Em formação

Influência da temperatura na transcrição, ligação de proteínas e taxas de decaimento


Eu sou o tipo de biólogo que não sabe muito sobre genética molecular e sobre a dinâmica das reações bioquímicas.

Pergunta

Minha pergunta diz respeito à influência da temperatura na dinâmica dos processos genéticos moleculares. Normalmente, gostaria de saber como (quantitativamente falando, procurando por $ Q_ {10} $ por exemplo) os seguintes parâmetros são modificados com a temperatura.

  • taxa de transcrição
    • ATUALIZAR Veja Como a taxa de transcrição é influenciada pela temperatura?
  • ligação de proteína a um motivo de ligação de DNA
    • ATUALIZAR veja a influência da temperatura na ligação às proteínas e nas taxas de decomposição
  • taxa de decadência de proteína
    • ATUALIZAR veja a influência da temperatura na ligação às proteínas e taxas de decomposição
  • taxa de decaimento do mRNA
    • ATUALIZAR respondido por @Chris abaixo

Por que eu faço essa pergunta?

A fim de saber que tipo de valores de parâmetros padrão devo inserir para fins de modelagem em biologia evolutiva. Embora nosso escopo seja grande, decidimos que consideraríamos os valores dos parâmetros observados na levedura.


Isso parece simples quando se pensa a respeito, mas encontrar evidências concretas não é realmente fácil. Como é muito longo para um comentário, tenho que colocá-lo como uma resposta. Apenas alguns pensamentos: Todas as reações enzimáticas são, obviamente, dependentes da temperatura e geralmente têm uma temperatura ótima nas temperaturas de vida específicas. Para leveduras, é cerca de 27 ° C, para termófilos é muito mais alto. Para a transcrição, vários outros fatores, incluindo a acessibilidade da cromatina e a disponibilidade de cofatores, desempenham um papel importante, além da maior atividade de uma enzima. Este artigo pode ser interessante para você: "A medição direta das taxas de transcrição revela vários mecanismos para a configuração da resposta da Arabidopsis à temperatura ambiente".

A ligação ao DNA deve ser um processo estatístico entre a associação e a dissociação em um determinado local de ligação. Em temperaturas mais altas, o turnover no local de ligação deve ser maior (porque há mais energia disponível para promover a dissociação). T


Splicing e base de toque da transcrição: montagem e função do spliceossomo co-transcricional

O splicing ocorre principalmente durante a transcrição. A catálise é realizada por meio da montagem em etapas do spliceossomo no RNA nascente.

Recente na Vivo estudos demonstraram que o spliceossomo catalítico está fisicamente próximo da RNA polimerase II, ressaltando que a montagem do spliceossomo e a catálise de splicing ocorrem em escalas de tempo semelhantes à da transcrição.

A taxa de alongamento da transcrição e a pausa influenciam a disponibilidade do site de splice e consequente montagem de spliceosome. A sequência de DNA, o posicionamento do nucleossomo, a estrutura da cromatina e as modificações pós-traducionais do domínio carboxi-terminal da RNA polimerase II influenciam a dinâmica da transcrição.

O splicing é acoplado a outros eventos de processamento de pré-mRNA, como capeamento de extremidade 5 ', processamento de extremidade 3' e edição de RNA, garantindo assim a produção eficiente e precisa de mRNAs maduros.

O processamento co-transcricional eficiente do RNA nascente pode ser alcançado concentrando a transcrição e as maquinarias de processamento em compartimentos sem membrana subnuclear.


INTRODUÇÃO

As medições dos níveis de mRNA são uma abordagem amplamente utilizada para investigar a expressão gênica em uma variedade de contextos experimentais, desde a genética molecular mecanicista até estruturas ecológicas e evolutivas. Embora os níveis de transcrição em estado estacionário dentro de uma célula sejam determinados por taxas de síntese (transcrição) e degradação, as alterações nos níveis de mRNA são geralmente inferidas como decorrentes de alterações na síntese.

As taxas de transcrição mudam quando a atividade do promotor é alterada por causa da remodelação da cromatina ou ligação de reguladores transcricionais (proteínas de ligação ao DNA e co-reguladores), que afetam coletivamente o recrutamento da maquinaria transcricional geral e o início da transcrição. Uma vez que o mRNA precursor é feito, ele deve ser processado (ou seja, splicing, poliadenilação, capping) e exportado para o citoplasma. Lá, muitos fatores pós-transcricionais influenciam se um mRNA específico entra na tradução. Tais fatores são mecanismos de vigilância de mRNA (por exemplo, decaimento de mRNA mediado sem sentido, decaimento de mRNA mediado sem interrupção e decaimento no-go), várias vias de decaimento (ou seja, exo- ou endoribonucleases) e controles de estabilidade [por exemplo, elementos ricos em adenilato-uridilato (AU), proteínas de ligação a poli (A)] (ver Garneau et al., 2007).

Além dos fatores que afetam os níveis de mRNA, existem outros controles pós-transcricionais que alteram a capacidade de transcrições específicas de serem traduzidas. Por exemplo, na via de interferência de RNA, alguns microRNAs (miRNA) funcionam como silenciadores de genes ligando-se a mRNAs alvo e evitando a tradução ou iniciando a degradação (ver Valencia-Sanchez et al., 2006). Assim, o nível de um mRNA específico pode permanecer alto, mas resultar em pouca tradução por causa da ligação de reguladores. Esses mecanismos ajudam a explicar a perda aparente de estequiometria quando os níveis de mRNA e proteínas mudam de forma incongruente (ver Suarez e Moyes, 2012).

Para muitos aplicativos, a causa subjacente de uma mudança no nível de transcrição é de menos interesse do que o fato de a mudança ter ocorrido. Por outro lado, os níveis de transcrição são frequentemente usados ​​para inferir uma mudança na regulação do gene e, portanto, as mudanças nos níveis de transcrição também são atribuídas a mudanças na transcrição. Mesmo com genes únicos, é difícil ligar quantitativamente o grau de ativação do gene (ou seja, síntese de mRNA) ao acúmulo de mRNA e, portanto, esses dois parâmetros são frequentemente discutidos em termos qualitativos. No entanto, ao traçar o perfil de transcritos de proteínas multiméricas e vias complexas, há uma suposição subjacente de que os níveis de transcrição devem mudar em paralelo à transcrição. Durante a biogênese mitocondrial, descrita em mamíferos sob exercício (Hawley e Holloszy, 2009), estimulação elétrica (Baar et al., 2002) e exposição ao frio (Puigserver et al., 1998 Wu et al., 1999), uma rede de mestre genético reguladores são pensados ​​para coordenar a transcrição de genes que codificam os cinco complexos (I – V) da cadeia de transporte de elétrons (ETC) (Hock e Kralli, 2009).

Quando a biogênese mitocondrial é induzida em peixes através da aclimatação ao frio, os níveis de mRNA das várias subunidades do complexo IV [citocromo c oxidase (COX)] do ETC carece de qualquer estequiometria (Duggan et al., 2011). Sob condições que causaram um aumento nas atividades COX, os níveis de mRNA para algumas subunidades não mudaram (por exemplo, COX6B-2), enquanto outros mudaram em paralelo com a atividade COX (COX5B-2 e COX6A-2), e vários mostraram um exagero resposta (por exemplo, COX4-1 e COX7C). A influência potencial das taxas de degradação específicas da subunidade nos perfis de transcrição COX não foi bem estudada, e não no contexto da aclimatação térmica em um animal ectotérmico. Até o momento, em mamíferos, há alguma evidência de um papel da degradação do mRNA no controle da COX4 (Zhang e Wong-Riley, 2000) e um papel do miRNA no controle de genes COX codificados por núcleo [miRNA-338 (Aschrafi et al., 2012)], genes COX codificados por mitocôndrias [miRNA-181c (Das et al., 2012)] e montagem COX [miRNA-210 (Colleoni et al., 2013)].

Neste estudo, investigamos (1) o impacto da aclimatação térmica na degradação do mRNA e como a degradação pode contribuir para (2) mudanças nos níveis de transcrição em estado estacionário com a temperatura e (3) perda de estequiometria do mRNA entre as subunidades. Usamos um paradigma de aclimatação térmica de peixes dourados [Carassius auratus (Linnaeus)] para avaliar o papel da degradação do mRNA específico do transcrito como uma explicação potencial para as mudanças não estequiométricas no mRNA das várias subunidades. Os resultados deste estudo não apenas elucidam o controle transcricional de COX em peixes, mas também esclarecem o controle de mRNA em ectotérmicos.


Introdução

Muitos processos biológicos são acompanhados por programas dinâmicos de expressão gênica, nos quais os níveis de centenas ou milhares de transcritos são regulados (Ferea e Brown, 1999). Como os níveis de RNA são determinados pelo equilíbrio entre transcrição e degradação, a contribuição de ambos os processos deve ser levada em consideração para um entendimento completo da regulação da expressão gênica (Perez-Ortin, 2007). No entanto, a maioria dos estudos em grande escala enfocou a função da transcrição e relativamente pouco se sabe sobre a importância do controle pós-transcricional e sobre como os dois níveis de regulação são coordenados.

Os processos de transcrição globais foram amplamente investigados pelo mapeamento sistemático dos locais de ligação do fator de transcrição (Farnham, 2009). Esses estudos revelaram a existência de redes complexas entre os fatores de transcrição e os genes que eles regulam. As redes transcricionais são enriquecidas em conexões recorrentes simples, chamadas de motivos de rede, que podem conferir propriedades cinéticas específicas à rede regulatória (Alon, 2007).

O turnover do RNA é regulado por proteínas de ligação ao RNA (RBPs) que reconhecem sequências específicas em seus alvos e aumentam ou reprimem o decaimento do mRNA modulando sua interação com a maquinaria de degradação (Garneau et al, 2007). A função de todo o genoma dos RBPs no controle do turnover do RNA pode ser investigada pela identificação de transcritos associados a RBP e pela análise das consequências funcionais da inativação dos RBPs. Os alvos de RBP podem ser determinados purificando proteínas individuais juntamente com RNAs ligados, seguido pela identificação dos transcritos usando microarrays de DNA (RIp-chip, para imunoprecipitação RBP seguida por análise com chips de DNA) (Keene et al, 2006). O chip RIP foi aplicado a um grande número de RBPs (ver Mata et al, 2005 Halbeisen et al, 2008 para análises e Hogan et al, 2008 para um exemplo recente), incluindo alguns reguladores de decaimento de RNA (as proteínas Puf1, HuR, tristetraprolina e AUF1 Lopez de Silanes et al, 2004 Galgano et al, 2008 Mazan-Mamczarz et al, 2009 Morris et al, 2008 Stoecklin et al, 2008 Mukherjee et al, 2009). Esses estudos revelaram que os RBPs se associam a populações específicas de RNA que frequentemente codificam proteínas com características comuns. Acredita-se que essas redes de interações RBP-RNA coordenem os destinos das moléculas de RNA em cada etapa do controle pós-transcricional (Keene e Tenenbaum, 2002). Os estudos do chip RIp foram complementados por abordagens funcionais, nas quais os genes que codificam RBPs foram silenciados ou mutados para revelar efeitos na estabilidade do transcrito (Halbeisen et al, 2008). Além disso, as taxas de decaimento da transcrição podem ser medidas para genomas inteiros (mais comumente pela inativação da transcrição e usando microarrays para acompanhar a redução nos níveis de RNA ao longo do tempo), permitindo assim a distinção entre efeitos diretos na estabilidade do RNA e consequências indiretas da inativação do RBP (Perez-Ortin, 2007). Esta abordagem foi aplicada a células de levedura que carregam mutações em genes que codificam componentes de vias de decaimento (as deadenilases CCR4 e PAN2 e as RBPs PUB1 e PUF4 específicas (revisadas em Halbeisen et al, 2008) e para eucariotos superiores (a proteína tristetraprolina Lai et al, 2006). Um estudo que mediu os níveis de transcrição e as taxas de decaimento de todo o genoma durante o estresse oxidativo encontrou relações complexas entre as mudanças nos níveis de mRNA e as taxas de renovação (Shalem et al, 2008), sugerindo a existência de uma coordenação sofisticada entre a produção e a degradação do mRNA. Finalmente, um estudo recente mostrou que a modelagem matemática que incorpora taxas de decaimento de todo o genoma pode ser usada para gerar perfis de atividade transcricional (que são diferentes dos perfis de expressão gênica, que refletem apenas os níveis de transcrição). Os perfis de atividade permitem a identificação de grupos de genes que são co-regulados por fatores de transcrição específicos (Barenco et al, 2009 ).

