta para qualquer redução na transmissão de bactérias que causam doenças respiratórias e gastrointestinais. Resumindo, os sabonetes com triclosan podem remover ou matar mais alguns germes, mas não o suficiente para reduzir a propagação da doença.

Talvez o mais preocupante seja o fato de que alguns riscos claros associados aos sabonetes à base de triclosan vieram à tona. O uso generalizado de triclosan levou a um aumento de cepas bacterianas resistentes ao triclosan, incluindo aquelas de importância clínica, como Salmonella enterica; esta resistência pode tornar o triclosan inútil como antibacteriano a longo prazo.34 As bactérias podem facilmente ganhar resistência ao triclosan por meio de uma mudança em um único gene que codifica a enzima-alvo na via de síntese de ácidos graxos bacterianos. Outros desinfetantes com um modo de ação menos específico são muito menos propensos a gerar resistência porque levaria muito mais do que uma única mudança genética.

O uso de triclosan nas últimas décadas também levou ao acúmulo desse produto químico no meio ambiente. Triclosan em sabonete para as mãos é introduzido diretamente nas águas residuais e sistemas de esgoto como resultado do processo de lavagem das mãos. Lá, suas propriedades antibacterianas podem inibir ou matar as bactérias responsáveis ​​pela decomposição do esgoto, fazendo com que os sistemas sépticos entupam e voltem a funcionar. Eventualmente, o triclosan em águas residuais encontra seu caminho em águas superficiais, riachos, lagos, sedimentos e solos, interrompendo populações naturais de bactérias que desempenham funções ambientais importantes, como a inibição de algas. O triclosan também chega aos corpos de anfíbios e peixes, onde pode atuar como um desregulador endócrino. Níveis detectáveis ​​de triclosan também foram encontrados em vários fluidos corporais humanos, incluindo leite materno, plasma e urina.5 Na verdade, um estudo conduzido pelo CDC encontrou níveis detectáveis ​​de triclosan na urina de 75% de 2.517 pessoas testadas em 2003-2004.6 Essa descoberta é ainda mais preocupante, dadas as evidências de que o triclosan pode afetar a função imunológica em humanos.7

Em dezembro de 2013, o FDA deu aos fabricantes de sabonetes até 2016 para provar que os sabonetes antibacterianos fornecem um benefício significativo sobre os sabonetes tradicionais; se não for possível, os fabricantes serão forçados a retirar esses produtos do mercado.

Exercício ( PageIndex {1} )

Por que o triclosan se parece mais com um antibiótico do que com um desinfetante tradicional?

Metais pesados

Alguns dos primeiros desinfetantes químicos e anti-sépticos usados ​​foram metais pesados. Os metais pesados ​​matam os micróbios ligando-se às proteínas, inibindo assim a atividade enzimática (Figura ( PageIndex {3} )). Os metais pesados ​​são oligodinâmicos, o que significa que concentrações muito pequenas apresentam atividade antimicrobiana significativa. Os íons de metais pesados ​​ligam-se aos aminoácidos contendo enxofre fortemente e bioacumulam dentro das células, permitindo que esses metais atinjam altas concentrações localizadas. Isso faz com que as proteínas se desnaturem.

Os metais pesados ​​não são seletivamente tóxicos para as células microbianas. Eles também podem bioacumular em células humanas ou animais, e concentrações excessivas podem ter efeitos tóxicos em humanos. Se muita prata se acumular no corpo, por exemplo, isso pode resultar em uma condição chamada argiria, na qual a pele torna-se irreversivelmente azul acinzentada. Uma maneira de reduzir a toxicidade potencial de metais pesados ​​é controlando cuidadosamente a duração da exposição e a concentração do metal pesado.

Mercúrio

O mercúrio é um exemplo de metal pesado que tem sido usado por muitos anos para controlar o crescimento microbiano. Foi usado por muitos séculos para tratar a sífilis. Os compostos de mercúrio como o cloreto de mercúrio são principalmente bacteriostáticos e têm um espectro de atividade muito amplo. Várias formas de mercúrio se ligam a aminoácidos contendo enxofre nas proteínas, inibindo suas funções.

Nas últimas décadas, o uso de tais compostos diminuiu devido à toxicidade do mercúrio. É tóxico para os sistemas nervoso central, digestivo e renal em altas concentrações e tem efeitos ambientais negativos, incluindo bioacumulação em peixes. Antissépticos tópicos como o mercurocromo, que contém mercúrio em baixas concentrações, e o mertiolato, uma tintura (uma solução de mercúrio dissolvido em álcool) já foram comumente usados. No entanto, devido à preocupação com o uso de compostos de mercúrio, esses anti-sépticos não são mais vendidos nos Estados Unidos.

Prata

A prata é usada há muito tempo como anti-séptico. Antigamente, a água potável era armazenada em jarros de prata.8 O creme de silvadene é comumente usado para tratar feridas tópicas e é particularmente útil na prevenção de infecções em queimaduras. As gotas de nitrato de prata costumavam ser aplicadas rotineiramente nos olhos de recém-nascidos para proteger contra a oftalmia neonatorum, infecções oculares que podem ocorrer devido à exposição a patógenos no canal do parto, mas os cremes antibióticos são mais comumente usados. A prata costuma ser combinada com antibióticos, tornando os antibióticos milhares de vezes mais eficazes.9 A prata também é comumente incorporada em cateteres e bandagens, tornando-os antimicrobianos; no entanto, há evidências de que os metais pesados ​​também podem aumentar a seleção para resistência a antibióticos.10

Cobre, Níquel e Zinco

Vários outros metais pesados ​​também exibem atividade antimicrobiana. O sulfato de cobre é um algicida comum usado para controlar o crescimento de algas em piscinas e tanques de peixes. O uso de cobre metálico para minimizar o crescimento microbiano também está se tornando mais difundido. Os forros de cobre nas incubadoras ajudam a reduzir a contaminação das culturas de células. O uso de potes de cobre para armazenamento de água em países subdesenvolvidos está sendo investigado como forma de combater doenças diarreicas. Os revestimentos de cobre também estão se tornando populares para objetos manuseados com frequência, como maçanetas, ferragens de armários e outros acessórios em instalações de saúde, na tentativa de reduzir a disseminação de micróbios.

Os revestimentos de níquel e zinco agora estão sendo usados ​​de maneira semelhante. Outras formas de zinco, incluindo cloreto de zinco e óxido de zinco, também são usadas comercialmente. O cloreto de zinco é bastante seguro para humanos e é comumente encontrado em enxaguatórios bucais, aumentando substancialmente seu tempo de eficácia. O óxido de zinco é encontrado em uma variedade de produtos, incluindo cremes antissépticos tópicos, como loção de calamina, pomadas para fraldas, talco para bebês e xampus para caspa.

Exercício ( PageIndex {2} )

Por que muitos metais pesados ​​são antimicrobianos e tóxicos para os humanos?

Halogênios

Outros produtos químicos comumente usados ​​para desinfecção são os halogênios iodo, cloro e flúor. O iodo atua oxidando componentes celulares, incluindo aminoácidos contendo enxofre, nucleotídeos e ácidos graxos, e desestabilizando as macromoléculas que contêm essas moléculas. É frequentemente usado como tintura tópica, mas pode causar manchas ou irritação na pele. Um iodóforo é um composto de iodo complexado com uma molécula orgânica, aumentando assim a estabilidade do iodo e, por sua vez, sua eficácia. Um iodóforo comum é iodo-povidona, que inclui um agente umectante que libera iodo de forma relativamente lenta. Betadine é uma marca de iodo-povidona comumente usada como esfoliante para as mãos pela equipe médica antes da cirurgia e para antissepsia tópica da pele do paciente antes da incisão (Figura ( PageIndex {4} )).

O cloro é outro halogênio comumente usado para desinfecção. Quando o cloro gasoso é misturado à água, ele produz um oxidante forte chamado ácido hipocloroso, que não é carregado e entra nas células facilmente. O gás cloro é comumente usado em estações de tratamento de água potável e esgoto municipais, com o ácido hipocloroso resultante produzindo o efeito antimicrobiano real. Aqueles que trabalham em estações de tratamento de água precisam tomar muito cuidado para minimizar a exposição pessoal ao gás cloro. O hipoclorito de sódio é o componente químico da lixívia doméstica comum e também é usado para uma ampla variedade de fins de desinfecção. Sais de hipoclorito, incluindo hipocloritos de sódio e cálcio, são usados ​​para desinfetar piscinas. Cloro gasoso, hipoclorito de sódio e hipoclorito de cálcio também são desinfetantes comumente usados ​​nas indústrias de processamento de alimentos e restaurantes para reduzir a propagação de doenças transmitidas por alimentos. Os trabalhadores dessas indústrias também precisam ter o cuidado de usar esses produtos corretamente para garantir sua própria segurança, bem como a segurança dos consumidores. Uma recente declaração conjunta publicada pela Organização para Alimentos e Agricultura (FAO) das Nações Unidas e a OMS indicou que nenhum dos muitos usos benéficos de produtos de cloro no processamento de alimentos para reduzir a propagação de doenças transmitidas por alimentos representa riscos para os consumidores.11

Outra classe de compostos clorados chamados cloraminas são amplamente usados ​​como desinfetantes. As cloraminas são relativamente estáveis, liberando cloro por longos períodos. As cloraminas são derivados da amônia pela substituição de um, dois ou todos os três átomos de hidrogênio por átomos de cloro (Figura ( PageIndex {5} )).

Cloraminas e outros compostos de cloro podem ser usados ​​para desinfecção de água potável, e comprimidos de cloramina são freqüentemente usados ​​pelos militares para esse propósito. Após um desastre natural ou outro evento que comprometa o abastecimento público de água, o CDC recomenda desinfetar a água da torneira adicionando pequenas quantidades de alvejante doméstico regular. Pesquisas recentes sugerem que o dicloroisocianurato de sódio (NaDCC) também pode ser uma boa alternativa para a desinfecção da água potável. Atualmente, os tablets NaDCC estão disponíveis para uso geral e para uso por militares, campistas ou pessoas com necessidades de emergência; para esses usos, o NaDCC é preferível aos comprimidos de cloramina. O dióxido de cloro, um agente gasoso usado para fumigação e esterilização de áreas fechadas, também é comumente usado para a desinfecção de água.

Embora os compostos clorados sejam desinfetantes relativamente eficazes, eles têm suas desvantagens. Alguns podem irritar a pele, o nariz ou os olhos de alguns indivíduos e podem não eliminar completamente certos organismos resistentes da água potável contaminada. O fungo Cryptosporidium, por exemplo, tem uma capa externa protetora que o torna resistente a desinfetantes clorados. Assim, a fervura da água potável em situações de emergência é recomendada quando possível.

O halogênio flúor também é conhecido por ter propriedades antimicrobianas que contribuem para a prevenção da cárie dentária (cáries).12 O flúor é o principal ingrediente ativo da pasta de dente e também é comumente adicionado à água da torneira para ajudar as comunidades a manter a saúde bucal. Quimicamente, o flúor pode ser incorporado à hidroxiapatita do esmalte dentário, tornando-o mais resistente aos ácidos corrosivos produzidos pela fermentação de micróbios bucais. O flúor também aumenta a absorção de íons cálcio e fosfato no esmalte dos dentes, promovendo a remineralização. Além de fortalecer o esmalte, o flúor também parece ser bacteriostático. Ele se acumula nas bactérias formadoras de placa, interferindo em seu metabolismo e reduzindo a produção dos ácidos que contribuem para a cárie dentária.

Exercício ( PageIndex {3} )

Qual é o benefício da cloramina sobre o hipoclorito para desinfecção?

Alcoóis

Os álcoois constituem outro grupo de produtos químicos comumente usados ​​como desinfetantes e anti-sépticos. Eles atuam desnaturando rapidamente as proteínas, o que inibe o metabolismo celular, e rompendo as membranas, o que leva à lise celular. Uma vez desnaturadas, as proteínas podem se dobrar potencialmente se houver água suficiente na solução. Os álcoois são normalmente usados ​​em concentrações de cerca de 70% de solução aquosa e, de fato, funcionam melhor em soluções aquosas do que as soluções de álcool 100%. Isso ocorre porque os álcoois coagulam as proteínas. Em concentrações mais altas de álcool, a coagulação rápida das proteínas de superfície impede a penetração efetiva das células. Os álcoois mais comumente usados ​​para desinfecção são o álcool etílico (etanol) e o álcool isopropílico (isopropanol, álcool isopropílico) (Figura ( PageIndex {6} )).

Os álcoois tendem a ser bactericidas e fungicidas, mas também podem ser viricidas apenas para vírus com envelope. Embora os álcoois não sejam esporicidas, eles inibem os processos de esporulação e germinação. Os álcoois são voláteis e secam rapidamente, mas também podem causar irritação na pele porque desidratam a pele no local da aplicação. Um uso clínico comum de álcoois é esfregar a pele para verificar a degermação antes da injeção da agulha. Os álcoois também são os ingredientes ativos em desinfetantes instantâneos para as mãos, que ganharam popularidade nos últimos anos. O álcool nesses desinfetantes para as mãos atua desnaturando as proteínas e rompendo a membrana da célula microbiana, mas não funcionará com eficácia na presença de sujeira visível.

Por último, os álcoois são usados ​​para fazer tinturas com outros anti-sépticos, como as tinturas de iodo discutidas anteriormente neste capítulo. Em suma, os álcoois são baratos e bastante eficazes para a desinfecção de uma ampla gama de micróbios vegetativos. Porém, uma desvantagem dos álcoois é sua alta volatilidade, limitando sua eficácia imediatamente após a aplicação.

Exercício ( PageIndex {4} )

  1. Cite pelo menos três vantagens dos álcoois como desinfetantes.
  2. Descreva várias aplicações específicas de álcoois usados ​​em produtos desinfetantes.

Surfactantes

Os agentes tensoativos, ou surfactantes, são um grupo de compostos químicos que reduzem a tensão superficial da água. Os surfactantes são os principais ingredientes dos sabões e detergentes. Os sabões são sais de ácidos graxos de cadeia longa e possuem regiões polares e apolares, permitindo que eles interajam com regiões polares e apolares em outras moléculas (Figura ( PageIndex {7} )). Eles podem interagir com óleos e graxas apolares para criar emulsões na água, soltando e removendo a sujeira e os micróbios das superfícies e da pele. Os sabonetes não matam ou inibem o crescimento microbiano e, portanto, não são considerados anti-sépticos ou desinfetantes. No entanto, o uso adequado de sabonetes remove mecanicamente os microrganismos, degerindo efetivamente uma superfície. Alguns sabonetes contêm agentes bacteriostáticos adicionados, como o triclocarban ou o cloflucarban, compostos estruturalmente relacionados ao triclosan, que introduzem propriedades anti-sépticas ou desinfetantes nos sabões.

Os sabões, no entanto, costumam formar filmes difíceis de enxaguar, especialmente em água dura, que contém altas concentrações de sais minerais de cálcio e magnésio. Os detergentes contêm moléculas de surfactante sintético com regiões polares e apolares que apresentam forte atividade de limpeza, mas são mais solúveis, mesmo em água dura e, portanto, não deixam depósitos de sabão.Os detergentes aniônicos, como os usados ​​para lavar roupas, têm um ânion carregado negativamente em uma extremidade ligado a uma longa cadeia hidrofóbica, enquanto os detergentes catiônicos têm um cátion carregado positivamente. Os detergentes catiônicos incluem uma classe importante de desinfetantes e anti-sépticos chamados sais de amônio quaternário (quats), nomeados pelo átomo de nitrogênio quaternário característico que confere a carga positiva (Figura ( PageIndex {8} )). No geral, os quats têm propriedades semelhantes aos fosfolipídios, com extremidades hidrofílicas e hidrofóbicas. Como tal, os quats têm a capacidade de se inserir na bicamada fosfolipídica bacteriana e interromper a integridade da membrana. A carga catiônica dos quats parece conferir suas propriedades antimicrobianas, que são diminuídas quando neutralizadas. Os quats têm várias propriedades úteis. Eles são estáveis, não tóxicos, baratos, incolores, inodoros e insípidos. Eles tendem a ser bactericidas por rompimento das membranas. Eles também são ativos contra fungos, protozoários e vírus envelopados, mas os endosporos não são afetados. Em ambientes clínicos, eles podem ser usados ​​como anti-sépticos ou para desinfetar superfícies. Misturas de quats também são comumente encontradas em produtos de limpeza e desinfetantes domésticos, incluindo muitas formulações atuais de produtos da marca Lysol, que contêm cloretos de benzalcônio como ingredientes ativos. Os cloretos de benzalcônio, junto com o cloreto de quatilpirimidina, também são encontrados em produtos como anti-sépticos para a pele, enxaguatórios orais e enxaguatórios bucais.

