Em formação

Cultivo de E. coli em temperatura ambiente?


Se eu fizesse uma seleção azul / branco de transformados E. coli em placas de ampicilina de ágar LB em temperatura ambiente (23⁰C) por cerca de 2 dias e 18 horas, terei de enfrentar o problema de colônias satélites ou qualquer outro problema?


Definitivamente, você obterá colônias satélites. A ampicilina decompõe-se após cerca de um dia, especialmente exposta à luz. Kan, mantém-se muito bem na temperatura ambiente, mas isso não adianta você :)


Como a triagem p / b é um meio de seleção, você deseja a pressão de seleção máxima. Isso será obtido incorporando todas as condições ótimas. As muitas enzimas do operon lac funcionarão melhor em sua temperatura ideal.

Por que você faria isso? Se é porque você não pode ir no dia seguinte, é melhor ir quando estiver disponível. Você só vai duvidar de seus resultados quando os obtiver.


Pergunte a um especialista: como preparar placas de cultura adequadamente com E. Coli

Estou fazendo um experimento que envolve testar as propriedades antimicrobianas de vários compostos contra a bactéria E. coli. Alguns dos meus experimentos preliminares não funcionaram como eu esperava, pois NÃO fiz crescer muitas bactérias.

Aqui está um resumo do que fiz:
Solicitou a cepa K12 de E. coli (em uma inclinação de ágar) da Carolina Biological Supply Company
http://www.carolina.com/product/escherichia+coli+k12%2C+living.do?keyword=e.+coli&sortby=bestMatches
Placas de cultura preparadas usando ágar nutient (em quantidades padrão)
Esterilizou uma alça de inoculação de 4 mm em um bico de bunsen e a usou para extrair 1 alça cheia de bactérias. Em seguida, espalhei sobre a superfície da placa, girei 120 graus, continuei espalhando e depois girei 120 graus novamente para espalhar um pouco mais.
Incubou as placas a 37 graus C por 24 horas.

Os resultados foram extremamente irregulares e não o piso de bactérias que eu esperava. Pensei em possíveis fontes de erro. Outras pessoas poderiam comentar sobre as fontes prováveis ​​para que, quando eu voltar para a escola, eu possa ajustar meu procedimento para cultivar E. coli com sucesso?

As possíveis fontes de erro são:
1. Usei E. coli direto do tubo de ensaio quando provavelmente deveria ter diluído as bactérias para fazer algum tipo de caldo bacteriano. É melhor usar as bactérias como caldo para o cultivo de bactérias?
2. Não deixei a alça de inoculação esfriar por tempo suficiente e posso ter "matado" a bactéria para que ela não crescesse. Preciso deixar o loop esfriar até a temperatura ambiente antes de colocá-lo na cultura bacteriana?
3. Usei uma alça cheia de bactérias em toda a placa de Petri, então pode não ter sido o suficiente. Depois de realizar este experimento, encontrei algumas referências que recomendavam que eu deveria ter usado 3 alças cheias de bactérias (por exemplo, 1 alça a cada 120 graus de rotação).
4. Usei uma alça de inoculação em vez de um instrumento de espalhamento. Embora eu tenha visto algumas referências recomendando um loop de inoculação para espalhar bactérias ao redor da placa, mais tarde encontrei outras referências que recomendam um instrumento de espalhamento para obter uma camada uniforme de bactérias na placa.
5. Usei uma alça de inoculação em vez de um cotonete esterilizado. Minhas referências iniciais recomendavam o uso de um loop de incoculação. Achei que, se usasse um cotonete esterilizado, não seria capaz de garantir que receberia uma quantidade infinita de bactérias de placa para placa. Mas, a alça de inoculação fornece cobertura suficiente?
6. A incubadora pode não estar funcionando corretamente. Os controles de temperatura da incubadora são um pouco sensíveis, por isso é difícil fazer com que funcione precisamente a 37 graus C. No entanto, acho que ela opera nas proximidades de 36 a 40 graus C. Eu li que o cultivo de E. coli em temperaturas abaixo de 37 graus C, mas não sei em que temperatura é muito quente para matar as bactérias na incubadora.

Agradeço todas as sugestões que me ajudem a identificar meus erros e a desenvolver E. coli com sucesso.

Re: Preparação Adequada de Placas de Cultura com E. Coli

Postado por uma dança & raquo Dom 28 de dezembro de 2008 9h31

Acho que você está no caminho certo com sua solução de problemas.

1. Fazer uma suspensão de bactérias é certamente uma opção.

2. Sim, isso é importante! Apenas deixe esfriar por alguns segundos depois de chamá-lo. Deve voltar à cor normal, não ao vermelho vivo, quando você o coloca na cultura.

3. Talvez. Se não houver bactérias suficientes, simplesmente levará mais tempo para que cresçam e se espalhem pela placa. Em 24 horas, a E. coli cria colônias bem pequenas, mas com mais tempo deve se espalhar.

4. Uma cultura líquida e um espalhador (apenas um tubo ou bastão de vidro dobrado, esterilizado) devem fornecer uma camada mais uniforme de bactérias. A técnica que você usou, eu acho que pela sua descrição, é mais comumente usada para traçar colônias únicas - exatamente o oposto do que você quer aqui.

5. Depende apenas de quantas bactérias você começa. Um cotonete vai espalhá-los mais, eu acho.

6. Eu acho que uma faixa de 36-40 é provavelmente OK, a menos que você tenha uma cepa particularmente sensível à temperatura. A E. coli também cresce à temperatura ambiente, mas leva mais tempo.

Acho que sua ideia de uma cultura líquida é a melhor. Se você inocular um líquido e deixá-lo crescer durante a noite com agitação, deverá ter uma boa suspensão uniforme para preparar. (Você também pode diluir um blob de células em meio líquido, mas o blob pode não se dispersar completamente.) Você provavelmente desejará diluí-lo um pouco com meio estéril. Em seguida, pegue 100 ul e espalhe sobre seus pratos com uma vareta de vidro dobrada. Deixe descansar do lado direito por alguns minutos para que o líquido possa ser absorvido pelo ágar. Só então vire de cabeça para baixo e coloque na incubadora.

Se você não estiver satisfeito com o gramado que verá no dia seguinte, tente deixá-lo passar outra noite na incubadora ou comece com mais bactérias.

