Em formação

Causas do comportamento estocástico de canais iônicos dependentes de voltagem


Eu vim com o seguinte modelo eletromecânico de um canal de íon ativado por voltagem, resp. de seu sensor de tensão, conforme descrito aqui e aqui. O sensor de tensão é um sistema biestável com dois mínimos de energia local $ E_1 (V) $, $ E_2 (V) $, o primeiro indicando "fechado", o segundo "aberto":

De Bezanilla, The Voltage Sensor in Voltage-Dependent Ion Channels, p. 567.
Você pode explorar interativamente uma superfície de energia dependente de voltagem aqui (esquematicamente).

Criei um modelo de mola com Algodoo que se parece com isto (verde: o sensor de voltagem (= uma subunidade peptídica), molas brancas: mantenha no lugar, azul: favorece o estado fechado, vermelho: simula voltagem, abre o portão):

(Você pode baixar o modelo aqui e explorá-lo interativamente com o Algodoo.)

Para se comportar estocasticamente - ou seja, a probabilidade de estar aberto $ p (V) sim e ^ {- Delta Q (V) / kT} $ que pressupõe um equilíbrio térmico - deve haver flutuações que podem levantar o sistema acima da barreira de energia entre os dois mínimos de energia.

Minha pergunta diz respeito à origem dessas flutuações no canal de íons real: são estas flutuações térmicas (mecânicas) (por exemplo, outras moléculas que atingem ou rasgam o sensor) ou são estas flutuações do potencial de membrana?


As flutuações surgem da energia térmica e podem ser descritas pela equação de Eyring


Quando os neurotransmissores se ligam aos seus receptores, canais iônicos em resposta neurônio ou células musculares abertas. O influxo resultante de íons Na + interrompe o potencial de repouso da célula-alvo. O efeito é apenas transitório se o potencial de membrana permanecer negativo. No entanto, se uma quantidade suficiente de íons Na + entrar na célula, a membrana torna-se despolarizada. Se a célula experimentar hiperpolarização, um localizado reversão da polaridade normal da membrana (digamos de & ndash70 mV a + 65mV ou mais) irá gerar um potencial de acção. Este potencial de ação irá viajar como uma corrente ao longo da membrana da célula neural ou muscular, eventualmente desencadeando uma resposta fisiológica, por exemplo, a excitação da próxima célula nervosa em uma via neuronal ou contração da célula muscular. o patch-clamp dispositivo detecta fluxo de íon específico e qualquer mudança resultante na diferença de potencial através da membrana. Os princípios de medição de patch-clamp são ilustrados abaixo.

No exemplo acima, fechar o interruptor na fonte de alimentação envia uma carga elétrica para a célula, abrindo canal iônico controlado por voltagem. Nesse caso, um sensor de potássio no dispositivo detecta o fluxo de íons K + através do canal e para fora da célula. Ao mesmo tempo, um voltímetro registra a mudança resultante no potencial da membrana.

Além dos canais de íons dependentes de voltagem, o dispositivo patch clamp pode medir o fluxo de íons através canais de íons controlados por ligante e canais iônicos mecanicamente controlados.

Os canais anteriores são portas receptor-íon que se abrem quando se ligam a uma molécula efetora. Canais iônicos mecanicamente controlados detectar fisico pressão ou estresse que resulta em uma deformação da membrana local, abrindo o canal.

Finalmente, as células mantêm uma alta concentração intracelular de íons K +, fazendo com que os íons K + vazem lentamente da célula, um fenômeno detectável por um patch-clamp. A presença de íons negativos (Clions, íons orgânicos) dentro de uma célula limita o vazamento. Isso cria o interior eletronegativo de uma célula em relação ao exterior da célula, ou seja, o potencial de repouso através de sua membrana plasmática. A técnica patch-clamp tem sido usada para correlacionar o fluxo de íons e as mudanças no potencial da membrana quando um neurônio dispara, causando um potencial de ação em uma célula que responde.

Essa correlação é descrita na próxima página. Na ilustração, acompanhe a abertura e o fechamento dos canais iônicos e o fluxo dos íons. Um potencial de ação (na verdade, qualquer mudança do potencial de repouso) resulta da difusão facilitada de íons específicos para dentro ou para fora da célula através de canais iônicos controlados (verde, acima) que devem abrir e fechar em sequência. O comportamento de dois diferentes canais iônicos dependentes de voltagem são ilustrados no gráfico. A estimulação elétrica abre os canais de Na +. Os íons Na + invadem a célula, reduzindo o potencial de membrana do estado de repouso para zero, ou mesmo tornando o citoplasma mais positivo do que o líquido extracelular. Se a inversão da polaridade for alta o suficiente, um K + voltagegado se abre e íons de potássio invadem a célula, restaurando o potencial de repouso da célula.

Uma célula pode continuar a responder a estímulos com potenciais de ação enquanto houver Na + suficiente fora da célula e K + dentro da célula. Embora o transporte ativo de Na + e K + não seja necessário para restabelecer o potencial de repouso, será necessário restaurar o equilíbrio dos dois íons na célula. Se uma célula nervosa ou muscular disparar várias vezes (ou mesmo se apenas vazar íons), o [K +] dentro da célula e o [Na +] fora da célula cairia a um ponto onde a célula não pode gerar um potencial de ação quando estimulado. Em última análise, é papel das bombas de Na + / K + dependentes de ATP restaurar o equilíbrio apropriado de Na +: K + através da membrana celular que responde. Como vimos, cada ciclo de bombeamento troca 3 íons Na + do espaço intracelular por 2 íons K + do espaço extracelular. A bomba tem dois efeitos:

  • Ele restaura as concentrações de Na + no espaço extracelular em relação ao citoplasma.
  • Ele restaura as concentrações de K + no citoplasma em relação ao espaço extracelular.

Junto com as maiores concentrações de íons negativos no citosol, a troca desigual de Na + por íons K + mantém o potencial de repouso da célula a longo prazo e garante que as células nervosas e musculares permaneçam excitáveis. A seguir, examinaremos mais de perto a função de ambos fechado por ligante e controlado por voltagem canais iônicos na neurotransmissão.

B. Canais de íons em neurotransmissão

Os potenciais de ação resultam em uma abertura e fechamento ordenado e sequencial de Voltagem- e fechado por ligante canais ao longo do axônio neuronal. No link abaixo, você pode ver o ciclo sequencial de canais dependentes de voltagem que propagam um potencial de ação localizado (despolarização da membrana) ao longo de um axônio em direção a uma sinapse.

Quando uma despolarização propagada atinge uma sinapse, os canais iônicos abrem ou fecham no neurônio e na célula respondente. A cooperação de canais dependentes de voltagem e ligante em uma junção neuromuscular é ilustrada abaixo.

Como você pode ver na ilustração, depois que um neurônio dispara, um impulso elétrico (uma região móvel de hiperpolarização) viaja pelo axônio até a terminação nervosa. Na terminação nervosa, a diferença de carga de deslocamento (potencial elétrico) através da membrana celular estimula um Ca ++ específico canal controlado por voltagem abrir. Os íons Ca ++ então fluem para a célula porque estão em concentrações mais altas no fenda sináptica do que no citoplasma.

Os íons Ca 2 + na célula fazem com que as vesículas sinápticas se fundam com a membrana na terminação nervosa, liberando neurotransmissores na fenda sináptica. Em seguida, os neurotransmissores se ligam a um receptor na membrana plasmática da célula que responde. Este receptor é um canal fechado por ligante (também chamado de canal quimicamente fechado) Após a ligação do ligante neurotransmissor, o canal se abre. A rápida difusão dos íons Na + na célula cria um potencial de ação que leva à resposta celular, neste caso, a contração muscular. Já vimos que os canais de K + participam na restauração do potencial de membrana após um potencial de ação, e o papel da bomba de sódio / potássio na restauração do equilíbrio celular Na + / K +.


Causas do comportamento estocástico de canais iônicos dependentes de voltagem - Biologia

Canais iônicos na medicina

Frank Lehmann-Horn e Karin Jurkat-Rott, Instituto de Fisiologia Aplicada, Universidade de Ulm, Ulm, Alemanha

Nossa compreensão atual dos canais iônicos foi possibilitada por técnicas como eletrofisiologia e biologia molecular, mas abordagens baseadas na genética inspiradas por doenças associadas apontaram para regiões de significância funcional nos canais iônicos. As canalopatias iônicas são causadas por mutações de genes ou autoanticorpos correspondentes. Embora os canais formem um grupo altamente diverso (cátion, ânion, dependente de voltagem, regulado por ligante) e sejam expressos em tecidos excitáveis ​​e não excitáveis, mutações subjacentes mostram padrões recorrentes em partes de proteínas funcionalmente essenciais e levam a características clínicas comuns e mecanismos quase previsíveis da patogênese. Este conhecimento será útil para o desenvolvimento de estratégias de tratamento para indivíduos com várias origens genéticas e contribuirá para a eficácia e segurança de medicamentos no futuro.

A química das soluções aquosas da vida emprega íons como portadores de sinais celulares. Para superar a membrana impermeável da bicamada lipídica, a célula inventou transportadores, canais e bombas. Gradientes de íons são estabelecidos por bombas e servem como baterias de energia potencial. Os canais iônicos são proteínas que atravessam a membrana e possuem um filtro de seletividade e um poro que geralmente é fechado por portas no estado de repouso. A descarga ocorre quando os canais iônicos abrem suas portas e permitem que os íons fluam por seus gradientes eletroquímicos. As células despolarizam quando os cátions se difundem para dentro ou quando os ânions se difundem para fora, as células se repolarizam quando ocorre o oposto. O controle preciso da abertura e fechamento do canal é necessário para a excitabilidade celular adequada e para a produção de sinais elétricos e, particularmente, dos potenciais de ação dos nervos e músculos. Estruturas importantes como poros, filtros de seletividade, sensores de voltagem, sítios de ligação de ligantes e portas de abertura e fechamento foram altamente conservadas por mais de 600 milhões de anos. Portanto, não é surpresa que uma alteração dessas estruturas funcionalmente importantes possa causar uma doença. As manifestações clínicas episódicas são provocadas por fatores ambientais e causadas por excitabilidade celular anormal, enquanto as manifestações progressivas que ocorrem em algumas doenças (paralisia periódica, epilepsia, ataxia e nefrocalcinose) são causadas por degeneração celular secundária.

Canais iônicos em doenças

A ligação com a doença humana veio da aplicação de medições eletrofisiológicas in vitro em células musculares doentes. Esses estudos mostraram que um mau funcionamento do canal iônico pode causar uma doença (1, 2). Posteriormente, o termo canalopatias iônicas foi introduzido para definir essa classe de doenças caracterizadas por aumento ou diminuição da excitabilidade elétrica celular (3).

A maioria das canalopatias conhecidas até o momento não leva à morte, mas requer uma situação anormal, um chamado gatilho, para apresentar sintomas reconhecíveis. Freqüentemente, as crises podem ser provocadas pelo repouso após a atividade física ou pelos próprios exercícios, hormônios, estresse e certos tipos de alimentos. A maioria das canalopatias tem um certo padrão clínico em comum: Normalmente, os sintomas ocorrem como ataques episódicos com duração de minutos a dias que mostram remissão espontânea e completa, início na primeira ou segunda década de vida e - por motivo desconhecido - mostram melhora no idade de 40 ou 50 anos. Surpreendentemente, muitos pacientes com canalopatias respondem à acetazolamida, um inibidor da anidrase carbônica. A maioria das canalopatias não mostra progressão crônica, entretanto, existem algumas exceções. As canalopatias são causadas por mutações ou por autoanticorpos. Embora raros, são modelos importantes para distúrbios frequentes.

Como as canalopatias hereditárias formam um grupo de doenças muito diversas para serem discutidas nesta breve revisão, nos referimos à Tabela 1. Além disso, iremos descrever em mais detalhes algumas doenças do maior grupo de canalopatias catiônicas dependentes de voltagem hereditárias, os canalopatias de Na + bloqueadas do músculo esquelético, cérebro e coração. Além disso, daremos um exemplo para uma canalopatia catiônica controlada por ligante autoimune e uma canalopatia aniônica.