Para analisar as contribuições da transcrição e do turnover do mRNA durante os programas de expressão genética dinâmica, usamos a diferenciação sexual da levedura de fissão. Schizosaccharomyces pombe como um modelo. Este processo de desenvolvimento culmina na meiose e na formação de esporos (Yamamoto et al, 1997), e envolve um programa complexo de expressão gênica em que & gt40% do genoma (& gt2000 genes) é regulado (Mata et al, 2002). Embora o controle transcricional seja crítico para a regulamentação de grande parte do programa (Mata e Bähler, 2006 Xue-Franzen et al, 2006 Mata et al, 2002, 2007), o controle da estabilidade do mRNA também tem uma função (Harigaya et al, 2006 McPheeters et al, 2009). Os genes regulados positivamente durante a diferenciação sexual foram classificados em quatro grupos principais de acordo com seus perfis de expressão. Em particular, um grupo de ∼555 genes (genes intermediários) é induzido transitoriamente no momento das divisões meióticas pela atividade do fator de transcrição Mei4p, que tem seu próprio pico de expressão durante este período (Horie et al, 1998 Watanabe et al, 2001 Mata et al, 2007 ).

Vários genes não caracterizados que codificam domínios de ligação a RNA são altamente induzidos durante a diferenciação sexual (Mata et al, 2002). Relatamos aqui uma investigação sobre a função de um deles, meu5, que é induzida durante as divisões meióticas. Usamos abordagens de todo o genoma para caracterizar a função de Meu5p na regulação do decaimento do mRNA. Nossos resultados estabelecem que Meu5p se liga e estabiliza um subconjunto de genes meióticos, determinando assim sua expressão temporal correta. Os alvos Meu5p são induzidos transcricionalmente pelo fator de transcrição Mei4p, que também ativa meu5 expressão. Portanto, as mudanças dinâmicas nos níveis de mRNA durante a diferenciação meiótica são determinadas pela regulação coordenada da transcrição e decaimento do mRNA.


Resultados

Marcação de RNA não perturbador em levedura

O análogo de nucleosídeo 4sU é prontamente absorvido por células de uma ampla gama de organismos eucarióticos e é eficientemente incorporado em seu RNA recém-transcrito. Isso pode ser usado para rotular metabolicamente e isolar RNA recém-transcrito do RNA celular total com alta especificidade (Kenzelmann et al, Dolken 2007 et al, 2008). Para estabelecer a rotulagem 4sU na levedura de brotamento S. cerevisiae, nós cultivamos células na presença de 100 μM – 5 mM 4sU. Embora tenhamos observado incorporação específica de 4sU dependente da concentração, a eficiência da incorporação foi baixa e a quantidade de RNA recém-transcrito recuperado foi muito pequena (não mostrado). Isso sugeriu uma absorção ineficiente de 4sU em células de levedura, em vez de um bloqueio intracelular na ativação ou incorporação por RNA polimerases.

No fermento de fissão Schizosaccharomyces pombe, a expressão do transportador de nucleosídeo equilibrado humano (hENT1) permite a absorção celular do análogo de nucleosídeo 5-bromo-2′-desoxiuridina, resultando na marcação de DNA durante a replicação (Hodson et al, 2003). Para testar se este transportador também pode mediar a absorção eficiente de 4sU na levedura de brotamento S. cerevisiaee, assim, instalar a rotulagem de RNA eficiente, cultivamos uma cepa BY4741 expressando hENT1 até uma fase logarítmica, adicionamos 4sU e isolamos o RNA em vários pontos de tempo (Figura 1A, Materiais e métodos). Isso aumentou significativamente a incorporação de 4sU a um nível semelhante ao geralmente alcançado em células de mamíferos, facilitando assim a separação eficiente do RNA celular total em RNA recém-transcrito e pré-existente.

Em seguida, testamos se Pol II incorpora o tionucleotídeo normalmente em RNA em vitro (Brueckner et al, Sydow 2007 et al, 2009). Pol II usou os substratos UTP e 4sU-triposfato (4sUTP) com cinética muito semelhante (Figura Suplementar S1). Considerando que kgato estava inalterado, KM aumentou de 3 nM para UTP para 13 nM para 4sUTP, indicando uma afinidade de substrato ligeiramente diminuída que pode resultar do emparelhamento de base mais fraco entre 4sUTP e o modelo (Figura 1C). Esta pequena diferença é provavelmente irrelevante na Vivo, onde a concentração de substrato é maior em várias ordens de magnitude do que estes KM valores. Para investigar se a marcação de RNA perturbou a expressão do gene na Vivo, comparamos os níveis de RNA em células que expressam hENT1 tratadas com 4sU com células de tipo selvagem não tratadas (materiais e métodos). Por um período de marcação de 6 min, não houve mudanças significativas nos níveis de RNA medidos com matrizes de expressão Affymetrix (Figura 1B, seção suplementar 12.6, Tabela suplementar 4, Figuras suplementares S11, S12). Assim, a marcação de RNA não perturba a transcrição nem o transcriptoma de levedura. Embora outros processos celulares possam ser influenciados por 4sU, seu efeito no metabolismo do mRNA aparentemente não é significativo, pois não foram observadas alterações nos níveis de mRNA total.

Análise de transcriptoma dinâmico

Para determinar o tempo de marcação ideal, purificamos o RNA total, recém-transcrito (marcado) e pré-existente (não marcado) em 3, 6, 12 e 24 min após a adição de 4sU, e submetemos essas frações à análise de array de expressão (Materiais e métodos). Os dados replicados sempre mostraram correlações acima de 0,9 para cada fração de RNA em cada ponto de tempo (Figura Suplementar S2). Para estimar a síntese de mRNA e as taxas de decaimento a partir de medições de ponto de tempo individuais, um novo modelo quantitativo de estado estacionário foi desenvolvido (Materiais e métodos, seção suplementar 13, Figuras suplementares S15-S18). O modelo assume uma síntese de RNA constante e taxas de decaimento durante o tempo de marcação. O modelo considera o crescimento exponencial das células e as variações nas eficiências de extração de RNA. Ele também corrige as diferenças na fração de RNAs recentemente sintetizados que escapam à marcação. Esta fração é maior para RNAs mais curtos e depende do conteúdo de uridina do RNA e da eficiência da marcação (Figura 2A).

A avaliação da reprodutibilidade dos dados (seção suplementar 12.6) e estudos de simulação (seção suplementar 13.4) sugeriram um tempo ótimo de marcação de 6 min, que foi subsequentemente usado em todos os experimentos. Este foi curto o suficiente para atender a suposição de síntese constante e taxas de decaimento durante a marcação, mas suficientemente longo para produzir RNA marcado o suficiente para medições robustas. As taxas de decaimento relativas dentro de um experimento podem ser estimadas com segurança, mas os valores absolutos são mais difíceis de obter (Seção complementar 13.5). Para investigar isso, conduzimos um experimento clássico de decaimento no tempo usando a inibição da transcrição e RT-PCR, e obtivemos taxas de decaimento geralmente consistentes (Figura Suplementar S3).Referimo-nos a este método de derivar a síntese de mRNA e taxas de decaimento após um curto pulso de marcação de RNA como DTA.

As taxas de síntese são baixas para a maioria dos mRNAs

Usamos DTA para derivar taxas de síntese e taxas de decomposição (meia-vida) para a maioria (4508) dos mRNAs de levedura (Suplementos, Parte I, Site suplementar). Com base em uma estimativa aproximada publicada de 15.000 transcritos de mRNA por célula de levedura (Hereford e Rosbash, 1977), calculamos a taxa de síntese como o número de moléculas de mRNA produzidas por célula por tempo de ciclo celular (150 min) (Figura 2B) . As taxas obtidas se correlacionaram com as taxas relatadas anteriormente obtidas por run-on nuclear (Pelechano e Perez-Ortin, 2010) (Figura Suplementar S4). As taxas de síntese variaram de 1 a -600 mRNAs por célula por tempo de ciclo celular. A distribuição da taxa de síntese é fortemente enviesada para a direita (assimetria 5), ​​com uma taxa de síntese média de 18 RNAs por célula e tempo de ciclo celular (média 31, 1º quartil 11 e 3º quartil 33). Isso mostra que apenas algumas cópias são feitas para a maioria dos mRNAs (Figura 2B). Esta observação é geralmente consistente com imagens de células vivas de molécula única (Park et al, 2010). Observamos que mRNAs com altas taxas de síntese codificam genes de proteínas ribossômicas e genes envolvidos na biogênese ribossômica, enquanto mRNAs com baixas taxas de síntese derivam de genes que são silenciados durante o crescimento normal, incluindo a maioria dos TFs (Figura 2B).

O decaimento do mRNA não está correlacionado com a síntese

O DTA mediu uma meia-vida média do mRNA de 11 minutos (média de 14, 1º quartil 9 e 3º quartil de 17 minutos, Figura 2B). A distribuição da meia-vida é fortemente enviesada para a direita (assimetria 8). Assim, a maioria dos mRNAs em leveduras são sintetizados e degradados várias vezes durante o ciclo celular. A análise da ontologia genética (GO) revelou que os mRNAs com as meias-vidas mais curtas estão envolvidos na regulação da transcrição e do ciclo celular e no processamento do mRNA (Figura 2C). Em contraste, os mRNAs com meia-vida longa estão envolvidos no metabolismo do carbono e do nitrogênio e incluem muitos transcritos que codificam enzimas de manutenção (Figura 2D). As taxas de decaimento não se correlacionaram com as taxas publicadas (Holstege et al, 1998 Wang et al, 2002 Grigull et al, 2004 Shalem et al, 2008), que foram obtidos com protocolos que perturbam o metabolismo do mRNA (Figura Suplementar S5). As taxas de decaimento não se correlacionaram com o comprimento do mRNA (Figura Suplementar S6), inconsistente com os modelos que assumem degradação estocástica, mas consistente com o controle da degradação no nível de deadenilação e decapeamento do mRNA. Muitos mRNAs com meia-vida longa continham elementos ricos em AU em sua região 3 'não traduzida, consistente com um papel estabilizador desses elementos (Barreau et al, 2005). As taxas de decaimento se correlacionaram fracamente com os níveis de mRNA (correlação de Spearman -0,59), mas as taxas de síntese se correlacionaram bem com os níveis de mRNA (correlação de Spearman 0,84). No entanto, as taxas de decaimento não se correlacionaram com as taxas de síntese (correlação de Spearman -0,15). Isso indica que o decaimento e a síntese de mRNA são funcionalmente independentes durante o crescimento normal e que ambos os processos contribuem para definir os níveis de mRNA celular.