Se você tiver tempo, acho que a melhor coisa a fazer seria um experimento piloto apenas para determinar qual protocolo oferece o melhor gramado. Experimente alguns procedimentos diferentes e, a seguir, escolha o que mais gostar para sua experiência & quotreal & quot.


INTRODUÇÃO

O serótipo O157: H7 do produtor de verotoxina Escherichia coli (VTEC) foi reconhecido pela primeira vez como um patógeno humano grave em 1982. Este organismo foi implicado como o agente causador da colite hemorrágica e também está associado à síndrome hemolítica urêmica e púrpura trombocitopênica trombótica. A maioria dos surtos está relacionada com alimentos ou água e tem sido associada, em particular, ao consumo de carne moída mal cozida. Escherichia coli O157: H7 é na verdade um patógeno de origem alimentar de preocupação primária de saúde pública na América do Norte, Europa e Japão, cujo gado leiteiro foi identificado como o reservatório (6 4).

Dada a gravidade das doenças associadas a E. coli O157: H7, é necessário dotar a indústria alimentar de procedimentos para prevenir a sua presença e controlar o seu crescimento. A cinética de crescimento do sorovar O157: H7 em condições ambientais variáveis ​​(temperatura de incubação, pH inicial, conteúdo de NaCl) foi investigada. Isso permitiu o desenvolvimento subsequente de modelos matemáticos que predizem seu comportamento nos alimentos (2 1 14).

Conhecendo o Tmin (a temperatura abaixo da qual o crescimento não é mais observado) e Tmax (a temperatura acima da qual nenhum crescimento ocorre) para E. coli O157: H7 é particularmente importante para conservar alimentos e detectar esta bactéria. Toptar (a temperatura na qual a taxa de crescimento específica máxima µmax igual ao seu valor ideal) é um parâmetro importante na microbiologia preditiva. Uma forte correlação foi observada entre as três temperaturas cardinais (Tmin, Tmax e Toptar) em várias cepas de várias espécies bacterianas (12). Seus valores para três não-O157 E. coli as cepas foram avaliadas entre 4 · 9 ° C e 11 · 2 ° C para Tmin, 47,3 ° C e 48,0 ° C para Tmax e 40,3 ° C e 41,3 ° C para Toptar (12). A incapacidade de E. coli O157: H7 para crescer bem, se em absoluto, a 44-45 · 5 ° C foi relatado para caldo de tripticase de soja (TSB) (7) e para meio E coli (11). Os resultados, obtidos em cada caso com uma única cepa, foram posteriormente interpretados como significando que as temperaturas cardinais para este sorovar seriam mais baixas. Em contraste com esses achados, 10 observaram que a maioria das cepas O157 cresceu em uma faixa de 8 a 10 ° C a pelo menos 45 ° C na infusão de cérebro e coração (BHI). Além disso, o crescimento de isolados O157: H7 foi adequadamente descrito por um modelo para não patogênicos E. coli cepas (13), e ao mesmo tempo, o crescimento de cepas não patogênicas foi adequadamente descrito por um modelo para E. coli cepas (1 14). Esses dados divergentes podem ser explicados pela variabilidade entre as cepas e as condições de cultura. Na verdade, 8 observaram que a capacidade de E. coli O157: H7 para crescer a 45,5 ° C dependia do meio, do tamanho do inóculo e da cepa. Nessa temperatura, apenas três das 18 cepas estudadas cresceram bem em caldo EC, com densidade inicial de 100 ufc ml-1, enquanto todas as cepas cresceram com densidades iniciais mais altas. Em TSB, todas as cepas foram capazes de crescer mesmo com uma densidade inicial de 10 cfu ml −1.

Este estudo foi realizado para comparar o Toptar do serovar O157 com outro E. coli sorotipos em um meio de laboratório complexo. Na verdade, a precisão de Toptar os valores experimentais foram melhores do que os de Tmin e Tmax. Várias cepas foram incluídas para explicar a variabilidade descrita entre os isolados (10 13).


Crescimento de E. coli a 4 graus? - (15 / set / 2010)

Recentemente, fiz um experimento de transformação com algumas das 10 células principais de E. coli da Invitrogen, a transformação não pareceu funcionar muito bem, mas isso é uma história diferente.

Contei o número de colônias nas placas de Ampacilina e coloquei pequenos pontos pretos em frente a cada colônia enquanto contava. Em seguida, embrulhei as placas em Parafilm e as coloquei na geladeira. Uma semana depois, peguei algumas das placas novamente e vi muito mais colônias do que eu contei em toda a placa e mais do que apenas as opostas aos pontos pretos, e essas não eram microcolônias minúsculas, eram aproximadamente do mesmo tamanho que os colônias originais.

E.Coli pode crescer colônias a 4 graus C? Em caso afirmativo, como faço para armazenar pratos por longos períodos de tempo?

A ampicilina tende a se decompor mais facilmente do que outros antibióticos. Se você quiser armazenar suas células, eu recomendo colocá-las em um novo prato, cultivá-las durante a noite e armazená-las a 4 ° C. Mesmo assim, você não deseja armazená-los por mais de algumas semanas dessa forma, sem recolocar os dentes.

philman em Quarta-feira, 15 de setembro 12:31:16 de 2010 disse:

Recentemente, fiz um experimento de transformação com algumas das 10 células principais de E. coli da Invitrogen, a transformação não pareceu funcionar muito bem, mas isso é uma história diferente.

Contei o número de colônias nas placas de Ampacilina e coloquei pequenos pontos pretos em frente a cada colônia enquanto contava. Em seguida, embrulhei as placas em Parafilm e as coloquei na geladeira. Uma semana depois, peguei algumas das placas novamente e vi muito mais colônias do que eu contei em toda a placa e mais do que apenas as opostas aos pontos pretos, e essas não eram microcolônias minúsculas, eram aproximadamente do mesmo tamanho que os colônias originais.

E.Coli pode crescer colônias a 4 graus C? Em caso afirmativo, como faço para armazenar pratos por longos períodos de tempo?