Exercício ( PageIndex {5} )

Por que os sabonetes não são considerados desinfetantes?

Bisbiguanidas

As bisbiguanidas foram sintetizadas pela primeira vez no século 20 e são moléculas catiônicas (carregadas positivamente) conhecidas por suas propriedades anti-sépticas (Figura ( PageIndex {10} )). Um anti-séptico bisbiguanida importante é a clorexidina. Tem atividade de amplo espectro contra leveduras, bactérias gram-positivas e bactérias gram-negativas, com exceção de Pseudomonas aeruginosa, que pode desenvolver resistência em exposições repetidas.13 A clorexidina rompe as membranas celulares e é bacteriostática em concentrações mais baixas ou bactericida em concentrações mais altas, nas quais realmente faz com que o conteúdo citoplasmático das células congele. Ele também tem atividade contra vírus envelopados. No entanto, a clorexidina é pouco eficaz contra Mycobacterium tuberculosis e vírus sem envelope, e não é esporicida. A clorexidina é normalmente usada no ambiente clínico como um exfoliante cirúrgico e para outras necessidades de lavagem das mãos para a equipe médica, bem como para antissepsia tópica para pacientes antes da cirurgia ou injeção de agulha. É mais persistente do que os iodóforos, proporcionando atividade antimicrobiana de longa duração. As soluções de clorexidina também podem ser usadas como enxágües orais após procedimentos orais ou para tratar gengivite. Outra bisbiguanida, a alexidina, está ganhando popularidade como esfoliante cirúrgico e enxágue oral porque age mais rápido do que a clorexidina.

Exercício ( PageIndex {6} )

Quais são os dois efeitos da clorexidina nas células bacterianas?

Agentes Alquilantes

Os agentes alquilantes são um grupo de produtos químicos desinfetantes fortes que atuam substituindo um átomo de hidrogênio dentro de uma molécula por um grupo alquil (CnH2n + 1), inativando enzimas e ácidos nucléicos (Figura ( PageIndex {11} )). O agente alquilante formaldeído (CH2OH) é comumente usado em solução a uma concentração de 37% (conhecido como formalina) ou como desinfetante gasoso e biocida. É um desinfetante e biocida forte de amplo espectro que tem a capacidade de matar bactérias, vírus, fungos e endosporos, levando à esterilização em baixas temperaturas, o que às vezes é uma alternativa conveniente aos métodos de esterilização por calor mais trabalhosos. Ele também faz ligações cruzadas com proteínas e tem sido amplamente utilizado como um fixador químico. Por isso, é usado para o armazenamento de espécimes de tecido e como fluido de embalsamamento. Também tem sido usado para inativar agentes infecciosos na preparação de vacinas. O formaldeído é muito irritante para os tecidos vivos e também cancerígeno; portanto, não é usado como anti-séptico.

O glutaraldeído é estruturalmente semelhante ao formaldeído, mas possui dois grupos aldeído reativos, permitindo que atue mais rapidamente do que o formaldeído. É comumente usado como solução a 2% para esterilização e é comercializado sob a marca Cidex. É usado para desinfetar uma variedade de superfícies e equipamentos cirúrgicos e médicos. No entanto, semelhante ao formaldeído, o glutaraldeído irrita a pele e não é usado como anti-séptico.

Um novo tipo de desinfetante que está ganhando popularidade para a desinfecção de equipamentos médicos é o o-ftalaldeído (OPA), que é encontrado em algumas formulações mais recentes de Cidex e produtos semelhantes, substituindo o glutaraldeído. O o-ftalaldeído também possui dois grupos aldeídos reativos, mas eles estão ligados por uma ponte aromática. Acredita-se que o o-ftalaldeído atue de forma semelhante ao glutaraldeído e ao formaldeído, mas é muito menos irritante para a pele e as passagens nasais, produz um odor mínimo, não requer processamento antes do uso e é mais eficaz contra micobactérias.

O óxido de etileno é um tipo de agente alquilante usado para esterilização gasosa. É altamente penetrante e pode esterilizar itens dentro de sacos plásticos, como cateteres, itens descartáveis ​​em laboratórios e clínicas (como placas de Petri embaladas) e outros equipamentos. A exposição ao óxido de etileno é uma forma de esterilização pelo frio, o que o torna útil para a esterilização de itens sensíveis ao calor. Porém, muito cuidado deve ser tomado com o uso de óxido de etileno; é cancerígeno, como os outros agentes alquilantes, e também é altamente explosivo. Com o uso cuidadoso e a aeração adequada dos produtos após o tratamento, o óxido de etileno é altamente eficaz e os esterilizadores de óxido de etileno são comumente encontrados em ambientes médicos para esterilizar materiais embalados.

A β-propionolactona é um agente alquilante com uma estrutura química diferente dos outros já discutidos. Como outros agentes alquilantes, a β-propionolactona se liga ao DNA, inativando-o (Figura ( PageIndex {11} )). É um líquido límpido com um odor forte e tem a capacidade de matar os endosporos. Como tal, tem sido usado na forma líquida ou como vapor para a esterilização de instrumentos médicos e enxertos de tecido, e é um componente comum das vacinas, usado para manter sua esterilidade. Também tem sido usado para esterilizar caldos nutritivos, bem como plasma sanguíneo, leite e água. É rapidamente metabolizado por animais e humanos em ácido láctico. No entanto, também é irritante e pode causar lesões permanentes nos olhos, rins ou fígado. Além disso, demonstrou ser cancerígeno em animais; assim, são necessárias precauções para minimizar a exposição humana à β-propionolactona.14

Exercício ( PageIndex {7} )

  1. De qual reação química os agentes alquilantes participam?
  2. Por que os agentes alquilantes não são usados ​​como anti-sépticos?

Diehard Prions

Os príons, proteínas acelulares mal dobradas responsáveis ​​por doenças incuráveis ​​e fatais, como o kuru e a doença de Creutzfeldt-Jakob, são notoriamente difíceis de destruir. Os príons são extremamente resistentes ao calor, produtos químicos e radiação. Eles também são extremamente infecciosos e mortais; portanto, o manuseio e o descarte de itens infectados por príons requerem treinamento extensivo e extrema cautela.

Os métodos típicos de desinfecção podem reduzir, mas não eliminar a infecciosidade dos príons. A autoclavagem não é totalmente eficaz, nem são produtos químicos como fenol, álcoois, formalina e β-propiolactona. Mesmo quando fixados em formalina, os tecidos afetados do cérebro e da medula espinhal permanecem infecciosos.

O pessoal que manuseia espécimes ou equipamentos contaminados ou trabalha com pacientes infectados deve usar uma capa protetora, proteção facial e luvas resistentes a cortes. Qualquer contato com a pele deve ser lavado imediatamente com detergente e água morna sem esfregar. A pele deve ser lavada com NaOH 1 N ou uma diluição 1:10 de água sanitária por 1 minuto. Resíduos contaminados devem ser incinerados ou autoclavados em uma solução básica forte e os instrumentos devem ser limpos e embebidos em uma solução básica forte.

Para obter mais informações sobre o manuseio de animais e materiais contaminados com príons, visite as diretrizes publicadas nos sites do CDC e da OMS.

Peroxigênios

Os peroxigênios são agentes oxidantes fortes que podem ser usados ​​como desinfetantes ou anti-sépticos. O peroxigênio mais amplamente utilizado é o peróxido de hidrogênio (H2O2), que é frequentemente usado em solução para desinfetar superfícies e também pode ser usado como um agente gasoso. As soluções de peróxido de hidrogênio são anti-sépticos de pele baratos que se decompõem em água e gás oxigênio, ambos ambientalmente seguros. Essa decomposição é acelerada na presença de luz, de modo que as soluções de peróxido de hidrogênio normalmente são vendidas em frascos marrons ou opacos. Uma desvantagem de usar peróxido de hidrogênio como anti-séptico é que ele também causa danos à pele que podem atrasar a cicatrização ou causar cicatrizes. Os limpadores de lentes de contato geralmente incluem peróxido de hidrogênio como desinfetante.

O peróxido de hidrogênio atua produzindo radicais livres que danificam as macromoléculas celulares. O peróxido de hidrogênio tem atividade de amplo espectro, atuando contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (com eficácia ligeiramente maior contra bactérias gram-positivas), fungos, vírus e endosporos. No entanto, as bactérias que produzem as enzimas desintoxicantes de oxigênio catalase ou peroxidase podem ter tolerância inerente a baixas concentrações de peróxido de hidrogênio (Figura ( PageIndex {12} )). Para matar os endosporos, o tempo de exposição ou concentração de soluções de peróxido de hidrogênio deve ser aumentado. O peróxido de hidrogênio gasoso tem maior eficácia e pode ser usado como esterilizante para salas ou equipamentos.

O plasma, um gás quente ionizado, descrito como o quarto estado da matéria, é útil para esterilizar equipamentos porque penetra em superfícies e mata células vegetativas e endosporos. O peróxido de hidrogênio e o ácido peracético, outro peroxigênio comumente usado, podem ser introduzidos como plasma. O ácido peracético pode ser usado como um esterilizante líquido ou de plasma na medida em que mata prontamente os endosporos, é mais eficaz do que o peróxido de hidrogênio mesmo em concentrações bastante baixas e é imune à inativação por catalases e peroxidases. Ele também se decompõe em compostos ambientalmente inócuos; neste caso, ácido acético e oxigênio.

Outros exemplos de peroxigênios incluem peróxido de benzoíla e peróxido de carbamida. O peróxido de benzoíla é um peroxigênio usado em soluções de medicação para acne. Isso mata a bactéria Propionibacterium acnes, que está associado à acne. O peróxido de carbamida, ingrediente usado na pasta de dente, é um peroxigênio que combate os biofilmes orais que causam a descoloração dos dentes e halitose (mau hálito).15 Por último, o gás ozônio é um peroxigênio com qualidades desinfetantes e é usado para limpar o ar ou o abastecimento de água. No geral, os peroxigênios são altamente eficazes e comumente usados, sem risco ambiental associado.

Exercício ( PageIndex {8} )

Como os peróxidos matam as células?

Fluidos Supercríticos

Nos últimos 15 anos, o uso de fluidos supercríticos, especialmente dióxido de carbono supercrítico (scCO2), ganhou popularidade para certas aplicações de esterilização. Quando o dióxido de carbono é levado a aproximadamente 10 vezes a pressão atmosférica, ele atinge um estado supercrítico que possui propriedades físicas entre as dos líquidos e dos gases. Os materiais colocados em uma câmara na qual o dióxido de carbono é pressurizado desta forma podem ser esterilizados devido à capacidade de scCO2 para penetrar nas superfícies.

O dióxido de carbono supercrítico atua penetrando nas células e formando ácido carbônico, reduzindo consideravelmente o pH da célula. Esta técnica é eficaz contra células vegetativas e também é usada em combinação com ácido peracético para matar endosporos. Sua eficácia também pode ser aumentada com o aumento da temperatura ou por ciclos rápidos de pressurização e despressurização, que provavelmente produzem lise celular.

Benefícios do scCO2 incluem as propriedades não reativas, não tóxicas e não inflamáveis ​​do dióxido de carbono, e este protocolo é eficaz em baixas temperaturas. Ao contrário de outros métodos, como calor e irradiação, que podem degradar o objeto a ser esterilizado, o uso de scCO2 preserva a integridade do objeto e é comumente usado para tratar alimentos (incluindo especiarias e sucos) e dispositivos médicos, como endoscópios. Ele também está ganhando popularidade para desinfetar tecidos como pele, ossos, tendões e ligamentos antes do transplante. scCO2 também pode ser usado para controle de pragas porque pode matar ovos e larvas de insetos dentro dos produtos.

Exercício ( PageIndex {9} )

Por que o uso de dióxido de carbono supercrítico está ganhando popularidade para usos comerciais e médicos?

Conservantes Químicos de Alimentos

Conservantes químicos são usados ​​para inibir o crescimento microbiano e minimizar a deterioração de alguns alimentos. Conservantes químicos comumente usados ​​incluem ácido sórbico, ácido benzóico e ácido propiônico e seus sais mais solúveis sorbato de potássio, benzoato de sódio e propionato de cálcio, todos os quais são usados ​​para controlar o crescimento de fungos em alimentos ácidos. Cada um desses conservantes não é tóxico e é facilmente metabolizado por humanos. Também não têm sabor, por isso não comprometem o sabor dos alimentos que conservam.

Os ácidos sórbico e benzóico apresentam maior eficácia à medida que o pH diminui. Acredita-se que o ácido sórbico atue inibindo várias enzimas celulares, incluindo aquelas no ciclo do ácido cítrico, bem como catalases e peroxidases. É adicionado como conservante em uma ampla variedade de alimentos, incluindo laticínios, pães, frutas e vegetais. O ácido benzóico é encontrado naturalmente em muitos tipos de frutas e bagas, especiarias e produtos fermentados. Acredita-se que ele atue diminuindo o pH intracelular, interferindo em mecanismos como a fosforilação oxidativa e a absorção de moléculas, como aminoácidos, pelas células. Os alimentos conservados com ácido benzóico ou benzoato de sódio incluem sucos de frutas, geleias, sorvetes, doces, refrigerantes, gomas de mascar e picles.

Acredita-se que o ácido propiônico iniba enzimas e diminua o pH intracelular, agindo de forma semelhante ao ácido benzóico. No entanto, o ácido propiônico é um conservante mais eficaz em um pH mais alto do que o ácido sórbico ou o ácido benzóico. O ácido propiônico é produzido naturalmente por alguns queijos durante o amadurecimento e é adicionado a outros tipos de queijo e produtos de panificação para evitar a contaminação por mofo. Também é adicionado à massa crua para evitar a contaminação pela bactéria Bacillus mesentericus, o que faz com que o pão fique viscoso.

Outros conservantes químicos comumente usados ​​incluem dióxido de enxofre e nitritos. O dióxido de enxofre evita o escurecimento dos alimentos e é usado para a preservação de frutas secas; tem sido usado na vinificação desde os tempos antigos. O gás dióxido de enxofre se dissolve na água prontamente, formando sulfitos. Embora os sulfitos possam ser metabolizados pelo corpo, algumas pessoas têm alergia ao sulfito, incluindo reações asmáticas. Além disso, os sulfitos degradam a tiamina, um nutriente importante em alguns alimentos. O modo de ação dos sulfitos não está totalmente claro, mas eles podem interferir na formação da ligação dissulfeto nas proteínas, inibindo a atividade enzimática. Alternativamente, eles podem reduzir o pH intracelular da célula, interferindo nos mecanismos movidos pela força motriz do próton.