O DTA monitora as mudanças de taxa durante o estresse osmótico

A análise acima e os estudos publicados estimam a síntese de mRNA e as taxas de decaimento apenas no estado estacionário (Dolken et al, 2008 Amorim et al, 2010). Para monitorar as mudanças na taxa e, portanto, a dinâmica no metabolismo do mRNA, estendemos o DTA para uma análise resolvida no tempo da resposta ao estresse osmótico (seção complementar 14). As células cresceram até uma fase logarítmica e dividiram-se em culturas de controle e amostra (Figura 3A). O cloreto de sódio foi adicionado à cultura da amostra e completado até uma concentração de 0,8 M. O controle e as culturas da amostra foram divididas em alíquotas, e 4sU foi adicionado a 0, 6, 12, 18, 24 e 30 min após a adição do sal. Após a marcação por 6 min, o RNA total, marcado e não marcado foi purificado e analisado com matrizes de expressão gênica. As taxas foram estimadas usando DTA dentro das janelas de tempo 0–6, 6–12, 12–18, 18–24, 24–30 e 30–36 min após a indução de estresse. Os resultados foram confirmados para genes selecionados por RT-PCR quantitativo em 12, 30 e 36 min após o estresse salino, em que fortes mudanças nas taxas foram observadas (Figura Suplementar S3).

Três fases da resposta ao estresse osmótico

O DTA resolveu as três fases da resposta ao estresse osmótico com clareza sem precedentes. Nos primeiros 12 minutos após a adição de sal (fase de choque), essencialmente todas as taxas de síntese e decaimento diminuíram, refletindo a regulação negativa da transcrição global e a estabilização do mRNA. Dentro de 12–24 min após a adição de sal (fase de indução), as taxas de síntese aumentaram fortemente para um subconjunto de mRNAs. Esses mRNAs induzidos por estresse mostram taxas de decaimento aumentadas, provavelmente para garantir sua remoção rápida no final da resposta. Finalmente, as taxas de decaimento foram restauradas em sua maioria, enquanto uma fração das taxas de síntese permaneceu em níveis distintos dos valores iniciais (fase de recuperação). Não foi possível monitorar a recuperação completa, que leva cerca de 2 h (Macia et al, 2009), mas uma fração das taxas de síntese aparentemente permanece em valores diferentes dos valores iniciais, para garantir a expressão contínua de genes de homeostase de sal e menor expressão de genes de manutenção. O DTA também revelou uma queda na eficiência de marcação de 0,5% (1 4sU em ∼200 nucleotídeos) para 0,27% (Figura 3A), refletindo a inibição conhecida da captação celular de pequenas moléculas durante o estresse.

Correlação temporária de síntese de mRNA e taxas de decaimento

Transformamos todas as taxas em suas classificações dentro das distribuições de taxas, para contornar uma estimativa sujeita a erros de um fator de normalização desconhecido entre medições em pontos de tempo diferentes. Ao comparar as classificações das taxas de síntese nos conjuntos de dados, 6 e 36 min após a adição de sal, cinco grupos de genes foram definidos (Figura 3C): ‘acima'(217 genes, ganho de classificação & gt2000),'equilibrado'(456 genes, ganho de classificação 1000-2000),'para baixo'(498 genes, perda de classificação 1000-2000),'baixa'(401 genes, perda de classificação & gt2000), e'até'(Todos os 2936 genes restantes). Embora a síntese e o declínio global do mRNA não tenham sido correlacionados antes do estresse, alguns grupos de genes mostraram correlações positivas e negativas durante o estresse (Figura 2B). Uma análise das mudanças nas taxas de síntese e decaimento revela uma interdependência temporária das mudanças nas taxas de síntese e decaimento do mRNA durante as duas primeiras fases de estresse (Figura 3D, filme complementar). Durante a fase de choque, uma diminuição na taxa de síntese geralmente acompanha uma diminuição na taxa de decaimento. Durante a fase de indução, um aumento nas taxas de síntese geralmente acompanha um aumento na taxa de decaimento. Eles novamente se tornam não correlacionados durante a recuperação. A natureza de um possível acoplamento físico subjacente a essa correlação temporária de taxas ainda precisa ser explorada.

A alta resolução temporal revela a dinâmica do mRNA

A resolução das três fases da resposta ao estresse dependia do DTA e não foi possível medindo os níveis de mRNA total sozinho (Figura 3B). Para testar o desempenho do DTA com um conjunto de genes imparciais, monitoramos os 305 genes responsivos Hog1 descritos anteriormente (Capaldi et al, 2008). O DTA detectou uma diminuição inicial nas taxas de síntese durante o choque, enquanto os níveis de RNA total aumentaram (Figura 3B). Isso, no entanto, não foi devido ao aumento da atividade transcricional, mas sim devido à atividade de transcrição residual combinada com a estabilização do mRNA (Figura 3D). Além disso, a razão sinal-ruído na detecção de alterações nas taxas de síntese foi em média duas vezes maior do que a medição das diferenças nos níveis de mRNA total (Figura Suplementar S7). Assim, a transcriptômica convencional falha em desvendar a natureza das mudanças no metabolismo do mRNA sob estresse, que são, entretanto, monitoradas por DTA.

Alta sensibilidade revela novos genes de resposta ao estresse

Devido ao aumento da sensibilidade, o DTA revela muitos genes que são induzidos durante o estresse. o acima cluster continha genes associados a termos GO relacionados à resposta ao estresse. Dos genes do módulo de estresse, conforme definido pelo Algoritmo de Estrutura Iterativa (Ihmels et al, 2002), 74% mostraram um ganho de classificação maior que 1000. O acima cluster continha apenas três TFs, consistente com a pré-existência de TFs para resposta ao estresse e sua ativação pós-transcricional (Proft e Struhl (2004), e referências nele). o acima cluster continha 62% dos genes que foram considerados significativamente regulados positivamente por um fator de pelo menos dois em um estudo recente da resposta ao estresse osmótico (Capaldi et al, 2008). No entanto, o DTA também detectou 58 novos genes envolvidos na resposta ao estresse osmótico (Materiais e métodos, Figura Suplementar S8). Estes são principalmente genes de função desconhecida, exceto Ubc5, que é conhecido por mediar a degradação de proteínas anormais durante o estresse celular. De genes no acima cluster, 35% eram descaracterizados, em comparação com apenas 16% de todos os genes de levedura. As cepas de leveduras com nocautes únicos dos genes de estresse recém-revelados geralmente não apresentam defeitos de crescimento sob condições de sal elevado (Suplementos, Parte IV), fornecendo uma possível explicação para o porquê de não terem sido descobertos anteriormente.

TFs subjacentes à resposta ao estresse

Para identificar TFs que ativam genes de estresse salino, perguntamos se os genes-alvo de um TF (MacIsaac et al, 2006) foram enriquecidos entre genes no acima ou baixa clusters. Um teste de Fisher para TFs com mais de 20 alvos (84 TFs) encontrou nove TFs significativos (Figura 4A, Materiais e métodos). TFs com alvos enriquecidos no acima cluster incluiu Msn2, Msn4 e Sko1, que são conhecidos por agirem na via Hog1 MAPK, e o fator de choque térmico Hsf1, consistente com a existência de um conjunto central de TFs de resposta ao estresse em leveduras. Outros TFs incluíram Nrg1, que inibe genes de resposta ao estresse em condições sem estresse (Vyas et al, 2005), e Aft1 e Aft2, que controlam Hsp26 e estão envolvidos na resposta ao estresse oxidativo (Courel et al, 2005). A análise revelou ainda Snt2, que não foi implicado na resposta ao estresse osmótico. No baixa cluster, o único FT super-representado foi Gcn4, um ativador da biossíntese de aminoácidos (Hinnebusch, 2005), que é regulado para baixo durante o estresse (Gasch e Werner-Washburne, 2002). Análise GO do baixa os genes do cluster revelaram um enriquecimento de genes com funções na biogênese do ribossomo e no processamento do RNA, consistente com a interrupção da produção do ribossomo durante o estresse (Gasch e Werner-Washburne, 2002). Geralmente, apenas 10-30% dos genes-alvo de um TF foram induzidos ou reprimidos (Figura 4B). Essa regulação de subconjuntos específicos de genes é provavelmente alcançada por interações de TF cooperativas.

Cooperatividade TF

Nós estabelecemos um em sílico Tela de interação TF-TF para prever a cooperatividade de TF específica da condição entre pares de TFs usando as taxas de síntese de mRNA DTA. Como base para nossa investigação, usamos os conjuntos de genes alvo definidos para um maior número de TFs (MacIsaac et al, 2006). Para pontuar a interação de um par TF (TF1, TF2), os conjuntos de destino TF de MacIsaac et al, foram usados ​​para dividir genes em quatro classes: genes direcionados nem por TF1 nem TF2 (o grupo de linha de base), genes direcionados por TF1 apenas (grupo 1), genes direcionados por TF2 apenas (grupo 2) e genes direcionados por TF1 e TF2 simultaneamente (grupo 3) (seção complementar 22.1). Comparamos as taxas de síntese de mRNA nos grupos 1-3 com o grupo da linha de base e avaliamos se os efeitos no grupo 3 podem ser explicados pelos efeitos combinados no grupo 1 e no grupo 2. A diferença entre os efeitos observados no grupo 3 e os efeitos esperados no grupo 3 (calculado a partir dos efeitos nos grupos 1 e 2) dá uma medida de interação.

Dois modelos diferentes foram desenvolvidos que atribuem uma pontuação de interação para cada par de TF (modelo de regressão logística, seção suplementar 22.2, modelo de razão de chances, seção suplementar 22.3). O cálculo das pontuações de interação para todos os pares TF1 – TF2 resulta em uma matriz de pontuação de interação quadrática. As entradas únicas dessa matriz não podem ser estimadas de maneira confiável, porque o número de entradas a serem estimadas é da mesma ordem de magnitude que o número de pontos de dados (seção complementar 22.1). Portanto, seguimos uma estratégia para a análise de matrizes genéticas sintéticas (Pan et al, 2006). Uma interação entre duas proteínas é reivindicada se os perfis de interação dessas proteínas, isto é, as linhas correspondentes na matriz de interação, são suficientemente semelhantes (Figura 5). Em nosso contexto, a similaridade do perfil é quantificada com a distância de correlação, e o agrupamento de linkage médio hierárquico é usado para agrupar TFs de acordo com sua similaridade.