Em uma nota muito engraçada, phil, você tem muitas colônias no seu prato.
Tínhamos um quarto de 4oC em nossa universidade. e guardei (esqueci) placas por um mês quase sem crescimento nelas. A geladeira estava funcionando bem enquanto você estava fora? ou você tem um novo aluno em seu laboratório que pode tê-los colocado para fora e colocá-los de volta no dia seguinte.
Sei que não recebo ajuda técnica minha, mas não consigo pensar em nada para os problemas que você mencionou aqui.

gt_ameya em Quarta, 15 de setembro 12:55:58 de 2010 disse:

Sim, eu sei que tenho muitas colônias, superestimei quantos transformantes eu receberia & # 33 Estou replantando hoje com uma diluição mais alta & # 33 E a geladeira deveria estar funcionando bem, eles ficaram apenas por uma semana. Posso enfiar um termômetro ali um pouco para ver o quanto está frio, é uma geladeira bem velha.

e EU SOU o novo aluno, e não me lembro de tê-los deixado de fora

e sim, eu sei que a ampicilina é um pouco ruim, deixei minha placa de controle negativo na incubadora por 5 dias uma vez por curiosidade e ela saiu com colônias (embora não houvesse nenhuma no dia após a transformação, então os controles ainda eram viáveis )

foi e enfiou um termômetro em um frasco de líquido que havia sido armazenado lá por um bom tempo, a geladeira estava apenas a 13 graus & # 33

Eu abaixei isso agora e espero que a temperatura chegue perto de 4 graus até amanhã, mas uma maneira irritante de descobrir que tem estado tão quente por Deus sabe quanto tempo

philman em Quarta-feira, 15 de setembro 15:13:43 de 2010 disse:

foi e enfiou um termômetro em um frasco de líquido que havia sido armazenado lá por um bom tempo, a geladeira estava apenas a 13 graus & # 33

Eu abaixei isso agora e espero que a temperatura chegue perto de 4 graus até amanhã, mas uma maneira irritante de descobrir que tem estado tão quente por Deus sabe quanto tempo

É exatamente por isso que você precisa de novos alunos a cada verão. Coisas incomuns acontecem em seus experimentos e você descobre o que REALMENTE está acontecendo em seu laboratório.

gt_ameya na sexta-feira, 17 de setembro 04:47:21 de 2010 disse:

philman em Quarta-feira, 15 de setembro 15:13:43 de 2010 disse:

foi e enfiou um termômetro em um frasco de líquido que havia sido armazenado lá por um bom tempo, a geladeira estava apenas a 13 graus & # 33

Eu abaixei isso agora e espero que a temperatura chegue perto de 4 graus até amanhã, mas uma maneira irritante de descobrir que tem estado tão quente por Deus sabe quanto tempo

É exatamente por isso que você precisa de novos alunos a cada verão. Coisas incomuns acontecem em seus experimentos e você descobre o que REALMENTE está acontecendo em seu laboratório.


Eu coloquei a geladeira no mínimo e a temperatura só caiu para 9 graus no dia seguinte. suspeitaram de todas as geladeiras do laboratório agora e colocaram um tubo de 15ml de água da torneira em cada uma ontem para verificar as temperaturas ainda hoje. pode ser um problema.

Isso não tem nada a ver com sua geladeira - você está vendo colônias de satélites surgindo na placa.

Quando você placa uma mistura de transformação, ela contém muitas células que não foram transformadas e (espero) algumas que foram. Inicialmente, essas células sem um plasmídeo não crescem por causa da ampicilina no meio. No entanto, à medida que as células transformadas crescem, elas secretam beta-lactamase (a enzima que destrói a ampicilina e confere resistência aos transformantes). À medida que essa enzima se acumula na mídia e se espalha para fora, a concentração de ampicilina cai, porque a enzima está destruindo a ampicilina. Agora, as células não transformadas podem crescer, pois a concentração de ampicilina restante é muito baixa para interromper seu crescimento.

Então, sim - E. coli cresce a 4 graus, e você não deve armazenar suas placas de transformação diretamente, em vez disso, você deve pegar seus transformantes em um prato novo e armazená-lo.

philman em Quarta-feira, 15 de setembro 12:31:16 de 2010 disse:

Recentemente, fiz um experimento de transformação com algumas das 10 células principais de E. coli da Invitrogen, a transformação não pareceu funcionar muito bem, mas isso é uma história diferente.

Contei o número de colônias nas placas de Ampacilina e coloquei pequenos pontos pretos em frente a cada colônia enquanto contava. Em seguida, embrulhei as placas em Parafilm e as coloquei na geladeira. Uma semana depois, peguei algumas das placas novamente e vi muito mais colônias do que eu contei em toda a placa e mais do que apenas as opostas aos pontos pretos, e essas não eram microcolônias minúsculas, eram aproximadamente do mesmo tamanho que os colônias originais.

E.Coli pode crescer colônias a 4 graus C? Em caso afirmativo, como faço para armazenar pratos por longos períodos de tempo?

Normalmente, essas colônias só aparecem quando você seleciona a ampicilina, pois ela se degrada gradualmente na geladeira.
Acho que a melhor maneira é simplesmente riscar novamente suas colônias em um novo prato com ampicilina e armazenar esses pratos. Afinal, as colônias nunca aparecerão se você não as tiver plaqueado & # 33


Taxa de crescimento de Escherichia coli.

Deve ser possível prever a taxa de crescimento de Escherichia coli de um determinado genótipo em um ambiente específico. A ideia de que a taxa de síntese de ATP determina a taxa de crescimento e de que o rendimento de ATP determina a produção de crescimento está arraigada na fisiologia bacteriana, embora essa ideia seja inconsistente com os resultados experimentais. Em meios mínimos, a taxa de crescimento e o rendimento variam com a fonte de carbono de uma maneira independente da taxa de formação e rendimento de ATP. Com o acetato como fonte de carbono, as reações anapleuróticas, e não a síntese de ATP, limitam a taxa de crescimento. Para o acetato e outros substratos gliconeogênicos, a etapa limitante parece ser a formação de fosfato de triose. Concluo que a taxa de crescimento é controlada pela taxa de formação de um metabólito precursor e, portanto, de monômeros como os aminoácidos derivados dele. O sistema de síntese de proteínas é regulado de acordo com a demanda para a síntese de proteínas. Eu examino a conjectura de que o sinal para essa regulação é a proporção de tRNA não carregado para aminoacil-tRNA, que esse sinal controla a concentração de tetrafosfato de guanosina e que a concentração de tetrafosfato de guanosina controla a transcrição dos genes rrn. As equações diferenciais que descrevem este sistema foram resolvidas numericamente para estados estacionários de crescimento, os valores computados de ribossomos e tetrafosfato de guanosina e a taxa máxima de crescimento estão de acordo com os valores experimentais obtidos na literatura dos últimos 35 anos. Essas equações também foram resolvidas para estados dinâmicos correspondentes a mudanças nutricionais para cima e para baixo.