Tabela 1. Visão geral das canalopatias humanas hereditárias *

Enxaqueca hemiplégica familiar 3

Família benigna neonatal / infantil

Paralisia periódica hipercalêmica

Paralisia periódica hipocalêmica 2

Fibrilações Ventriculares Idiopáticas,

Eritromialgia, extrema paroxística

Paralisia periódica hipocalêmica 1

Ataxia episódica 2, ataxia espinocerebelar 6

Enxaqueca hemiplégica familiar 1

Cegueira noturna estacionária congênita

Epilepsia generalizada, ataxia episódica 3

Suscetibilidade à hipertermia maligna

Doença do núcleo central, doença multiminicore

Taquicardia polimórfica catecolinamérgica

Doença renal policística, proteína como Cav

Síndrome de LQT induzível, fibrilação atrial

Convulsões neonatais familiares benignas

Variante pré-natal de Bartter

Síndrome do QT curto, fibrilação atrial

Epilepsia, discinesia paroxística

Canais catiônicos menos seletivos

Síndrome epiléptica idiopática

Receptor nicotínico de acetilcolina

Síndrome miastênica congênita

Epilepsia noturna do lobo frontal

GEFS +, epilepsia de ausência com febre

convulsões, convulsões mioclônicas juvenis

G, ganho L, perda D, R dominante, recessivo.

* Os nomes dos genes e sua localização cromossômica são fornecidos nas colunas 1 e 2 e os nomes das proteínas correspondentes estão listados na coluna 3 para canais dependentes de voltagem (indicados por um “v” subscrito) e canais ligados por ligante. As colunas 4 e 5 listam as doenças e suas heranças. Os efeitos das mutações na função do complexo de canal são categorizados na coluna 6 como ganho ou perda de função. Ganho representa um ganho que leva a um bloqueio de despolarização. Em geral, as mutações de ganho de função exercem efeitos dominantes se dominam a função celular, enquanto as mutações de perda de função só causam herança dominante se o complexo de canal for multimérico (efeito negativo dominante) ou se o segundo gene não puder compensá-lo ( haploinsuficiência).

Bioquímica de canais de cátions controlados por voltagem

O motivo básico da subunidade do canal catiônico principal, a chamada subunidade, é uma associação tetramérica de uma série de seis segmentos a-helicoidais transmembrana, numerados S1-S6, conectados por ambos os loops intracelulares e extracelulares, os interlinkers (Fig. 1 ) A subunidade a contém o poro condutor de íons e, portanto, determina as características principais da seletividade de íons de transporte de complexo de canal de cátions, sensibilidade à voltagem, farmacologia e características de ligação para ligantes endógenos e exógenos. Embora para os canais de Ca 2+ e Na + a subunidade a consista em um momômero, os canais de K + formam homotetrâmeros ou heterotetrâmeros porque cada subunidade consiste em apenas um domínio com seis hélices transmembrana. As subunidades acessórias denominadas β, γ ou δ não compartilham um estrutura comum alguns têm um a vários segmentos transmembranares e outros são inteiramente intracelulares ou extracelulares. Funcionalmente, eles podem influenciar a expressão, o tráfego e o bloqueio do canal.

Os canais de cátions sensíveis à tensão têm pelo menos um estado aberto e pelo menos dois estados fechados, um a partir do qual o canal pode ser ativado diretamente (o estado de repouso) e outro a partir do qual não pode (o estado inativado). Isso implica que pelo menos duas portas regulam a abertura do poro, uma ativação e uma porta de inativação, ambas geralmente mediadas pela subunidade (. Embora a ativação seja um processo dependente da voltagem, a inativação e a recuperação do estado inativado são tempo dependente.

A sensibilidade à voltagem dos canais de cátions é transmitida pelos segmentos S4 que se pensa se moverem para fora na despolarização e na abertura do canal (4). Durante o fechamento do canal, nem todos os sensores de voltagem se movem para trás ao mesmo tempo, o que gera uma variedade de estados fechados que explicam a distribuição das mutações do sensor de voltagem para fenótipos nos canais de Na +. Acredita-se que o poro condutor de íons seja revestido pelos interligadores S5-S6 que contêm o filtro de seletividade. Embora a localização do portão de ativação possa estar dentro do poro, foi demonstrado que o portão de inativação está localizado em diferentes regiões dos canais de Na + e K +.

A estrutura cristalina de um canal esclareceu a base para a seleção de íons que podem passar pelo poro do canal aberto e o mecanismo pelo qual as proteínas do canal detectam mudanças na voltagem transmembrana que controlam os estados conformacionais aberto ou fechado do canal (5). Assim, as investigações das proteínas do canal iônico empregam a física fundamental para estudar a função das proteínas biologicamente críticas.

Figura 1. Canal de Na + controlado por voltagem e distúrbios associados. A subunidade a consiste em quatro domínios altamente homólogos (repetições I-IV) que contêm seis segmentos transmembrana cada (SI-S6). Os loops S5, loops S6 e os segmentos transmembranares S6 formam o poro seletivo de íons, e os segmentos S4 contêm resíduos carregados positivamente que conferem dependência de voltagem à proteína. Observe a pequena subunidade β modulatória. Mutações associadas a canalopatias são indicadas por abreviações convencionais de 1 letra para os aminoácidos substituídos.

Fisiologia dos canais de cátions controlados por voltagem

No potencial de repouso, a probabilidade de abertura de canais de cátions dependentes de voltagem é extremamente baixa, o que indica que muito poucos canais abrem aleatoriamente. A despolarização causa a ativação do canal, aumentando significativamente a probabilidade de abertura. Durante a despolarização mantida, a probabilidade de abertura é reduzida dependente do tempo e não dependente da voltagem pela inativação do canal, o que leva a um estado fechado a partir do qual os canais não podem ser reativados imediatamente. Em vez disso, os canais inativados requerem repolarização e um certo tempo para a recuperação da inativação. Por outro lado, a repolarização da membrana antes do processo de inativação desativará o canal (ou seja, a ativação reversa que leva ao estado de repouso fechado a partir do qual os canais podem ser ativados). Neste modelo simples e aproximativo, as transições de um estado para outro são possíveis em ambas as direções, o que permite também a transição do estado de repouso para o estado inativado na despolarização, bem como a recuperação da inativação através do estado aberto (para revisão, consulte a Referência ( 6)). As constantes de taxa para frente e para trás para as transições determinam as probabilidades dos vários estados do canal.

Canalopatias catiônicas hereditárias controladas por voltagem

As doenças hereditárias dos canais iônicos dependentes de voltagem cobrem os diversos campos da medicina, miologia, neurologia, cardiologia e nefrologia.Como os canais iônicos não vêm sozinhos, mas sim em famílias inteiras de proteínas relacionadas que conduzem cada tipo de íon com função ligeiramente modificada e padrões de expressão teciduais variáveis, as mutações subjacentes são restritas a genes únicos expressos em um tecido específico, como cérebro, músculo esquelético , músculo cardíaco, tecidos sensoriais e tecidos secretores (Tabela 1). Exemplos são miotonia, paralisias periódicas, arritmia cardíaca, síndrome do QT longo, enxaqueca, ataxia episódica, epilepsia e nefrocalcinose. Esse truque é evolutivo: por um lado, ele medeia muitas funções com o auxílio de um mecanismo básico. Por outro lado, compensa uma função eventualmente perturbada por irmãos de canal intimamente relacionados. A localização das mutações causadoras da doença nas várias proteínas do canal e suas consequências funcionais podem ser semelhantes nesses distúrbios.

Canalopatias de Na + dependentes de voltagem do músculo esquelético

Clinicamente, as canalopatias de Na + do músculo esquelético aparecem como episódios recorrentes de rigidez ou fraqueza muscular desencadeada por circunstâncias típicas, como frio, exercícios, carga oral de K + ou drogas. A rigidez muscular, denominada miotonia, melhora com o exercício e pode estar associada à fraqueza transitória durante movimentos rápidos que duram apenas alguns segundos. É o fenótipo clínico provocado por disparos repetitivos descontrolados de potenciais de ação que levam à contração muscular involuntária. Por outro lado, a fraqueza é caracterizada pela falta de potenciais de ação ou inexcitabilidade.

Vários tipos de miotonias hereditárias foram observados devido a mutações no gene do canal de Na +, SCN4A (Tabela 1, Fig. 1). A miotonia agravada pelo potássio (PAM) pode ser distinguida clinicamente de outras formas mais frequentes de miotonia do canal de Na + por sua sensibilidade ao K +. Por outro lado, a miotonia paradoxal ou paramiotonia (PC) piora com o exercício e o frio, e é seguida por longos períodos de fraqueza nos membros que duram de horas a dias. Dois outros distúrbios do canal de Na + são caracterizados por tipos episódicos de fraqueza, com ou sem miotonia, e são diferenciados pelo nível de K + sérico durante ataques de tetraplegia: hipercalemia ou paralisia periódica hipocalêmica (HyperPP e HypoPP). Todos são autossômicos e transmitidos de forma dominante.

Para PAM, PC e HyperPP, o mecanismo de patogênese do canal de Na + subjacente são as mesmas mutações presentes que causam um defeito de passagem do canal de Na +, o que leva à inativação lenta ou incompleta - uma mutação chamada de "ganho de função" (normalmente, os canais de Na + são inativados rapidamente). Essa mutação resulta em um aumento da tendência das fibras musculares a despolarizar. Embora o influxo de Na + na despolarização leve gere potenciais de ação muscular repetitivos e miotonia, despolarizações mais fortes levam à inativação geral dos canais de Na + e à abolição dos potenciais de ação, o que causa fraqueza muscular. Os heterozigotos têm canais mutantes e do tipo selvagem, mas o canal mutante determina a mudança na excitabilidade celular e, portanto, esses distúrbios são dominantes. As mutações (Fig. 1) estão localizadas principalmente 1) no segmento S4 de detecção de voltagem do domínio IV, que é sugerido para acoplar a inativação ao processo de ativação [PC (7)] 2) no interligador III-IV, que é conhecido por conter o portão de inativação [PC e PAM (8)] e 3) em várias posições intracelularmente voltadas para o envolvimento potencial como aceitador para a partícula de inativação (Fig. 2) ou envolvido no impedimento estérico da ligação do aceitador e da partícula de inativação [ PAM e HyperPP (9, 10)]. A sobreposição de fenótipos clínicos dos três distúrbios provavelmente é causada por um aumento semelhante na probabilidade de abertura de canal (Fig. 3). A despolarização da membrana mais severa encontrada no PC e no HyperPP se correlaciona com o maior acúmulo intracelular transitório de Na +, enquanto a despolarização e o acúmulo são pequenos no PAM (11).

Anestésicos locais e drogas antiarrítmicas de Classe I, como mexiletina e derivados de lidocaína, são agentes antimiotônicos úteis para o tratamento terapêutico de PAM e PC. Sua ação antimiotônica ocorre porque estabilizam o estado inativado, o que leva a um bloqueio dependente do uso. A fraqueza espontânea típica do HyperPP não é afetada pela mexiletina porque não ocorrem potenciais de ação repetitivos. No entanto, para o HyperPP, diuréticos como a hidroclorotiazida e a acetazolamida podem ser úteis, pois essas drogas diminuem a frequência e a gravidade dos episódios paralíticos pela redução do K + sérico e por outros mecanismos desconhecidos, talvez, por exemplo, afetando o pH ou os canais de K +.

Figura 2. Modelo de tampa articulada de rápida inativação dos canais de Na +. Visão aérea do canal que consiste em quatro repetições semelhantes (I-IV). O canal é mostrado cortado e aberto entre as repetições I e IV para permitir uma visão da alça intracelular entre as repetições III e IV. O loop atua como o portão de inativação cuja dobradiça GG (um par de glicinas) permite que ele oscile entre duas posições: o estado de canal aberto e o estado fechado inativado onde a partícula de inativação IFM (os aminoácidos isoleucina, fenilalanina e metionina) se liga ao seu aceitador.

Figura 3. Dois exemplos de inativação defeituosa do Na mutantev1.4 Canais de Na + do músculo esquelético associados à miotonia agravada pelo potássio. Registros de patch-clamp de canais normais (WT), G1306V e V1589 M expressos em células de rim embrionário humano. Painéis superiores: famílias de correntes de sódio registradas em vários potenciais de teste no modo de célula inteira mostram decadência retardada e falha em retornar à linha de base completamente. A inativação lenta é mais pronunciada com G1306V, a corrente de sódio interna persistente é maior para V1589 M. Painéis inferiores: traços de cinco registros de canal único, cada um obtido pelo aperto do potencial de membrana a -20 mV. Os canais mutantes apresentam reaberturas, razão das alterações de corrente '' macroscópicas '' apresentadas nos painéis superiores. Modificado após a referência (8).