Esta análise resultou em 16 pares / triplos de TFs cooperativos (Figura 5). Sete desses pares / triplos TF são conhecidos por agirem sinergicamente, incluindo Ndd1-Fkh1-Fkh2 (Voth et al, 2007 Romero-Santacreu et al, 2009) e Msn2-Msn4, Ino2-Ino4, Swi4-Swi6, Hap3-Hap4, Arg80-Arg81 e Ste12-Dig1 (Stark et al, 2006). Assim, nossa tela detectou cooperatividade de FT com alta especificidade. Nove novos pares / triplos de TF cooperativos foram detectados para os quais não pudemos encontrar evidências na literatura ou em bancos de dados (SGD, STRING), a saber Yap1-Yap7, Yap5-Gat3, Sok2-Sut1, Gcr2-Azf1, Gln3-Yap6, Cst6- Dal80, Sko1-Aft2, Tec1-Stb1 e Spt23-Arr1-Stb2 (Figura 5).

A redistribuição do Genomic Pol II prevê mudanças na taxa de síntese de mRNA

Para investigar se as taxas de síntese de mRNA se correlacionam com a presença de Pol II em genes transcritos, determinamos os perfis de ocupação para a subunidade Rpb3 de Pol II por imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e análise de microarray de tiling (chip), e calculamos a ocupação média de Pol II entre os local de início da transcrição (TSS) e o local de poliadenilação (pA) para cada gene (Mayer et al, 2010). Também medimos os perfis do chip ChIP 12 e 24 min após a adição de sal, para investigar se Pol II é redistribuído ao longo do genoma sob estresse. Em todos os três pontos de tempo (0, 12 e 24 min), a ocupação média do gene Pol II foi calculada. Os três vetores de ocupação Pol II resultantes foram comparados com os vetores de RNA total, RNA recém-sintetizado e taxas de síntese em todas as seis janelas de tempo de 6 minutos do estresse osmótico (Figura 6).

As ocupações do gene Pol II em 0, 12 e 24 min se correlacionaram apenas fracamente com os níveis de mRNA, mas muito bem com os níveis de mRNA marcado e com as taxas de síntese nos pontos de tempo correspondentes (Figura 6). Os resultados também demonstraram a resolução temporal inferior da transcriptômica padrão, uma vez que a ocupação de Pol II 12 e 24 min após a indução de estresse se correlacionou com os níveis de mRNA em um ponto de tempo posterior (Figura 6). Calculamos a média dos perfis de ocupação de Pol II sobre genes pertencentes ao até, baixa, e acima clusters (Figura 7). o até O agrupamento mostrou um perfil típico de média genética com níveis elevados de Pol II na região transcrita e picos em torno do sítio TSS e pA. Este perfil persistiu durante o estresse, embora os níveis gerais de polimerase tenham diminuído. o baixa os genes do cluster aparentemente perderam a maior parte, senão todo o Pol II durante o estresse. Em contraste, o acima os genes do cluster não continham quantidades detectáveis ​​de Pol II antes do estresse, mas ganharam Pol II durante o estresse. A forma do perfil médio de acima genes agrupados após 24 min de estresse salino mostraram uma distribuição uniforme de Pol II que era muito diferente do perfil canônico (Figura 7), talvez por causa de uma alta densidade de Pol II nesses genes induzidos por estresse. Assim, a ocupação de Pol II previu as taxas de síntese de mRNA e a redistribuição de Pol II sob estresse previu mudanças nas taxas de síntese. Por outro lado, as correlações observadas confirmam que o DTA monitora de forma realista a mudança da atividade transcricional.


MATERIAIS E MÉTODOS

Cepas de levedura e condições de crescimento

Os experimentos apresentados neste estudo foram realizados usando a levedura de brotamento S. cerevisiae. Uma lista completa de cepas e plasmídeos usados ​​é fornecida nas Tabelas Suplementares S7 e S8, respectivamente. As cepas foram geradas por integração genômica de cassetes de marcação ou interrupção, conforme descrito (33, 34). As células de levedura foram cultivadas em meio YPAD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 20 mg / ml de sulfato de adenina, 2% de dextrose) a 30 ° C durante a noite e, em seguida, as culturas foram diluídas para OD600 = 0,1. A maioria dos experimentos foram realizados com células de fase exponencial colhidas entre um OD600 de 0,3 e 0,6, salvo indicação em contrário.

Para o esgotamento condicional de proteínas alvo, as células foram cultivadas até a fase log (OD600 = 0,3-0,4) e a ancoragem de proteínas marcadas com FRB foi induzida pelo tratamento de células com rapamicina (1 mg / ml de solução estoque ressuspensa em etanol 90%, Tween-20 a 10%) para concentração final de 1 μg / ml por 20 min ou 60 min antes da coleta (35). A rápida depleção de proteínas marcadas com degron induzida por auxina (AID) foi induzida pela adição de ácido 3-indoloacético (Auxina) na concentração final de 500 mM (36). Para experimentos de estresse por calor, as células foram incubadas em meio completo até a fase logarítmica a 30 ° C, então as amostras foram brevemente centrifugadas e os pellets foram ressuspensos em meio pré-aquecido nas temperaturas indicadas e incubados por 5 min. A interrupção da tradução foi induzida pela adição de cicloheximida a uma concentração final de 25 μg / ml. A biogênese e a secreção do ribossomo foram inibidas pelo tratamento das células com diazaborina para uma concentração final de 50 μg / ml ou tunicamicina para uma concentração final de 1 μg / ml, respectivamente.

Ensaios de crescimento

Diluições em série de dez vezes de células em crescimento de fase logarítmica (OD600 = 0,3) foram colocados em placas contendo meio completo (YPAD) ou meio seletivo sintético nas temperaturas indicadas. As placas foram fotografadas após 24 e 48 horas de incubação.

ChIP e ChIP-Seq

Culturas de levedura de 50 mL em meio completo foram coletadas em OD600 = 0,4–0,6 para cada condição. As células foram reticuladas com formaldeído a 1% por 10 min e extintas pela adição de glicina 125 mM por 5 min em temperatura ambiente. As células foram então lavadas com HBS gelado (HEPES-Na 50 mM pH: 7,5, NaCl 140 mM) e ressuspensas em 0,6 ml de tampão de lise ChIP (HEPES-Na 50 mM pH: 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, NP-40 a 1%, desoxicolato de sódio a 0,1%) suplementado com PMSF 1 mM e coquetel de inibidor de protease 1 × (Roche). As células foram quebradas usando esferas de zircônia / sílica (BioSpec) e os lisados ​​foram centrifugados a 13.000 rpm por 30 min a 4 ° C. Após a centrifugação, os pellets foram ressuspensos em 300 μl de tampão de lise ChIP contendo 1 mM de PMSF e sonicados por 15 min (30s ON-60s OFF) em um Bioruptor (Diagenode). Os lisados ​​foram centrifugados a 7000 rpm durante 15 min a 4 ° C, após o que os anticorpos primários foram adicionados ao sobrenadante e incubados durante 1 h a 4 ° C.O ChIP foi realizado usando os seguintes anticorpos: para RNAPII, Abcam ab5131 para Myc, sobrenadante de cultura de Ab monoclonal 9E10 de camundongo produzido internamente para Hmo1, Ab policlonal de coelho produzido por Pocono Farms. Esferas magnéticas acopladas a IgG contra coelho ou camundongo (Invitrogen, Dynabeads ™ M-280 Sheep Anti-Rabbit ou Anti-Mouse IgG) foram lavadas três vezes com PBS (137 m m NaCl, 2,7 m m KCl, 10 m m Na2HPO4, 1,8 m m KH2PO4) contendo 0,5% de BSA e adicionado aos lisados ​​(30 μl de grânulos / 300 μl de lisado celular). As amostras foram incubadas durante 2 h a 4 ° C. As contas foram lavadas duas vezes com tampão AT1 (HEPES-Na 50 mM pH: 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, SDS 0,03%), uma vez com tampão AT2 (HEPES-Na 50 mM pH: 7,5, NaCl 1 M, 1 EDTA mM), uma vez com tampão AT3 (Tris-Cl 20 mM pH: 7,5, LiCl 250 mM, EDTA 1 mM, NP-40 0,5%, desoxicolato de sódio 0,5%) e duas vezes com tampão TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM ) A cromatina foi eluída das contas por ressuspensão em TE contendo SDS a 1% e incubação a 65 ° C durante 10 min. O eluato foi transferido para novos tubos Eppendorf e incubado durante a noite a 65 ° C para reverter as reticulações. Os DNAs foram purificados usando o MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). As bibliotecas de DNA foram preparadas usando o TruSeq ChIP Sample Preparation Kit (Illumina) de acordo com as especificações do fabricante. As bibliotecas foram sequenciadas usando uma plataforma Illumina HiSeq 2500 no Instituto de Genética e Genômica de Genebra (iGE3 http://www.ige3.unige.ch/genomics-platform.php) e as leituras foram mapeadas para a montagem do genoma sacCer3 usando HTSStation60 (as densidades de leitura foram calculadas usando deslocamento: 100, extensão: 50 bp). Todas as densidades foram normalizadas para leituras de 10M.

Para RNAPII, o sinal foi quantificado para cada gene entre o local de início da transcrição (TSS) e o local de terminação da transcrição (TTS). Para quantificar sinais ChIP-seq para cada promotor, uma razão entre o número total de leituras de cada amostra em uma região de 400 bp a montante do TSS (37) para cada ORF e o número total de leituras da mesma região foram obtidas com IP simulado da cepa de controle não marcada. Para comparar células esgotadas e não esgotadas, dividimos o sinal das amostras de + auxina e / ou + rapamicina pelo sinal das amostras de auxina e / ou rapamicina (veículo) e log2 transformou esse valor. Todos os dados de bancos de dados disponíveis publicamente foram mapeados usando HTS Station (http://htsstation.epfl.ch (38)). Para experimentos ChIP-seq, cromatina reticulada obtida a partir de levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe foi usado como um controle de pico (39). Os valores do sinal ChIP-seq para cada gene são relatados nas Tabelas Suplementares S1 – S4 e S6.

ChEC-seq

Os experimentos de ChEC-seq foram realizados conforme descrito (40). Os dados de ChEC-seq de (23) foram usados ​​para determinar os locais de ligação Sfp1 e Ifh1. Uma cepa que expressa MNase "livre" sob o controle do REB1 o promotor foi usado como um controle (40). Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com tampão A (Tris 15 mM pH 7,5, KCl 80 mM, EGTA 0,1 mM, espermina 0,2 mM, espermidina 0,5 mM, inibidores de mini protease livres de EDTA 1xRoche, PMSF 1 mM) e ressuspensos em 200 μl de tampão A contendo 0,1% de digitonina. As células foram incubadas a 30 ° C durante 5 min. A atividade de MNase foi então induzida pela adição de CaCl2 a 5 mM e as reações foram interrompidas nos pontos de tempo indicados com EGTA a uma concentração final de 50 mM. O DNA foi purificado usando MasterPure Yeast DNA purification Kit (Epicenter) de acordo com as especificações do fabricante. Fragmentos grandes de DNA foram removidos por uma incubação de 5 min com 2,5 x volume de esferas AMPure (Agencourt), após o que o sobrenadante foi mantido, e o DNA digerido por MNase foi precipitado usando isopropanol.