Os nitritos são adicionados às carnes processadas para manter a cor e interromper a germinação de Clostridium botulinum endosporos. Os nitritos são reduzidos a óxido nítrico, que reage com grupos heme e grupos ferro-enxofre. Quando o óxido nítrico reage com o grupo heme dentro da mioglobina das carnes, um produto vermelho se forma, dando à carne sua cor vermelha. Alternativamente, acredita-se que quando o ácido nítrico reage com a enzima ferro-enxofre ferredoxina dentro das bactérias, esse transportador da cadeia de transporte de elétrons é destruído, impedindo a síntese de ATP. As nitrosaminas, no entanto, são cancerígenas e podem ser produzidas através da exposição de carnes preservadas com nitrito (por exemplo, cachorros-quentes, carne do almoço, salsicha para café da manhã, bacon, carne em sopas enlatadas) ao calor durante o cozimento.

Conservantes Químicos Naturais de Alimentos

A descoberta de substâncias antimicrobianas naturais produzidas por outros micróbios acrescentou ao arsenal de conservantes usados ​​nos alimentos. A nisina é um peptídeo antimicrobiano produzido pela bactéria Lactococcus lactis e é particularmente eficaz contra organismos gram-positivos. A nisina atua interrompendo a produção da parede celular, deixando as células mais sujeitas à lise. É usado para conservar queijos, carnes e bebidas.

A natamicina é um antibiótico macrolídeo antifúngico produzido pela bactéria Streptomyces natalensis. Foi aprovado pelo FDA em 1982 e é usado para prevenir o crescimento de fungos em vários tipos de produtos lácteos, incluindo queijo cottage, queijo fatiado e queijo ralado. A natamicina também é usada para preservação de carne em países fora dos Estados Unidos.

Exercício ( PageIndex {10} )

Quais são as vantagens e desvantagens de usar sulfitos e nitritos como conservantes de alimentos?

Conceitos-chave e resumo

  • Metais pesados, incluindo mercúrio, prata, cobre e zinco, há muito tempo são usados ​​para desinfecção e preservação, embora alguns tenham toxicidade e riscos ambientais associados a eles.
  • Halogênios, incluindo cloro, flúor e iodo, também são comumente usados ​​para desinfecção. Compostos de cloro, incluindo hipoclorito de sódio, cloraminas, e dióxido de cloro, são comumente usados ​​para desinfecção de água. Iodo, em ambos tintura e iodóforo formas, é um anti-séptico eficaz.
  • Alcoóis, incluindo álcool etílico e álcool isopropílico, são anti-sépticos comumente usados ​​que atuam desnaturando proteínas e rompendo membranas.
  • Fenólicos são desinfetantes estáveis ​​de ação prolongada que desnaturam as proteínas e rompem as membranas. Eles são comumente encontrados em produtos de limpeza doméstica, enxaguatórios bucais e desinfetantes hospitalares, e também são usados ​​para preservar as colheitas.
  • O composto fenólico triclosan, encontrado em sabonetes antibacterianos, plásticos e têxteis é tecnicamente um antibiótico por causa de seu modo de ação específico de inibir a síntese bacteriana de ácidos graxos.
  • Surfactantes, incluindo sabões e detergentes, reduzem a tensão superficial da água para criar emulsões que transportam mecanicamente os micróbios. Os sabões são ácidos graxos de cadeia longa, enquanto os detergentes são surfactantes sintéticos.
  • Compostos de amônio quaternário (quats) são detergentes catiônicos que rompem as membranas. Eles são usados ​​em produtos de limpeza domésticos, desinfetantes para a pele, enxaguatórios orais e enxaguatórios bucais.
  • Bisbiguanidas rompe as membranas celulares, fazendo com que o conteúdo da célula gelifique. Clorexidina e alexidina são comumente usados ​​para excrementos cirúrgicos, para lavagem das mãos em ambientes clínicos e em enxaguatórios orais prescritos.
  • Agentes alquilantes esterilizam efetivamente os materiais em baixas temperaturas, mas são cancerígenos e também podem irritar o tecido. Glutaraldeído e o-ftalaldeído são usados ​​como desinfetantes hospitalares, mas não como anti-sépticos. Formaldeído é usado para o armazenamento de amostras de tecido, como um fluido de embalsamamento e na preparação de vacinas para inativar agentes infecciosos. Óxido de etileno é um esterilizante a gás que pode permear materiais embalados sensíveis ao calor, mas também é explosivo e cancerígeno.
  • Peroxigênios, Incluindo peróxido de hidrogênio, ácido peracético, peróxido de benzoílae o gás ozônio são fortes agentes oxidantes que produzem radicais livres nas células, danificando suas macromoléculas. Eles são ambientalmente seguros e são desinfetantes e anti-sépticos altamente eficazes.
  • Dióxido de carbono pressurizado na forma de um fluido supercrítico permeia facilmente materiais embalados e células, formando ácido carbônico e diminuindo o pH intracelular. O dióxido de carbono supercrítico é não reativo, não tóxico, não inflamável e eficaz em baixas temperaturas para esterilização de dispositivos médicos, implantes e tecidos transplantados.
  • Conservantes químicos são adicionados a uma variedade de alimentos. Ácido sórbico, ácido benzóico, ácido propiónico, e seus sais mais solúveis inibem enzimas ou reduzem o pH intracelular.
  • Sulfitos são usados ​​na vinificação e processamento de alimentos para evitar o escurecimento dos alimentos.
  • Nitritos são usados ​​para preservar carnes e manter a cor, mas cozinhar carnes preservadas com nitrito pode produzir nitrosaminas cancerígenas.
  • Nisin e natamicina são conservantes produzidos naturalmente, usados ​​em queijos e carnes. A nisina é eficaz contra bactérias gram-positivas e a natamicina contra fungos.

Notas de rodapé

  1. US Food and Drug Administration. “Triclosan: O que os consumidores devem saber.” 2015. www.fda.gov/ForConsumers/Cons.../ucm205999.htm. Acessado em 9 de junho de 2016.
  2. J. Stromberg. “Cinco razões pelas quais você provavelmente deveria parar de usar sabonete antibacteriano.” Smithsonian.com 3 de janeiro de 2014. www.smithsonianmag.com/scienc...948078/?no-ist. Acessado em 9 de junho de 2016.
  3. SP Yazdankhah et al. “Triclosan and Antimicrobial Resistance in Bacteria: An Overview.” Resistência microbiana a drogas 12 não. 2 (2006): 83–90.
  4. L. Birošová, M. Mikulášová. “Desenvolvimento de Triclosan e Resistência a Antibióticos em Salmonella enterica serovar Typhimurium. ” Journal of Medical Microbiology 58 não. 4 (2009): 436–441.
  5. AB Dann, A. Hontela. “Triclosan: Exposição Ambiental, Toxicidade e Mecanismos de Ação.” Journal of Applied Toxicology 31 não. 4 (2011): 285–311.
  6. Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças. “Folha de dados do triclosan”. 2013. www.cdc.gov/biomonitoring/Tri...FactSheet.html. Acessado em 9 de junho de 2016.
  7. EM Clayton et al. “The Impact of Bisphenol A and Triclosan on Immune Parameters in the US Population, NHANES 2003-2006.” Perspectivas de Saúde Ambiental 119 no. 3 (2011): 390.
  8. N. Silvestry-Rodriguez et al. “Prata como desinfetante.” No Avaliações de Contaminação Ambiental e Toxicologia, pp. 23-45. Editado por GW Ware e DM Whitacre. Nova York: Springer, 2007.
  9. B. Owens. “Silver Makes Antibiotics Thousands of Times More Effective.” Natureza 19 de junho de 2013. http://www.nature.com/news/silver-ma...ective-1.13232
  10. C. Seiler, TU Berendonk. “Heavy Metal Driven Co-Selection of Antibiotic Resistance in Soil and Water Bodies impactated by Agriculture and Aquaculture.” Fronteiras em Microbiologia 3 (2012):399.
  11. Organização Mundial da Saúde. “Benefícios e riscos do uso de desinfetantes contendo cloro na produção e processamento de alimentos: Relatório de uma reunião conjunta de especialistas FAO / OMS.” Genebra, Suíça: Organização Mundial da Saúde, 2009.
  12. RE Marquis. “Antimicrobial Actions of Fluoride for Oral Bacteria.” Canadian Journal of Microbiology 41 no. 11 (1995): 955–964.
  13. L. Thomas et al. “Desenvolvimento de resistência ao diacetato de clorexidina em Pseudomonas aeruginosa e o efeito de uma concentração 'residual'. ” Journal of Hospital Infection 46 não. 4 (2000): 297–303.
  14. Instituto de Medicina. “Efeitos de Longo Prazo na Saúde da Participação no Projeto SHAD (Perigo a Bordo e Defesa).” Washington, DC: The National Academies Press, 2007.
  15. Yao, C.S. et al. “Efeito antibacteriano in vitro do peróxido de carbamida no biofilme oral.” Journal of Oral Microbiology 12 de junho de 2013. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3682087/. doi: 10.3402 / jom.v5i0.20392.

11.3: Usando produtos químicos para controlar microorganismos - Biologia

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Padrão de Teste

Nenhum método padrão para avaliar desinfetantes de ar foi adotado. Consulte as referências anexas para obter informações sobre o teste de produtos destinados à higienização do ar de espaços fechados. Os protocolos de teste propostos para estudos deste tipo podem ser submetidos para revisão e avaliação pela Agência antes do início dos testes.

Para produtos contendo pelo menos 5% de glicóis (trietileno, dipropileno e / ou propileno glicóis), determinações químicas quantitativas devem ser realizadas, usando um dispositivo de amostragem de ar, para mostrar a concentração de vapor de glicol alcançada com o produto, usado conforme as instruções, em uma sala ou câmara experimental fechada. (Nota: Até que as Diretrizes de Desempenho do Produto propostas sejam finalizadas, os requisitos de teste estão sendo adiados para produtos deste tipo. Atualmente, os requisitos de eficácia são satisfeitos pela declaração da fórmula química que mostra o conteúdo de glicol apropriado.) DIS / TSS-11 3 Set. 80

Para produtos diferentes dos especificados acima em produtos de glicol, ensaios microbiológicos quantitativos devem ser realizados, usando um dispositivo de amostragem de ar, para mostrar o nível de redução de microrganismos viáveis ​​alcançado com o produto, usado como direcionado, em uma sala ou câmara experimental fechada. As bactérias de teste primárias são Staphylococcusaureus ATCC 6538 e Klebsiellapneumoniae ATCC 4352. Se o produto se destinar ao uso em ambientes hospitalares ou médicos, os testes com Pseudomonasaeruginosa ATCC 15442 também são necessários.

Devem ser informadas a metodologia empregada, como procedimentos de pulverização e amostragem, e as condições ambientais da sala ou câmara, como temperatura, umidade relativa, etc. Os dados brutos, bem como qualquer interpretação estatística ou gráfica dos resultados, devem ser incluídos nos relatórios.


Pacote de registro para pesticidas bioquímicos e microbianos

As categorias de aplicativos descritas no Capítulo 2 se aplicam a todos os pedidos de registro de produtos convencionais, biopesticidas e pesticidas antimicrobianos. Todos os pedidos de registro devem incluir os dados, informações, formulários e taxas e / ou isenção de taxas ou solicitações de isenção conforme descrito no Capítulo 2.

Pesticidas bioquímicos e microbianos estão, no entanto, sujeitos a um conjunto diferente de requisitos de dados para registro do que os produtos químicos convencionais, e estão listados em Requisitos de Dados para Registro 40 CFR Parte 158:

A EPA publicou orientações para o desenvolvimento desses dados nas Diretrizes de Teste de Pesticidas Bioquímicos, Série OPPTS 880 e nas Diretrizes de Teste de Pesticidas Microbianos, Série OPPTS 885. Consulte também o Capítulo 2 deste manual para informações gerais sobre como enviar um pedido de registro, e Capítulo 12 para informações adicionais sobre licenças de uso experimental.

Várias dicas úteis estão disponíveis na página da Web para biopesticidas, especificamente a página da Web das Ferramentas de Registro de Biopesticidas, para ajudar os solicitantes na preparação dos envios de biopesticidas. Entre eles estão:

Pesticidas microbianos geneticamente modificados pode estar sujeito a requisitos de dados adicionais (ou menos) ou requisitos de informação caso a caso, dependendo do microrganismo particular, do microrganismo original, do padrão de uso proposto e da maneira e extensão em que o organismo foi geneticamente modificado.

Requisitos de dados adicionais podem incluir:

  • informações sobre as técnicas de engenharia genética utilizadas
  • a identidade do segmento de gene inserido ou excluído (dados de sequência de base ou mapa de restrição enzimática do gene)
  • informações sobre a região de controle do gene em questão
  • uma descrição dos novos traços ou características que se pretendem expressar
  • testes para avaliar a estabilidade genética e troca e / ou
  • testes de expressão ambiental e toxicologia selecionados de Nível II.

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer a M. Bernardi pela assistência gráfica e a D. Abernathy, P. Marcenac e D. Paton pela leitura cuidadosa deste manuscrito. F.C. é financiado em pesquisas relacionadas ao tópico discutido aqui por um Prêmio Acadêmico de Pesquisa da Faculdade do Howard Hughes Medical Institute (HHMI) e da Fundação Bill & amp Melinda Gates (BMGF) (concessão ID OPP1158190), e pelo National Institutes of Health (NIH) ) (R01 AI124165). As descobertas e conclusões nesta publicação são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente as posições ou políticas do HHMI, do BMGF ou do NIH.


Conclusões

A primeira estrutura de biologia sintética para engenharia genética de C. glutamicum foi criado. A plataforma é baseada no uso de plasmídeos onde todos os componentes que influenciam a expressão do gene são flanqueados por sítios de restrição únicos para facilitar a troca de partes e a montagem rápida de construções para a expressão de múltiplos genes. O pedido foi validado testando promotores, sítios de ligação de ribossomo e pela montagem de operons e construções de agrupamento de genes para expressar genes repórter. A plataforma apresentada pode facilitar a engenharia metabólica de C. glutamicum para produzir compostos valiosos de uma maneira econômica.


11.3: Usando produtos químicos para controlar microorganismos - Biologia

O que é controle biológico?

Este segmento inclui vários parágrafos com informações gerais sobre o controle biológico e estas subseções:

O controle biológico é um componente de uma estratégia de manejo integrado de pragas. É definida como a redução de populações de pragas por inimigos naturais e normalmente envolve um papel humano ativo. Lembre-se de que todas as espécies de insetos também são suprimidas por organismos que ocorrem naturalmente e fatores ambientais, sem intervenção humana. Isso é freqüentemente referido como controle natural. Este guia enfatiza o controle biológico de insetos, mas o controle biológico de ervas daninhas e doenças de plantas também está incluído. Os inimigos naturais de insetos-praga, também conhecidos como agentes de controle biológico, incluem predadores, parasitóides e patógenos. O controle biológico de ervas daninhas inclui insetos e patógenos. Os agentes de controle biológico de doenças de plantas são mais frequentemente referidos como antagonistas.

Predadores, como joaninhas e crisopídeos, são principalmente espécies de vida livre que consomem um grande número de presas durante sua vida. Parasitóides são espécies cujo estágio imaturo se desenvolve em ou dentro de um único inseto hospedeiro, acabando por matá-lo. Muitas espécies de vespas e algumas moscas são parasitóides. Os patógenos são organismos causadores de doenças, incluindo bactérias, fungos e vírus. Eles matam ou debilitam seu hospedeiro e são relativamente específicos para certos grupos de insetos. Cada um desses grupos de inimigos naturais é discutido com muito mais detalhes nas seções seguintes.

Os comportamentos e ciclos de vida dos inimigos naturais podem ser relativamente simples ou extraordinariamente complexos, e nem todos os inimigos naturais dos insetos são benéficos para a produção agrícola. Por exemplo, os hiperparasitóides são parasitóides de outros parasitóides. Em batatas cultivadas no Maine, foram identificados 22 parasitóides de pulgões, mas estes foram atacados por 18 espécies adicionais de hiperparasitóides.