A doença em que as mutações foram encontradas apenas em sensores de voltagem são os tipos 1 e 2 de paralisia periódica hipocalêmica (HypoPP). Em ambos os tipos, episódios de fraqueza muscular generalizada ocorrem ocasionalmente, muitas vezes durante a segunda metade da noite após um dia de intenso exercício. Outro gatilho é uma refeição rica em carboidratos. A glicose e a insulina liberada induzem uma rápida captação de K + pelas fibras musculares. A hipocalemia resultante se correlaciona com a expressão clínica do ataque paralítico e deu o nome à doença. Se nenhum K + for substituído, a fraqueza pode durar várias horas ou dias até que o nível sérico seja normalizado por rabdomiólise induzida por hipocalemia ou retenção de K +. Como a força muscular é normal entre os ataques, pelo menos em pacientes jovens, o defeito do canal iônico subjacente deve ser bem compensado. Os ataques intermitentes de fraqueza no HypoPP levam à necessidade de mecanismos de gatilho. A secreção de insulina, como após refeições ricas em carboidratos, é um desses gatilhos. A insulina ativa a insulina eletrogênica Na + / K + -ATPase per se e a diminuição resultante na [K +] o normalmente leva a uma hiperpolarização da membrana. Em contraste com o músculo normal, no entanto, as fibras musculares HypoPP-1 e HypoPP-2 despolarizam para -50 mV a uma [K +] reduzidao de 1 mmol / L e força solta (12). Isso explica a fraqueza hipocalêmica dos pacientes.

No HypoPP-1, as mutações foram identificadas no Cav1.1 sensores de tensão (segmentos S4) de repetições II ou IV (13, 14). Mutações HypoPP-2 estão localizadas em segmentos S4 de Nav1.4 repete II e III [Fig. 1 (12, 15)]. As mudanças resultantes nas correntes dos poros foram menores para HypoPP-1 e mostraram função reduzida para HypoPP-1/2 em vez de ganho de função. Resultados recentes nos canais de K + e Na + indicam que as mutações do sensor de voltagem podem criar uma via de íons acessórios que gera um vazamento de cátion ativado por hiperpolarização independente do poro do canal principal, e que essa corrente de vazamento é responsável pela patogênese da doença (16 -18).

Canalopatias de Na + dependentes de voltagem neuronal

Das muitas canalopatias neuronais de Na + dependentes de voltagem (Tabela 1), apenas a epilepsia generalizada com convulsões febris plus (GEFS +) e a epilepsia mioclônica grave da infância (SMEI) serão descritas em mais detalhes. GEFS + é uma síndrome de início autossômico dominante na infância que apresenta convulsões febris e uma variedade de tipos de crises epilépticas afebris dentro do mesmo pedigree (19). A SMEI é caracterizada por convulsões clônicas e tônico-clônicas no primeiro ano de vida, frequentemente prolongadas e associadas à febre. A estagnação do desenvolvimento com demência ocorre na primeira infância. Em contraste com GEFS +, a síndrome geralmente é resistente à farmacoterapia. Às vezes, os pacientes com SMEI têm história familiar de convulsões febris ou afebris, e existem famílias em que GEFS + e SMEI se sobrepõem, de modo que SMEI pode ser considerado o fenótipo mais grave do espectro GEFS + (20).

O primeiro defeito genético neste grupo de doenças foi descoberto em um grande pedigree GEFS + (19). Os autores identificaram uma mutação C121W que interrompe a ponte dissulfeto do β1- alça extracelular da subunidade e leva a uma perda da função da subunidade β. Posteriormente, vários grupos encontraram ligação a um agrupamento de genes que codificam as subunidades a do canal Na + neuronal no cromossomo 2q21-33 (Tabela 1). As duas primeiras mutações pontuais foram detectadas em SCN1A para prever alterações de aminoácidos nos segmentos S4 dos domínios II e IV [T875M, R1648H (21)]. Muitas outras mutações SCN1A foram descritas desde então, além das mutações no GABAUMA receptor (Tabela 1). Algumas das mutações do canal de Na + foram expressas em células renais embrionárias humanas ou oócitos de Xenopus que revelaram mecanismos de ganho e perda de função. As alterações de ganho de função foram uma aceleração da recuperação da inativação que encurtou o período refratário após um potencial de ação para o R1648H (22). As correntes de sódio persistentes aumentadas predizem a despolarização da membrana para T875M, W1204R e R1648H (23), uma mudança de hiperpolarização na corrente de janela para W1204R (24) e uma inativação de canal reduzida após despolarizações de alta frequência para D188V (25). Se as mutações S4 geram uma hiperpolarização - o vazamento de cátion ativado através de uma via de íon acessório ainda não foi estudado. Em contraste, os mecanismos de perda de função foram descritos em parte para as mesmas mutações, como a inativação rápida e lenta aumentada para T875 M e R1648H (22, 24) ou uma mudança de despolarização da curva de ativação em estado estacionário para I1656 M e R1657 C (26), que reduzem a quantidade de canais de sódio disponíveis. Uma perda completa de função foi descrita para duas outras mutações pontuais GEFS +, V1353L e A1685V (26). Portanto, os mecanismos de perda de função parecem predominar para GEFS +, o que está de acordo com os achados genéticos em SMEI, conforme será descrito abaixo.

Em contraste com as mutações pontuais encontradas nas famílias GEFS +, a maioria dos pacientes SMEI carregam mutações sem sentido de novo que predizem proteínas truncadas sem função (27). Uma mutação pontual de SMEI também mostrou produzir canais não funcionais quando expressa em células renais embrionárias humanas (26). O bloqueador dos canais de sódio lamotrigina, que é o único fármaco desta classe em uso em pacientes com epilepsias generalizadas idiopáticas, piora a situação clínica em pacientes com SMEI em particular, pode levar a um aumento do número de crises mioclônicas (28), semelhantes à epilepsia mioclônica juvenil. Esta observação confirma que SMEI é um distúrbio do canal de sódio com perda de função causada por haploinsuficiência de SCN1A do ponto de vista genético e clínico, é uma variante alélica grave de GEFS +. Como a perda de função de um canal de sódio controlado por voltagem diminui a excitabilidade da membrana, parece paradoxal que tais mutações possam causar epilepsia. No entanto, ao atuar predominantemente em neurônios inibitórios, esse efeito pode ser responsável pela ocorrência de hiperexcitabilidade em circuitos neuronais que induzem crises epilépticas. A hipótese de que SCN1A é expresso seletivamente em neurônios inibitórios foi recentemente confirmada (29, 30).

Canalopatias de Na + dependentes de voltagem cardíaca

De todas as doenças episódicas que se sabe serem causadas por canais iônicos, a síndrome do QT longo (LQTS) é a mais grave devido ao risco aumentado de arritmias ventriculares potencialmente fatais. O nome é derivado do eletrocardiograma do paciente, que mostra um alongamento do intervalo QT como resultado da repolarização miocárdica perturbada. Arritmias ventriculares associadas típicas são Torsade de Pointes, em que o complexo QRS se torce em torno do eixo isoelétrico no eletrocardiograma. LQTS é um distúrbio geneticamente heterogêneo de herança geralmente dominante para o qual quatro genes causadores foram identificados: três genes do canal de K + e um gene do canal de Na +, SCN5A (Tabela 1). Os fatores desencadeantes associados a eventos arrítmicos são diferentes entre os subconjuntos genéticos de LQTS. LQT-3, a forma causada por mutações SCN5A, muitas vezes produz características clínicas distintas que incluem bradicardia e uma tendência para eventos cardíacos ocorrerem durante o sono ou repouso em indivíduos frequentemente jovens e saudáveis ​​(31), enquanto outras LQTS se manifestam em alta atividade de o sistema nervoso simpático com bloqueadores beta sendo benéficos.

A expressão de mutações causadoras de LQT-3 típicas, como a deleção de três aminoácidos na alça que conecta as repetições III e IV, a porta de inativação do canal (Fig. 1), revelou uma inativação rápida defeituosa caracterizada por uma corrente de sódio persistente durante despolarização da membrana (4). Esta corrente interna persistente é causada pelo rompimento e reabertura do canal, como nos distúrbios do canal de sódio do músculo esquelético descritos acima. Além desse ganho de função, efeitos secundários indiretos podem ocorrer em alguns casos (32). O resultado é um prolongamento do potencial de ação cardíaco e do período refratário, e a geração de arritmias induzida pelo gatilho que resulta em síncopes. Os antiarrítmicos classe I e os anestésicos locais, como mexiletina e flecainida, mostraram-se eficazes devido à sua capacidade de prevenir a reabertura dos canais (33), ao passo que os betabloqueadores não são eficazes (34).

Mutações em SCN5A também foram associadas à fibrilação ventricular idiopática e à síndrome de Brugada (35). Uma história familiar de morte súbita inexplicada é típica. Indivíduos com síndrome de Brugada frequentemente exibem um padrão ECG característico que consiste em supradesnivelamento de ST nas derivações precordiais direitas, um aparente bloqueio de ramo direito e intervalos QT normais. Eles têm um risco aumentado de taquicardia ventricular polimórfica potencialmente letal. A administração de antiarrítmicos Classe I e anestésicos locais pode expor esse padrão de ECG em casos latentes. Consequentemente, a base celular proposta da síndrome de Brugada envolve uma redução primária na corrente de sódio do miocárdio. Na verdade, a maioria das mutações de Brugada causa códons de parada prematuros, erros de deslocamento de quadros e defeitos de site de emenda, e espera-se que causem canais não funcionais. A expressão heteróloga de mutações missense revelou uma probabilidade de abertura de canal reduzida, também de acordo com uma função de canal reduzida. Atualmente, um cardioversor-desfibrilador implantável é considerado a única terapia eficaz para interromper arritmias ventriculares em pacientes sintomáticos com síndrome de Brugada (36).

Canalopatias catiônicas autoimunes ou adquiridas

Muitos anos antes de o termo canalopatias ter sido estabelecido, as doenças musculares foram identificadas como sendo causadas por autoanticorpos contra canais iônicos dependentes de ligante ou voltagem. Freqüentemente, esses distúrbios ocorrem em associação com malignidade. Por exemplo, muitos pacientes com timoma desenvolvem autoanticorpos para o receptor nicotínico da acetilcolina (nAChR) da junção neuromuscular. Normalmente, as moléculas de ACh podem se ligar ao nAChR, que está situado na junção neuromuscular da membrana da célula muscular e é o primeiro canal catiônico clonado (37). A ligação de ACh desencadeia a abertura do canal iônico e elicia uma corrente interna de Na + e Ca 2+ com fases de aumento e diminuição rápidas. A corrente de entrada elicia com um alto fator de segurança um potencial de ação que se propaga ao longo da membrana da fibra muscular e ativa o acoplamento excitação-contração. Os anticorpos para miastenia gravis causam fadiga profunda e fraqueza devido ao comprometimento do fator de segurança da transmissão neuromuscular do bloqueio do receptor e internalização (38).

A síndrome de Lambert-Eaton está associada ao câncer de pulmão de pequenas células e é causada pela ligação do anticorpo a epítopos extracelulares específicos na glicoproteína do canal de cálcio do tipo P / Q controlada por voltagem do terminal do neurônio motor periférico. É caracterizada por fadiga muscular (39). A hiperexcitabilidade do nervo periférico (HPN) é um mau funcionamento do nervo periférico e leva, além de outros sintomas, à hiperatividade espontânea do músculo esquelético. Em alguns pacientes, a HPN é hereditária, enquanto na maioria dos pacientes é adquirida e frequentemente uma canalopatia auto-imune causada por anticorpos séricos contra canais de K + sensíveis à dendrotoxina, dependentes de voltagem, dos nervos periféricos (40). Como esses distúrbios autoimunes preenchem os critérios de distúrbios do canal, esse grupo de doenças foi incluído recentemente na classificação mais ampla de canalopatias.