As bibliotecas foram preparadas usando o kit NEB Next (New England Biolabs) de acordo com o protocolo do fabricante. Antes da amplificação por PCR das bibliotecas, pequenos fragmentos de DNA foram selecionados por uma incubação de 5 minutos em 0,9 × volume de esferas AMPure, após o que o sobrenadante foi mantido e incubado com o mesmo volume de esferas antes por mais 5 min. O DNA foi eluído com 0,1 × TE após a lavagem das esferas com etanol a 80% e a PCR foi realizada. Dímeros adaptadores foram removidos com uma incubação de 5 min usando 0,8 × volume de esferas AMPure, após o que o sobrenadante foi mantido e incubado com 0,3 × volume das esferas. As contas foram então lavadas duas vezes com etanol a 80% e o DNA foi eluído usando 0,1 × TE. A qualidade das bibliotecas foi verificada executando uma alíquota em um gel de agarose a 2%. As bibliotecas foram sequenciadas usando uma máquina HiSeq 2500 em modo single-end. As leituras foram estendidas pelo comprimento de leitura. As leituras foram mapeadas para o genoma (montagem sacCer3) usando HTSStation, e a posição da base mais 5′ de cada leitura foi usada como a posição do local de corte MNase. Todas as densidades foram normalizadas para leituras de 10M. Para a análise do pico, usamos o sinal obtido para Sfp1-MNase ou Ifh1-MNase após 30 s ou 2 min 30 s de CaCl2 tratamento, respectivamente, normalizado dividindo-o pelo sinal obtido para MNase livre após 20 min de tratamento. Os valores do sinal ChEC-seq em cada promotor são relatados na Tabela Suplementar S5.

Mapas de calor, gráficos e estatísticas

Em todos os gráficos de caixa, a caixa mostra o percentil 25 a 75, os bigodes mostram o percentil 10 a 90 e os pontos mostram os percentis 5 e 95. A significância estatística da diferença entre os grupos foi avaliada usando o teste da soma das classificações de Mann-Whitney.


Materiais e métodos

Deformação

As cepas usadas neste estudo são Saccharomyces cerevisiae cepas de ancoragem (Haruki et al, 2008) que foram recriados no plano de fundo do BY4742 (de Jonge et al, 2017). Além do domínio FRB do alvo mamífero da rapamicina (mTOR), a tag de ancoragem consiste em proteína fluorescente verde intensificada por levedura (yEFGP) e uma tag V5 tripla. A cepa de ancoragem parental BY4742, que tem uma FPR1 exclusão e um tor1-1 mutação para dessensibilizar a cepa para rapamicina, foi usada como um controle de tipo selvagem.

Condições de crescimento

As cepas foram semeadas a partir de estoques de −80 ° C em placas de seleção apropriadas (para a cepa de ancoragem parental: YPD + Nourseothricin e para as cepas Abf1-aa: YPD + Nourseothricin + Higromicina) e incubadas a 30 ° C por 3 dias. De manhã, as pré-culturas líquidas foram inoculadas em 1,5 ml de meio completo sintético (SC): mistura de eliminação de 2 g / l completa e 6,71 g / l de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, carboidratos & w / AS (YNB) dos EUA Biologicals (Swampscott, EUA) com 2% de D-glicose. À tarde, várias pré-culturas foram combinadas, diluídas para o volume final de 20 ml e cultivadas durante a noite. As condições de crescimento foram idênticas para todos os experimentos e pré-culturas: em meio SC a 30 ° C, com agitação (230 rpm).

Esgotamento de âncora

No t = 0, Abf1 foi esgotado do núcleo por adição de rapamicina (LC Laboratories # R-5000 dissolvido a 2 mM em DMSO), para uma concentração final de 7,5 μM. Para o t = Ponto de tempo 0, o mesmo volume de DMSO em vez de rapamicina foi adicionado e incubado por 90 min.

Imunoprecipitação da cromatina

ChIP foi realizado conforme descrito em detalhes em (de Jonge et al, 2000) usando triplicados biológicos. Para resumir: as células foram diluídas de manhã para uma densidade óptica (OD) de 0,11-0,15 (medidor de densidade celular WPA Biowave CO8000) em 100 ml de meio SC e cultivadas por pelo menos 2 duplicações para uma OD600 = 0,8, que corresponde a cerca de 2 × 10 7 células por ml. As adições de rapamicina e DMSO foram escalonadas de modo que todos os pontos de tempo estivessem prontos na mesma DO (0,8). Quando esta OD foi atingida, as células foram reticuladas por 5 min por adição de formaldeído a 37% (Sigma-Aldrich # 252549) para uma concentração final de 2%. O formaldeído foi extinto usando uma concentração final de 1,5 M de Tris (tris (hidroximetil) aminometano) durante 1 min. Posteriormente, as células foram sedimentadas por centrifugação a 3.220 g a 4 ° C durante 3 min. O sedimento foi lavado em 10 ml de TBS (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5) e sedimentado novamente a 3.220 g por 3 min a 4 ° C. Após ressuspensão em 1 ml de MQ, as células foram centrifugadas a 3.381 g por 20 s em temperatura ambiente e o pellet foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a −80 ° C.

Para lisar as células, as células foram ressuspensas em tampão de lise FA (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-desoxicolato, 0,1% SDS) contendo o inibidores de protease aprotinina, pepstatina A, leupeptina e PMSF para um volume final de 2 ml, transferidos para tubos de tampa de rosca de 2 ml e rompidos usando esferas de zircônio / sílica de 0,5 mm (Produtos BioSpec, # 11079105z) por batimento de conta 7 vezes 3 min em um Disruptor Genie (Indústrias Científicas). O lisado foi recuperado e centrifugado a 1.503 g por 2 min a 4 ° C para remover os resíduos celulares. O sobrenadante foi posteriormente fragmentado por sonicação das amostras por 10 ciclos de 15 s ligado, 30 s desligado usando um sonicador Bioruptor Pico (Diagenode # B01060010).

Para a imunoprecipitação, 450 μl da cromatina fragmentada foram incubados com 1 μl de anticorpo anti-V5 (Life Technologies # R96025) por 2 h a 4 ° C. Uma alíquota de 20 μl foi mantida separada como um controle de entrada. A cromatina + anticorpo foram subsequentemente ligados por 20 min em temperatura ambiente a contas magnéticas (Dynabeads proteína G, Life Technologies # 10004D) que foram pré-incubadas com BSA. As contas foram lavadas duas vezes com PBS e duas vezes usando PBS-T. Durante a última lavagem, as contas foram transferidas para tubos LoBind frescos (Eppendorf # 0030108051). As ligações cruzadas foram revertidas incubando em TE / SDS a 1% (Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0, SDS a 1% (p / v)) durante a noite a 65 ° C. Na manhã seguinte, o RNA foi degradado pela adição de RNAse A / T1 (Thermo Scientific # EN0551) a 37 ° C e, subsequentemente, as proteínas foram digeridas pela adição de proteinase K (Roche # 03115852001) a 37 ° C. Após a digestão da proteína, o DNA foi recuperado usando um kit de limpeza de purificação de PCR Qiagen (Qiagen # 28106) por eluição em 30 μl de tampão EB.

Rotulagem e extração de RNA

Para o curso de tempo de 4tU-seq, culturas de 20 ml foram usadas, com triplicatas biológicas para cada ponto de tempo. As adições de rapamicina e DMSO foram escalonadas de modo que todas as culturas estivessem prontas na mesma DO (0,8). Amostras WT incubadas com rapamicina ou DMSO por 90 min foram tomadas junto como controles. Três minutos antes das culturas estarem prontas, 4-tiouracil (4tU Sigma-Aldrich # 440736) foi adicionado às culturas de células para uma concentração final de 5 mM. As células foram incubadas com 4tU por 6 min no total, de modo que o centro do período de marcação correspondeu ao ponto de tempo do curso de tempo do chip. Posteriormente, as células foram colhidas por centrifugação a 3.220 g por 3 min, os pellets de células foram congelados imediatamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C.

Para isolar o RNA total, as células foram ressuspensas em ácido fenol clorofórmio (Sigma # P1944) e imediatamente misturadas com o mesmo volume de tampão TES (10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% SDS). As amostras foram agitadas por 20 s, os tubos foram cobertos com papel alumínio para manter as amostras escuras e incubadas em banho-maria a 65 ° C por 10 min. Em seguida, as amostras foram transferidas para tubos de 1,5 ml e incubadas em termomixer por 50 min a 65 ° C e 1.400 rpm, cobertas com papel alumínio. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 18.407 g por 20 min a 4 ° C. A fase aquosa foi recuperada e a extração do fenol foi repetida uma vez, seguida pela extração com clorofórmio-álcool isoamílico (25: 1). O RNA foi precipitado usando acetato de sódio (NaAc 3M, pH 5,2) e etanol 100% (−20 ° C) por incubação a −20 ° C por pelo menos 30 min. O DTT também foi adicionado a uma concentração final de 1 mM para prevenir a oxidação do 4tU. O sedimento foi lavado uma vez com etanol a 80% e ressuspenso a uma concentração final de 1 μg / μl em MQ estéril.

Para recuperar as transcrições nascentes do protocolo de (Dölken et al, 2008) foi usado com pequenas adaptações. Em resumo, 100 μg de RNA limpo foi aquecido a 60 ° C por 10 min e imediatamente colocado no gelo por 2 min. O RNA foi biotinilado pela adição de 200 μl de Biotina-HPDP (Thermo Fisher Scientific # 21341) dissolvido a 1 mg / ml em 30% de DMF. A biotina não ligada foi removida usando extração com clorofórmio. O RNA biotinilado foi separado do RNA total usando contas magnéticas conjugadas com estreptavidina e colunas μMACs (Miltenyi Biotec # 130-074-101). As contas foram lavadas 6x usando tampão de lavagem a 65 ° C (Tris 100 mM pH 7,5, EDTA 10 mM, NaCl 1 M, Tween-20 a 0,1%) e o RNA ligado foi eluído usando 200 μl de DTT 100 mM. O RNA nascente foi purificado usando um RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen # 74204).

Preparação e sequenciamento da biblioteca

Bibliotecas ChIP-seq foram criadas usando uma combinação de um kit NEXTflex Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific # NOVA-5144) e um kit NEXTflex Rapid Directional qRNA-Seq (Bioo Scientific # NOVA-5130) para permitir a incorporação de identificadores moleculares exclusivos (UMIs) (Kivioja et al, 2012) em ambos os lados de cada fragmento. Para melhorar a velocidade e a precisão, um máximo de 8 bibliotecas foram preparadas ao mesmo tempo. Para tornar a quantidade de material inicial das amostras de entrada semelhante à das amostras de IP, as amostras de entrada foram diluídas 1: 300 antes da preparação da biblioteca. O reparo final e a adenilação foram realizados usando o kit NEXTflex Rapid DNA-Seq com metade dos volumes recomendados. As etapas subsequentes foram realizadas usando o kit NEXTflex Rapid Directional qRNA-Seq com um quarto dos volumes recomendados para a ligação do adaptador e meio volume para a amplificação por PCR. O volume inicial usado para cada uma das limpezas de grânulos foi ajustado para 50 μl por adição de MQ e as proporções de grânulos foram mantidas conforme recomendado. O número de ciclos de PCR usados ​​foi o mesmo para todas as amostras de ChIP e de entrada (13 ciclos), exceto para os IPs WT onde foram usados ​​15 ciclos de PCR. Os rendimentos da biblioteca foram avaliados usando um chip bioanalisador de DNA de alta sensibilidade (Agilent) e as quantidades equimolares da biblioteca foram agrupadas e sequenciadas de extremidade emparelhada 2 × 75 bp em um sistema NextSeq 500 (Illumina).