Patogênico E. coli: O lado negro de um micróbio amigável

E. coliA presença da empresa no meio ambiente é motivo de preocupação, pois sua relação com os humanos não é totalmente benigna. De fato, E. coli é uma das principais causas de doenças diarreicas, peritonite, colite, bacteremia, mortalidade infantil e infecções do trato urinário que custam bilhões de dólares em todo o mundo para tratar e matar cerca de 2 milhões de humanos a cada ano (Russo e Johnson, 2003 Kaper et al., 2004). Algumas cepas podem até causar câncer (Arthur et al., 2012). Alguns oportunistas E.coli as infecções são causadas por cepas normalmente inofensivas ou benéficas quando introduzidas em hospedeiros doentes ou em partes do corpo de um hospedeiro fora do intestino (Kaper et al., 2004). No entanto, também existem cepas patogênicas que produzem fatores de virulência e podem causar doenças até mesmo no hospedeiro mais saudável. Essas cepas são classificadas por onde e como causam a doença em grupos chamados patotipos (consulte & # x02018Glossário & # x02019), que incluem enteroagregativa, enterohemorrágica, enteropatogênica, enterotoxigênica, uropatogênica, associada a meningite e associada a septicemia E. coli (Kaper et al., 2004 Leimbach et al., 2013) (ver & # x02018Glossário & # x02019).

O mais notório deles é E. coli O157: H7, uma cepa enterohemorrágica que produz um shiga-como a toxina (Griffin e Tauxe, 1991 Robinson et al., 2006). Esta toxina (ver & # x02018Glossário & # x02019) ataca pequenos vasos sanguíneos, matando células intestinais e causando diarreia com sangue e dor abdominal intensa, bem como síndrome hemolítica urêmica (SHU), uma condição potencialmente mortal que pode envolver coágulos disseminados nos capilares e anemia hemolítica, trombocitopenia e insuficiência renal (ver & # x02018Glossário & # x02019 Griffin et al., 1988 Kaper et al., 2004). O tratamento pode ser difícil porque os antibióticos aumentam o risco de SHU. Como resultado, o tratamento é geralmente limitado ao fornecimento de fluidos, nutrição adequada, medicamentos para dor e febre e transfusões de sangue quando necessário (Bitzan, 2009 Smith et al., 2012).

O157: H7 é particularmente perigoso porque pode contaminar facilmente os suprimentos alimentares humanos. Ele reside de forma assintomática no gado e em outros animais, e pode ser transferido para o homem através da contaminação fecal da carne durante o seu abate e embalagem (Ferens e Hovde, 2011). Também pode contaminar vegetais por meio de fertilizantes e água, e por meio do contato com aves associadas ao estoque vivo (Callaway et al., 2009, 2014). Por meio desses pontos de entrada na cadeia alimentar humana, o O157 causou inúmeros surtos de doenças (Frenzen et al., 2005, Rangel et al., 2005). Só nos EUA, esses surtos afetaram anualmente & # x0223c63.000 indivíduos, matando 20 e custando cerca de US $ 405 milhões em saúde e perda de produtividade (Mead et al., 1999 Scallan et al., 2011). Quando E. coli recebe má publicidade, O157: H7 é quase sempre o culpado, e com razão.


Introdução à E.coli e doença diarreica

Escherichia coli é uma pequena bactéria gram-negativa que vive no intestino de muitos mamíferos, incluindo humanos. Esta bactéria tem uma taxa de crescimento rápida. Se for fornecido um meio rico, ele pode dobrar a cada 20 minutos. Também é fácil de crescer e não precisa de suplementos nutricionais especiais. Embora cresça bem à temperatura do corpo humano (cerca de 37 ° C), também pode crescer à temperatura ambiente. É uma bactéria versátil e pode utilizar muitos substratos para o crescimento. Ele pode crescer aerobicamente e anaerobicamente (ou seja, é um anaeróbio facultativo e pode crescer com ou sem oxigênio). As bactérias crescem bem em meio líquido com ou sem aeração. Eles também crescem bem em superfícies sólidas, incluindo meio ágar de laboratório feito em placas de Petri. A cepa de laboratório de E. coli contém genes que codificam cerca de 4.000 proteínas. As bactérias são geneticamente flexíveis e podem trocar DNA por meio de conjugação. No laboratório, eles podem absorver DNA do ambiente se tratados com cátions divalentes como magnésio e cálcio (transformação). Há evidências de que eles também podem absorver DNA exógeno em seu habitat natural no intestino. Existem vários vírus DNA bacterianos (bacteriófagos) que podem infectar E. coli. Esses vírus podem transferir DNA entre bactérias. A versatilidade genética e a facilidade de trabalhar com E. coli a tornaram um organismo modelo em laboratório por mais de 80 anos. Ele tem sido usado para muitos estudos de fisiologia e genética bacteriana. Por ser tão bem compreendido, também é um organismo favorito para ser usado como veículo para DNA clonado.

Cepas de E. coli

Existe um grande número de cepas de E. coli. As cepas de laboratório são um tanto atípicas quando comparadas às cepas isoladas do intestino de animais ou humanos ou do meio ambiente. As cepas naturais contêm mais genes do que as cepas de laboratório. Cerca de 2.000 genes constituem o genoma central, que consiste naqueles genes que qualquer cepa de E. coli deve ter para viver e crescer. O restante dos genes variam entre as cepas (há mais de 15.000 genes diferentes que foram encontrados em diferentes cepas) 1. Os genes encontrados em apenas algumas cepas incluem genes envolvidos na patogênese e na sobrevivência em um hospedeiro mamífero. Essa composição genética variável significa que diferentes cepas de E. coli causam diferentes doenças. Assim, existem E. coli diarreiogênica (DEC), E. coli uropatogênica (UPEC) e E. coli que causam meningite. Neste artigo, irei me concentrar nas cepas DEC.