Canalopatias hereditárias de ânions

A fibrose cística (FC) é uma das doenças genéticas mais frequentes, com um caso em 2.000 a 4.000 nascidos vivos. É uma doença gravíssima, com expectativa de vida média de 20 a 40 anos. Os pacientes sofrem principalmente de infecções pulmonares crônicas que levam à destruição do pulmão, insuficiência cardíaca direita e insuficiência cardíaca. O produto gênico defeituoso, o regulador da condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR), foi identificado em 1991 (41). A molécula complexa funciona como canal de Cl e como reguladora de outros canais e transportadores de íons. Um defeito no CFTR leva à redução da secreção de NaCl e água nas vias aéreas e em outros epitélios. Além disso, a absorção de NaCl é aumentada. Como resultado, a limpeza das vias aéreas é impedida e a colonização crônica por bactérias patogênicas, como Pseudomonas aeruginosa, leva à destruição das vias aéreas. A FC é uma das primeiras doenças genéticas em que a terapia genética está sendo tentada. No entanto, o entusiasmo inicial foi prejudicado pelo sucesso muito limitado em modelos animais e pela falta de benefícios convincentes para o paciente. Atualmente, novas abordagens para genes e ainda mais para terapia “clássica” estão em estudo. Além disso, a molécula CFTR com todas as suas funções complexas é alvo de pesquisa básica. É inteiramente possível que a compreensão mais próxima desta molécula, sua síntese, maturação e interação com outros transportadores levem a novas e talvez inesperadas estratégias terapêuticas.

Ferramentas e técnicas usadas para o estudo de canais iônicos

A técnica de patch clamp

Hodgkin e Huxley desvendaram a base iônica da excitação do nervo no axônio gigante da lula pela primeira descrição detalhada dos processos de ativação e inativação do sódio dependente de voltagem e das correntes de K + que usam a técnica de fixação de voltagem (42). Depois que essa técnica se tornou a principal ferramenta para o estudo de canais por décadas, um desenvolvimento mais recente revolucionou esse campo. A técnica de patch clamp, desenvolvida por Hamill et al. (43), é uma aplicação específica de fixação por voltagem desenvolvida para registrar a corrente através de um retalho de membrana conduzido por uma única molécula de canal. A técnica de patch clamp permite a medição elétrica direta das correntes do canal de íons, ao mesmo tempo que controla o potencial de membrana da célula. Ele usa um capilar de vidro de ponta fina para fazer contato com um pedaço de uma membrana celular para formar um selo GΩ. Originalmente, esse selo de alta resistência foi obtido nas fibras do músculo esquelético por tratamento enzimático que removeu a membrana basal, o glicocálice e o tecido conjuntivo. Assim, a preparação tratada permitiu a Hamill et al. (43) para fixar a pipeta de vidro à membrana plasmática com uma resistência a vazamentos de 10 a 50 MΩ. A sucção resultou em um selo GΩ e possibilitou a medição de correntes na faixa de 50-pA com um pequeno ruído.

Variantes atuais desta técnica tornam possível a aplicação de solução no exterior e no interior de células inteiras e nos remendos de membrana arrancados da célula (de fora para fora ou de dentro para fora) - toda configuração pensável de solução e orientação do canal de íons almejada pelo pesquisador de canais iônicos. Normalmente, células de cultura primária ou linhagens de células são preferidas, pois revelam uma membrana de superfície relativamente limpa (44) e não requerem nenhum tratamento enzimático que danifique a membrana plasmática. A técnica de patch clamp é agora a medida padrão ouro para caracterizar e estudar canais iônicos e é um dos métodos mais importantes aplicados à fisiologia.

As gravações de canal único mostraram que muitos canais (por exemplo, o canal de Na + ativado por voltagem) possuem apenas dois níveis de condutância: zero quando o canal está fechado e uma condutância constante quando o canal está aberto. Após a despolarização, ocorre um breve retardo antes da abertura dos canais. Os intervalos não são idênticos durante cada despolarização, de fato, a abertura e o fechamento de um determinado canal é um processo aleatório, embora a probabilidade de abertura dependa da tensão e seja mais sensível à tensão do que um dispositivo eletrônico como um transistor. Após um curto intervalo subsequente, o tempo de abertura, a corrente volta a zero conforme os canais fecham.

A natureza estocástica pode ser entendida por certas barreiras de energia que devem ser superadas antes que um canal possa mudar de uma conformação (por exemplo, aberto) para outra (por exemplo, fechado). A energia necessária para este propósito vem da energia térmica aleatória do sistema. Pode-se imaginar que cada vez que a molécula do canal vibra, dobra ou se estica, ela tem uma chance de superar a barreira de energia. Cada movimento é como uma tentativa binomial com certa probabilidade de sucesso. Claramente, como os movimentos das proteínas ocorrem em uma escala de picossegundos, mas o canal permanece aberto por milissegundos, a chance de sucesso em cada tentativa deve ser pequena e muitas tentativas serão necessárias antes que o canal se feche. Normalmente, um canal de Na + normal não reabre, embora a despolarização possa ser associada à etapa de pinça de tensão por um certo tempo. Notavelmente, o comportamento médio de um único canal é idêntico ao da corrente macroscópica de Na + de célula inteira.

Ao combinar o patch clamp com técnicas de clonagem molecular, a função e o significado de resíduos de aminoácidos potencialmente importantes são elucidados rapidamente. Uma abordagem comum a essa técnica envolve a clonagem do gene de interesse e, em seguida, a inserção de uma mutação projetada ou de ocorrência natural no clone por mutagênese, na esperança de que a mutação produza mudanças mensuráveis ​​na função do canal. Então, um sistema de expressão heterólogo (por exemplo, uma linha celular de um tecido diferente), que não expressa o gene de interesse endogenamente, deve ser usado para expressar o gene. Esta expressão pode ser transitória, como em oócitos Xenopus injetados com RNA, ou estável, como em células infectadas com vírus ou transfectadas. Finalmente, a técnica patch-clamp é usada para caracterizar a função de um conjunto de canais ou de uma única molécula de proteína.

A expressão funcional das mutações em "sistemas de expressão" permite estudar as alterações funcionais dos canais mutantes e desenvolver novas estratégias para a terapia de canalopatias iônicas (por exemplo, projetando drogas que suprimem especificamente os efeitos de canais com mau funcionamento). As limitações no rendimento são superadas pela automação da técnica de patch clamp, pela qual ela se tornará econômica e rápida e, ao mesmo tempo, permitirá a maior sensibilidade e a descrição mais precisa do efeito da droga em comparação com qualquer outro canal iônico método de rastreio de drogas. Diversas estratégias para a automação da técnica de patch clamp têm sido perseguidas com setups já disponíveis no mercado.

Atualmente, as drogas moduladoras do canal iônico são responsáveis ​​por vários bilhões de dólares americanos em vendas mundiais, como os ativadores dos canais Cl (benzodiazepínicos, ansiolíticos e antiepilépticos), bloqueadores dos canais de K + (antidiabéticos sulfonilureia, antiarrítmicos do tipo amiodarona), Ca 2+ bloqueadores de canais (antiarrítmicos do tipo verapamile) e bloqueadores de canais de Na + (anestésicos do tipo lidocaína, antiarrítmicos do tipo mexiletina e antiepilépticos como lamotrigina e carbamazepina). Como proteínas localizadas na membrana, os canais iônicos são facilmente acessíveis aos medicamentos e, devido à variedade de padrões de expressão e splicing específico do tecido, eles provavelmente têm um perfil de efeitos adversos restrito. Isso os torna alvos ideais de drogas, especialmente devido à possibilidade de observação precisa do efeito da droga na função do canal pela técnica de patch clamp.

Agradecemos o apoio contínuo da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG, JU470 / 1).

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1. Introdução

Uma característica óbvia do comportamento é a variabilidade que se observa de uma tentativa para outra, mesmo nos ambientes mais controlados. Essa variabilidade comportamental é refletida no nível neural no caráter ruidoso dos trens de pico. Várias hipóteses foram apresentadas para um papel funcional potencial da variabilidade neural, como ressonância estocástica (McDonnell e Abbott, 2009), prevenção de sincronia (van Rossum et al., 2002) e amostragem probabilística (Buesing et al., 2011 ) Vários fatores podem contribuir para a variabilidade de ensaio a ensaio: modulação não estacionária e não observada da dinâmica da rede caótica do sistema nervoso resultante da dinâmica determinística de um único neurônio (van Vreeswijk e Sompolinsky, 1996) e ruído biofísico. Neste artigo nos concentramos no último, e em particular no ruído de canais iônicos dependentes de voltagem.

Os canais iônicos são proteínas macromoleculares formadoras de poros que permitem a passagem seletiva de correntes iônicas para dentro e / ou para fora da célula (Hille, 2001). Cada canal iônico pode, em qualquer dado momento, ocupar apenas um dos vários estados conformacionais discretos, pelo menos um dos quais é um estado aberto / condutor e pelo menos um dos quais é um estado fechado / não condutor. As transições entre os estados são extremamente rápidas (& # x0003C1 & # x003BCs) e, como todas as reações moleculares, de natureza estocástica & # x02014, elas são impulsionadas pela agitação térmica. No caso de canais dependentes de voltagem (VGCs) considerados aqui, as probabilidades de transição dependem do potencial de membrana da célula & # x00027s. Os canais são comumente modelados como processos de Markov, que levam a previsões precisas do ruído em correntes macroscópicas registradas dos neurônios (Hille, 2001).

Como a geração de picos parece confiável durante a injeção de corrente somática (Calvin e Stevens, 1968 Bryant e Segundo, 1976 Mainen e Sejnowski, 1995) e o número de VGCs é grande, normalmente acredita-se que o gating estocástico de VGC contribui pouco para o total observado variabilidade em spiking neuronal. No entanto, tal conclusão pode ser prematura. Em primeiro lugar, durante a injeção de corrente somática, os dendritos são tipicamente mais hiper-polarizados em comparação com o caso realístico onde o neurônio recebe entrada sináptica, e o ruído normalmente diminui fortemente com hiper-polarização (veja abaixo). Além disso, o número total de canais em um neurônio pode ser grande, mas em compartimentos espaciais como axônios estreitos ou dendritos, o número de canais é tipicamente pequeno.

Vários estudos experimentais enfocaram as consequências fisiológicas do ruído do canal iônico. Sigworth (1980) usou a análise de flutuação para estimar o número de canais de Na & # 43 em um único nó de rã de Ranvier & # x0007E30000 e, posteriormente, usou fórmulas de Lecar e Nossal (1971a, b) para estimar flutuações no limite de ação atual geração potencial devido ao ruído do canal. Johansson e Arhem (1994) descobriram que a abertura estocástica de um pequeno número de canais em neurônios do hipocampo em cultura era suficiente para desencadear potenciais de ação espontâneos. White et al. (1998) registraram oscilações de potencial de membrana subliminar em células estreladas do córtex entorrinal (EC) da camada II e descobriram que elas só podiam reproduzir a coexistência de ambas as oscilações e picos em um modelo computacional se incluíssem gating estocástico dos canais de Na & # 43 , sugerindo uma forma de ressonância estocástica periódica. Posteriormente, Dorval e White (2005) usaram a técnica de grampo dinâmico para injetar uma condutância & # x0201Cvirtual & # x0201D Na & # 43 que era determinística ou estocástica para células estreladas EC em vitro. Apenas a condutância estocástica poderia reproduzir as oscilações do potencial de membrana observadas. Da mesma forma, Dudman e Nolan (2009) usaram modelos computacionais do mesmo tipo de célula para demonstrar que o gating de canal estocástico também pode ser responsável pelos padrões de disparo agrupados exibidos por essas células quando estimulados por pulsos de corrente constante em vitro. Diba et al. (2004) caracterizou o ruído somático de voltagem subliminar em neurônios do hipocampo em cultura devido ao gating do canal de íon estocástico. As flutuações de voltagem foram pequenas, com um desvio padrão & # x0003C0.3 mV e com base em experimentos farmacológicos pareceram surgir principalmente dos canais K & # 43. Jacobson et al. (2005) relataram resultados semelhantes de células piramidais neocorticais da camada IV / V de fatias cerebrais do córtex somatossensorial de rato, com flutuações de voltagem de amplitude (submilivolt) semelhantes. Finalmente, Kole et al. (2006) usaram a análise de flutuação para medir as propriedades e distribuição de canais de cátions ativados por hiperpolarização (Ih) em células piramidais neocorticais do VE em vitro. Eles descobriram que, embora a condutância de canal único Ih fosse excessivamente pequena (& # x0003C1 pS), os canais Ih contribuem substancialmente para o ruído de voltagem nos dendritos distais dessas células.