Bibliotecas 4tU-seq foram criadas usando o kit NEXTflex Rapid Directional qRNA-Seq (Bioo Scientific # NOVA-5130) com um protocolo ligeiramente modificado. Durante a etapa D do protocolo (ou seja. limpeza do grânulo após a síntese da segunda fita), os grânulos foram ressuspensos em 10 μl de tampão de ressuspensão e 8 μl foram usados ​​para a próxima etapa. A partir desta etapa, metade de todos os volumes recomendados foram usados. O volume inicial usado para cada uma das limpezas de grânulos foi ajustado para 50 μl por adição de MQ e as proporções de grânulos foram mantidas conforme recomendado. Uma vez que as concentrações de RNA marcado diferiram após a purificação, um qPCR foi realizado para estimar o número de ciclos de PCR necessários para cada amostra após a ligação do adaptador. O número de ciclos usados ​​variou entre 8 e 12 ciclos. Os rendimentos da biblioteca foram avaliados usando um chip bioanalisador de DNA de alta sensibilidade (Agilent) e as quantidades equimolares da biblioteca foram agrupadas e sequenciadas de extremidade pareada 2 × 75 bp em duas sequências em um sistema NextSeq 500 (Illumina).

Mapeamento

As leituras dos experimentos ChIP-seq e 4tU-seq foram alinhadas à montagem do genoma sacCer3 (fevereiro de 2011) usando HISAT2 v2.0.5 (Kim et al, 2015). As configurações para as amostras de ChIP-seq foram “--add-chrname -X 1000 --score-min L, 0, -0,2 -k 1 - sem emenda-alinhamento -5 12 -3 6” e para o 4tU -seq mostra as configurações “--add-chrname -X 1000 --score-min L, 0, -0,175 -5 10 -3 10 --dta -max-intronlen 1500 --rna-strandness RF”. Posteriormente, os arquivos bam foram filtrados para manter apenas as transcrições com uma combinação única de IHMs usando os scripts personalizados “addumis2bam.sh” e “uniqify-umis.pl” disponíveis em https://github.com/wdejonge/DIVORSEQ.

Pico de chamadas e filtragem

Os dados ChIP-seq foram filtrados para manter apenas leituras de mapeamento exclusivas e, subsequentemente, os picos foram chamados usando MACS2 v2.1.1.20160309 (Zhang et al, 2008) com as configurações “-f BAMPE -g 1,25e7 --manter-dup tudo --mfold 5 2000 --call-summits -q 0,001 --fe-cutoff 2” usando todas as três réplicas t = 0 pontos no tempo (sem esgotamento) versus suas entradas correspondentes, produzindo 948 picos Abf1.

Para monitorar o esgotamento, os níveis de ligação iniciais precisam ser suficientemente fortes para medir com precisão uma redução nos níveis de ligação. Portanto, apenas os picos de ligação com um enriquecimento de pelo menos 4 vezes foram considerados (421 picos). Isso também filtra a ligação fraca aparente em quadros de leitura abertos e tRNAs, que é um artefato conhecido de ChIP (Park et al, 2013 Teytelman et al, 2013). Além disso, foi recentemente demonstrado que Abf1 é apenas reticulado de forma eficiente a locais com uma guanina ou uma citosina a -8 bp a partir do centro do motivo de ligação Abf1 (Rossi et al, 2018a). Para cada pico de ligação, procuramos motivos (± 100 bp do pico do pico) que correspondam intimamente ao consenso Abf1 (pelo menos 85% da pontuação do motivo de consenso de (MacIsaac et al, 2006)) e determinou se havia um G / C ou um A / T a -8 bp de cada motivo. Apenas os picos onde todos os motivos encontrados tinham um G / C em -8 bp do ponto médio do motivo foram mantidos para análise posterior (195 picos). Quatro desses picos estavam localizados em regiões teloméricas. Embora as estimativas de tempo médio de residência desses quatro picos sejam provavelmente precisas, notamos que outras características eram muito distintas de outros picos (por exemplo. organização do nucleossomo, composição do motivo, ligação da RNA polimerase II). Portanto, esses picos foram excluídos, resultando em um total de 191 locais de ligação de Abf1 que foram analisados ​​em maior detalhe.

Ajuste de decaimento exponencial

(1)

SSasymp (time, yf, y0, log_koff), data = data) ”, usando todas as três réplicas juntas para obter um único ajuste por pico. A qualidade do ajuste para cada ajuste foi avaliada pelo cálculo de um pseudo-R 2, calculado como:

(2)

Isso gerou regressões com excelente R 2 , com o mais baixo R 2 = 0,65 e a mediana R 2 = 0,94 (Fig EV2D). Uma das amostras de ChIP de depleção de 10 min teve níveis de ligação muito mais elevados em comparação com as outras amostras de 10 min, com um desvio absoluto médio mais de seis vezes maior. Após a remoção desta amostra, todos os ajustes melhoraram. Esta amostra foi, portanto, removida de todas as análises. Os 191 locais de ligação foram divididos em quatro grupos de tempo médio de residência definidos pelos quartis dos seus tempos médios de residência (48 ou 47 locais por quartil). Um modelo de decaimento exponencial com os níveis de ligação absoluta foi usado em vez de um ajuste de decaimento exponencial com dados transformados em log, uma vez que tal modelo linear não pode estimar uma linha de base yf, produzindo ajustes ruins e estimativas imprecisas para as taxas de desconto. O conjunto de dados EV1 contém para os 191 locais de ligação Abf1 as coordenadas das janelas de 101 bp, os níveis de ligação antes e depois de 90 min de esgotamento, as estimativas para y0, yf, kdesligado e o tempo médio de residência, bem como o número de motivos, pontuações de motivos e a qual quartil de tempo de residência um sítio de ligação pertence.

Análise de expressão 4tU-seq

As leituras 4tU-seq foram atribuídas a características genômicas usando featureCounts do pacote de sub-leitura v1.6.5 (Liao et al, 2014). Como um arquivo de anotação, a transcrição inicia as anotações do site de (van Bakel et al, 2013) foram mesclados com a anotação do genoma do banco de dados do genoma Saccharomyces (SGD Cherry et al, 2012) contendo ORFs, tRNAs, rRNAs e snRNAs. As contagens das duas sequências independentes foram combinadas e a expressão diferencial das características genômicas (genes) foi calculada usando o pacote DESeq2 v1.10.1 (Love et al, 2014) em R. Apenas genes com alteração de dobra de mais de 1,5 com um ajuste P-valor & lt 0,01 após 20 min, bem como 30 min de depleção foram considerados diferencialmente expressos. A alteração na síntese de mRNA foi calculada em relação a t = 0.

Para modelar a taxa de diminuição da síntese de mRNA, contagens absolutas de transcritos foram usadas em cada ponto de tempo. Eles foram normalizados para o número médio de transcrições de todas as amostras após filtrar os rRNAs. Apenas genes que foram significativamente regulados para baixo com ligação de Abf1 ao promotor foram usados ​​(n = 88). Os picos de ligação foram atribuídos aos genes quando o ápice desse pico foi encontrado no promotor (500 pb a montante do local de início da transcrição). Conforme descrito para os dados ChIP-seq, uma função de decaimento exponencial de primeira ordem (Equação 1) foi usada para modelar as mudanças na síntese de mRNA. Nesse caso, y0 é o nível de expressão antes do esgotamento e kdesligado é a taxa com a qual a expressão diminui para o nível de expressão final yf. Para seis dos genes com mudanças robustas na síntese de mRNA, nenhum ajuste confiável pôde ser obtido e estes foram, portanto, excluídos da Fig 3G (n = 82).

Conjuntos de dados externos

Para avaliar qual porcentagem de picos de ligação Abf1 se sobrepõem com locais de ligação Abf1 detectados anteriormente, os picos (picos de pico ± 50 bp) detectados aqui (n = 948) foram comparados com conjuntos de dados publicados. Foram utilizados dados de três técnicas diferentes: ORGÂNICA, ChEC-seq e ChIP-exo (Kasinathan et al, 2014 Zentner et al, 2015 Rossi et al, 2018b). Para os dados ORGÂNICOS, os sites Abf1 vinculados publicados (n = 1.068) das amostras “10’ MNase 80mM ”foram usadas (Kasinathan et al, 2014). Para os dados ChEC-seq, os sites Abf1 que foram classificados como "rápido" e "motivo de alta pontuação" (n = 1.583) foram tomadas (Zentner et al, 2015). Para os picos ChIP-exo, todos os sites detectados usando o protocolo ChIP-exo v5 (n = 3.177) foram usados ​​(Rossi et al, 2018b).

Para avaliar na Vivo proteção de clivagem de MNase, os arquivos bigwig “Abf1aa_V_freeMNase_ChEC” e “Abf1aa_R_freeMNase_ChEC” foram baixados do conjunto de dados omnibus de expressão gênica (GEO) GSE98259 (Kubik et al, 2018) e suavizado com uma janela de 3 bp. Os dados foram centrados no motivo de ligação Abf1, e o número médio de locais de clivagem por quartil de tempo de residência médio foi calculado. Posteriormente, o número médio de locais de corte foi calculado na área do motivo (−8 bp a +8 bp do ponto médio do motivo) tanto na presença quanto na ausência de Abf1. A taxa de clivagem foi calculada dividindo o número de cortes na ausência de Abf1 pelo número de cortes na presença de Abf1. Locais sem cortes em qualquer das condições (com ou sem rapamicina) foram excluídos da quantificação (Fig. 1J).

Para comparar as taxas de síntese com taxas de desaceleração e níveis de ligação, as taxas de síntese de todo o genoma foram retiradas de (Sun et al, 2012), baixando-os do site dos pesquisadores: https://www.mpibpc.mpg.de/13760807/Sc_turnover.zip.

Para visualizar o posicionamento do nucleossomo antes e após o esgotamento de Abf1, os arquivos importantes "Abf1veh15" e "Abf1rapa15" foram baixados do conjunto de dados GEO GSE73337 (Kubik et al, 2015). Os dados foram centrados no motivo de ligação Abf1 (Fig. 2) ou alinhados no nucleossomo +1 (Figs. 3B e EV3A), com as posições do nucleossomo +1 retiradas de (Kubik et al, 2015). A ocupação média do nucleossomo foi calculada para genes com ligação Abf1, um nucleossomo +1 anotado e que foram fortemente regulados para baixo (mudança de dobra & gt 2 em t = 20, n = 44), fracamente regulado para baixo (mudança de 1,5 & lt vezes & lt 2 em t = 20, n = 42) ou não mudou (alteração da dobra & lt 1,5 em t = 20, n = 112) após o esgotamento de Abf1 (Fig 3B). Na Fig. 2, a ocupação média do nucleossomo foi calculada por quartil do tempo médio de residência. Os intervalos de confiança nas Figs 2 e 3B são indicados pela área sombreada que é calculada como a média ± 2 × o erro padrão da média (SEM).