Cepas diarreiogênicas de E. coli (DEC)

Os DEC vivem no intestino de muitos animais, incluindo vacas, veados e outros animais que pastam. A infecção por cepas que causam doenças em humanos pode ser assintomática em animais. As bactérias vivem no intestino e são excretadas nas fezes. A carne em fábricas de processamento pode ficar contaminada com DEC devido à contaminação da carne por bactérias do intestino do animal. No ambiente natural, o DEC excretado nas fezes precisa sobreviver e chegar a um novo hospedeiro. Uma estratégia de sobrevivência envolve a ligação das bactérias às superfícies das plantas. Quando a planta é comida por um hospedeiro em potencial, a bactéria entra e cresce no trato digestivo do hospedeiro. Os humanos são infectados pelo DEC ao comer carne ou plantas contaminadas. Nos últimos cinco anos nos EUA, o DEC foi transmitido por brotos de trevo, salada picada, alface romana, farinha, carne moída e bisão, manteiga de noz de soja e brotos de alfafa. Os surtos de doenças resultantes resultaram em recalls dos produtos contaminados, sempre que possível, resultando em perdas econômicas.

Casos estimados de DEC, hospitalizações e mortes resultantes nos EUA. 2 Casos estimados de DEC e resultantes e óbitos em todo o mundo3

A doença causada por DEC é relatada pelo US CDC (Center for Disease Control) em quatro categorias: cepas que carregam o gene da toxina Shiga (STEC), uma cepa particularmente virulenta que carrega o gene da toxina Shiga e vários outros genes de virulência (O157: H7), cepas que carregam genes para outras toxinas (ETEC) e outras cepas de DEC. Em países em desenvolvimento com sistemas de purificação e saneamento de água pobres ou nenhum, o DEC pode se espalhar facilmente de pessoa para pessoa pela via fecal-oral e causar grandes surtos de doenças. O número estimado de casos, hospitalizações e mortes causadas por cada um dos grupos de cepas anualmente nos EUA e em todo o mundo é mostrado nas tabelas. Como acontece com todas as doenças diarreicas, as infecções por DEC são mais graves em bebês e idosos.

Olhando para a frente

Este é o primeiro de uma série de artigos. Artigos futuros considerarão a transmissão e redução de DEC e uma pesquisa de patógenos humanos transmitidos por plantas.


Resultados

Avaliação da temperatura de pré-indução

O recombinante E. coli BL21 (DE3) Star ™ / pAE / LigB (131-645aa) foi cultivado a 28 ° C e 37 ° C, e monitorado por absorbância a 600 nm a cada 30 min com vistas à obtenção de curvas de crescimento para essas temperaturas e avaliação da especificidade taxas de crescimento na fase exponencial. Pode-se observar na Figura 2 (a) e nos cálculos das taxas de crescimento específicas nas fases de crescimento exponencial que a taxa máxima de crescimento a 28 ° C (μmax = 0,62 h -1) foi cerca de 40% menor do que a taxa de crescimento obtida no ótimo E. coli temperatura de crescimento de 37 ° C (μmax = 1,05 h -1). Demorou 1 h 50 min para atingir a absorbância de 0,75 (fase exponencial inicial) a 37 ° C, enquanto que levou 3 h para atingir a mesma absorbância a 28 ° C. A 37 ° C, a célula foi cultivada por 4,5 h até atingir a absorbância em 600 nm em torno de 4, enquanto levou 6 h para atingir esse crescimento celular a 28 ° C, conforme mostrado na Figura 2 (a). A 37 ° C, μmax de 1,05 h -1 foi mantida até 3 h de crescimento, com absorbância (medida a 600 nm) em torno de 2, quando as células atingiram a fase final de crescimento exponencial.

Curvas de crescimento de E. coli BL21 (DE3) Star ™ / pAE / LigB (131-645aa). (uma) Crescimento celular a 37 ° C e 28 ° C em TB a 200 rpm (erros na absorbância medidos a 600 nm entre 1 e 2%). (b) Comparação entre crescimento não induzido e induzido por IPTG a 28 ° C. A indução foi realizada por 4 h após IPTG ter sido adicionado (equivalente a 7 h de processo) em Absind = 0,75 (o tempo em que IPTG 0,55 mM foi adicionado é indicado por uma seta no processo de 3 h). Conforme indicado na escala, a indução de 1 h foi alcançada após o processo de 4 h, a indução de 2 h após o processo de 5 h e a indução de 3 h após o processo de 6 h, respectivamente.

Em duas outras execuções, as bactérias foram cultivadas a 28 ° C e 37 ° C até a absorbância atingir 0,75, momento em que IPTG foi adicionado para induzir a expressão da proteína recombinante LigB (131-645aa). Em ambos os experimentos, a temperatura pós-indução foi mantida a 28 ° C por 4 h, enquanto a absorbância foi monitorada a 600 nm e o nível de expressão foi verificado a cada hora usando SDS-PAGE. No experimento conduzido a 28 ° C (antes e depois da indução com IPTG), uma queda de mais de 60% na taxa de crescimento de bactérias foi identificada após a indução com IPTG (de 0,62 h -1 a 0,24 h -1) (Figura 2b ) A redução da taxa de crescimento após a indução pode ter sido causada pelo efeito tóxico do IPTG e / ou a carga metabólica imposta às células devido à expressão de genes heterólogos ou toxicidade de proteínas [19-24].

Quando a cinética de expressão de LigB (131-645aa) a 28 ° C foi comparada para os ensaios usando diferentes temperaturas de pré-indução (28 ° C e 37 ° C), não foi encontrada diferença significativa entre o crescimento obtido sob os dois após indução com IPTG, nem entre os níveis de expressão obtidos em 4 h (Tabela 1).

Como a taxa de crescimento específico durante a fase de pré-indução foi maior a 37 ° C, o processo foi conduzido inicialmente a 37 ° C (temperatura ideal para E. coli crescimento), e apenas na fase de indução a temperatura foi reduzida para 28 ° C (temperatura ótima para a expressão de LigB (131-645aa) em E. coli) Para a avaliação do efeito da indução de IPTG na fase exponencial, a cultura levou cerca de 3 h a 37 ° C para atingir absorbância próxima a 2 (maior concentração de células na qual o μmax é mantido constante, ou seja, o final da fase de crescimento exponencial). A mesma absorbância levou quase 5 h com crescimento a 28 ° C, o que reduziria a produtividade do processo.

Expressão de LigB recombinante usando projeto experimental para avaliar o crescimento celular para indução (Absind) e concentração de IPTG

Diferentes condições experimentais foram testadas para variar a absorbância para a indução da expressão do LigB (131-645aa) recombinante e a concentração de IPTG, usando um projeto composto central para duas variáveis. E. coli BL21 (DE3) Star ™ foi cultivado a 37 ° C e 200 rpm até que a fase exponencial foi atingida (Absind de entre 0,75 e 2,0), ponto em que IPTG (entre 0,1 mM e 1 mM) foi adicionado para a expressão de LigB recombinante (131-645aa) a 28 ° C durante 4 h.