Uma grande quantidade de estudos teóricos e numéricos analisaram o ruído da membrana de canais de íons estocásticos, começando com Lecar e Nossal, que usaram equações diferenciais estocásticas e um modelo de sistema dinâmico reduzido do potencial de ação para tentar quantificar a magnitude do ruído da membrana em ação potenciais flutuações de limiar (Lecar e Nossal, 1971a, b). Skaugen e Wall & # x000F8e (1979) foram os primeiros a examinar as consequências da passagem estocástica de canais iônicos por meio de simulação numérica. Eles descobriram que na versão estocástica do modelo de axônio gigante de lula de Hodgkin & # x02013Huxley (HH), o limite de corrente foi reduzido em comparação com modelos determinísticos, a membrana pode aumentar espontaneamente e que a curva de frequência-corrente foi espalhada em torno do limite. O trabalho de simulação subsequente de DeFelice e colegas (Clay e DeFelice, 1983, Strassberg e DeFelice, 1993) aprofundou a ligação direta entre as versões microscópica (estocástica) e macroscópica (determinística) do modelo HH. Rubinstein (1995) simulou um modelo do nó sapo de Ranvier e reproduziu o limite de disparo do potencial de propagação em ação devido ao gating do canal estocástico previsto por Lecar e Nossal, de acordo com experimentos anteriores (Verveen, 1960). Chow e White (1996) examinaram a dependência da taxa de disparo espontâneo no modelo HH estocástico na área do remendo da membrana e descobriram que ela diminuía exponencialmente com a área. Eles aproximaram o sistema como um problema de escape de fronteira, com a passagem estocástica da subunidade de ativação do canal Na & # 43 como a fonte de ruído. Eles descobriram que o tempo médio de escape em função da área concordou bem com os resultados da simulação numérica (comentaremos sobre essa descoberta abaixo). Manwani e Koch (1999) usaram uma abordagem perturbativa para comparar as contribuições de ruído térmico, ruído de canal e ruído sináptico & # x0201Cnoise & # x0201D (de entradas Poissonianas) para ruído de tensão de membrana total em um único compartimento. Steinmetz et al. (2000) usaram métodos semelhantes para demonstrar a tensão e a dependência do tipo de canal dos espectros de ruído do canal de íons para o modelo HH e um modelo de célula piramidal neocortical comumente usado (Mainen et al., 1995). No presente estudo, empregamos métodos muito semelhantes a ambos os trabalhos, mas com um objetivo diferente: pretendemos separar sistematicamente todos os fatores contribuintes que determinam a contribuição de um tipo de canal iônico para o ruído de tensão e disparo espontâneo.

Em geral, a simulação detalhada de canais estocásticos dará a resposta mais precisa em relação ao ruído e à contribuição dos diferentes canais. Mas como a simulação estocástica da cinética de canal completo está muito envolvida, vários estudos recentes desenvolveram modelos de equação diferencial estocástica aproximada que capturam de forma eficiente a essência das estatísticas de ruído de canais de íons discretos (Goldwyn e Shea-Brown, 2011 Goldwyn et al., 2011 Linaro et al., 2011 Orio e Soudry, 2012). Nosso objetivo aqui é complementar, mas diferente: em vez de desenvolver um modelo preciso para o ruído, buscamos estimativa a contribuição dos vários tipos de canais. Intuitivamente, não está claro quais propriedades de um determinado tipo de canal são determinantes importantes para o ruído. Isso é relevante quando um diagrama de estado completo de um determinado tipo de canal não está disponível, mas, no entanto, uma estimativa grosseira de sua contribuição para o ruído é desejada. Ao mesmo tempo, decompondo os vários fatores que determinam a magnitude do ruído de um determinado tipo de canal, uma visão mais profunda dos resultados de simulações e experimentos pode ser obtida.

Nosso estudo é dividido em quatro partes: Usamos simulações para demonstrar que no modelo estocástico Hodgkin & # x02013Huxley bem estudado, a maioria dos picos se deve ao gating do canal estocástico K & # 43 e não ao canal Na & # 43. Isso é interessante, pois podem ser encontrados achados conflitantes na literatura (ver Discussão). A seguir, revisamos os diferentes fatores que explicam como o ruído do canal estocástico leva ao ruído na tensão da membrana, usando uma análise de ruído linear e fraca, e explicamos por que o ruído K & # 43 é dominante. Embora esses fatores individuais sejam bem conhecidos, em nossa opinião faltava um relato conciso. Terceiro, examinamos a relação entre o ruído de voltagem e picos espontâneos usando uma abordagem recentemente introduzida para neurônios de integração e disparo. Mostramos que essa relação é complexa, mas que estimativas grosseiras são possíveis. Finalmente, aplicamos os mesmos métodos para analisar um modelo de neurônio piramidal CA1 para mostrar que a abordagem é facilmente generalizável para outros modelos de neurônio.


Discussão

Usando uma combinação de abordagens experimentais e de modelagem computacional, fizemos cinco observações importantes sobre a formação de aglomerados de canais iônicos e o tráfico de células vivas. Primeiro, as distribuições de clusters dos cinco tipos de canais estudados (CaV1,2, BK, TRPV4, CaV1.3s, e CaV1.3eu) foram todos descritos por uma única função exponencial, independentemente do tipo de célula em que são expressos, apoiando a hipótese de que a presença de agrupamentos de canais iônicos nas membranas celulares é conseqüência de um processo estocástico de automontagem. Segundo, CaVOs clusters dos canais 1.2 e TRPV4 formam-se nas células tsA-201 com um período inicial de rápido crescimento em tamanho, após o qual são mantidos em estado estacionário. Terceiro, esta forma de estado estacionário em células tsA-201 é mantida por uma taxa de renovação relativamente rápida de CaVCanais 1.2 e TRPV4. Em quarto lugar, nosso modelo prevê que as distribuições de tamanho de estado estacionário de clusters de canais de membrana podem ser sustentadas por uma faixa de taxas de renovação do canal. Embora estejamos cientes da possibilidade de que nossas medições sejam baseadas exclusivamente em um sistema de expressão heterólogo e possam diferir daquelas feitas em outros tipos de células, nossa quinta observação é que tanto nossos tempos de espera de membrana medidos experimentalmente quanto previstos são semelhantes aos relatados para CaV1,2 em células HL-1 cardíacas cultivadas (Conrad et al., 2018) e neurônios primários (Di Biase et al., 2011), bem como para transcrição média e tempos de permanência da proteína (Schwanh & # x000e4usser et al., 2011).

Para ilustrar como nosso modelo pode ser usado por fisiologistas interessados ​​em investigar o papel de uma determinada proteína interagindo no agrupamento de canais iônicos, consideramos três cenários potenciais em que uma mudança em um processo fisiológico altera a área ou densidade do cluster de canais iônicos por meio de mudanças em um dos três parâmetros do modelo (ou seja, Pn, Pg, ou PR) No primeiro cenário, vamos propor que a inserção de canais na membrana plasmática seja potencializada pela regulação positiva ou ativação de uma via de sinalização. Em nosso modelo, este processo resultaria em um aumento no parâmetro Pn. Um exemplo disso poderia ser a regulação positiva dependente de Ca 2+ da expressão dos canais de K + por meio da ativação da calcineurina / fator nuclear da via de sinalização de células T ativadas. Conforme demonstrado pela primeira vez por Amberg et al. (2004) e (Rossow et al., 2004, 2006, 2009), a expressão dos canais Kv4 e Kv2 é rigidamente regulada pelo Ca 2+ intracelular em células cardíacas e vasculares. A expressão do canal BK também é regulada pelos níveis de Ca 2+ no músculo liso (Nieves-Cintr & # x000f3n et al., 2007, 2008). Nesse cenário, o aumento da expressão dos canais aumentará o pool de canais disponíveis que podem ser inseridos na membrana plasmática, aumentando a densidade do cluster. Curiosamente, as diferenças de CaV1.2 e densidades de cluster TRPV4 relatadas aqui entre as células tsA-201, músculo liso e miócitos ventriculares foram simuladas por variações no Pn entre essas células. Esses dados sugerem que o nível de expressão desses canais e / ou das proteínas relacionadas com o tráfego e entrega desses canais para a membrana plasmática varia entre as células.

No segundo cenário, consideramos a possibilidade de que a inserção de novos canais seja favorecida para ocorrer nos mesmos locais onde outros canais foram inseridos anteriormente devido à regulação positiva de uma proteína interagindo. Em nosso modelo, esse processo aumentaria Pg. Um exemplo de tal proteína é BIN1, que se liga à face interna da membrana plasmática e forma reticulados por meio da ligação cooperativa de outras moléculas, criando assim micro dobras de membrana (Adam et al., 2015). Em miócitos ventriculares, BIN1 tem sido implicado na formação de curvaturas de membrana (Lee et al., 2002) e na ancoragem de microtúbulos onde o Ca recém-sintetizadoV1,2 canais são entregues à membrana de superfície (Hong et al., 2010, 2014). Como tal, BIN1 poderia funcionar para aumentar a concentração local de CaV1,2 canais em locais específicos na membrana plasmática, aumentando seu agrupamento. Consistente com isso, De La Mata et al. (2019) descobriram que a superexpressão de BIN1 em células-tronco embrionárias humanas & # x02013 cardiomiócitos derivados (hESC-CMs) aumentou o CaV1,2 tamanho do cluster. Assim, BIN1 poderia estar atuando para direcionar a inserção de CaV1,2 canais no sarcolema de miócitos cardíacos, o que aumentaria o Pg desses canais. É importante ressaltar que, no caso de canais que sofrem acoplamento funcional (isto é, canais de Ca 2+ do tipo L), o aumento no tamanho do cluster poderia fortalecer o acoplamento entre esses canais, resultando em um aumento adicional na amplitude do fluxo de íons.

Finalmente, no terceiro cenário, imaginamos uma situação em que a remoção de canais iônicos individuais ou grupos de canais iônicos da membrana plasmática é intensificada por uma proteína em interação. Em nosso modelo, este processo resultaria em um aumento no parâmetro PR. Um exemplo disso poderia ser a ativação da HECT ubiquitina ligase ALP4, que foi associada à internalização do canal TRPV4 (Wegierski et al., 2006). Outro exemplo é o fator de iniciação eucariótico supressor de tumor 3 subunidade e / Int6, que induz internalização de CaV1,2 canais em neurônios (Green et al., 2007). Nesse cenário, a ativação dessas proteínas provavelmente estará associada a uma diminuição geral no tempo de permanência da membrana do canal e uma diminuição no tamanho do cluster.

Uma observação importante que fizemos no decorrer deste estudo é que, enquanto os tamanhos e densidades de CaVOs clusters de canal 1.2 e TRPV4 expressos em células tsA-201 aumentaram rapidamente após a transfecção, ambos os parâmetros atingiram um patamar em 24 h. Estes resultados sugerem que os níveis de expressão da membrana plasmática e agrupamento de Ca expresso exogenamenteVOs canais 1.2 e TRPV4 estão sob o controle de um mecanismo de feedback. De fato, experimentos recentes de imagem de células vivas indicam que o CaV1.2 contendo vesículas em células tsA-201 poderia ter vários mecanismos para interagir e distribuir canal para a membrana plasmática (Ghosh et al., 2018). Propostas semelhantes foram feitas para o Ca endógenoV1,2 em miócitos cardíacos (Rosati et al., 2011) e neurônios (Green et al., 2007). O último relatório sugeriu que a taxa de disparo do potencial de ação, a atividade do canal e um aumento impulsionado pelo Ca 2+ no CaV1.2 internalização (ou seja, PR) foram responsáveis ​​por regular os níveis de expressão da membrana plasmática de CaV1.2. Nosso modelo de feedback depende exclusivamente do número do canal e não leva em consideração o estado do canal (por exemplo, aberto, desativado, inativado ou dessensibilizado). Assim, um canal dessensibilizado ou inativado teria a mesma probabilidade de ser removido por internalização ou endocitose que um canal desativado ou aberto. Os mecanismos que determinam os níveis de estado estacionário desses canais iônicos no músculo cardíaco e liso precisarão de mais estudos.