Este guia concentra-se nas espécies para as quais os benefícios de sua presença superam quaisquer desvantagens. Um inimigo natural bem-sucedido deve ter uma alta taxa reprodutiva, boa capacidade de busca, especificidade do hospedeiro, ser adaptável a diferentes condições ambientais e estar sincronizado com seu hospedeiro (praga).

Uma alta taxa reprodutiva é importante para que as populações do inimigo natural possam aumentar rapidamente quando há hospedeiros disponíveis. O inimigo natural deve ser eficaz na procura de seu hospedeiro e deve procurar apenas uma ou algumas espécies hospedeiras. As aranhas, por exemplo, se alimentam de muitos hospedeiros diferentes, incluindo outros inimigos naturais. Também é muito importante que o inimigo natural ocorra ao mesmo tempo que seu hospedeiro. Por exemplo, se o inimigo natural é um parasitóide de ovo, ele deve estar presente quando os ovos do hospedeiro estiverem disponíveis. Nenhum inimigo natural tem todos esses atributos, mas aqueles com várias características serão mais importantes para ajudar a manter as populações de pragas.

Existem três tipos amplos e um tanto sobrepostos de controle biológico: conservação, controle biológico clássico (introdução de inimigos naturais em um novo local) e aumento.

A conservação de inimigos naturais é provavelmente a prática de controle biológico mais importante e prontamente disponível para os produtores. Inimigos naturais ocorrem em todos os sistemas de produção, desde a horta até o campo comercial. Eles são adaptados ao ambiente local e à praga-alvo, e sua conservação geralmente é simples e econômica. Com relativamente pouco esforço, a atividade desses inimigos naturais pode ser observada. Lacewings, joaninhas, larvas de moscas flutuantes e múmias de pulgões parasitados estão quase sempre presentes em colônias de pulgões. Moscas adultas infectadas com fungos são freqüentemente comuns após períodos de alta umidade. Esses controles naturais são importantes e precisam ser conservados e considerados ao tomar decisões de manejo de pragas. Em muitos casos, a importância dos inimigos naturais não foi estudada adequadamente ou não se tornou aparente até que o uso de inseticidas seja interrompido ou reduzido. Freqüentemente, o melhor que podemos fazer é reconhecer que esses fatores estão presentes e minimizar os impactos negativos sobre eles. Se um inseticida for necessário, todo esforço deve ser feito para usar um material seletivo de maneira seletiva.

Controle biológico clássico

Em muitos casos, o complexo de inimigos naturais associados a uma praga de inseto pode ser inadequado. Isso é especialmente evidente quando uma praga de inseto é acidentalmente introduzida em uma nova área geográfica sem seus inimigos naturais associados. Essas pragas introduzidas são chamadas de exóticas e compreendem cerca de 40% das pragas de insetos nos Estados Unidos. Exemplos de pragas vegetais introduzidas incluem a broca do milho europeia, um dos insetos mais destrutivos da América do Norte. Para obter os inimigos naturais necessários, nos voltamos para o controle biológico clássico. É a prática de importar e liberar para estabelecimento inimigos naturais para controlar uma praga introduzida (exótica), embora também seja praticada contra insetos-praga nativos. O primeiro passo no processo é determinar a origem da praga introduzida e então coletar os inimigos naturais apropriados (daquele local ou locais semelhantes) associados à praga ou espécies intimamente relacionadas. O inimigo natural passa então por um rigoroso processo de quarentena, para garantir que nenhum organismo indesejado (como hiperparasitóides) seja introduzido, criado, idealmente em grande número, e liberado. Estudos de acompanhamento são conduzidos para determinar se o inimigo natural se estabeleceu com sucesso no local de liberação e para avaliar o benefício de longo prazo de sua presença.

Existem muitos exemplos de programas clássicos de controle biológico bem-sucedidos. Um dos primeiros sucessos foi com a escama de algodão, uma praga que estava devastando a indústria cítrica da Califórnia no final do século XIX. Um inseto predador, o besouro vedália e uma mosca parasitóide foram introduzidos da Austrália. Dentro de alguns anos, a escala de almofada de algodão foi completamente controlada por esses inimigos naturais introduzidos. Os danos causados ​​pelo gorgulho da alfafa, uma séria praga introduzida na forragem, foram substancialmente reduzidos pela introdução de vários inimigos naturais. Cerca de 20 anos após sua introdução, a área de alfafa tratada para o gorgulho da alfafa no nordeste dos Estados Unidos foi reduzida em 75 por cento. Uma pequena vespa, Trichogramma ostriniae, introduzida da China para ajudar a controlar a broca do milho europeia, é um exemplo recente de uma longa história de esforços clássicos de controle biológico para esta grande praga. Muitos programas clássicos de controle biológico de pragas e ervas daninhas estão em andamento nos Estados Unidos e no Canadá.

O controle biológico clássico é duradouro e barato. Além dos custos iniciais de coleta, importação e criação, pouca despesa é incorrida. Quando um inimigo natural é estabelecido com sucesso, raramente requer informações adicionais e continua a matar a praga sem ajuda direta de humanos e sem nenhum custo. Infelizmente, o controle biológico clássico nem sempre funciona. Geralmente é mais eficaz contra pragas exóticas e menos eficaz contra pragas de insetos nativos. As razões para o fracasso geralmente não são conhecidas, mas podem incluir a liberação de poucos indivíduos, má adaptação do inimigo natural às condições ambientais no local de liberação e falta de sincronia entre o ciclo de vida do inimigo natural e a praga hospedeira.

Este terceiro tipo de controle biológico envolve a liberação suplementar de inimigos naturais. Relativamente poucos inimigos naturais podem ser liberados em um momento crítico da estação (liberação inoculativa) ou literalmente milhões podem ser liberados (liberação inundativa). Além disso, o sistema de cultivo pode ser modificado para favorecer ou aumentar os inimigos naturais. Esta última prática é freqüentemente chamada de manipulação de habitat.
Um exemplo de liberação de inoculante ocorre na produção em estufas de várias safras. Liberações periódicas do parasitóide Encarsia formosa são usadas para controlar a mosca-branca de estufa, e o ácaro predador, Phytoseiulus persimilis, é usado para o controle do ácaro-rajado.
Besouros, crisopídeos ou parasitóides como o Trichogramma são freqüentemente liberados em grande número (liberação inundativa). As taxas de liberação recomendadas para Trichogramma em vegetais ou plantações de campo variam de 5.000 a 200.000 por acre por semana, dependendo do nível de infestação de pragas. Da mesma forma, os nematóides entomopatogênicos são liberados a taxas de milhões e até bilhões por acre para o controle de certas pragas de insetos que vivem no solo.
A manipulação do habitat ou do ambiente é outra forma de aumento. Essa tática envolve alterar o sistema de cultivo para aumentar ou aumentar a eficácia de um inimigo natural. Muitos parasitóides e predadores adultos se beneficiam de fontes de néctar e da proteção fornecida por refúgios, como cercas vivas, plantações de cobertura e bordas com ervas daninhas.

As plantações mistas e a provisão de bordas de flores podem aumentar a diversidade de habitats e fornecer abrigo e fontes alternativas de alimento.Eles são facilmente incorporados em hortas caseiras e até mesmo em plantações comerciais de pequena escala, mas são mais difíceis de acomodar na produção agrícola em grande escala. Também pode haver algum conflito com o controle de pragas para o grande produtor por causa da dificuldade de direcionar as espécies de pragas e o uso de refúgios por insetos-praga, bem como por inimigos naturais.
Exemplos de manipulação de habitat incluem o cultivo de plantas com flores (fontes de pólen e néctar) perto de plantações para atrair e manter populações de inimigos naturais. Por exemplo, moscas planas adultas podem ser atraídas por plantas umbelíferas em flor.


Um trabalho recente na Califórnia demonstrou que o plantio de ameixas em vinhedos fornece um habitat melhorado para o inverno ou refúgio para um parasitóide-praga da uva. As ameixas secas abrigam um hospedeiro alternativo para o parasitóide, que antes só conseguia hibernar a grandes distâncias da maioria dos vinhedos. Deve-se ter cuidado com essa tática porque algumas plantas atraentes para inimigos naturais também podem ser hospedeiras de certas doenças de plantas, especialmente vírus de plantas que podem ser transmitidos por insetos-praga para a cultura. Embora a tática pareça promissora, apenas alguns exemplos foram adequadamente pesquisados ​​e desenvolvidos.

Compra e liberação de inimigos naturais

Muitos insetários comerciais criam e comercializam uma variedade de inimigos naturais, incluindo ácaros predadores, joaninhas, crisopídeos, mantídeos rezadores e várias espécies de parasitóides. O sucesso com tais lançamentos requer tempo apropriado (o hospedeiro deve estar presente ou o inimigo natural simplesmente morrerá ou deixará a área) e lançamento do número correto de inimigos naturais por unidade de área (taxa de liberação). Em muitos casos, a taxa de liberação mais eficaz não foi identificada, pois variará dependendo do tipo de cultura e da densidade do hospedeiro alvo.

O sucesso também requer um inimigo natural saudável e robusto. Este guia não faz recomendações específicas sobre a compra ou liberação dos inimigos naturais comercialmente disponíveis, mas fornece informações essenciais sobre a biologia e o comportamento da maioria das espécies criadas comercialmente. Essas informações devem ser úteis na tomada de decisões sobre seu uso.


Informações de Apoio

S1 Fig. Produtos químicos que são bons para a captura de DNA não são necessariamente bons para a amplificação de DNA.

(A) DNA de esperma de salmão marcado com GelRed em tampão de pH 5 (imagem à esquerda) ou pH 8,5 (imagem à direita) foi adicionado ao centro de um disco de filtro Whatman No.1 no qual os produtos químicos: 1,25% de quitosana (1), 2,5% dopamina (2), 2,5% de espermina (3), 2,5% de polivinilpiriliodona (4), 1,25% de polietilenimina (5) e 3-aminopropil-trimetoxisilano (6) foram manchados. Os filtros foram visualizados sob luz ultravioleta antes (imagens superiores) e depois (imagens inferiores) da adição de DNA. (B) discos de 3 mm de diâmetro de papel Whatman No.1 que foram tratados com ou sem 1,25% de quitosana foram incubados em UMA. thaliana DNA genômico por um minuto, depois lavado em tampão de pH 5 ou pH 8,5 por um minuto e depois transferido para uma mistura de PCR para amplificação. 1 μl de água foi usado no lugar do disco de celulose no NTC. NTC, sem controle de modelo.

S2 Fig. A extração de DNA pode ser realizada por uma variedade de matrizes de suporte sólido.

(A) Fragmentos de tamanho idêntico de uma variedade de fontes foram usados ​​para purificar os ácidos nucleicos de um Arabidopsis extrato de folha. Os ácidos nucleicos extraídos foram usados ​​para amplificação por PCR usando primers projetados para o gene da subunidade 1 da proteína G gama (At3g63420) (B) Um, dois ou três discos (3 mm de diâmetro) de Whatman No.1, Hybond N ou toalha de papel da marca Scott foram incubados em toalha de papel purificada Arabidopsis DNA, lavado e, em seguida, usado em uma reação de PCR usando primers projetados para o gene da subunidade 1 da proteína G gama.

S1 Movie. Vídeo do protocolo de purificação de ácido nucleico da vareta de medição de celulose aplicado a uma amostra de folha de planta.

Uma folha é retirada de uma planta e colocada em um tubo contendo tampão de lise e dois rolamentos de esferas. O tecido foi macerado agitando o tubo por aproximadamente 8 segundos. A vareta de medição de celulose é mergulhada no lisado para ligar os ácidos nucléicos, então mergulhada em tampão de lavagem para remover contaminantes e finalmente mergulhada na mistura de amplificação para eluir os ácidos nucléicos.

S1 Data. A celulose e o Hybond N têm carga negativa.

Os potenciais zeta medidos de Whatman No.1 e Hybond N em uma faixa de pH.

Tabela S1. Sequências de oligonucleotídeos.

Os nomes, sequências, espécies-alvo e fonte de cada oligonucleotídeo usado neste estudo.


Métodos e análises: estudo principal do HATUA

Atividades de campo e coleta de dados

A atividade do HATUA acontecerá no Quênia, Uganda e Tanzânia, e as equipes multidisciplinares farão pesquisas sequenciais em três áreas de estudo (SAs) em cada país (figura 2). Os locais são sociodemograficamente distintos: (1) cenários urbanos, economicamente avançados que aumentam potencialmente a acessibilidade e o acesso a ABs (2) vilas remotas em áreas mais pobres onde a pobreza, isolamento físico e menor acesso a ABs possivelmente levam a potenciais condutores, como o compartilhamento de prescrições, cultura microbiológica restrita e baixa sensibilidade de teste AB (C & ampAST) capacidade e (3) pastoralista e áreas de rede negligenciadas com comunidades pastoris altamente móveis e altos níveis de interação humano-animal promovendo uma ligação zoonótica. O hospital terciário (nível 5) e as unidades de saúde de nível inferior nos SAs (clínicas / hospitais de nível 4, 3 e 2) serão usados ​​para recrutar pacientes com ITU e também conduzir entrevistas com profissionais de saúde (ver fluxos de trabalho (WS) 1, 2 e 3 mais). Para além dos hospitais, a actividade decorrerá no resto do SA, com visitas a revendedores AB, agregados familiares e comunidades. No início das atividades em todos os SAs, workshops de iniciação à comunidade serão realizados para apresentar e comunicar os objetivos do HATUA às partes interessadas relevantes (a comunidade local, equipes de saúde da aldeia, médicos, funcionários de hospitais e laboratórios e autoridades de saúde locais). A amostragem começará em abril de 2019 em alguns locais e continuará até 2020 (se COVID-19 permitir). Todas as ferramentas de coleta de dados e protocolos operacionais são padronizados, permitindo uma comparação válida entre sites e países. Para coletar dados quantitativos, de ciências sociais e laboratoriais e mapeamento geoespacial, usaremos o EpiCollect 5 (https://five.epicollect.net), 29 uma ferramenta personalizável de coleta de dados móveis instalada em tablets e telefones celulares.

Localização de HATUA SAs. HATUA, Abordagem Holística para Desvendar a Resistência Antibacteriana na África Oriental SA, área de estudo.

Recrutamento de amostra de pacientes com ITU

No cerne do estudo HATUA estará um conjunto de dados vinculados de 1.800 pacientes (600 por país, 200 por local com ITU confirmada por cultura (tabela 1). Dada a prevalência estimada de ITU do estudo piloto, isso significará o recrutamento três vezes esse número, c. 5400 pacientes. Os cálculos do tamanho da amostra foram desafiadores, dado o número de maneiras possíveis de medir isso e as evidências limitadas de diferentes taxas de prevalência para infecções de ITU resistentes adquiridas na comunidade e em hospitais de adultos e crianças nesta região. Para estimar precisão, sob um modelo binomial, os números necessários para obter um IC de 95% para a prevalência de 0,5 com largura não superior a 0,1 seriam um pouco abaixo de 400 (384). Esse modelo se baseia em não haver população subjacente ou estrutura de amostragem e portanto, levará a uma subestimação dos verdadeiros números necessários em nosso estudo complexo. Nosso estudo maior, 600 por país, fornecerá alguma robustez à nossa capacidade de estimar este parâmetro com a precisão desejada y enquanto nos permite descobrir algumas das estruturas populacionais que, se modeladas corretamente, irão melhorar a precisão em nossa estimativa de prevalência. Nos hospitais de nível 2, 3, 4 e 5 em cada SA, vamos recrutar pacientes ambulatoriais adultos e crianças (mínimo de 90% da amostra total) que um médico identifica como sofrendo de sintomas semelhantes aos de ITU (por exemplo, queimação / irritação ao urinar , disúria e piúria). Nos hospitais de nível 5, também recrutaremos pacientes internados (máximo de 10% do total). Para crianças não grávidas com menos de 18 anos, os dados serão fornecidos por um pai ou responsável acompanhante. Nossa amostra é representativa apenas da população de participantes da clínica, e não da população em geral, e é provável que inclua uma proporção maior de pacientes com falhas no tratamento que são mais ricos e pacientes que vivem perto das clínicas. No entanto, os participantes da clínica são um subconjunto importante de pacientes, pois são os indivíduos especificamente para os quais os médicos devem tomar as decisões de manejo e tratamento do paciente.