Para visualizar a ligação da polimerase, os dados PAR-CLIP (reticulação e imunoprecipitação aprimorada com ribonucleosídeo fotoativável) para a fita positiva e negativa da amostra "Controle Rpb2-HTB com Rapamicina" foram baixados do conjunto de dados GEO GSE56435 (Schaughency et al, 2014). Como o motivo Abf1 é específico da fita, os dados foram reorientados em conformidade, o que significa que quando os dados tiveram que ser reorientados para coincidir com a orientação do motivo (como mostrado nas Figs EV2B e 5C), a fita mais e menos também foram trocadas. Para calcular a eficiência do roadblock, a ligação média no pico bloqueado, localizado a -37 bp ± 5 bp do centro do motivo de ligação Abf1, foi normalizada pela quantidade de transcrição recebida (definida como a ligação Pol II média na região de - 300 bp até -100 bp a montante do motivo de ligação Abf1). Para a quantificação mostrada na Fig 4C, um pico foi considerado um pico de bloqueio quando tinha ligação normalizada a montante de Pol II & gt 2. Com este corte, aproximadamente 25% dos picos (49/191) foram considerados como um obstáculo para Pol II.

Pontuação do motivo e análise da forma do DNA

A matriz de frequência de posição de (MacIsaac et al, 2006) foi obtido do banco de dados YeTFaSCo (de Boer & Hughes, 2011), multiplicado por um fator 1.000 e convertido em uma matriz de peso de posição (PWM). A região ± 100 bp do ápice de cada pico de ligação foi pesquisada para uma correspondência deste PWM usando a função matchPWM do pacote Biostrings v2.38.4 em R, usando uma pontuação mínima de motivo de 85%. Sempre que um pico de ligação tinha mais de um motivo correspondente, a pontuação mais alta era atribuída a esse pico de ligação. Para todos os gráficos agregados, os dados foram alinhados ao motivo com a pontuação de motivo mais alta com todos os motivos na mesma orientação como mostrado nas Figs EV2B e 5C. A análise da forma do DNA foi feita nos motivos alinhados ± 40 bp do ponto médio do motivo usando DNAshapeR v1.10.0 (Chiu et al, 2016). A forma do DNA dos locais ligados e não ligados de (Rossi et al, 2018a) foi calculado conforme descrito em (Rossi et al, 2018a), tomando para cada um dos 8 motivos os 50 picos vinculados superiores e 50 inferiores e mostrando a média dos 400 picos vinculados superiores e 400 inferiores. Para mais detalhes, veja (Rossi et al, 2018a).

Análise estatística e visualização de dados

Todas as análises estatísticas foram feitas usando a linguagem estatística R v3.2.2, exceto para a forma do DNA e as análises do diagrama de Venn, que foram feitas usando R v3.5.1. Os diagramas de Venn proporcionais à área foram criados usando o pacote eulerr v6.0.0 em R v3.5.1.

Para visualizar a ligação a diferentes loci genômicos na Fig 1B, o pacote Sushi v1.24.0 foi usado (Phanstiel et al, 2014). Todos os boxplots foram criados usando a função boxplot embutida de R, com configurações padrão aqui, a linha horizontal sólida representa a mediana, a caixa mostra o intervalo interquartil e os bigodes estão no ponto de dados mais extremo, não mais longe do quartil mais próximo do que 1,5 vezes o intervalo interquartil. As diferenças entre os quatro quartis de tempo médio de residência foram avaliadas usando uma ANOVA de uma via seguida pelo teste de diferença significativa honesta de Tukey (Figs 1J, 4B, 5B e D). A diferença entre os dois grupos na Fig. 4C foi testada usando um teste t bicaudal e entre os grupos na Fig. 5A usando um teste de soma de postos de Wilcoxon, uma vez que um dos grupos foi considerado muito diferente da normalidade.


Decaimento do mRNA eucariótico: metodologias, caminhos e links para outros estágios da expressão gênica

A concentração de mRNA depende do equilíbrio entre as taxas de transcrição e degradação. Em ambos os lados do equilíbrio, síntese e degradação mostram, no entanto, diferenças interessantes que condicionaram a evolução dos mecanismos reguladores dos genes. Aqui, discutimos métodos recentes de todo o genoma para determinar as meias-vidas do mRNA em eucariotos. Também revisamos os regulons pré e pós-transcricionais que coordenam o destino de mRNAs funcionalmente relacionados usando proteínas ou RNA baseadas em trans fatores. Alguns desses fatores podem regular as taxas de transcrição e decaimento, mantendo assim a homeostase adequada do mRNA durante a vida da célula eucariótica.


Influência da temperatura na transcrição, ligação de proteínas e taxas de decaimento - Biologia

O dogma central concentra-se na produção dos grandes ácidos nucléicos e polímeros de proteínas da biologia. No entanto, o controle e a manutenção das funções da célula dependem de mais do que apenas síntese de novas moléculas. A degradação é outro processo-chave na vida das macromoléculas da célula e, por sua vez, é rigidamente controlada. Na verdade, no modelo mais simples de produção de mRNA, a dinâmica do nível médio de mRNA é dada por

onde r é a taxa de produção de mRNA e γ é a constante de taxa que determina o declínio do mRNA. O valor de estado estacionário do mRNA é dado por

mostrando que, em uma primeira aproximação, é o equilíbrio dos processos de produção e decadência que controla os níveis de estado estacionário dessas moléculas. Se nossa equação for para o número de cópias de moléculas por célula, haverá uma mudança abrupta no número cada vez que as células se dividirem, uma vez que o mRNA total e o conteúdo de proteína são divididos entre as duas células filhas. Se, em vez disso, nossa equação for pensada na linguagem das concentrações, não temos que enfrentar esse problema porque, à medida que a célula cresce, o mesmo acontece com o número de moléculas e, portanto, a concentração varia suavemente. O efeito do crescimento na concentração pode ser absorvido pela constante de taxa de degradação para levar em conta a diluição. Esta é uma solução matematicamente elegante comum, mas não imediatamente intuitiva, portanto, tentaremos esclarecê-la a seguir. Mas, primeiro, quais são os valores característicos dos tempos de degradação do mRNA e da proteína?

Figura 1: Meias-vidas medidas de mRNAs em E. coli, levedura de brotamento e fibroblastos NIH3T3 de camundongo. (A, adaptado de JA Bernstein et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 9697, 2002 B, adaptado de Y. Wang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 5860, 2002 C. adaptado de B. Schwanhausser, Nature, 473: 337, 2013).

O tempo de vida das moléculas de mRNA é geralmente curto em comparação com a escala de tempo fundamental da biologia celular definida pelo tempo entre as divisões celulares. Conforme mostrado na Figura 1A, para E. coli, a maioria das moléculas de mRNA tem tempos de vida entre 3 e 8 minutos. Os experimentos que levaram a esses resultados foram realizados inibindo a transcrição por meio do uso do fármaco rifampicina que interage com a RNA polimerase e, em seguida, questionando as células quanto aos seus níveis de mRNA em intervalos de dois minutos após o tratamento com o fármaco. Em particular, os níveis de RNA foram quantificados por hibridização com DNAs complementares em um microarray e medindo os níveis relativos de fluorescência em diferentes pontos de tempo. Esses tempos de degradação são apenas várias vezes maiores do que o tempo mínimo necessário para o alongamento transcricional e translacional, conforme discutido na vinheta em “O que é mais rápido, transcrição ou tradução?”. Isso reflete a existência fugaz de algumas mensagens de mRNA.

Dados esses dados de todo o genoma, várias hipóteses podem ser exploradas para os fundamentos mecanicistas das vidas observadas. Por exemplo, existe uma correlação entre a abundância de certas mensagens e sua taxa de decaimento? Existem motivos de estrutura secundária ou motivos de sequência que conferem diferenças nas taxas de decaimento? Uma das grandes surpresas das medições que levam à Figura 1A é que nenhum conhecimento convencional sobre as origens do tempo de vida do mRNA foi considerado consistente com os dados, que não revelaram correlação clara com a estrutura secundária, abundância de mensagens ou taxa de crescimento.

Figura 2: L & # 8217éléphant et l & # 8217Escheria Coli, décembre 1972. & # 8220Tout ce qui est vrai pour le Colibacille est vrai pour l & # 8217éléphant & # 8221, ou em inglês “O que é verdade para a E. coli é verdade para o elefante". De: http://www.pasteur.fr/infosci/ archives / mon / im_ele.html

Até que ponto a declaração de Monod de que "o que é verdade para E. coli é verdade para o elefante ”(representado por Monod na Figura 2) em nossa avaliação do tempo de vida do mRNA em outros organismos? A resposta curta não é muito. Considerando que o tempo de vida médio de degradação do mRNA é de aproximadamente 5 minutos em E. coli, o tempo de vida médio é de ≈20 minutos no caso de levedura (ver Figura 1B) e 600 minutos (BNID 106869) em células humanas. Curiosamente, uma escala clara é observada com os tempos de ciclo celular para esses três tipos de células de cerca de 30 minutos (E. coli), 90 minutos (fermento de brotamento) e 3000 minutos (humano), sob as taxas de crescimento exponencial rápido em que as células de interesse foram cultivadas para esses experimentos. Como regra geral, esses resultados sugerem que a escala de tempo de degradação do mRNA nesses casos é, portanto, cerca de um quinto do tempo do ciclo celular exponencial rápido.

O RNA mensageiro não é o único alvo de degradação. As moléculas de proteínas também são alvos de destruição específica, embora geralmente seus tempos de vida tendam a ser mais longos do que os mRNAs que levam à sua síntese, como discutido a seguir. Por causa dessas vidas longas, sob taxas de crescimento rápido, o número de cópias de uma determinada proteína por célula é reduzido não por causa de um processo de degradação ativo, mas simplesmente porque a célula dobra todos os seus outros constituintes e se divide em duas filhas, deixando cada uma das filhas com metade das cópias da proteína de interesse que estavam presentes na célula-mãe. Para entender o efeito de diluição, imagine que toda a síntese de proteínas para uma determinada proteína foi desligada enquanto a célula continua dobrando seu volume e logo depois se divide. Em termos de valores absolutos, se o número de cópias de nossa proteína de interesse antes da divisão for N, depois será N / 2. Em termos de concentração, se começou com uma concentração c, durante o ciclo celular foi diluído para c / 2 pela duplicação do volume. Este mecanismo é especialmente relevante no contexto de bactérias, onde o tempo de vida das proteínas é frequentemente dominado pelo tempo de divisão celular. Como resultado, a taxa de perda total de proteína α (o termo com o mesmo significado que γ para mRNA) é a soma de uma parte devido à degradação ativa e uma parte devido à diluição que ocorre quando as células se dividem e podemos escrever o total taxa de remoção na forma α = αativo+ αdiluição.

A afirmação de que a vida útil das proteínas em bactérias de crescimento rápido é mais longa do que o próprio ciclo celular é apoiada por medições já feitas na década de 1960, onde a marcação radioativa era usada como forma de medir as taxas. Nesse caso, a degradação das proteínas marcadas foi monitorada observando-se o acúmulo de aminoácidos radioativos em um perfusato trocado rapidamente. Estima-se que apenas 2-7% do proteoma esteja ativamente degradado, com meia-vida de cerca de 1 hora (BNID 108404). Mais recentemente, estudos mostraram casos específicos de degradação rápida, incluindo alguns fatores sigma, fatores de transcrição e proteínas de choque frio, mas a afirmação geral de que a diluição é o mecanismo de perda de proteína dominante em bactérias permanece válida.