Outra questão intrigante colocada pelo nosso trabalho é se os tempos de permanência da membrana e o curso do tempo de agrupamento de CaVOs canais 1.2 e TRPV4 em células nativas são semelhantes aos que encontramos operando em células tsA-201. O trabalho de De La Mata et al. (2019) sugere que em hESC-CMs, CaVOs tamanhos e densidades de 1,2 aglomerados aumentaram desde a indução da diferenciação até o dia 30. Curiosamente, os tamanhos e densidades dos aglomerados de canais alcançados neste momento foram semelhantes aos dos miócitos ventriculares adultos, levantando a possibilidade de que eles tivessem alcançado um nível intrinsecamente definido de estável -expressão de estado e agrupamento. Independentemente de se um estado estacionário foi alcançado ou não, esses dados de hESC-CM sugerem que as taxas de nucleação de cluster, crescimento, remoção e, portanto, tempos de permanência da membrana do canal são provavelmente diferentes entre as células em diferentes níveis de diferenciação. Uma hipótese testável é que o tempo de permanência da membrana dos canais é maior em células de divisão rápida, como células tsA-201, do que em células totalmente diferenciadas e sem divisão, como miócitos ventriculares, e que após estimulação (por exemplo, sistema nervoso autônomo ou hipertrofia fisiológica e patológica), as mudanças na expressão gênica, entrega de canal, reciclagem e / ou degradação de proteína pode aumentar a dinâmica do canal.

Outra questão importante levantada por nosso estudo é se os canais de membrana são internalizados individualmente ou por meio da remoção de clusters inteiros. Nossos dados experimentais e simulações de modelo não fornecem uma resposta definitiva, mas simulações em que os canais foram removidos exclusivamente um de cada vez previram a formação de um grande número de macroclusters com parâmetros semelhantes aos usados ​​para reproduzir dados experimentais de miócitos cardíacos, músculo liso células, neurônios e células tsA-201. No entanto, os macroclusters previstos pelo modelo não foram observados experimentalmente. Consequentemente, modificamos o modelo para que a internalização do canal fosse estocástica e envolvesse canais individuais, bem como clusters de canais de tamanhos variados. Considerando que a área de uma vesícula endocítica pode variar de 1.200 a 1,26 & # x000d7 10 5 nm 2 e as áreas médias do cluster relatadas aqui variam de & # x0223c1,900 a 3.700 nm 2, esta suposição parece razoável. Experimentos futuros serão necessários para testar esta hipótese.

Finalmente, embora nossos dados revelem que no músculo liso e nas células tsA-201, os canais são agrupados aleatoriamente em toda a superfície da célula, é importante mencionar que as variações na expressão do canal entre e dentro das células são comumente observadas e relatadas. Para citar apenas alguns exemplos, NaV1 canais são altamente concentrados nos nódulos de Ranvier de axônios mielinizados, mas amplamente ausentes da membrana internodal (Hille, 2001), CaV1,2 canais são preferencialmente expressos ao longo dos túbulos T de miócitos ventriculares (Dixon et al., 2015), o trocador Na + / H + está ausente dos túbulos T (Garciarena et al., 2013), e o Na + As proteínas / K + & # x003b12ATPase são distribuídas preferencialmente nos túbulos T e no sarcolema de superfície (Yuen et al., 2017). Embora essas variações regionais na expressão do canal possam parecer incompatíveis com nosso modelo, elas ainda podem ser o resultado de um processo estocástico de automontagem operando dentro de um domínio celular restrito. Por exemplo, nossos dados sugerem que CaVOs clusters de 1,2 canal são estocasticamente automontados ao longo dos túbulos T dos miócitos ventriculares, mas não em toda a célula. Essas observações aparentemente contraditórias podem ser reconciliadas, propondo que pode haver variações em Pn, Pg, ou PR em diferentes compartimentos da mesma célula que levam à auto-montagem estocástica de clusters nela. A possibilidade de variações regionais em Pn, Pg, e Pr deve ser abordado em estudos futuros.

Em resumo, fornecemos um conjunto de medições experimentais e simulações de computador que suportam a hipótese de que a formação de aglomerados de canais iônicos na membrana superficial de células excitáveis ​​reflete a operação de um processo de automontagem estocástica sem o envolvimento de qualquer mecanismo ativo de agregação, como o recrutamento induzido por agrina de receptores de acetilcolina na placa motora pós-sináptica (Sanes e Lichtman, 2001), agrupamento mediado por anquirina G & # x02013 de canais de Na + dependentes de voltagem e canais Kv7 em nós de Ranvier (Nelson e Jenkins, 2017) e agrupamento de canais Kv2 por proteínas VAPA e VAPB (Johnson et al., 2018 Kirmiz et al., 2018). Na verdade, nossos dados são consistentes com a visão de que o agrupamento de canais de membrana é a organização padrão para vários tipos de canais nas membranas de superfície de quatro tipos de células diferentes. Notavelmente, nosso modelo incorpora um mecanismo de autorregulação que assume um processo de feedback entre o número do canal e a formação do cluster do canal. Nosso modelo pode ser amplamente aplicável às distribuições de muitos tipos diferentes de membrana (proteínas e canais ligados) em estados de saúde e doença. Certamente não podemos descartar a possibilidade de que uma ou mais proteínas sejam encontradas que não estejam distribuídas aleatoriamente ao longo da membrana superficial. Se existe ou não uma consequência funcional do agrupamento para todos os tipos de canais iônicos, como descobrimos para o CaV1,2, CaVCanais 1.3, BK e TRPV4, permanece uma questão em aberto, mas muito importante.


As múltiplas rotas evolutivas para canais de sódio dependentes de voltagem

N / DVOs s são responsáveis ​​pela iniciação e propagação da sinalização elétrica em células excitáveis ​​e são caracterizados por ativação dependente de voltagem, inativação rápida e condutância iônica seletiva de sódio. O processo de inativação rápida mostrou-se acoplado ao movimento para fora do sensor de tensão em DIV (Chen et al., 1996 Cha et al., 1999 Kühn e Greeff, 1999 Sheets et al., 1999), o que leva à oclusão do poro pela partícula de inativação (West et al., 1992 Rohl et al., 1999) do lado intracelular em um mecanismo de tampa articulada alguns milissegundos após a ativação do canal (Vassilev et al., 1988 Stühmer et al., 1989 Patton et al., 1992).

No NaV1 família que é encontrada na maioria dos bilaterais, a seletividade para íons de sódio é habilitada pelo filtro de seletividade altamente conservado que consiste nos quatro resíduos Asp-Glu-Lys-Ala (DEKA), com Asp situado no p-loop de DI, Glu em DII, Lys em DIII e Ala em DIV (Heinemann et al., 1992). O Lys em DIII mostrou ser crucial para a seletividade do sódio, pois a substituição desse resíduo aumentou a condutância de potássio e cálcio (Schlief et al., 1996 Favre et al., 1996). Além disso, a posição dos resíduos é crítica para a seletividade do sódio e a troca de sua posição nos domínios resultou na perda da seletividade do sódio (Schlief et al., 1996).

A revolução genômica da década que se passou revelou que homólogos de NaVs estão presentes nos eucariotos unicelulares Thecamonas trahens do Apusozoa (Cai, 2012), bem como em M. brevicollis (Liebeskind et al., 2011). Essas descobertas implicam que o NaVCanais semelhantes surgiram antes que os sistemas nervosos ou mesmo a multicelularidade evoluíssem, há mais de um bilhão de anos. Exame dos filtros de seletividade do Monosiga e Thecamonas os canais mostraram que são constituídos pelos resíduos DEEA e DEES, respectivamente (Liebeskind et al., 2011 Cai, 2012). No Tricoplax e Mnemiopsis, todo NaV foram encontrados canais com o arquivador de seletividade DEEA (Liebeskind et al., 2011 Gur Barzilai et al., 2012). No entanto, nas esponjas, não há NaV canais homólogos estão presentes. N / DVs com o filtro de seletividade DEEX (NaV2 canais) são encontrados na maioria dos Filos animais, com exceção dos vertebrados, que possuem apenas NaV1 canais (Fig. 4) (Liebeskind et al., 2011 Gur Barzilai et al., 2012). Expressão heteróloga de inseto e anêmona do mar NaV2 canais em Xenopus oócitos mostraram que, apesar de sua similaridade de sequência com o NaV1, esses canais são relativamente não seletivos, conduzindo íons de sódio e potássio e cálcio, com uma clara preferência pelos íons de cálcio (Zhou et al., 2004 Zhang et al., 2011 Gur Barzilai et al., 2012).

Em contraste com o Na condutor de cálcioV2 canais, que apareceram antes da divisão fungo-metazoário, como sabemos por sua presença em Thecamonas, o Na seletivo de sódioV1 canais são encontrados exclusivamente em Bilateria. Curiosamente, em Nematostella, cinco genes que codificam NaV2 homólogos estão presentes (Putnam et al., 2007 Gur Barzilai et al., 2012), dos quais três têm o filtro de seletividade DEEA, um tem DEET e um tem DKEA (o NvNaV2,5 canais). Em comparação, no genoma da mosca da fruta D. melanogaster, apenas um NaV1 e um NaV2 gene de codificação está presente (Littleton e Ganetzky, 2000) e cada um desses genes dá origem a dezenas de isoformas com diferentes propriedades funcionais por extenso splicing alternativo e edição de RNA (Thackeray e Ganetzky, 1994 Tan et al., 2002 Song et al. , 2004 Olson et al., 2008 Zhang et al., 2011). No genoma humano, existem 10 genes que codificam NaVs (NaV1.1 – NaV1,9 e NaX) Pensa-se que no ancestral comum dos vertebrados apenas um NaV1 gene estava presente, que passou por duas rodadas de duplicação no vertebrado basal e posterior duplicação e diversificação em teleósteos e tetrápodes (Widmark et al., 2011 Zakon et al., 2011). Como no caso de KVConforme discutido anteriormente, a descoberta de tal diversidade de canais de sódio em uma anêmona do mar foi altamente inesperada (Gur Barzilai et al., 2012). Expressão heteróloga de NvNaV2,5 mostrou que este canal é seletivo ao sódio, semelhante ao NaV1 canais (Gur Barzilai et al., 2012). Além disso, substituindo o filtro de seletividade do NvNaV2,5 (DKEA) com o de NaV1 (DEKA) resultou na perda de seletividade de sódio (Gur Barzilai et al., 2012), ao substituir o filtro de seletividade de NaV1 com o da NvNaV2,5 também resultou na perda de seletividade do sódio (Schlief et al., 1996). Esses resultados sugerem que a seletividade do sódio em NvNaV2,5 é alcançado de uma maneira diferente daquela em NaV1 canais.

Filogenia de canais de sódio dependentes de voltagem. Uma árvore de máxima verossimilhança foi construída usando o modelo LG (+ F + G + I) (modificado de Gur Barzilai et al., 2012). O suporte de bootstrap de 100 é indicado nas ramificações. Uma análise bayesiana usando o modelo WAG resultou em topologia idêntica. Probabilidades posteriores de 1,0 são indicadas por um asterisco vermelho e aquelas de 0,95 & ltX& lt1.0 são indicados por um asterisco azul. Todas as sequências são de cDNA clonado, a menos que seja mencionado de outra forma. Modelos de proteínas a partir de sequências genômicas só foram usados ​​após verificação bioinformática de que a previsão é suficientemente precisa. Os clados de animais são indicados por cores. Ac, Aplysia californica (lesma do mar Molusca) Ag, Anopheles gambiae (mosquito Arthropoda) Ap, Aiptasia pallida (anêmona do mar Cnidaria) Bf, Branchiostoma floridae (lancelet Cephalochordata) Bg, Blatella germanica (barata Arthropoda) Cb, Câncer boreal (caranguejo Arthropoda) Cc, Cyanea capillata (água-viva Cnidaria) Ch, Clytia hemisphaerica (hidrozoário água-viva Cnidaria) Ct, Capitella teleta [verme segmentado Annelida (proteínas previstas)] Dm, Drosophila melanogaster (mosca da fruta Arthropoda) Dr, Danio rerio (peixe-zebra, Vertebrata) h, humano (Vertebrata) Hm, Hydra magnipapillata (hidra Cnidaria) Hr, Halocynthia roretzi (água do mar Urochordata) Lb, Loligo bleekeri (lula Mollusca) Lo, Loligo Opleans (lula Mollusca) m, rato (vertebrados) Mb, Monosiga brevicollis (coanoflagellate Choanoflagellida) Ml, Mnemiopsis leidyi [comb jellies Ctenophora (predicted protein)] Nv, Nematostella vectensis (anêmona do mar Cnidaria) Pp, Polyorchis penicillatus (água-viva Cnidaria) r, rato (Vertebrata) Spi, Stylophora com pistilo (coral Cnidaria) Spu, Strongylocentrotus purpuratus [ouriço-do-mar Echinodermata (proteína prevista)] Ta, Trichoplax adhaerens (Placozoa) Tp, Thalassiosira pseudonana [diatom Heterokontophyta (predicted protein)] Tt, Thecamonas trahens [Apusozoa (proteína prevista)] Vd, Varroa destructor (ácaro Arthropoda).