Alvo tamanhos de amostra para ferramentas de coleta de dados HATUA

Uma amostra de urina e, quando possível, uma amostra fecal serão coletadas de todos os pacientes. De pacientes internados cateterizados, amostras de cateter de urina serão coletadas, enquanto os pacientes ambulatoriais serão orientados sobre como coletar amostras de urina de jato médio. Além disso, os pacientes terão um questionário administrado para coletar dados retrospectivos sobre sua história clínica recente e busca de tratamento relacionada e uso de AB (ver figuras 3 e 4 para os tópicos cobertos no questionário). O questionário irá capturar dados sociodemográficos de nível individual (por exemplo, idade, sexo, educação, domicílio e circunstâncias familiares), fatores socioeconômicos do domicílio (por exemplo, tipo de moradia, amenidades e propriedade de ativos usados ​​para derivar índices de pobreza multidimensionais), comportamentos de busca de tratamento, atitudes para medicamentos, ABs e AMR, e informações geográficas residenciais.

Descrição dos dados quantitativos e qualitativos coletados sobre a "via do paciente" autorrelatada na amostra de paciente vinculada. HATUA, Abordagem holística para desvendar a resistência antibacteriana na UTI da África Oriental, infecção do trato urinário.

Conjunto de dados de pacientes vinculados, coletados no HATUA. AB, antibiótico AMR, resistência antimicrobiana AST, teste de sensibilidade a antibióticos ESBL, resistência a beta-lactâmicos de espectro estendido HATUA, Abordagem holística para desvendar a resistência antibacteriana na África Oriental MDR, resistência a múltiplas drogas UTI, infecção do trato urinário WGS, sequência do genoma inteiro.

Durante o recrutamento inicial, todos os pacientes serão solicitados a fornecer consentimento para serem acompanhados se o teste for positivo para ITU. Pacientes ambulatoriais elegíveis com ITU confirmada por cultura serão contatados novamente para um acompanhamento em suas casas (consulte WS4). Por razões logísticas, apenas os pacientes que vivem a uma distância aproximada de 70 km do hospital de nível 5 e 10 km dos hospitais de nível 4 e 3 serão elegíveis para acompanhamento. Durante o acompanhamento, um questionário será aplicado a um membro adulto competente da família para captar saneamento e higiene, sociodemografia, dimensões econômicas e de pobreza, comportamento familiar de busca de saúde e práticas de criação de gado. Amostragem ambiental de solo, amostras de fezes de animais e outros materiais nas proximidades imediatas da casa serão conduzidas usando uma variedade de abordagens, incluindo esfregaços de toalete e amostragem de meia de botas / esfregaço do solo dentro e ao redor da propriedade. Para enriquecer os dados quantitativos, uma subamostra de pacientes com ITU será intencionalmente selecionada para IDIs qualitativos com base em sua presença de patógenos de ITU resistentes a medicamentos ou relato de vias de tratamento de paciente complexas (10 por SA, 90 no total). As entrevistas qualitativas serão conduzidas usando um guia de tópicos padronizado em todos os sites, que cobre a experiência da doença, estigma, narrativas do caminho do paciente, experiência da consulta médica e etapas subsequentes, compreensão dos fatores de risco para UTI, AMR e administração AB.

Os dados qualitativos e quantitativos de ciências sociais e dados microbiológicos resultantes formarão um conjunto de dados vinculado em nível individual. Isso irá incorporar dados quantitativos do questionário coletados na clínica e em casa, dados qualitativos de IDIs, C & ampAST e sequência do genoma completo (WGS) de patógenos do paciente, e C & ampAST de amostras domiciliares (ver figura 4). Isso pode estar relacionado a dados multiescalares na paisagem (WS1).

Coleta de dados adicionais

Mapeamento geoespacial

Usando o EpiCollect em um tablet com GPS, em todos os SAs, conduziremos o mapeamento geoespacial de provedores AB observados na comunidade local (por exemplo, de hospitais e clínicas a farmácias de varejo e vendedores informais de drogas, a farmácias veterinárias).

Estudo de cliente misterioso de vendedores de drogas

Um meio comum de reduzir o viés de resposta de pesquisas é usar clientes misteriosos ou estudos de clientes simulados para investigar práticas de distribuição de medicamentos e farmácias na 'vida real'. 17 30 Usando a estrutura de amostragem criada pelo exercício de mapeamento geoespacial mencionado acima, iremos aleatoriamente selecione pontos de venda para participar de um estudo de cliente simulado / misterioso. Trabalhadores de campo treinados usando cenários predefinidos irão solicitar ABs e / ou aconselhamento para o tratamento de sintomas semelhantes a ITU. Após o encontro, eles registrarão os dados, incluindo se e que tipo de AB foram oferecidos, o curso e regime que foram vendidos, se eles pediram uma receita, custos e conselhos dados.

IDIs qualitativos com vendedores de drogas

Também selecionaremos 10 vendedores de medicamentos / farmácias por SA (consulte a tabela 1) para IDIs qualitativos para investigar seus conhecimentos, motivações, atitudes e práticas em torno do fornecimento de AB e ABR. Eles discutirão o serviço que prestam à comunidade, a compreensão e a atitude em relação à governança e à AMR, e sobre os motivadores econômicos e de negócios de seu trabalho.

IDIs qualitativos com profissionais de saúde

Em nossos hospitais / clínicas de recrutamento, recrutaremos profissionais clínicos treinados usando amostragem de conveniência para investigar seus conhecimentos e atitudes usando IDIs qualitativos (cinco por SA, 45 no total). O guia de tópicos cobre a experiência de diagnóstico e prescrição de ITU, conhecimento, atitudes em relação à "administração AB" e compreensão dos condutores de ABR, incluindo questões econômicas e culturais.

Grupos de foco na comunidade

Em cada SA, FGDs de comunidade específicos por idade e gênero serão conduzidos (entre não participantes do estudo), selecionando a partir de uma variedade de grupos de status socioeconômico. O guia de tópicos cobrirá a experiência da doença, caminhos para o cuidado, experiência dos serviços de saúde, acesso aos ABs, percepções da AMR e da administração do AB. No total, serão realizados até 24 FGDs por país.

Envolvimento do paciente e do público

Além dos grupos focais comunitários realizados durante o trabalho piloto e das oficinas de iniciação à comunidade (detalhadas acima), ao final das atividades da SA, usaremos Diálogos Comunitários (CDs) que reúnem membros da comunidade, profissionais de saúde e veterinários para um rosto - engajamento face a face, discutir as descobertas e estimular a participação e o engajamento total da comunidade, e também identificar como os trabalhadores de saúde de base podem ser usados ​​de forma mais eficaz para melhorar a gestão ABR.

Perguntas de pesquisa e plano de análise de dados

As principais questões de pesquisa e análises correspondentes são elaboradas em cinco WSs interligados.

WS1: o cenário da terapia

Este WS investigará como ABs são fornecidos e usados ​​em nossos SAs de várias maneiras interligadas. Em primeiro lugar, ao analisar os dados geoespaciais coletados nos provedores de AB, descreveremos a distribuição espacial e a densidade dos pontos de venda de medicamentos em ambientes formais e informais de saúde. Em segundo lugar, analisaremos os dados dos estudos de clientes misteriosos geoespacialmente. Terceiro, combinando a análise estatística quantitativa do estudo do cliente misterioso com a codificação temática sistemática das entrevistas qualitativas, investigaremos as práticas de provisão de AB e o conhecimento entre diferentes provedores de AB. Ao desenvolver uma compreensão das diferenças no cenário de fornecimento de AB e do conhecimento, motivações e práticas dos vendedores de AB, buscaremos determinar quais fatores regulam os caminhos individuais do paciente para o uso de AB.

WS2: patógeno

Neste WS, iremos confirmar UTI, identificar os organismos patogênicos presentes e determinar a susceptibilidade antimicrobiana. Amostras de urina de 1.800 pacientes confirmados por cultura com ITU serão analisadas para investigar a carga da doença e resistência. O teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) será conduzido em um conjunto acordado de ABs clinicamente relevantes, juntamente com fenótipos especiais, como resistência a beta-lactâmicos de espectro estendido (ESBL) (consulte o apêndice B suplementar online). O software de captura de dados e relatórios WHONET será adotado em todos os laboratórios de hub do SA, fornecendo análise automatizada de vários fenótipos multirresistentes.

O DNA genômico das amostras será extraído e sequenciado. As bibliotecas WGS resultantes serão usadas para caracterizar os isolados e definir as estruturas da população de patógenos. Identificaremos a disseminação local e regional dos determinantes ABR e descreveremos sua dinâmica evolutiva e reservatórios locais entre as populações bacterianas do HATUA. Esses dados serão vinculados aos dados sociodemográficos do paciente e do domicílio para identificar possíveis fatores de resistência em nível de paciente, hospital e domicílio. Ao comparar nossas coleções com genomas publicados anteriormente, os clones de alto risco e suas origens potenciais serão determinados e sua propagação mapeada no espaço e no tempo.

WS3: paciente

Este WS investigará os impulsionadores sociais, estruturais e comportamentais do ABR, identificando os vários caminhos do paciente para o tratamento e como eles se cruzam com o processo ABR. Resumiremos os dados quantitativos do caminho usando a análise de classe latente longitudinal e / ou análise de sequência, e relacionaremos isso estatisticamente aos perfis ABR nos níveis individual e comunitário. Para identificar como as vias de tratamento podem se tornar mais clinicamente eficazes, combinaremos dados quantitativos e qualitativos da via do paciente com IDIs de vendedores de medicamentos e médicos para investigar fontes de ABs e práticas prescritas e não prescritas, prevalência e determinantes da automedicação e como estes são constituídos.

WS4: comunidade

Neste WS, iremos investigar as atitudes sociais e da comunidade em relação à busca de tratamento, uso de AB e ABR, e como fatores de nível doméstico da comunidade, incluindo práticas de higiene, comportamento relacionado à saúde, práticas de criação de gado e a paisagem microbiológica familiar, influenciam ABR e mais cargas de risco. As perguntas no questionário doméstico que abordam o uso de AB com animais e produtos de origem animal serão estatisticamente relacionadas à carga de ABR em amostras de urina, fezes e ambientais. Também analisaremos dados relevantes coletados durante IDIs de pacientes e grupos de foco da comunidade, transcritos e traduzidos por tradutores locais e pesquisadores de campo, usando codificação temática sistemática no NVivo para nos fornecer informações sobre experiências de doença e justificativas localizadas para o tratamento.

WS5: síntese interdisciplinar

Neste WS, iremos integrar e sintetizar os dados coletados no WS1–4 para explorar como os comportamentos e processos populacionais e individuais interagem para contribuir para o risco de ABR.Usando o conjunto de dados vinculado ao paciente, geraremos hipóteses sobre os condutores diretos e indiretos do ABR usando a análise de rede Bayesiana.31 Usaremos redes Bayesianas para identificar fatores latentes em diferentes tipos de dados e, em seguida, conectá-los entre si e as principais variáveis ​​de resultado de uma forma heterogênea rede em todos os dados. A estrutura da rede identificará influências diretas e indiretas no ABR, e a inferência probabilística das redes Bayesianas irá prever a probabilidade de impacto no ABR de mudança em diferentes drivers. A regressão multinível será então usada para identificar quais desses fatores diretos e indiretos são responsáveis ​​pela maior variação no resultado e fornecer previsões numéricas de modificações. As informações sobre a sensibilidade AB de patógenos urinários serão ocultadas de pesquisadores de campo conduzindo visitas domiciliares e questionários e de microbiologistas que coletam amostras ambientais de domicílios para garantir a fidelidade.


Introdução

O aumento do uso de combustíveis fósseis tem causado emissões de gases de efeito estufa e criado danos indesejáveis ​​ao meio ambiente. A atual instabilidade do abastecimento de petróleo e a contínua flutuação dos preços geraram ainda mais interesse generalizado por fontes alternativas de energia. Esses fatores, que giram em torno de questões econômicas, ambientais e geopolíticas, são centrais para o interesse atual em fontes de energia renováveis ​​[1].

Um ramo inteiro da biotecnologia, conhecido como "biotecnologia branca" [2], abrange a bioprodução de combustíveis e produtos químicos de fontes renováveis. Essas tecnologias usam células vivas e enzimas para sintetizar produtos que são facilmente (bio) degradáveis, requerem menos energia e criam menos resíduos durante sua produção ou uso do que aqueles produzidos a partir de recursos fósseis.

Enquanto o conceito de biocombustíveis foi concebido na década de 1970, quando o mundo enfrentou uma crise de petróleo em grande escala, os avanços recentes em biologia sintética [3, 4], engenharia metabólica [4-7] e biologia de sistemas [8, 9] geraram um renovado interesse pela produção de biocombustíveis. Fábricas microbianas para a síntese de biocombustíveis e passíveis de aplicações industriais estão sendo construídas por meio da montagem natural e de novo caminhos que redirecionam o carbono para os produtos desejados [10-16]. A expressão do gene é modulada para ajustar o metabolismo microbiano para produção ideal e proteínas projetadas para adquirir novas atividades catalíticas ou para melhorar as propriedades nativas [17-19]. "ômicas"tecnologias foram desenvolvidas para analisar e modelar sistemas de uma maneira holística e abordar questões complexas sobre o funcionamento de redes nativas e sintéticas em células microbianas [20]. Novas tecnologias de sequenciamento (NST) permitindo a rápida identificação e análise de variações genômicas, como polimorfismos de nucleotídeos (SNPs), variações do número de cópias (CNVs), translocações e inserções e deleções [21, 22], estão sendo instrumentais para compreender ambientes microbianos complexos, descobrir a diversidade e caracterizar a composição genética de várias espécies de microrganismos [23] que pode ser uma promessa para a geração de biocombustíveis. Os esforços contínuos nas últimas décadas no campo da engenharia metabólica abriram caminho para a engenharia de vias sintéticas eficientes para a produção de biocombustíveis [4, 6, 7, 11].

Por causa de sua abundância e natureza renovável, a biomassa tem o potencial de oferecer diversos suprimentos de biocombustíveis confiáveis, acessíveis e ambientalmente saudáveis ​​para substituir os combustíveis fósseis. Dada a complexidade da biomassa em termos de composição química, um bioprocesso convencional para produção de combustíveis envolve várias etapas, como coleta de biomassa, desconstrução de matéria-prima para obter constituintes de biomassa (por exemplo, monossacarídeos, ácidos graxos, etc.) e sua conversão em biocombustíveis (Fig. . 1).

Esquema geral de bioprocessos para a produção de combustíveis a partir de matérias-primas renováveis. Diferentes matérias-primas são listadas de acordo com sua sustentabilidade ambiental e econômica. A desconstrução da matéria-prima libera blocos de construção elementares, como pentoses, hexoses, polióis, ácidos graxos, etc. que são então convertidos microbianamente em biocombustíveis.

Esta revisão enfocará o papel da engenharia metabólica e da biologia sintética como tecnologias facilitadoras para a produção de biocombustíveis de álcool (ou seja, etanol e butanol). Embora grandes esforços tenham sido dedicados ao desenvolvimento de biocombustíveis gasosos, bem como à exploração dos fluxos colaterais gerados pela utilização de biomassa para a produção de biocombustíveis (conceito de biorrefinaria), esses tópicos estão além do escopo desta revisão e foram discutidos em outro lugar [ 24–26].