As bandas do extrato proteico total, fração solúvel e fração insolúvel analisadas em gel foram normalizadas pelo crescimento celular medido pela absorbância a 600 nm, conforme descrito em Métodos. As bandas SDS-PAGE são semelhantes para todos os Absind e as concentrações de IPTG testadas, indicando que a expressão normalizada pelo crescimento celular não dependia dessas variáveis. Em todas as condições testadas, LigB (131-645aa) foi obtido em sua forma solúvel no tampão de lise (20 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) com cerca de 15% da proteína total expressa em seu insolúvel fração em todas as condições testadas, exceto no ensaio 4 (em Absind 2,0 e 1 mM de IPTG) onde a fração insolúvel foi maior, próxima a 35% da proteína total expressa. As análises SDS-PAGE realizadas para avaliar a expressão de LigB (131-645aa) normalizada pelo crescimento celular e solubilidade por densitometria são mostradas na Figura 3. Os resultados do crescimento celular e a expressão de LigB (131-645aa) na fração solúvel são mostrados na Tabela 2

SDS-PAGE com induzido e não induzido por IPTG E. coli BL21 (DE3) Star / pAE/Amostras de LigB (131-645aa) normalizadas por absorbância a 600 nm do ensaio 3 (Abs ind = 2,0 e IPTG 0,1 mM), extrato de proteína total separado em frações solúveis e insolúveis de proteína recombinante em Tris 20 mM / EDTA 1 mM / Triton X-100 0,1% (pH8). Não induzido = não induzido Ind = TE induzido = Extrato total.

Nos ensaios 1 e 2, induzido em Absind = 0,75, as células cresceram por 1 h 45 min e 1 h 50 min, respectivamente, a 37 ° C antes da indução as células cresceram por 2 h 45 min e 3 h nos ensaios 3 e 4 (Absind = 2,0), respectivamente. Nos pontos centrais, as células cresceram por 2 h 15 min para que a absorbância atingisse 1,4 cada. Esses tempos de crescimento celular em cada experimento antes da adição do indutor foram adicionados ao tempo de indução de 4 h para os cálculos de produtividade mostrados na Tabela 2.

No que diz respeito ao crescimento celular no qual LigB (131-645aa) deveria ser induzido, verificou-se que havia um aumento significativo no crescimento celular e na expressão de proteína recombinante quando Absind 0.75 was compared with 2.0, while the IPTG concentration was kept the same (Table 2). In assays 1 and 3, where induction was done at 0.75 and 2.0, respectively, and the IPTG concentration was the same (0.1 mM), cell growth of 0.95 and 1.6 g (dry cell)/L was obtained (respectively 3.75 and 6.33 in terms of absorbance at 600 nm) while 180 mg/L and 288 mg/L LigB (131-645aa) was expressed, representing around 70% higher cell growth and 60% higher protein expression. When assays 2 and 4 are compared, where induction with 1 mM IPTG was made at different absorbances, cell growth and LigB (131-645aa) expression were also found to be higher when the Absind was higher. When the concentration of inducer was varied, the comparison of assays 1 and 2 (Absind 0.75) and the comparison of assays 3 and 4 (Absind 2.0) show that cell growth and LigB (131-645aa) expression were both higher at 0.1 mM (Table 2), although the difference was lower than when the cell concentration was varied at induction. The productivity data (amount of expressed target protein per volume of bacterial culture per process time) indicated that at the lower concentration of IPTG (0.1 mM), expressing the target protein at Absind 2.0 was better.

In the analysis of the triplicate at the central point (Absind = 1.4 and 0.55 mM IPTG), the errors associated with each of the response variables were assessed by calculations of means and their respective standard deviations, resulting in 1.15 ± 0.05 g (dry cell)/L for cell growth (equivalent of 4.61 ± 0.20 measured by absorbance at 600 nm), and 207 ± 8 mg/L for the yield of soluble LigB (131-645aa) expressed, while productivity was found to be 33.2 ± 1.3 (mg/L)/h. The errors calculated for the intermediate Absind and IPTG conditions, in triplicate (Central Points 1-3), were lower than 5%. The errors in the data obtained from the densitometry analysis that were used to calculate protein expression were found to be around 8%.

There was no significant reduction in the pH at the end of the experiments, as they were buffered with potassium salts in the TB medium (Table 2). The final pH at the central points was measured at around 6.6 ± 0.1 (errors of less than 1%). The glucose uptake after the 4 h induction period was found to be 30-50% of the initial concentration (9-10 g/L confirmed by the enzyme colorimetric method used) (Table 2). This indicates that the initial glucose concentration could have been lower. The assessment of the central point indicated the error in the glucose measurements to be around 12%, averaging 5.8 ± 0.7 g/L. The experiments that resulted in the greatest drop in pH and the greatest glucose uptake were the ones that yielded the highest cell growth.

Experimental design techniques were developed so that the maximum of process information could be gathered using the smallest number of experiments. Experimental design techniques usually rely on empirical model structures in order to interpret experimental data and provide optimal process operation conditions [23]. The linear effects and the effect of the interaction between Absind and IPTG concentration (x1 e x2 for codified variables, respectively) on cell growth (in g (dry cell)/L), the yield of expressed soluble LigB (131-645aa) (mg/L) and productivity ((mg/L)/h) can be described by linear models obtained by the statistical analysis with 95% confidence level (p < 0.05 for statistically significant parameters), according to the equations below (in terms of codified variables):

Experimental and model data for each experiment were compared in order to check if the models are realist (shown in Table 2). The relative errors confirmed the models were representative of the experimental data. The correlation coefficients (R 2 ) obtained were around 0.98 and Fcal> > Faba in the F-test analysis of variance (ANOVA), shown in Table 3, indicating that the models are statistically significant and predictive.

The models were evaluated by the correlation coefficients R 2 and ANOVA, demonstrating that they represent the experimental data (good agreement between the experimental values and the values predicted by the models) as such, the response surfaces could be obtained from the models. The response surfaces for cell growth and soluble LigB (131-645aa) productivity can be seen in Figure 4, where the linear effects of Absind and IPTG and the effect of their interactions on the response variables can be assessed.

Model representation for the effects of Abs ind and IPTG on (a) cell growth measured at 600 nm (Abs 600nm ) and (b) LigB (131-645aa) productivity ((mg/L)/h) in E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE.