Filogenia de canais de sódio dependentes de voltagem. Uma árvore de máxima verossimilhança foi construída usando o modelo LG (+ F + G + I) (modificado de Gur Barzilai et al., 2012). O suporte de bootstrap de 100 é indicado nas ramificações. Uma análise bayesiana usando o modelo WAG resultou em topologia idêntica. Probabilidades posteriores de 1,0 são indicadas por um asterisco vermelho e aquelas de 0,95 & ltX& lt1.0 são indicados por um asterisco azul. Todas as sequências são de cDNA clonado, a menos que seja mencionado de outra forma. Modelos de proteínas a partir de sequências genômicas só foram usados ​​após verificação bioinformática de que a previsão é suficientemente precisa. Os clados de animais são indicados por cores. Ac, Aplysia californica (lesma do mar Molusca) Ag, Anopheles gambiae (mosquito Arthropoda) Ap, Aiptasia pallida (anêmona do mar Cnidaria) Bf, Branchiostoma floridae (lancelet Cephalochordata) Bg, Blatella germanica (barata Arthropoda) Cb, Câncer boreal (caranguejo Arthropoda) Cc, Cyanea capillata (água-viva Cnidaria) Ch, Clytia hemisphaerica (hidrozoário água-viva Cnidaria) Ct, Capitella teleta [verme segmentado Annelida (proteínas previstas)] Dm, Drosophila melanogaster (mosca da fruta Arthropoda) Dr, Danio rerio (peixe-zebra, Vertebrata) h, humano (Vertebrata) Hm, Hydra magnipapillata (hidra Cnidaria) Hr, Halocynthia roretzi (água do mar Urochordata) Lb, Loligo bleekeri (lula Mollusca) Lo, Loligo Opleans (lula Mollusca) m, rato (vertebrados) Mb, Monosiga brevicollis (coanoflagellate Choanoflagellida) Ml, Mnemiopsis leidyi [comb jellies Ctenophora (predicted protein)] Nv, Nematostella vectensis (anêmona do mar Cnidaria) Pp, Polyorchis penicillatus (água-viva Cnidaria) r, rato (Vertebrata) Spi, Stylophora com pistilo (coral Cnidaria) Spu, Strongylocentrotus purpuratus [ouriço-do-mar Echinodermata (proteína prevista)] Ta, Trichoplax adhaerens (Placozoa) Tp, Thalassiosira pseudonana [diatom Heterokontophyta (predicted protein)] Tt, Thecamonas trahens [Apusozoa (proteína prevista)] Vd, Varroa destructor (ácaro Arthropoda).

A análise filogenética com um amplo conjunto de dados de sequências de canais de sódio mostrou que, embora Na seletiva de sódioV1 canais apareceram primeiro no Na urbano seletivo de sódioV2,5 canais surgiram exclusivamente em cnidários, como NvNaV2,5 forma um subgrupo dentro do Na contendo DEEXV2 canais junto com vários NaVs de hidrozoários (Spafford et al., 1998) e águas-vivas cifozoárias (Anderson et al., 1993) (Fig. 4). Todos os canais deste subgrupo carregam o filtro de seletividade de íon DKEA exclusivo (Gur Barzilai et al., 2012), sugerindo que o NaVO subtipo 2,5 divergiu de um canal contendo um filtro de seletividade DEEA após um evento de duplicação de genes no ancestral comum de todos os cnidários existentes há mais de 540 milhões de anos (Park et al., 2012). Notavelmente, cada um dos cnidários cujo genoma ou transcriptoma foi sequenciado até agora carrega pelo menos um NaV2.1 e um NaV2,5 canais.

Os NaChBac são uma família de canais seletivos de voltagem bacterianos de sódio (Ren et al., 2001 Yue et al., 2002 Koishi et al., 2004). No entanto, seu filtro de seletividade é composto pelos resíduos EEEE, assemelhando-se ao do CaVs (Durell e Guy, 2001 Ren et al., 2001 Koishi et al., 2004 Payandeh et al., 2011). Substituindo o filtro de seletividade no Na de mamíferosV1 canal do cérebro com EEEE, o CaVs filtro de seletividade, mostrou tornar o canal de sódio de cálcio seletivo (Heinemann et al., 1992). Como ambos CaV e NaV2 canais parecem ser mais antigos do que o Na específico do bilaterianoV1, podemos assumir que a seletividade de sódio em canais iônicos dependentes de voltagem evoluiu independentemente em pelo menos três linhagens na árvore da vida: em canais bacterianos de NaChBac, no cnidário NaV2,5 subfamília e no NaV1 canais. A pergunta óbvia é por que o Na condutor de cálcioV2 canais dominados em Metazoa até o surgimento do Na seletivo ao sódioV1 canais em bilaterais e por que os cnidários também desenvolveram um canal seletivo de sódio. A visão comum é que a seletividade do sódio é vantajosa para a evolução do sistema nervoso, principalmente devido à separação da sinalização do cálcio intracelular da sinalização neuronal (Hille, 2001 Petersen et al., 2005 Meech e Mackie, 2007). Além disso, como KVs gera a fase de queda do potencial de ação, enquanto NaVs é responsável por sua fase de subida, há uma clara vantagem funcional em separar os fluxos de íons sódio e potássio e aumentar a seletividade do NaV canais para íons de sódio. Portanto, é provável que as regiões de poros em ambos os campos urbanos NaV1 e o Na primordialVO canal de 2,5 cnidários evoluiu sob pressão seletiva para interromper a condutância de íons de potássio e cálcio, resultando em canais seletivos de sódio.

Apesar das vantagens da seletividade ao sódio, Nematostella N / DV2,5 mostrou ser expresso apenas em um subconjunto de células, enquanto muitos outros neurônios putativos expressam Na condutor de cálcioV2 canais (Gur Barzilai et al., 2012), indicando que a sinalização cnidária é fortemente baseada em cálcio. Portanto, é provável que, quando surgiram as primeiras redes neuronais, sua sinalização era baseada em cálcio, como exemplificado pelos ctenóforos contemporâneos (Hille, 2001 Meech e Mackie, 2007). Além disso, várias linhagens de animais com sistemas nervosos simples (por exemplo, nemátodos e equinodermos) parecem ter perdido de forma independente o NaV1 canais (Fig. 4) (Littleton e Ganetzky, 2000 Jegla et al., 2009 Widmark et al., 2011), e NaV2 canais com preferência de cálcio foram retidos em paralelo com canais seletivos de sódio em muitos grupos de animais, como ascídias, insetos e cnidários (Fig. 4) (Nagahora et al., 2000 Liebeskind et al., 2011 Cui et al., 2012 ) Em moscas, o NaVDescobriu-se que o DSC1 de 2 canais é expresso em vários tecidos e acredita-se que contribua para a regulação da excitabilidade neuronal e para a estabilidade da função do sistema nervoso em resposta a estresses ambientais (Zhang et al., 2013). Além disso, as moscas com mutação no gene DSC1 exibiram deficiência olfativa (Kulkarni et al., 2002 Zhang et al., 2013) e eram mais suscetíveis a choque térmico e fome em comparação com o tipo selvagem (Zhang et al., 2013). Portanto, parece que os potenciais de ação baseados em cálcio não são meramente uma relíquia evolutiva, mas podem ser vantajosos em circuitos neuronais simples. Curiosamente, todos os cnidários podem reagir muito rapidamente aos estímulos e alguns são até capazes de detectar e incorporar entradas visuais ou exibir padrões de comportamento mais complexos do que qualquer ctenóforo, equinoderme ou nematóide (Meech e Mackie, 2007 Garm et al., 2011). É possível que esta maior complexidade comportamental possa, pelo menos em parte, ser o resultado da integração do Na seletivo ao sódio.V2,5 canais em circuitos neuronais selecionados, que requerem sinalização mais rápida e maior precisão, como neurônios motores ou neurônios que controlam tentáculos de pólipos envolvidos na captura de presas em movimento.


Mecanismos candidatos para histerese em proteínas de domínio de detecção de voltagem S4

A atividade dos canais iônicos pode ser definida por pelo menos os dois parâmetros gerais a seguir: 1) a probabilidade dos canais serem abertos e 2) sua capacidade de conduzir e discriminar íons. Esta revisão se concentrará no primeiro desses parâmetros gerais.

Os canais dependentes de tensão são assim chamados porque a probabilidade desses canais serem abertos (probabilidade de abertura, PO) é uma função da diferença no potencial elétrico através da membrana. Existem vários tipos de canais controlados por voltagem. Aqui, o foco da revisão será em canais contendo um domínio de detecção de voltagem (VSD) feito de quatro segmentos helicoidais transmembrana (S1 & # x02013S4), com o quarto segmento (S4) carregando as principais cargas de detecção de voltagem. Este tipo de canais dependentes de tensão são chamados de canais & # x0201cS4 baseados em tensão, & # x0201d ou & # x0201cS4-VSD canais. & # X0201d

A evidência de histerese nos canais S4-VSD data do início dos anos 1980, quando foi descrita para a condutância de sódio observada no axônio gigante da lula (Bezanilla et al., 1982). Foi mostrado que a dependência da tensão para detectar o movimento da carga é dependente do potencial de retenção, mudando para potenciais mais negativos quando a membrana foi mantida em 0 & # x000a0mV em vez de & # x0221270 & # x000a0mV. Análogo ao caso da magnetização de um material ferromagnético, o retorno das cargas de passagem de volta ao seu estado de repouso exigiu trazer a membrana para potenciais mais negativos quando a membrana foi inicialmente mantida a 0 & # x000a0mV.

Observações semelhantes foram feitas mais de uma década depois com o canal de voltagem ativado seletivo de potássio conhecido como & # x0201cShaker & # x0201d (Olcese et al., 1997 Lacroix et al., 2011). Como aquela do axônio de lula & # x02019s condutância de sódio, a dependência de voltagem para o movimento de carga de Shaker era sensível ao potencial de retenção. Neste caso, a dependência de tensão para o movimento de carga de disparo foi deslocada aproximadamente 25 & # x000a0mV para tensões mais negativas quando o potencial de retenção foi definido em 0 & # x000a0mV em vez de & # x0221290 & # x000a0mV (Olcese et al., 1997). Pesquisas posteriores mostraram que a mudança na dependência da tensão foi superestimada devido a uma diminuição notável na taxa de desativação (Lacroix et al., 2011). No entanto, naquela época, foi proposto que os canais poderiam estar em uma conformação & # x0201cpermissiva & # x0201d ou & # x0201crelutante & # x0201d (Olcese et al., 1997). Na conformação & # x0201cpermissive & # x0201d, o canal pôde ser ativado e as cargas foram movidas prontamente. Na conformação & # x0201crelutante & # x0201d, o canal foi inativado e o movimento da carga foi lento, exigindo mais hiperpolarização da membrana. A adoção do estado & # x0201crelutante & # x0201d foi associada à lenta inativação de Shaker (Olcese et al., 1997). Como o estado inativado é alcançado após o estado aberto, ele se torna mais estável termodinamicamente.Isso tornaria o estado aberto um estado & # x0201ctransitory & # x0201d ou & # x0201cmeta-stable & # x0201d. A partir dessa ideia, pode-se concluir que tirar o canal de um estado estável pode exigir mais energia do que a necessária para mover as cargas em primeiro lugar (Villalba-Galea, 2017).

Outro aspecto interessante do Shaker é que os canais nas conformações & # x0201cpermissive & # x0201d e & # x0201creluctant & # x0201d são considerados como estando em populações interconvertíveis separadas, onde a fração de canais em cada uma dessas populações depende do potencial de retenção (Olcese et al., 1997). O fato de haver duas populações significa que a atividade do VSD pode adotar modos de operação & # x0201c. & # X0201d Para ilustrar essa ideia, consideremos um canal dependente de tensão que tem dois estados: fechado e aberto (Figura 1A , principal). Após a ativação de um potencial de retenção inicial (V0.1, ini) para um determinado potencial que o levará a 90% da atividade (V90), os canais podem mudar para outro & # x0201cmodo de atividade & # x0201d com uma sensibilidade diferente ao potencial de membrana (Figura 1A, parte inferior). Neste novo modo, a membrana deve ser definida em um potencial (V0,1, trocado) que é mais negativo do que V0.1, ini a fim de trazer o canal para o nível de atividade inicial (Figura 1B).