Matérias-primas renováveis ​​para produção de biocombustíveis

Muitas matérias-primas de biomassa podem ser usadas para a produção de biocombustíveis (Fig. 1). Estes incluem resíduos lignocelulósicos agrícolas, colheitas comestíveis e não comestíveis e fluxos de resíduos (por exemplo, bagaço da fabricação de açúcar, subprodutos industriais) (Fig. 1). A biomassa lignocelulósica varia entre as espécies, mas geralmente consiste em

Polímeros de 75% de carboidratos (celulose e hemicelulose) [27] e é a maior fonte renovável de carboidrato conhecida. As culturas de sementes oleaginosas, por outro lado, são compostas principalmente de vários triacilgliceróis (TAGs), moléculas que consistem em três cadeias de ácidos graxos (geralmente de 18 ou 16 C de comprimento) esterificadas em glicerol [28].

Amido (ou seja, milho, trigo, cevada, etc.) e safras de açúcar (ou seja, cana, beterraba, etc.) são as matérias-primas principais atualmente usadas para bioconversão em etanol, enquanto os TAGs são extraídos de oleaginosas (ou seja, soja, dendê, girassol , etc.) são quimicamente esterificados em biodiesel. Ambos os processos estão atualmente em debate, uma vez que empregam matérias-primas comestíveis. Conforme mostrado na Fig. 1, eles são matérias-primas caras e não sustentáveis ​​que podem impactar adversamente a cadeia alimentar alimentar. As matérias-primas lignocelulósicas podem ser convertidas em combustíveis termoquímica ou biologicamente (Fig. 1). Os principais desafios para a conversão biológica são colocados pela recalcitrância da biomassa. As porções celulósica e hemicelulósica da biomassa podem ser separadas da lignina e despolimerizadas por hidrólise enzimática para obter os açúcares constituintes, principalmente glicose, xilose e arabinose (Fig. 1) [27]. Por outro lado, por atuar como material estrutural, a lignina impede o acesso de enzimas hidrolíticas, dificultando sua conversão biológica. Para superar sua recalcitrância, a desconstrução da matéria-prima é, portanto, necessária [28]. As rotas de processamento para as culturas de sementes oleaginosas envolvem a prensagem ou extração com solvente / supercrítica de triacilgliceróis [29, 30].

Em contraste, a utilização de culturas de sementes oleaginosas lignocelulósicas ou não comestíveis é sustentável e renovável [27]. Por exemplo, descobriu-se que muitas espécies de algas crescem rapidamente e produzem quantidades substanciais de triacilgliceróis ou óleo (algas oleaginosas). Portanto, prevê-se que as algas possam ser empregadas como fábricas de células para a produção de biocombustíveis [31, 32]. As algas oferecem muitas vantagens na busca por matérias-primas de bioenergia sustentáveis ​​e renováveis ​​e têm o potencial de fornecer ordens de magnitude a mais de óleo por acre de terra do que as tradicionais culturas de sementes oleaginosas [33]. Além disso, as algas podem ser cultivadas em climas áridos com água salobra ou água do mar e usar dióxido de carbono como nutriente. Lagoas abertas provavelmente serão o único meio de produção de custo e energia eficaz para matérias-primas de biocombustíveis de algas em um futuro previsível [34]. Existem, no entanto, grandes desvantagens associadas ao uso de sistemas de lagoas abertas, pois requerem ambientes altamente controlados devido à ameaça inerente de contaminação microbiana e produzem baixa concentração de biomassa na cultura de microalgas devido ao limite de penetração da luz [34]. No entanto, espera-se que esses problemas sejam superados ou minimizados pelo desenvolvimento / aprimoramento de tecnologia.

Vastos suprimentos de diversos recursos renováveis ​​estão, portanto, disponíveis para conversão em constituintes genéricos de matéria-prima (carboidratos, polióis, ácidos graxos, etc.) que podem ser microbianamente convertidos em combustíveis valiosos (Fig. 1).

Síntese de biocombustíveis a partir de matérias-primas à base de carboidratos

Açúcares de seis carbonos (6-C, hexoses) e cinco carbonos (5-C, pentoses) são os constituintes de biomassa mais abundantes. Diversas estratégias de engenharia metabólica e biologia sintética foram implementadas nas últimas décadas para convertê-las, individualmente ou como uma mistura de açúcar, em diferentes biocombustíveis.

Conversão de açúcares em etanol

Fermento de padeiro (Saccharomyces cerevisiae) há muito tempo é usado na indústria cervejeira para produzir etanol a partir de açúcares 6-C (Fig. 2), mas esse organismo é incapaz de fermentar açúcares 5-C. Muitas bactérias, por outro lado, produzem etanol como um produto natural da fermentação da hexose, mas esse biocombustível representa apenas uma pequena fração da mistura do produto (fermentação com ácido misto) [35].

Vias projetadas para produção microbiana de etanol a partir de carboidratos. Caixas laranja, vermelha e verde indicam caminhos para a utilização de açúcares de pentose e hexose e síntese de etanol, respectivamente. As linhas tracejadas indicam várias etapas. Abreviações: ADH, álcool desidrogenase AR, aldose redutase ARAA, L-arabinose isomerase ARAB, L-ribuloquinase ARAD, L-ribulosefosfato 4-epimerase FDH, formato desidrogenase FHL, formato hidrogenoliase LAD, L-arabitol 4-desidrogenase LAD, L-arabitol 4-desidrogenase xilulose redutase PDC, piruvato descarboxilase PDH, piruvato desidrogenase PFL, piruvato formato liase XDH, xilitol desidrogenase XR, xilose redutase XYLA, xilose isomerase XYLB, xiluloquinase.

Biologia sintética e engenharia metabólica têm sido amplamente utilizadas em S. cerevisiae, Zymomonas mobilis e Escherichia coli para aumentar a fermentação do etanol (Fig. 2) [27, 35-38]. Muitos microrganismos, incluindo bactérias e leveduras, podem produzir etanol como o principal produto de fermentação dos carboidratos [39]. Uma vez que nenhum S. cerevisiae nem Z. mobilis, atualmente usado para realizar a fermentação de etanol industrial, pode usar xilose ou arabinose (os açúcares lignocelulósicos mais abundantes, ao lado da glicose), outros microrganismos que não S. cerevisiae chegaram à vanguarda na produção de bioetanol a partir de biomassa lignoceluosa. Na verdade, muitos microrganismos são capazes de utilizar os açúcares pentose com eficiência, mas não podem produzir etanol naturalmente com rendimento e produtividade suficientes. Alguns microrganismos que utilizam pentoses, como a bactéria E. coli e Klebsiella oxytoca e o fermento Pichia stipitis, foram projetados com sucesso para a produção de etanol [36]. Alternativamente, as vias catabólicas de pentose foram expressas em microrganismos etanologênicos, como a levedura convencional S. cerevisiae[40, 41] ou a bactéria etanologênica Z. mobilis[42]. Esses esforços são discutidos em detalhes abaixo.

Sabe-se da existência de duas vias enzimáticas naturais para o consumo de xilose (Fig. 2), e ambas foram independentemente transferidas para S. cerevisiae. Em uma via, a conversão de D-xilose em D-xilulose é realizada por uma xilose isomerase (XI). Uma vez que as leveduras podem crescer e fermentar xilulose, uma xilose isomerase bacteriana heteróloga (XI) foi expressa em S. cerevisiae para o catabolismo da xilose. No entanto, todos os esforços iniciais usando esta abordagem falharam, apesar da clonagem e expressão bem-sucedidas do gene xylA a partir de Thermus thermophilus[43, 44] e Piromyces sp E2 [44] que produziu um XI ativo em S. cerevisiae. A falha foi parcialmente porque a xilose isomerase é fortemente inibida pelo xilitol, favorecendo o equilíbrio de isomerização para a formação de xilose. Mais recentemente, uma cepa geneticamente modificada expressando o heterólogo xylA gene do fungo anaeróbio Piromyces sp E2a evoluiu para crescer anaerobicamente em xilose [38, 44] e produziu alto rendimento de etanol (0,42 g / g de xilose). Esta abordagem demonstrou que o S. cerevisiae a via metabólica poderia ser melhor projetada por meio de uma combinação de abordagens racionais e combinatórias.

A segunda via natural encontrada principalmente em certas espécies de fungos e leveduras consiste em duas etapas enzimáticas: aldose (xilose) redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) (Fig. 2). Abordagens que usaram esse caminho para a engenharia S. cerevisiae dependem dos genes correspondentes (xyl 1 e xyl 2) da levedura de fermentação de xilose P. stipitis[45, 46]. A introdução de qualquer uma das vias permite S. cerevisiae para consumir xilose [47]. No entanto, esta estratégia não teve sucesso, porque a cepa recombinante, que converte xilose em xilulose pela ação combinada de xilose redutase dependente de NADPH e xilitol desidrogenase ligada a NAD, não pode sustentar seu crescimento anaeróbico devido a um desequilíbrio de equivalentes redutores (ou seja, Acúmulo de NADH e depleção de NADPH), que também resulta na excreção de xilitol [48]. Isso ocorre porque o NADH gerado pela reação da xilitol desidrogenase não pode ser usado para produzir NADPH para redução da xilose devido à falta de uma transhidrogenase que interconverte NADPH e NADH [49]. Embora os equivalentes redutores em excesso possam ser removidos com eficácia por meio de aeração, isso mudaria o metabolismo celular da fermentação para a respiração e limitaria a produção de etanol. Várias abordagens para aliviar o desequilíbrio do cofator foram relatadas, incluindo o controle da razão de expressão de XR / XDH para um valor baixo [46], mutações para reduzir a afinidade de XR para NADPH [50] e XDH para NAD + [51], e deslocando a especificidade do cofator de XDH de NAD + para NADP + [51]. A via de assimilação de amônio mediada por duas desidrogenases de glutamato foi alterada pela exclusão de GDH1 (dependente de NADPH) e superexpressão de GDH2 (dependente de NADH), resultando em redução de 44% no acúmulo de xilitol e aumento de 16% no rendimento de etanol [52]. A análise do fluxo metabólico usando marcação com 13 C mostrou que a modificação mudou a preferência do cofator de XR de NADPH para NADH [53]. Z. mobilis, outra bactéria etanologênica, é capaz de produzir altos títulos de etanol a partir da glicose e da sacarose, mas não de pentoses. Para introduzir o metabolismo da xilose, E. coli genes que codificam para xilose isomerase, xiluloquinase, transcetolase e transaldolase foram expressos em Z. mobilis CP4 (pZB5), permitindo o crescimento em xilose com rendimento de etanol de 86% [42]. Da mesma forma, o metabolismo da arabinose foi introduzido em Z. mobilis ATCC39676 (pZB206) pela expressão de E. coli genes araABD (L-arabinose isomerase, L-ribulokinase, L-ribulose-5-P-4-epimerase), bem como genes que codificam para transcetolase e transaldolase, resultando em crescimento em arabinose com 98% de rendimento de etanol [54]. Em ambos os casos, a xilose ou arabinose são primeiro convertidas em xilulose-5-P e, em seguida, continuam na via da pentose fosfato para produzir gliceraldeído-3-P, que é um intermediário na via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) (Fig. . 2). O recombinante Z. mobilis pode produzir etanol a partir de pentoses apenas em baixas concentrações, limitando seu potencial para aplicações industriais [55].

Uma alternativa para o desenvolvimento de uma cepa etanologênica de fermentação de pentose é construir vias sintéticas para a produção de etanol em hospedeiros que podem utilizar pentoses. Tipo selvagem E. coli tem uma excelente faixa de utilização de substrato, incluindo todos os açúcares lignocelulósicos (glicose, xilose, arabinose, manose, galactose) [35]. E. coli também cresce bem em condições anaeróbicas e aeróbicas e pode sustentar alto fluxo glicolítico. No entanto, o rendimento do etanol é baixo porque sob condições fermentativas E. coli também produz ácidos lático, acético, fórmico e succínico [56]. Fermentação homoetanol em E. coli é prejudicado pelo desequilíbrio redox. A via para o etanol começa a partir do piruvato, que é clivado em acetil-CoA e ácido fórmico pela piruvato formato liase (PFL) (Fig. 2). A redução da acetil-CoA a etanol procede em duas etapas através do acetaldeído como intermediário a proteína multienzimática AdhE desempenha o papel da acetaldeído desidrogenase e álcool desidrogenase, cada uma exigindo um NADH [57]. Assim, em uma base triose, a via do piruvato para o etanol consome dois NADH, enquanto a glicólise para o piruvato fornece apenas um NADH (na conversão do gliceraledeído-3-P em 1,3-bisfosfoglicerato). Portanto, a produção de etanol é balanceada por outros produtos mais oxidados, como o ácido acético (nenhum NADH consumido). Para contornar a limitação redox da via do etanol endógeno, as enzimas piruvato descarboxilase (PDC) e álcool desidrogenase (ADH) de Z. mobilis foram expressos em E. coli, por meio de um plasmídeo contendo um bicho de estimação (produção de etanol) operon contendo o pdc e adhB genes [58]. A transformação conferiu a via do homoetanol, com o etanol respondendo por 95% dos produtos de fermentação. Além disso, o equilíbrio redox é possível na via heteróloga porque a conversão de piruvato em acetaldeído e CO2 por PDC é não oxidativo, exigindo apenas um NADH para a redução do acetaldeído a etanol.

o bicho de estimação operon foi integrado ao pfl locus de E. coli B para tirar proveito de seus promotores nativos fortes e constitutivos. No entanto, os recombinantes tinham baixa expressão de PDC e, portanto, baixo rendimento de etanol [59]. A seleção em placas indicadoras de cloranfenicol ou aldeído resultou em mutantes análogos com expressão de PDC comparável àquela na cepa portadora de plasmídeo e Z. mobilis. Deleção adicional de fumarato redutase (ΔfrdABCD) reduziu a produção de ácido succínico em 95%, a cepa resultante, KO11, produziu etanol com rendimento teórico de 100% quando cultivada em glicose ou xilose em meio rico [59]. Em comparação com a cepa parental, KO11 exibe maior taxa de crescimento máximo (30% maior) e fluxo glicolítico (50% maior). Isso é atribuído à maior expressão dos genes catabólicos de xilose, que veio à tona por meio da análise de expressão global usando microarranjos de DNA [60]. A evolução direcionada de KO11 pelo aumento da concentração de etanol de 35 para 50 g / L resultou na cepa LY01, que fermentou xilose para um título de etanol de 60 g / L com 85% de rendimento [61, 62]. A análise de microarray revelou aumento do metabolismo da glicina e síntese de betaína em LYO1 em comparação com KO11, portanto, ligando a tolerância ao etanol ao estresse osmótico (glicina e betaína são osmólitos protetores) [63]. A adição de glicina ou betaína mostrou aumentar a tolerância ao etanol em KO11 e permitiu a fermentação de 9% (p / v) de xilose a 4% (p / v) de etanol em 48 horas [62]. Mais recentemente Kim et al. relataram fermentação de homoetanol a partir de xilose e glicose usando E. coli genes com rendimentos de até 82%, combinando a atividade da piruvato desidrogenase, geralmente aeróbia, com a da álcool desidrogenase [64].

Arabinose é outro açúcar pentose obtido a partir da desconstrução da biomassa. Existem duas vias diferentes de utilização da arabinose na natureza, bacteriana e fúngica.A via bacteriana é balanceada por redox e abrange três etapas enzimáticas, enquanto a via fúngica consiste em cinco enzimas, incluindo quatro oxidorredutases, e é caracterizada por um desequilíbrio redox. Ambas as vias foram expressas de forma independente em leveduras [65, 66]. Os resultados obtidos com o recombinante S. cerevisiae cepa projetada com a via fúngica heteróloga mostrou crescimento em L-arabinose, embora em uma taxa muito baixa [66]. Recentemente, uma cepa de levedura mutante que converte anaerobicamente arabinose em etanol na fermentação em lote foi relatada [67]. Esta cepa foi obtida através da introdução da via bacteriana para utilização de arabinose a partir de Lactobacillus plantarum, superexpressando S. cerevisiae genes que codificam as enzimas PPP não oxidativas e subsequente engenharia evolutiva. Um rendimento de etanol de 0,43 g / g de carboidrato consumido e uma taxa de produção específica de etanol de 0,29 g / g / h a partir de arabinose como única fonte de carbono foram alcançados.