The models indicate that the growth of E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE/LigB (131-645aa) (measured by absorbance at 600 nm and converted to g (dry cell)/L), the yield of soluble protein (mg/L) at the end of 4 h induction and the productivity of the process taken as a whole, in (mg/L)/h, were influenced both by the cell growth at which protein expression was induced by IPTG, and by the concentration of the inducer. It was also found that the interaction between the two variables, Absind and IPTG, had a significant effect on soluble LigB (131-645aa) expression: the concentration of IPTG that yielded increased protein production depended on the cell growth when induction was begun. The interaction between these two variables did not have a statistically significant effect only on cell growth, since p > 0.05 for this parameter. The statistical analysis for the densitometry values of the bands corresponding to the soluble fractions in SDS-PAGE (that means the soluble expression of LigB (131-645aa) normalized by cell growth) indicated that both Absind and IPTG concentration had no statistical influence on this response, as all the effects resulted in p & gt 0,05.

The data on soluble LigB (131-645aa) expression indicated that productivity was improved when 0.1 mM IPTG was used (lower inducer concentration) and when the highest absorbances were reached for induction at the final exponential growth phase, keeping the maximum specific growth rates (Absind 2.0). Induction at Absind 2.0 resulted in a higher level of expression of the recombinant protein (positive effect of this parameter on soluble LigB (131-645aa) expression yield and productivity). Comparing with the assay when Absind was 0.75 (early exponential phase) and IPTG was 1 mM, cell growth increased by almost 100% while soluble LigB (131-645aa) expression rose by around 50%, even though the process time was increased because induction was done at a higher absorbance at the exponential phase. The IPTG concentration was reduced to the lowest value because had a negative effect on cell growth, the final yield of soluble LigB (131-645aa) obtained, and the overall productivity of the process. The data therefore indicated that the best concentration of IPTG for expression was 0.1 mM.

The condition that produced the higher yield and productivity of soluble LigB (131-645aa) in E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE was confirmed in shaking flasks by inducing protein expression at the final exponential growth phase using the minimum inducer concentration. The expression results for the triplicate in shaking flasks at Absind 2.0 and 0.1 mM IPTG (equivalent to assay 3 presented in Table 2), 28°C, for 4 h induction in TB medium were: 1.5 ± 0.1 g (dry cell)/L (equivalent to 5.9 ± 0.4 measured by absorbance at 600 nm) for cell growth, yield of 272 ± 6 mg/L for LigB (131-645aa) expression, and 40.4 ± 0.9 (mg/L)/h for productivity.

Correlation between cellular growth and protein expression yield

In order to check whether the expression of soluble LigB (131-645aa) was proportional to cell growth, a linear correlation was performed using the experimental design results (Figure 5). The equation: mg/L = 181 (g dry cell)/L, with a linear correlation coefficient (R 2 ) of 0.9, was obtained, indicating that the soluble expressed LigB (131-645aa) was proportional to cell growth with a yield factor YP/X of 181 mg/g (dry cell). When it came to protein production in milligrams per liter of culture at Abs600nm of 1, the yield factor was 45.3 mg/L per absorbance measured at 600 nm, which indicates the same significance as the yield of product per unit of cell [25]. This finding indicates that the expression of soluble LigB (131-645aa) in the conditions tested in this work in terms of mg L −1 Abs −1 was similar in all the experiments, with an error of around 10%. That is, LigB (131-645aa) expression per cell in terms of mg L −1 Abs −1 obtained from the bands of the soluble fractions in the densitometry analysis was not statistically influenced by either of the variables (Absind and IPTG concentration), as already indicated before.

Correlation between soluble LigB (131-645aa) expression (mg/L) in E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE and cell growth measured at 600 nm (Abs 600nm). The linear correlation is mg/L = 181 (g dry cell)/L or mg/L = 45.3 Abs600nm, that is, (mg L -1 )/Abs600nm = 45.3 = YP/X.

Expression of LigB protein in microbioreactor and purification by IMAC

The condition for soluble LigB (131-645aa) expression at the end of exponential growth phase and 0.1 mM IPTG was also performed using Biopod microbioreactors. A cell growth curve was run in the Biopod microbioreactors at 37°C in TB medium without induction of E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE/LigB (131-645aa) and the exponential phase was reached after 1 h, corresponding to an absorbance at 600 nm of 6. The exponential growth phase was verified until the absorbance of 12 and the final absorbance was around 18 after 6.5 h. This growth was due to high rate of aeration caused by the dispersion of air through microbubbles [18].

The maximum specific growth rate at 37°C (μmax de 0.69 h -1 ) was maintained until the bacteria reached absorbance 12. At this point, the cells were induced with 0.1 mM IPTG, as suggested by the experimental design performed in shaking flasks. The specific growth rate of the bacteria was found to be 0.3 h -1 after induction with IPTG at 28°C (25% improvement over the specific growth rate of 0.24 h -1 obtained in shaking flasks). Cell grew until 18.8 ± 1.2 (measured by absorbance at 600 nm) after 4 h induction. The results for densitometry of soluble protein bands showed a yield of 970 ± 174 mg/L and a final productivity of 157.4 ± 28.2 (mg/L)/h. The soluble fraction of the protein was around 77% of the total LigB (131-645aa) expressed in this condition. Cell growth, expression levels and productivities were greater than in shaking flasks due to more efficient aeration in the microbioreactor [18].

Protein purification was performed by IMAC and eluted with 300 mM imidazole, as shown in Figure 6. LigB (131-645aa) band evaluated by gel densitometry was equivalent to 25-27% of the total E. coli protein lysate obtained in microbioreactor (Figure 6). Purified LigB (131-645aa) was obtained in a final concentration of 260 mg/L medium culture with 91% homogeneity (10% error).

SDS-PAGE results from protein purification obtained with 300 mM imidazole elution by IMAC. The lysate fraction contains 25-27% LigB (131-645aa) and flow-through contains proteins without binding, leading to enrichment of the protein of interest in the last gel lane.


Mechanisms of microbial growth

Microbial growth refers to an increase in number of cells rather than an increase in cell size. Many microbes (including Escherichia coli, Salmonella enterica, e Listeria monocytogenes) are unicellular, meaning they are made of only one cell. The size of any unicellular microbe is limited by the capacity for the essential components of the cell to support its survival. For example, the integrity of the cell wall is impaired when cells become too large. The solution to growing despite limits on cell size is for cells to divide or produce new cells from the original cell. Therefore, the population grows although the size of the individual members of the population remains stable.