FIGURA 1. (UMA) Modelo de dependência de tensão para um canal que consiste em um estado fechado (C) e um estado aberto (O). Após a ativação, o modelo de dois estados muda de um modo de atividade para outro. Para o modo inicial, a tensão é a metade do potencial máximo (Vh) é & # x0221240 & # x000a0mV. Para o modo final, Vh é & # x0221260 & # x000a0mV. (B) Gráfico semi-log da atividade (fração dos canais abertos). Devido ao interruptor de modo, a mudança no potencial necessária para conduzir a fração de canais abertos de 0,001 a 0,9 (& # x0007cV90& # x02212V0.1, ini& # x0007c) é menor em magnitude que a mudança no potencial necessária para trazer a fração de canais abertos de volta para 0,001 (& # x0007cV0,1, trocado& # x02212V90) Os índices 0,1 e 90 referem-se a 0,1 e 90% da população do canal, respectivamente.

Por muitos anos, as mudanças na dependência da voltagem para o movimento de carga no Shaker foram associadas à inativação lenta, que se pensava ser devido a rearranjos conformacionais no domínio dos poros. No entanto, estudos de movimento de carga na fosfatase sensível à voltagem isolada de Ciona intestinalis (Ci-VSP) forneceu evidências que demonstram que o DVD pode ser um fenômeno intrínseco de um S4-VSD (Villalba-Galea et al., 2008 Akemann et al., 2009 Villalba-Galea et al., 2009b). A enzima controlada por voltagem Ci-VSP é uma proteína dimérica feita de um S4-VSD homólogo aos canais dependentes de voltagem (Murata et al., 2005 Murata e Okamura, 2007 Sakata e Okamura, 2019). O VSD está ligado ao domínio de fosfato de fosfoinositídeo por meio de um motivo de ligação de fosfolipídeo / fosfoinositídeo (Villalba-Galea et al., 2009a Kohout et al., 2010 Hobiger et al., 2012 Hobiger et al., 2013). A ação do VSD confere sensibilidade à voltagem para a atividade enzimática do VSP & # x02019s por meio de um mecanismo que permanece em debate (Villalba-Galea, 2012a Villalba-Galea, 2012b Sakata e Okamura, 2019).

Sob o grampo de tensão, as correntes de detecção podem ser observadas durante a ativação de um VSD. Essas correntes são devidas ao movimento das cargas de detecção no VSD, análogo às correntes de disparo em canais dependentes de voltagem (Sakata e Okamura, 2019). No caso de Ci-VSP, a dependência de tensão para movimento de carga muda cerca de & # x0221250 & # x000a0mV ao manter o potencial de membrana em & # x0002b80 & # x000a0mV em vez de & # x0221260 & # x000a0mV ou mais tensões negativas. Além disso, a deleção do domínio de fosfato de fosfoinositídeo de Ci-VSP causa uma mudança maior na dependência de voltagem para detectar o movimento de carga após o relaxamento. Mudança que quase dobrou a da enzima intacta (Villalba-Galea et al., 2008). Esta observação indica que um VSD isolado pode mudar sua dependência de voltagem sem ser acoplado a outro domínio. Ainda não foi possível determinar se a interação entre os dois VSDs causa uma mudança na dependência da tensão. No entanto, estudos mais recentes expressando o VSD isolado de Shaker mostram que esse tipo de domínio pode apresentar um comportamento histérico intrínseco (Zhao e Blunck, 2016).


Modelagem cinética em tempo real de canais de íons controlados por voltagem usando grampo dinâmico ☆

Propomos o que, até onde sabemos, é uma nova técnica para modelar a cinética de canais iônicos dependentes de voltagem em um contexto funcional, em neurônios ou outras células excitáveis. O princípio é bloquear farmacologicamente o tipo de canal estudado e substituí-lo funcionalmente por pinça dinâmica, com base em um modelo computacional. Em seguida, os parâmetros do modelo são modificados em tempo real (manual ou automaticamente), com o objetivo de combinar o comportamento dinâmico da célula (por exemplo, forma do potencial de ação e frequência de pico), mas também as propriedades transitórias e de estado estacionário de o modelo (por exemplo, aqueles derivados de gravações de pinça de tensão). Através desta abordagem, pode-se encontrar um modelo e valores de parâmetro que explicam tanto a dinâmica celular observada quanto as propriedades biofísicas do canal. Testamos extensivamente o método, com foco no Nav modelos. Modelos complexos de Markov (10-12 estados ou mais) podem ser integrados com precisão em tempo real a & gt50 kHz usando a matriz de probabilidade de transição, mas não o método de Euler explícito. A praticidade da técnica foi testada com experimentos em neurônios marca-passo da rafe. Por meio do ajuste automatizado em tempo real, um modelo de Hodgkin-Huxley pode ser encontrado que reproduz bem a forma do potencial de ação e a frequência de spiking. Adicionando um compartimento axonal virtual com uma alta densidade de Nav os canais melhoraram ainda mais a forma do potencial de ação. O procedimento computacional foi implementado no software QuB gratuito, rodando em Microsoft Windows e apresentando uma interface gráfica amigável.

Murtaza Z. Mogri & # x27s endereço atual é Dept. of Bioengineering, Stanford University, Stanford, CA.


Biology 112, Homework Collection P3

O que aconteceria quando um canal artificial de K + fosse inserido na membrana de um axônio no potencial de repouso?

2. muitos canais de Na + dependentes de voltagem abertos

3. Os íons Na + entram na célula

5. No local g, a membrana do axônio está no potencial de repouso.

2. No local f, a membrana do axônio atinge o limiar e os canais de Na + dependentes de voltagem se abrem.

7. No local e, o potencial de membrana muda de sinal (de um valor negativo para um valor positivo) e os canais de Na + dependentes de voltagem estão abertos.

4. No local d, os canais de Na + dependentes de voltagem estão inativados e os canais de K + dependentes de voltagem estão se abrindo.

1. No local c, o potencial da membrana muda de sinal (de um valor positivo para um valor negativo) e os canais de K + dependentes de voltagem estão abertos.

6. No local b, os canais de K + dependentes de voltagem estão fechando.

Suponha, entretanto, que um potencial de ação seja artificialmente disparado no ponto indicado pela seta vermelha. Em que sequência o potencial de ação passaria pelos pontos (a), (b) e (c)?

O primeiro passo no processo de diagnóstico é desenvolver uma lista de condições "candidatas" que possam explicar os sintomas do paciente. Seu médico assistente menciona algumas causas possíveis de fraqueza muscular e paralisia:

- miastenia grave
- botulismo
- hipocalemia
- hipercalemia

Ela pede um exame de sangue inicial e entrega o paciente a você. Ao conversar com o paciente, você obtém as seguintes informações sobre sua saúde geral e histórico médico familiar.

* Ele não tem histórico médico significativo e não está tomando nenhum medicamento.
* Não há histórico familiar de doença cardíaca, derrame, diabetes ou câncer.
*Ele não fuma.
* Ele bebe moderadamente, mas nega o uso de substâncias ilegais.
* Sua dieta consiste exclusivamente em vegetais frescos e carnes criadas organicamente.
* Ele não come alimentos pré-embalados.
* Ele treina quatro vezes por semana em sua academia local.
* Ele não relata ter adoecido recentemente.
* Ele teve episódios repetidos de fraqueza muscular e paralisia nos últimos três meses.

- A hipercalemia é uma condição em que o nível de potássio (K +) no sangue se eleva acima do normal.

- A miastenia gravis é uma doença auto-imune. Os anticorpos bloqueiam os receptores de acetilcolina, impedindo a abertura dos canais iônicos para despolarizar a célula muscular. Os pacientes apresentam primeiro fraqueza ou paralisia dos músculos das pálpebras e dos olhos.

*Exame físico
* Respirar, engolir e falar são normais.
* Ele não tem fraqueza nos músculos faciais, pálpebras caídas e problemas de visão.
* O paciente não relata dores de cabeça, tontura ou confusão.
* Ele não tem tosse ou falta de ar - os pulmões parecem com clareza no exame.
* Sua pele parece normal e intacta, sem feridas abertas.

O hemograma do paciente indica que o nível de potássio no sangue está abaixo do normal, sugerindo que o paciente está hipocalêmico, não hipercalêmico.

2.Como resultado do K + fluir para baixo em seu gradiente de concentração, a célula nervosa se torna ____ hiperpolarizada ______. (Dentro da célula perderá K + e se tornará mais negativo do que o normal, observe que o potencial de membrana em repouso é -70mV.).

3. Portanto, o potencial de membrana em repouso do paciente tem um valor mais ____negativo___ do que o normal.

4. Isso torna ___mais difícil____ para a célula nervosa atingir o limite para um potencial de ação (o limite é -55mV).

5. Como resultado, a célula nervosa libera ____less___ neurotransmissor na fenda sináptica,

* Os rins são importantes para regular os níveis de potássio liberados na urina. Um paciente com disfunção renal pode estar liberando potássio em excesso na urina, fazendo com que o nível de potássio no sangue caia.
* Canais iônicos anormais podem permitir que grandes quantidades de potássio sejam transferidas do sangue para as células sob certas condições, fazendo com que o nível de potássio no sangue caia.

Uma maneira rápida de saber a diferença entre esses dois diagnósticos é calcular o gradiente transtubular de potássio (TTKG). O TTKG é uma medida da quantidade de K + mantida nos dutos coletores dos rins. Se os rins do paciente estiverem funcionando adequadamente, o nível baixo de potássio no sangue deve fazer com que o rim reduza severamente a quantidade de K + liberada na urina, a fim de tentar aumentar os níveis de K + no sangue. No entanto, se a hipocalemia for causada por rins com disfunção, os níveis de K + na urina estarão elevados.

TTKO = ([K +] urina × osmolaridade do plasma) ÷ ([K +] Plasma × osmolaridade da urina)

Como seu paciente é japonês, você decide solicitar um painel de teste de função tireoidiana (TFT) que mede os níveis do hormônio tireoidiano (T3, T4) e o nível do hormônio estimulador da tireoide (TSH). (A figura aqui mostra como os hormônios no sistema hipotálamo-hipófise-tireoide são regulados.) Além disso, você solicita um teste para autoanticorpos que indicará se há ou não um distúrbio autoimune, como a doença de Graves, contribuindo para a condição do paciente.

Use os resultados do seu paciente para determinar se ele tem TPP e, em caso afirmativo, a causa do hipertireoidismo. Existem várias causas possíveis para o hipertireoidismo:

* A doença de Graves é uma doença autoimune na qual são produzidos autoanticorpos da tireoide que se ligam e ativam o receptor de TSH, causando um aumento na liberação de T3 e T4 da tireoide.
* Um tumor da tireoide causa um aumento nas células produtoras de T3 e T4 na tireoide.
* Um tumor hipofisário causa um aumento nas células secretoras de TSH na pituitária anterior.

Os cientistas classificam os comportamentos como inatos ou aprendidos, dependendo se o comportamento foi influenciado por experiências anteriores. Eles também tentam determinar as causas imediatas e as causas finais dos comportamentos que estudam.

- Os abutres egípcios usam pedras para quebrar ovos de avestruz, que depois comem.
- Um abutre pode procurar até 50 m de distância de um ovo de avestruz por uma pedra apropriada (que geralmente é em forma de ovo) para usar para quebrar o ovo. O abutre então joga a pedra no ovo até que ele se rache.
- Este mesmo comportamento de arremesso de pedras também ocorre em pássaros jovens nascidos em cativeiro que não foram expostos a adultos que arremessam pedras. No entanto, esses abutres ingênuos tiveram que aprender que os ovos de avestruz eram uma fonte de alimento.

Alguns cientistas teorizam que esse comportamento se desenvolveu a partir da tática de jogar ovos menores para abri-los. Ovos de avestruz, entretanto, são grandes demais para serem pegos e jogados, então talvez a técnica de lançamento de pedras tenha evoluído nos abutres. Isso poderia explicar por que os abutres escolhem rochas em forma de ovo, em vez de rochas dentadas ou irregulares.
Com base nas observações dos cientistas e em seu conhecimento sobre o comportamento animal, quais das afirmações a seguir são verdadeiras?

- Questionando se o comportamento de arremesso de pedras surgiu de arremesso de ovo se relaciona com a causa final.


Assista o vídeo: Vídeo curto - Canais Iônicos (Janeiro 2022).