Conversão de açúcares em butanol

Recentemente, tem havido um interesse crescente em converter açúcares da biomassa lignocelulósica em butanol. Devido às suas propriedades físicas, o álcool de quatro carbonos é um substituto melhor para a gasolina do que o etanol [68]. Como mencionado acima, vários clostrídios têm sido utilizados na fermentação de butanol, embora esses anaeróbios Gram-positivos coproduzam butanol com alguns subprodutos, como ácido butírico, acetona, etanol, diminuindo, portanto, seu rendimento [69]. Do ponto de vista da biotecnologia, a falta de ferramentas genéticas eficientes para manipular clostrídios dificulta os esforços de engenharia metabólica para a otimização da síntese de butanol e a redução da formação de subprodutos. Por esses motivos, E. coli[10, 11, 70, 71] e S. cerevisiae[72] foram recentemente projetados para a síntese de butanol a partir de açúcares [Fig. 3]. A estratégia de engenharia em E. coli envolveu a reconstrução da via clostridial dependente de CoA sintética. Operons sintéticos carregando todos os genes necessários para a bioconversão de acetil-CoA em butanol (thl, hbd, crt, bcd, etfAB, e adhE2) foram expressos simultaneamente em E. coli e levou à produção fermentativa de até 14 mg / l de butanol a partir da glicose como única fonte de carbono [70]. Esta via foi posteriormente otimizada pela utilização de enzimas de diferentes microrganismos. Substituindo o gene da tiolase de Clostridium (thil) com o nativo E. coli A para B (a para B) levou a resultados divergentes [10, 70]. Além disso, uma vez que a butiril-CoA desidrogenase clostridial (bcd) atividade é hipotetizada como uma etapa limitante da taxa na produção de butanol [73] e sua atividade está intimamente ligada à expressão de proteínas de transferência de elétrons (etfA, etfB), uma crotonase heteróloga (ccr) a partir de Streptomyces collinus foi expresso no lugar do clostridial. No entanto, substituindo a enzima original por ccr resultou em rendimentos muito mais baixos de butanol em E. coli[10, 11, 70]. Uma vez que a expressão da via do butanol resultou em baixa síntese de butanol, alguns endógenos E. coli caminhos foram interrompidos para evitar o fluxo de carbono para subprodutos [10, 11, 70, 71]. Combinando todas as estratégias de otimização, o título máximo de butanol e o rendimento na engenharia E. coli foram 1,2 g / le 6,1 g butanol / g glicose, respectivamente [71].

Esforços atuais de engenharia metabólica para a produção de 1-butanol. Expressão heteróloga de genes clostridiais em S. cerevisiae e E. coli. Os nomes dos genes em vermelho indicam etapas projetadas para a biossíntese de butanol. A origem dos genes é relatada entre parênteses. c.a., Clostridium acetobutylicum c.b., Clostridium beijerinckii e.c., Escherichia coli s.c., Saccharomyces cerevisiae ., Ralstonia eutropha s.c., Streptomyces collinus. || indica nocaute de gene. Nomes de genes / enzimas: adh, adhE1, adhE2, álcool desidrogenasebcd-etfAB, butiril-CoA desidrogenaseccr, butiril-CoA desidrogenasecrt, crotonase erg10, tiolase fdh1, formato desidrogenase phaA, tiolase phaB, acetoacetil-Coa redutase thl, tiolase.

Uma estratégia sintética semelhante também foi investigada em S. cerevisiae[72]. O efeito de duas tiolases diferentes, alternativas à nativa S. cerevisiae Foi avaliado o Erg 10, sobre a produção de butanol. AtoB, o nativo E. coli enzima, demonstrou catalisar eficientemente a conversão de acetil-CoA em acetoacetil-CoA [74], enquanto PhaA de Ralstonia eutropha foi relatado anteriormente como muito ativo [75] e rendeu o título de butanol mais alto (1 mg / l). Além disso, uma vez que o crescimento em condições fermentativas geralmente leva ao acúmulo de equivalentes redutores (NADH), o uso de Hbd, uma isoforma de 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase dependente de NADH, foi investigado como alternativa a PhaB, que é dependente de NADPH. Enquanto uma combinação de diferentes isoformas de 3-hidroxibutiril-CoA com as diferentes tiolases mostraram que PhaA e PhaB provavelmente foram otimizados pela evolução para funcionarem perfeitamente em conjunto, a melhor combinação para a produção de butanol mostrou ser a tiolase de levedura nativa (Erg10 ) em combinação com a 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase dependente de NADH [72]. Expressão heteróloga da crotonase (Ccr) de S. collinus no lugar do clostridial Etf-dependente levou a títulos um pouco mais altos, mas ainda estava limitado a 2,5 mg / l de butanol [72].

A produção de butanol também foi tentada em E. coli explorando a via mediada por cetoácido, que utiliza a química de biossíntese de norvalina e o operon de biossíntese de leucina (leuABCD) [76] (Fig. 4). Esta estratégia foi desenvolvida para superar as limitações enfrentadas durante a expressão da via clostridial sintética. De fato, foi hipotetizado que os baixos títulos de butanol alcançados nessas plataformas projetadas foram provavelmente devido à sensibilidade ao oxigênio e à dependência de CoA da via clostridial [76, 77]. Implementação da via biossintética da norvalina e superexpressão de seu precursor em E. coli levou à produção de 2-cetovalerato, um intermediário da biossíntese de norvalina, que foi canalizado para butanol pela ceto-ácido descarboxilase e álcool desidrogenase. 2-cetovalerato foi produzido através do leuABCD E. coli via do 2-cetobutirato gerado a partir da L-treonina pelo produto do gene ilvA[76]. Superexpressão de ilvA-leuABCD levou a um aumento de três vezes na síntese de butanol. Também foi demonstrado que a disponibilidade de treonina foi uma etapa limitante, uma vez que a adição de treonina exógena levou a títulos mais elevados. Além disso, um título de 2 g / l com aproximadamente 0,85 g / l de butanol foi alcançado desregulando a biossíntese de aminoácidos e eliminando as vias concorrentes [76]. Uma rota alternativa para a síntese de 2-cetobutirato é fornecida pela via do citramalato, identificada em Leptospira interrogans e Methanocaldococcus jannaschii a citramalato sintase converte o piruvato em 2-cetobutirato em uma reação de uma etapa. A evolução direcionada desta enzima foi usada para desenvolver um mutante com maior atividade catalítica e insensibilidade à inibição do feedback da isoleucina, o que permitiu atingir títulos 22 vezes maiores em comparação com a enzima nativa [78].

Vias sintéticas para biocombustíveis avançados. Os combustíveis gerados pela via mediada por cetoácido são mostrados em vermelho. A biossíntese de isoprenóides, incluindo as vias do mevalonato e do metileritritol, é mostrada em azul. A via dos ácidos graxos para ésteres etílicos de ácidos graxos (FAEE), álcoois graxos e alcanos / alcenos de cadeia longa é relatada em verde. As linhas tracejadas indicam várias etapas. Os produtos combustíveis são apresentados em caixas. Abreviações: ACP, proteína carreadora de acila CoA, Coenzima A DMAPP, pirofosfato de dimetilalila FAEE, ésteres etílicos de ácidos graxos FPP, difosfato de farnesila Gly-3P, gliceraldeídos-3Fosfato GPP, pirofosfato de geranil GGPP, geranil-geranil pirofosfato de isofosfato de geranil, polifosfato de geranil-geranil, PEFenofosfato de geranil, polifenofosfato de geranil.

Várias espécies de bactérias solventes também são muito atraentes do ponto de vista da produção de biocombustíveis devido à sua capacidade de utilizar açúcares pentose e alguns outros carboidratos complexos. A produção de solventes em clostrídios é caracterizada por duas fases fisiológicas, acidogênica e solvogênica [79], a última, durante a qual acetona, butanol e etanol são sintetizados, está intimamente ligada à esporulação [80]. Estratégias de engenharia metabólica em clostrídios têm como objetivo melhorar a seletividade da síntese de produtos, aumentando a tolerância ao butanol e ampliando a faixa de utilização do substrato [81]. Uma das primeiras tentativas nessa direção foi a superexpressão da via clostridial nativa para a produção de acetona. As vias do butanol e da acetona são de fato parcialmente acopladas [79]. A amplificação dos genes que codificam para o acetoacetato descarboxilase e CoA transferase levou a um aumento na quantidade do precursor da produção de butanol, butiril-CoA, e como consequência a títulos mais elevados de butanol [82]. Estudos posteriores investigaram o efeito de solR, um suposto repressor transcricional, que regula negativamente a expressão de genes associados ao metabolismo solvogênico [83]. Embora mais estudos ainda sejam necessários para elucidar o mecanismo de regulação, a ruptura do solR gene levou a um aumento na síntese de butanol. A tolerância ao solvente e a resposta ao estresse em clostrídios é muito complexa e está ligada também à expressão de chaperonas e à modulação da síntese de ácidos graxos [84]. A amplificação dos produtos do gene do choque térmico (groES, groEL) levou a um aumento na tolerância ao solvente, provavelmente devido à estabilização das enzimas solvogênicas [85]. Por último, esforços significativos são direcionados para o desenvolvimento de uma capacidade celulolítica em C. acetobutylicum que poderia permitir a utilização direta de celulose. Celulanase de C. cellulovorans[86], C. cellulolyticum e C. thermocellum foram expressos em C. acetobutylicum, mas as atividades de alta celulose ainda não foram alcançadas [81].

Conversão de açúcar em biocombustíveis avançados

A conversão de hexose em combustíveis é atualmente a rota mais estabelecida para a produção de biocombustíveis e foi desenvolvida para produzir uma ampla gama de biocombustíveis avançados (Fig. 4). Até o momento, a pesquisa sobre substitutos da gasolina tem se concentrado principalmente no etanol. No entanto, biossintético e de novo as vias podem potencialmente produzir moléculas semelhantes ou idênticas às atualmente encontradas na gasolina. Estes incluem alcanos de cadeia linear e ramificada de ácidos graxos e vias isoprenóides, além de álcoois superiores e ésteres (Fig. 4). A ampla gama de ácidos graxos de diferentes comprimentos de cadeia e graus de saturação que são produzidos microbianamente poderia fornecer uma mistura ideal para uma mistura de biocombustível. O biodiesel de óleo de microalga foi extensivamente investigado, mas é um processo que ainda depende da transesterificação química para produzir as moléculas de combustível [87, 88]. Em uma abordagem alternativa, Kalscheuer et al. relatou recentemente um E. coli processo baseado na conversão bacteriana de hexoses em microdiesel [89, 90]. A biossíntese de ácidos graxos em bactérias é um processo bem conhecido, que se baseia no pool de acetil-CoA [91, 92]. E. coli as células foram metabolicamente modificadas pela introdução dos genes PDC e ADH (pdc e adhB), respectivamente, de Z. mobilis para a produção abundante de etanol (veja a seção anterior e a Fig. 2). O gene atfA para uma aciltransferase inespecífica de Acinetobacter baylyi foi introduzido para esterificar o etanol com as porções acil dos tioésteres CoA de ácidos graxos. Expressão heteróloga desses genes na forma recombinante E. coli resultou em biossíntese significativa de éster etílico de ácido graxo (FAEE). Embora os rendimentos de FAEE obtidos tenham ficado significativamente abaixo dos requisitos de um processo industrial viável, a viabilidade da abordagem foi demonstrada no estudo.

Os isoprenóides também foram considerados como fonte potencial de biocombustíveis [6]. E. coli e S. cerevisiae cepas foram desenvolvidas para a superprodução de isoprenóides, devido ao seu valor farmacêutico e nutricional [93]. Os dois precursores comuns de isoprenóides são isoprenil difosfato (IPP) e dimetilalil pirofosfato (DMAPP), sintetizado a partir de gliceraldeído-3-fosfato e piruvato através da via do metileritritol ou do acetil-Coa através da via do mevalonato (Fig. 4) [94]. Recentemente, dois genes de Bacillus subtilis foram relatados que podem converter o precursor IPP em isopentenol [95]. A expressão heteróloga de uma pirofosfatase de Bacillus subtilis no E. coli possibilitou a produção de isopentenol [95]. Além disso, o farnesol e o farneseno foram produzidos em E. coli e S. cerevisiae usando uma fosfatase de levedura e certas terpeno-sintases de planta, respectivamente [96]. Mesmo que a engenharia dessas vias ainda esteja em um estágio inicial, essas moléculas de terpeno são desenvolvidas como precursores dos combustíveis diesel e podem ser componentes potenciais da próxima geração de combustíveis para aviação [4, 97].

Isobutanol, um isômero de n-butanol com um número de octanas mais alto, foi sintetizado em E. coli pela superexpressão do operon ilvIHCD, de modo a desviar o carbono do piruvato para 2-cetoisovalerato (Fig. 4). Para aumentar a síntese de isobutanol, as vias de competição para o piruvato foram interrompidas e um ligeiro aumento na produção de isobutanol foi observado [98]. Além disso, um acetolactato de B. subtilis com maior afinidade para o piruvato foi superexpresso e o pflB interrompido para permitir o acúmulo de piruvato. A implementação das estratégias acima mencionadas levou a títulos de 20 g / l de isobutanol [98]. A via mediada por cetoácido acima mencionada também permite a síntese de álcoois 5-C, como 2-metil-1-butanol e 3-metil-1-butanol (Fig. 4). Quanto à produção de butanol, o 2-metil-1-butanol é sintetizado a partir do 2-cetobutirato. Portanto, todas as estratégias discutidas anteriormente para a síntese de butanol via ceto-ácido mediado também são aplicáveis. O operon leuABCD foi interrompido para aumentar a especificidade do produto. Uma combinação dessas abordagens levou a títulos de até 1,25 g / l de 2-metil-1-butanol [99]. Da mesma forma, a produção de 3-metil-1-butanol compartilha a mesma estratégia usada para a produção de isobutanol, com a qual compete pelo precursor comum 2-cetoisovalerato (Fig. 4). A distribuição de carbono entre os dois ramos ainda permanece um desafio. Mutantes resistentes à leucina foram utilizados para superar a inibição do feedback da leucina e as vias para a formação de valina e isoleucina foram interrompidas. Um título de 1,28 g / l de 3-metil-1-butanol foi alcançado [100].

Utilização eficiente de misturas de açúcar

Dada a alta complexidade dos hidrolisados ​​lignocelulósicos, a engenharia metabólica tem sido amplamente utilizada para desenvolver cepas recombinantes de produtores de etanol tradicionalmente usados, como S. cerevisiae e Z. mobilise bactérias entéricas, como E. coli, que fermentará com eficiência misturas de glicose e xilose e, em alguns casos, arabinose [101]. Quando cultivado em uma mistura de açúcares, como os obtidos da biomassa vegetal, o tipo selvagem E. coli exibe consumo sequencial deles, que se manifesta em crescimento diauxic / diauxie. Este é o resultado da repressão do catabólito de carbono (CCR) [102], um fenômeno no qual a presença de um substrato preferido reprime a expressão de genes necessários para o metabolismo de outros substratos. A glicose é a fonte de carbono preferida para E. coli e muitos outros organismos, portanto o CCR induzido por glicose é bem conhecido como o "efeito glicose". Devido ao CCR, a fermentação de xilose, arabinose e outros açúcares derivados da biomassa lignocelulósica é atrasada e frequentemente incompleta, resultando em menores produtividades e rendimentos do produto (açúcares residuais também são problemáticos para processamento posterior de produtos). Portanto, a obtenção de cepas recombinantes capazes de fermentar misturas de açúcar de forma eficiente é uma etapa crítica na conversão de açúcares lignocelulósicos em produtos valiosos.