Figura 3: Meias-vidas medidas de proteínas em leveduras de brotamento e uma linha de células de câncer humano HeLa. A experiência de levedura usou o inibidor de tradução cicloheximida que perturba a fisiologia celular normal. A meia-vida média das 4100 proteínas medidas na célula HeLa sem divisão é de 36 horas. (A, adaptado de A. Belle et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 103: 13004, 2006 B, adaptado de S. Cambridge et al, J. Proteome Res. 10: 5275, 2011.)

Assim como com os estudos de todo o genoma de tempos de vida do mRNA descritos acima, os tempos de vida das proteínas foram submetidos a um escrutínio semelhante. Surpreendentemente, não pudemos encontrar informações genômicas na literatura sobre os tempos de degradação de proteínas em E. coli mas na levedura de brotamento, um fármaco de inibição da tradução (cicloheximida) foi usado para inibir a síntese macromolecular e, em seguida, o conteúdo de proteína foi quantificado em momentos posteriores usando Western blots. A técnica de Western blot é um esquema no qual as proteínas de interesse são pescadas por ligação específica a alguma parte da proteína (por exemplo, por anticorpos) e a quantidade de proteína é lida a partir da intensidade de um repórter que foi calibrado contra um padrão. A inibição da tradução pode causar artefatos, mas com essa advertência em mente, os tempos de vida medidos mostrados na Figura 3A usando o método de inibição da tradução revelam os tempos de vida mais longos das proteínas em comparação com suas contrapartes de mRNA, com uma vida média de cerca de 40 minutos (BNID 104151). Problemas com a precisão desses resultados ainda exigem o desenvolvimento de novos métodos para a construção de tais pesquisas.

Figura 4: Distribuição de 100 proteínas de uma linha celular humana H1299, comparando a taxa de degradação à diluição para descobrir qual mecanismo de remoção é dominante para cada uma das proteínas. A taxa de remoção geral alfa varia entre 0,03 e 0,82 hora-1 com uma média de 0,1 +/- 0,09 hora-1. Isso é equivalente à meia-vida de ≈7 horas por meio da meia-vida da relação, T1 / 2 = ln (2) / alfa. Adaptado de E. Eden et al, Science, 331: 764, 2011.

Usando técnicas modernas de fluorescência, tornou-se possível medir as taxas de degradação de proteínas humanas na Vivo sem a necessidade de lisar as células. Os longos tempos de remoção observados em células humanas são mostrados na Figura 3B. As medições foram feitas fundindo a proteína de interesse a uma proteína fluorescente. Então, ao dividir a população em dois grupos, um dos quais fotodegradado e o outro não, e observando o ressurgimento da fluorescência na população fotodegradada, é possível medir diretamente o tempo de degradação. Conforme mostrado na Figura 4, para células humanas há uma interação interessante entre a degradação ativa e a remoção de proteínas por diluição. As meias-vidas de degradação ativa foram amplamente distribuídas com o turnover mais rápido observado de menos de uma hora e o mais lento mostrando degradação ativa insignificante nos poucos dias de microscopia de lapso de tempo. Esses resultados podem ser contrastados com uma previsão baseada na regra do N-end que afirma que o aminoácido no N terminal da proteína tem um forte efeito na degradação ativa realizada através do sistema de ubiquitinação. Por exemplo, em sistemas de mamíferos, prevê que arginina, glutamato e glutamina levarão à degradação em cerca de uma hora, enquanto valina, metionina e glicina serão estáveis ​​por dezenas de horas.

Na tentativa de caracterizar o tempo de vida das proteínas mais estáveis, os camundongos receberam alimentos isotopicamente marcados por um curto período em uma idade precoce e então analisados ​​um ano depois. Os resultados mostraram que a renovação da maioria das proteínas em alguns dias, mas alguns mostram uma estabilidade notável. As meias-vidas das histonas foram medidas em ≈200 dias ainda mais tentadoras, o poro nuclear consiste em um esqueleto de proteína com meia-vida & gt1 ano, enquanto todos os componentes circundantes são reabastecidos muito mais rápido.


DISCUSSÃO

Descobrimos que a taxa de ligação do TF a um local alvo dentro da região de entrada-saída do nucleossomo em relação ao DNA duplex é reduzida em mais de duas ordens de magnitude, enquanto a taxa de dissociação é aumentada em três ordens de magnitude. O equilíbrio de exposição do local, Keq, terá impacto na taxa de ligação ao TF, uma vez que LexA só pode se ligar ao estado do nucleossomo não embalado. Partindo do pressuposto de que a taxa de ligação de LexA ao seu local dentro do DNA duplex é a mesma que a de um local desvinculado do nucleossomo, a redução de 500 vezes na taxa de ligação é igual à redução na probabilidade de o local alvo ser exposto. Esta regulação da ligação ao TF pela exposição ao local via desdobramento transitório do DNA nucleossômico está bem estabelecida (12). No entanto, a descoberta de que os nucleossomos também regulam a ocupação do TF, aumentando dramaticamente a taxa de dissociação de proteínas, parece ser uma nova observação. Isso fornece um mecanismo adicional para regular a ocupação TF. Dado que observamos um aumento dramático na taxa de dissociação para dois TFs separados, isso parece uma característica geral da ligação do TF nos nucleossomos. Embora a regulação das taxas de ligação ao TF seja amplamente influenciada pelas propriedades do nucleossomo, como a sequência de DNA, histonas PTMs e a localização da sequência alvo (24, 25, 41), a regulação das taxas de dissociação do TF será influenciada pelas propriedades do nucleossomo e do TF.

Existem pelo menos dois modelos não exclusivos pelos quais o nucleossomo pode aumentar a dissociação do FT. (i) O nucleossomo pode influenciar diretamente as taxas de dissociação de TF, alterando a estrutura do local de reconhecimento que é exposto para a ligação de TF dentro do nucleossomo parcialmente desembrulhado em relação à estrutura de DNA duplex de modo que o tempo de residência de TF seja encurtado. Isso seria manifestado por uma mudança direta no kdesligado (Figura 1E). Além disso, (ii) estados de nucleossomo parcialmente desembrulhado poderiam competir com estados de TF parcialmente ligados (Figura 6). Por exemplo, o dímero LexA se liga com afinidades nanomolares, enquanto o monômero LexA se liga com afinidades micromolares (33), sugerindo que o monômero tem uma taxa de dissociação muito maior. Se a porção interna de um dímero de TF se dissociar transitoriamente, o nucleossomo poderia se embrulhar parcialmente bloqueando a religação da porção interna do TF. Com apenas o monômero externo do dímero TF ligado, ele é efetivamente ligado como um monômero com uma taxa de dissociação significativamente aumentada. O reenvolvimento parcial que bloqueia a religação da porção interna do TF pode resultar em um estado intermediário de FRET transitório, que não observamos. No entanto, o tempo de vida desse estado provavelmente estará na escala do reenvolvimento do nucleossomo, que ocorre na escala de milissegundos (23) e é muito rápido para ser detectado. Estudos futuros são necessários para determinar o mecanismo por trás do aumento na taxa de dissociação do TF. Curiosamente, o modelo competitivo é semelhante a como os TFs adjacentes se ligam dentro dos nucleossomos cooperativamente (42, 43).

Modelo de ligação competitiva entre o envolvimento do nucleossomo e a ligação ao TF. Os FTs podem se dissociar parcialmente onde parte do FT é liberada transitoriamente do sítio de DNA-alvo e, em seguida, rapidamente se liga novamente. No entanto, se o local estiver localizado dentro dos nucleossomos e a parte do FT mais para dentro do nucleossomo for liberada transitoriamente, o nucleossomo poderia se embrulhar impedindo o FT de se religar completamente, o que poderia aumentar a taxa na qual o FT se dissocia totalmente.

Modelo de ligação competitiva entre o envolvimento do nucleossomo e a ligação ao TF. Os FTs podem se dissociar parcialmente onde parte do FT é liberada transitoriamente do sítio de DNA-alvo e, em seguida, rapidamente se liga novamente. No entanto, se o local estiver localizado dentro dos nucleossomos e a parte do FT mais para dentro do nucleossomo for liberada transitoriamente, o nucleossomo poderia se embrulhar impedindo o FT de se religar completamente, o que poderia aumentar a taxa na qual o FT se dissocia totalmente.

Nossos resultados também parecem ser consistentes com relatórios anteriores de ligação competitiva entre proteínas de ligação ao DNA de alta afinidade. Várias proteínas de ligação a DNA independentes de sequência têm tempos de residência de -1 h (44, 45) na ausência de proteína solúvel. Porém, com a adição de proteína solúvel (45) ou esforço mecânico (46), os tempos de residência são reduzidos para minutos. Foi proposto que as proteínas de ligação ao DNA sofrem "microdissociação", onde a proteína se dissocia parcial ou totalmente do DNA, mas permanece dentro do comprimento de triagem (1 nm) do DNA e é muito mais rápida do que a taxa de dissociação macroscópica (45). Essas breves excursões rápidas da proteína ligada do DNA podem permitir que as proteínas solúveis competam com a religação, aumentando assim a taxa de dissociação macroscópica. Da mesma forma, parece que o desempacotamento e reenvolvimento rápido do nucleossomo poderia funcionar da mesma forma para competir com os TFs que sofrem micro dissociação para aumentar a taxa de dissociação.

Enquanto os TFs eucarióticos podem ligar suas sequências alvo com constantes de dissociação picomolar, eles podem estar em concentrações nanomolares ou mais altas dentro da célula (47, 48). Sob essas condições, a colocação de um nucleossomo em relação à sequência alvo do TF influenciará tanto a ocupação quanto a dinâmica do TF. Os promotores do gene com sítios alvo de TF posicionados fora de um nucleossomo serão ocupados pelo TF e permanecerão ligados por horas, resultando em um gene ativado constituinte. Nessas condições, a taxa de dissociação é tão lenta que levará da ordem do tempo do ciclo celular para atingir o equilíbrio. Portanto, a taxa na qual o FT pode se ligar determinará a taxa de ativação do gene, o que implica que ele é controlado cineticamente. Os promotores do gene com sítios alvo de TF dentro da região de entrada-saída do nucleossomo também serão ocupados pelo TF em concentrações nanomolares, como Gal4, mas serão trocados na escala de tempo de segundo a minuto, permitindo a rápida regulação do gene. Aqui, o equilíbrio entre o estado ligado e não ligado determinará a ocupação, que pode ser ajustada pela concentração de TF. Em contraste, promotores de genes com locais alvo de TF próximos ao eixo de simetria da díade do nucleossomo raramente serão expostos e, portanto, provavelmente não serão acessíveis para ligação ao TF, resultando em um gene inativo, a menos que atuado por complexos modificadores e remodeladores da cromatina. Curiosamente, as explosões de localização de TF e produção de mRNA foram relatadas como na escala de tempo minuto por medições de células individuais (49-51), sugerindo que a influência dos nucleossomos na dissociação de TF poderia desempenhar um papel regulador das explosões transcricionais.

Numerosas outras proteínas se ligam ao DNA dentro dos nucleossomos, incluindo os complexos de reparo e replicação de DNA. A influência do nucleossomo na cinética de ligação e dissociação de outros complexos de ligação ao DNA pode desempenhar um papel regulador de suas funções. Estudos futuros da dinâmica de ligação de outros complexos de ligação de DNA a sítios dentro da cromatina serão importantes para determinar se esta característica do nucleossomo desempenha um papel regulador em outros tipos de processamento de DNA.


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