Most commonly, a single-cellular microbe divides into two identical new cells during one growth cycle (Figure 3a). The original cell, called the parent cell, makes a copy of its DNA and generates enough material to build the membrane, wall, and molecular machines for two cells. The parent cell slightly increases in size to accommodate these additional materials. Then, the parent cell begins to contract at the middle and a new piece of cell wall is assembled at the site of contraction. This process continues until the parent cell is split into two cells with complete cell walls. The resulting cells are called the daughter cells. Because both daughter cells are identical, cell division is also called replication. Replication in this manner leads to a rapid increase in the number of cells as each daughter cell begins the cycle again by acting as a parent cell. Cell division can look slightly different for microbes with different shapes (Figure 3b), but the key principles remain the same.

As long as the conditions are favorable, one cell produces two new cells in a continuous cycle. Every cycle doubles the number of cells in the population. This is known as exponential growth. Depending on the conditions, the division cycle of E. coli can be as short as 20 minutes. This rapid division leads to a rapid increase in the population size (Figure 3c). Eventually, the population is large enough to have an impact we can detect, such as formation of a physical structure. In a research lab, this might be a “colony,” a mound of bacteria on solid growth media. You might notice this as plaque on your teeth. It takes over a million bacteria to form a visible structure, but this can occur in only about eight hours when conditions are optimal for E. coli.

Figure 3: The population increases exponentially as cells divide. Microbes with different shapes divide similarly.

Some microbes produce new cells asymmetrically. In this situation, one parent cell produces a single daughter cell by a process called budding. During budding the parent cell develops a small protrusion known as the bud. The materials necessary to support a new cell are sent into the bud, which eventually splits from the parent cell to form a new daughter cell. The parent cell continues to make buds, but the budded daughter cells do not divide. Buds can remain connected in a chain or separate into individual cells (Figure 4). Saccharomyces cerevisiae, a yeast used to make bread, is a budding yeast.

There are also multicellular microbes, like algae and the fungi that form molds. For these microbes, multiple cells work together to keep the organism alive. Each cell might perform slightly different functions for the organism. When a parent cell divides, each daughter cell begins to perform specific functions based on its surroundings. The entire organism grows as new cells form and take on new functions. This is similar to the way larger organisms, like animals, grow.

Figure 4: Some cells use budding to produce daughter cells. A parent cell produces small protrusions called buds.


Procedimento

Part 1: Preparing Strain 4-1 and 4-2 for transformation

  1. In advance of lab today, a small patch of each strain was grown for you on an LB agar petri dish. A video of this procedure is here.Strain 4-1 is a K-12 type of E. coli. Strain 4-2 is a B-type strain.
  2. Label 2 small eppendorf tubes either "4-1" or "4-2".
  3. Pipet 200 ul of CaCl2 solution into each eppendorf and then place the tubes on ice.
  4. Use a sterile wooden dowel to scrape up one entire patch of cells (NOT including the agar that they're growing on!) labeled "4-1," and then swirl the cells into its tube of cold CaCl2. A small bit of agar can get transferred without consequence to your experiment, but remember you're trying to move the cells to the CaCl2, not the media they're growing on. If you have a vortex, you can resuspend the cells by vortexing very briefly. If no vortex is available, gently flick and invert the eppendorf tube, then return it to your icebucket.
  5. Repeat, using a different sterile wooden dowel to scrape up the patch of cells labeled "4-2." Vortex briefly if possible. It's OK for some clumps of cells to remain in this solution.
  6. Keep these competent cells on ice while you prepare the DNA for transformation.

Part 2: Transforming Strains 4-1 and 4-2 with pPRL and pGRN

The cells you've prepared will be enough to complete a total of 6 transformations. You will transform the purple-color generator into each strain, and also the green-color generator into each strain. You will also use the last bit of competent cells as negative controls for the transformation.
A video of this procedure is here.

  1. Retrieve 2 aliquots of each plasmid for a total of 4 samples (2x pPRL, 2x pGRN). Each aliquot has 5 ul of DNA in it. The DNA is at a concentration of 0.04 ug/ul. You will need these values when you calculate the transformation efficiency at the end of this experiment.
  2. Label one of the pPRL tubes "4-1." Label the other pPRL tube "4-2." Be sure that the labels are readable. Place the tubes in the ice bucket.
  3. Label one of the pGRN tubes "4-1." Label the other pGRN tube "4-2." Be sure that the labels are readable. Place the tubes in the ice bucket.
  4. Flick the tube with the competent 4-1 strain and then pipet 75 ul of the bacteria into the tube labeled "pPRL, 4-1" and an additional 75 ul into the tube labeled "pGRN, 4-1." Flick to mix the tubes and return them to the ice. Save the remaining small volume of the 4-1 strain on ice.
  5. Flick the tube with the competent 4-2 strain and then pipet 75 ul into the tube labeled "pPRL, 4-2" and an additional 75 ul into the tube labeled "pGRN, 4-2." Flick to mix and store them, as well as the remaining volume of competent cells, on ice.
  6. Let the DNA and the cells sit on ice for 5 minutes. Use a timer to count down the time.
  7. While your DNA and cells are incubating, you can label the bottoms (not the tops) of the 6 petri dishes you'll need. The label should indicate the strain you've used ("4-1" or "4-2") and the DNA you've transformed them with ("pPRL," "pGRN," or "no DNA control")
  8. Heat shock all of your DNA/cell samples by placing the tubes at 42° for 90 seconds exactly (use a timer). This step helps drive the DNA into the cells and closes the porous bacterial membranes of the bacteria.
  9. At the end of the 90 seconds, move the tubes to a rack at room temperature.
  10. Add 0.5 ml of room temperature LB to the tubes. Close the caps, and invert the tubes to mix the contents.
  11. Using a sterilized spreader or sterile beads, spread 250 ul of the transformation mixes onto the surface of LB+ampicillin agar petri dishes. A video of the procedure is here.
  12. If desired the remaining volumes of transformation mixes can be plated on LB plates to show the effect of antibiotic selection on the outcome.
  13. Incubate the petri dishes with the agar side up at 37° overnight, not more than 24 hours.

Next day

In your lab notebook, you will need to construct a data table as shown below. These may be provided. Also be sure to share your data with the BioBuilder community here.