A CCR pode ocorrer por meio de diferentes mecanismos, como repressão permanente, repressão transitória, exclusão do indutor e expulsão do indutor [103]. No E. coli, CCRs mediados pela ação combinada de mecanismos regulatórios globais e específicos de operon, aqui referidos como sistemas reguladores de utilização de açúcar (SURS). Vias globais que medeiam SURS incluem o ativador transcricional CRP (c AMP cíclico (cAMP) r eceptor p roteína), o metabólito de sinal cAMP, a enzima adenilato ciclase e o componente da enzima IIA do sistema fosfoenolpiruvato específico da glicose: carboidrato fosfotransferase (PTS) (EIIA Glc também chamado de resistência à repressão catabólica (Crr) ou EIIA Crr). O PTS usa fosfoenolpiruvato como um ATP equivalente no transporte ativo de açúcar. A proteína PTS de glicose IIAglc (crr) também exerce controle regulatório sobre o nível intracelular de cAMP, que é um efetor alostérico necessário na expressão de enzimas catabólicas para outros açúcares [104]. Assim, o PTS é responsável pelo "efeito da glicose", isto é, a glicose reprime a utilização de fontes de carbono menos preferidas (por exemplo, xilose, arabinose), resultando em crescimento diauxic e consumo sequencial de açúcares. A interrupção do PTS alivia a repressão da glicose na xilose e na arabinose e, portanto, ocorre a captação simultânea de açúcar [101, 105, 106]. Por causa do sistema de transporte prejudicado, esses PTS - mutantes exibiriam taxas de absorção de açúcar diminuídas e, portanto, crescimento mais lento, mas essa deficiência é melhorada pela ativação de um transporte alternativo de glicose e sistema de fosforilação composto de uma proteína facilitadora de glicose (ou uma permease de galactose) e a enzima glucoquinase [107]. Isso foi conseguido nos exemplos acima pela superexpressão dos componentes mencionados acima ou pelo uso de uma abordagem de evolução adaptativa que seleciona PTS - variantes que recuperaram a capacidade de crescer em glicose. Uma abordagem alternativa para evitar o CCR é o uso de mutantes de CRP que não requerem cAMP para ativar a expressão de genes catabólicos (mutantes de CRP *) [102].

Um estudo recente de Yomano e colegas de trabalho mostrou que a interrupção do gene da metilglioxal sintase aumentou o co-metabolismo de misturas de açúcar [108]. O metilglioxal, um intermediário no desvio do metilglioxal que desvia o carbono do fosfato de diidroxiacetona, é geralmente considerado um inibidor do consumo de açúcar [109, 110]. Exclusão de mgsA já havia comprovado anteriormente que melhora a produção de lactato e agora foi aplicado na construção de E. coli[108].

Produção de biocombustíveis a partir de matérias-primas sem carboidratos

Bio-óleos consistem em ácidos graxos (FAs) ligados a uma estrutura de base, tipicamente glicerol e, portanto, são geralmente encontrados na forma de triglicerídeos (ou seja, triésteres de FAs e glicerol). Os bioóleos não são apenas abundantes, mas seu uso para a produção de combustível também oferece várias vantagens que se traduzem em maior rendimento do biocombustível em comparação com sua produção a partir de açúcares lignocelulósicos. As vantagens do uso de componentes de bio-óleo (ou seja, glicerol e FAs) para a produção de biocombustível, juntamente com os recentes esforços de engenharia nesta área, são discutidas abaixo.

Conversão de ácidos graxos em biocombustíveis

O metabolismo dos FAs para o principal metabólito intermediário AcCoA é muito eficiente, pois resulta na recuperação de 100% do carbono (Fig. 5). Uma vez que muitos biocombustíveis podem ser derivados de AcCoA, altos rendimentos podem ser obtidos em sua síntese de FAs. Em contraste, o metabolismo do açúcar gera uma molécula de dióxido de carbono (ou formato) por molécula de AcCoA sintetizada via glicólise, limitando severamente a recuperação de C e, portanto, o rendimento de produtos derivados de AcCoA (Fig. 3 e 4). Outra vantagem dos FAs sobre os açúcares é o seu conteúdo de energia mais alto (ou seja, a natureza mais reduzida de seus átomos de carbono), o que também resulta em maiores rendimentos de biocombustíveis. Apesar dessas vantagens, o metabolismo dos AFs requer a presença de um aceptor de elétrons externo, que por sua vez impedia a síntese de produtos metabólicos. Para superar esse obstáculo, nosso grupo projetou rotas respiro-fermentativas sintéticas para a produção eficiente de combustíveis e produtos químicos em combinação com a degradação efetiva de AFs (Dellomonaco e Gonzalez, não publicado). E. coli foi escolhido como organismo modelo para ilustrar a viabilidade desta abordagem, que foi demonstrada pela engenharia da síntese de biocombustíveis etanol e butanol (Dellomonaco e Gonzalez, não publicado). O rendimento de etanol na cepa modificada (1,08 g etanol / g de FAs) foi duas vezes o valor máximo teórico que pode ser alcançado com o uso de açúcares lignocelulósicos (0,51 g etanol / g açúcar). O butanol, por outro lado, foi produzido com rendimentos e títulos entre duas e três vezes maiores do que aqueles relatados para sua produção a partir de açúcares de engenharia E. coli e S. cerevisiae estirpes [71-73, 77].

Vias projetadas para a produção microbiana de biocombustíveis a partir dos constituintes do bio-óleo glicerol e ácidos graxos. A via de dissimilação do glicerol é mostrada em vermelho. O catabolismo dos ácidos graxos é mostrado em azul. A linha tracejada indica várias etapas. || indica nocaute de gene. Os combustíveis são relatados em caixas vermelhas. Os genes entre parênteses indicam etapas sintéticas clostridiais projetadas em E. coli para a produção de butanol. 2 [H] = NAD (P) H = FADH2 = H2. Nomes de genes / enzimas: adhE, adhE1, adhE2, álcool desidrogenase a para B, tiolasedhaKLM, dihidroxiacetona quinase bcd-etfAB, butiril-CoA desidrogenase fadA, 3-cetoacil-CoA tiolase fadB, enoil-CoA hidratase, 3-hidroxibutiril-CoA epimerase fadD, sintetase de acil-CoA graxo desvaneça, acil-CoA desidrogenase fdhF, formato desidrogenase frdABCD, fumarato redutase gldA, glicerol desidrogenase hbd, β-hidroxibutiril-CoA desidrogenase hycB-I, hidrogenase ldhA, lactato desidrogenase lpdA-aceEF, piruvato desidrogenase pflB, piruvato formato liase pykF, piruvato quinase thil, tiolase. Abreviaturas: DHA, dihidroxiacetona DHAP, dihidroxiacetona fosfato PEP, posfoenol piruvato.

Conversão de matérias-primas ricas em glicerol em biocombustíveis

O glicerol (ou glicerina) é um subproduto dos processos de produção de biodiesel, oleoquímico e bioetanol. Devido ao enorme crescimento da indústria de biocombustíveis, o glicerol é agora considerado um produto residual com muitas vezes um custo de descarte associado a ele [111]. Dada a natureza altamente reduzida dos átomos de carbono no glicerol, vantagens adicionais podem ser obtidas usando glicerol em vez de açúcares. Por exemplo, a conversão de glicerol nos intermediários glicolíticos fosfoenolpiruvato (PEP) ou piruvato gera duas vezes a quantidade de equivalentes redutores produzidos pelo metabolismo de glicose ou xilose (Fig. 2 e 5). O metabolismo fermentativo, então, permitiria maior rendimento de combustíveis e redução dos produtos químicos do glicerol em comparação com os obtidos de açúcares comuns, como glicose ou xilose.

E. coli não pode crescer anaerobicamente devido a um desequilíbrio do potencial redox, e. acumulação de equivalentes redutores [112]. Trinh e colaboradores consideraram quatro aceitadores de elétrons diferentes para testar in silico a conversão anaeróbia do glicerol [113]. Os aceitadores de elétrons podem estar na forma de substratos adicionados ao meio ou vias que servem como coletores redox. A produção de 1,3-propanodiol, a ativação da via do metilglioxal para produzir 1,2-propanodiol ou substratos (por exemplo, fumarato, nitrato) foram investigados como mecanismos potenciais que permitem a fermentação do glicerol. Trinh e colegas utilizaram oxigênio como aceitador de elétrons e empregaram análise de modo elementar (EM) para projetar um E. coli plataforma com funcionalidade metabólica minimizada que poderia converter eficientemente glicerol em etanol em condições microaeróbicas. E. coli foi adaptado para produzir etanol de forma eficiente a partir do glicerol, inserindo nove genes nocauteados (Δzwf Δndh ΔscfA ΔmaeB ΔldhA ΔfrdA ΔpoxB Δpta Δmdh) [113].

Embora muitos microrganismos sejam capazes de metabolizar glicerol na presença de aceitadores de elétrons externos (metabolismo respiratório) [112, 114], poucos são capazes de fazê-lo fermentativamente (ou seja, na ausência de aceitadores de elétrons). O metabolismo fermentativo do glicerol foi estudado em grande detalhe em várias espécies de Enterobacteriaceae família, como Citrobacter freundii e Klebsiella pneumoniae. No entanto, o potencial de utilização desses organismos em nível industrial é limitado devido à sua patogenicidade, exigência de condições anaeróbias estritas, necessidade de suplementação com nutrientes ricos e falta de ferramentas genéticas adequadas e conhecimentos fisiológicos necessários para sua manipulação eficaz.

Um desenvolvimento recente na fermentação microbiana do glicerol é a descoberta pelo nosso grupo de que E. coli, um organismo considerado o burro de carga da biotecnologia moderna, pode fermentar o glicerol anaerobicamente [115-117]. Identificação de vias e condições ambientais que afetam o metabolismo do glicerol em condição anaeróbia por tipo selvagem E. coli forneceu oportunidades para manipular este microrganismo para aumento do rendimento e produtividade do etanol, conforme descrito abaixo e mostrado na Figura 5.

Fermentação de glicerol para etanol e H2 ou etanol [115, 118] e formato é uma das formas mais eficazes de explorar a propriedade reduzida do glicerol para a produção de biocombustíveis. Perturbação de genes que codificam fumarato redutase (FRD) e fosfotransacetilase (PTA) em E. coli permitido para etanol-H2 produção [115]. FRD e PTA são duas enzimas principais envolvidas na produção de succinato e acetato, respectivamente [Fig. 5. A cepa resultante (SY03) produziu quantidades quase equimolares de etanol e hidrogênio com um rendimento comparável ao máximo teórico de 1 mol de cada produto por mol de glicerol [115]. Para facilitar a coprodução de formato e etanol, uma mutação adicional foi introduzida no gene (fdhF) que codifica um componente do formato-hidrogênio-liase (FHL). FHL é responsável pela oxidação do formato em H2 e companhia2. Esta cepa mutante tripla, chamada SY04, produziu exclusivamente etanol e formato com rendimentos de 92-96% do máximo teórico. No entanto, as estratégias utilizadas na geração desses mutantes levaram à diminuição nas taxas de crescimento de E. coli mutantes [115]. A superexpressão de glicerol desidrogenase (GldA) e dihidroxiacetona quinase (DHAK), responsável por converter glicerol em intermediário glicolítico fosfato de dihidroxiacetona, foi avaliada para melhorar a taxa de crescimento de E. coli mutantes. A superexpressão de GldA e DHAK no mutante triplo SY04 levou à produção de etanol e formato a taxas volumétricas máximas de 3,58 e 3,18 mmoles / L / h, respectivamente. Da mesma forma, a superexpressão de GldA e DHAK em SY03 com mutações em dois genes, frdA e pta, para coprodução de etanol-H2 levou à produção de etanol a 4,6 mmol / L / he etanol e H2 rendimentos de 0,96 mol por mol de glicerol utilizado, respectivamente. Em um estudo mais recente, Hu e colaboradores [118] demonstraram taxas de crescimento mais altas junto com títulos aumentados de hidrogênio e etanol sob condições anaeróbicas usando evolução adaptativa e mutagênese química. A utilização de condições microaeróbicas foi recentemente explorada como um meio de eliminar a necessidade de nutrientes ricos [119]. A disponibilidade de baixas quantidades de oxigênio possibilitou o equilíbrio redox, preservando a capacidade de sintetizar produtos reduzidos. Experimentos envolvendo vários mutantes confirmaram o papel das vias respiratórias e fermentativas da utilização do glicerol em condições microaeróbicas e este processo metabólico foi aproveitado por cepas de engenharia para a coprodução eficiente de etanol e hidrogênio e etanol e formato [119].

Ultimamente, a produção de butanol a partir do glicerol também tem recebido atenção crescente [10, 11, 120, 121]. Nos últimos anos, a investigação neste contexto tem-se centrado principalmente nas espécies de Clostridium, nomeadamente Clostridium acetobutylicum e Clostridium beijerinckii, para o qual uma via para a produção de butanol a partir da glicose foi estabelecida [83, 122, 123]. Enquanto C. acetobutylicum pode metabolizar o glicerol na presença de glicose [124], Clostridium pasteuranium pode crescer em glicerol como única fonte de carbono [120, 121]. Produção de butanol em C. pasteurianum no glicerol bruto derivado do biodiesel foi estabelecido [120, 121]. Taconi e colaboradores relataram rendimentos de até 0,36 g butanol / g glicerol [120]. Embora este estudo comprove a capacidade desta linhagem de crescer e produzir solventes a partir do glicerol bruto, o crescimento das culturas foi extremamente lento (25 dias), limitando, portanto, sua aplicabilidade industrial imediata.

Como mencionado anteriormente, E. coli oferece uma série de vantagens em relação aos clostrídios em termos de facilidade de aplicação industrial e disponibilidade de ferramentas genéticas. Produção de butanol em E. coli sobre a glicose foi estabelecido e extensivamente revisado acima, a conversão de glicerol em butanol também foi relatada recentemente [10].

Conclusões e direções futuras

A engenharia metabólica e a biologia sintética mais recente têm sido cruciais como tecnologias facilitadoras para a produção de biocombustíveis, como fica evidente nas melhorias dos biocatalisadores e da própria matéria-prima de biomassa. No levantamento da literatura sobre engenharia de biocatalisadores, surgem temas recorrentes, nomeadamente estratégias de expressão de genes heterólogos, seleção evolutiva e engenharia metabólica "reversa". Avanços na "ômicas"as ciências estão produzindo saltos quânticos em nosso conhecimento, investigando mudanças celulares associadas a novos fenótipos e impulsionando a construção de microorganismos eficientes para a produção de biocombustíveis.

Os últimos avanços em biologia sintética, engenharia metabólica e biologia de sistemas continuarão a impulsionar o desenvolvimento de fábricas de células que produzem quantidades substanciais de biocombustíveis [6–9, 11, 13, 15, 16]. A integração formal de ferramentas de biologia de sistemas, como transcriptômica, proteômica, metabolômica e fluxômica, apoiará a caracterização de novos mutantes e novas vias metabólicas para a produção dos produtos de grau combustível desejados, contribuindo assim para o processo de otimização de cepas. O aprimoramento dos modelos metabólicos proporcionará uma melhor descrição do comportamento fisiológico das células e uma identificação mais rápida de alvos para modificações genéticas e posterior engenharia metabólica. Além disso, o desenvolvimento de modelos cinéticos detalhados que incluem parâmetros de rede regulatórios precisos facilitará a identificação de gargalos enzimáticos nas vias metabólicas que poderiam ser aproveitadas para atingir a superprodução de biocombustíveis.


Assista o vídeo: Microbiologia e Imunologia Aula 04 - Crescimento microbiano e controle (Dezembro 2021).