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Aumentando / diminuindo a intensidade do sinal no Western blotting


Então, eu estava em aula e meu professor estava explicando o Western blotting. Parece que há mais de uma maneira de aumentar ou diminuir a intensidade do sinal. Ele nos apresentou o desafio de descobrir maneiras diferentes de como isso pode acontecer. Por mais que pareça, tudo que posso encontrar na internet ou mesmo no google scholar são apenas alguns produtos químicos como 'intensificador de sinal' e é isso, nada remotamente específico. Legitimamente, não proponho isso como um dever de casa real, na verdade é apenas uma curiosidade que tenho. Portanto, eu pergunto à comunidade científica quais são as condições em que se pode aumentar ou diminuir a intensidade do sinal no western blotting, se houver. Eu entendo o que é western blotting, qualquer um pode encontrar isso na wikipedia, mas condições que podem aumentar ou diminuir a intensidade do sinal?


Existem vários locais diferentes em um protocolo típico de Western blotting, onde as condições podem ser alteradas para modular a intensidade do sinal. O primeiro é a quantidade de proteína carregada - mais proteína dará um sinal mais forte, menos fornecerá um sinal mais fraco. No entanto, muita proteína pode resultar em bandas indistintas, aumento de fundo, distorção de pista e outros problemas.

A próxima condição a ser alterada é a quantidade de anticorpo primário e o tampão de incubação. Mais primário pode levar a um aumento do sinal, mas muito pode resultar em um fundo mais alto. Alguns anticorpos fornecem um sinal melhor quando diluídos em BSA, outros quando diluídos em leite em pó desnatado. Geralmente, o leite fornece uma mancha mais limpa, mas pode reduzir o sinal. O tempo de incubação também pode afetar a especificidade e a intensidade do sinal - alguns anticorpos se ligam totalmente com uma incubação de 1-2 horas em temperatura ambiente, outros requerem uma incubação durante a noite a 4 ° C.

A terceira condição a ser alterada é a quantidade e o tipo de anticorpo secundário. Aumentar a quantidade de secundário pode aumentar o sinal, mas, novamente, pode resultar em aumento de fundo. Existem também diferentes tipos de secundários, dependendo do seu sistema de detecção - HRP para detecção quimioluminescente, AP para colorimétrico, marcadores fluorescentes para sistemas de imagem, etc. Estes têm diferentes sensibilidades, mas também podem resultar em aumento de fundo, dependendo das outras condições de o protocolo.

Finalmente, o tipo de sistema de detecção pode afetar a sensibilidade. Por exemplo, ao usar secundários conjugados com HRP padrão, existem vários substratos ECL diferentes com sensibilidades amplamente variáveis. Aqui está uma lista de diferentes sistemas disponíveis da Thermo / Pierce, variando de ECL padrão a Femto.

Portanto, embora o Western blotting pareça um procedimento bastante simples, há muitos lugares para otimizar as condições para obter os resultados que você está procurando.


Uma coisa que outras pessoas ainda não mencionaram é que o tempo da lavagem pode afetar o sinal. Se for lavado por mais tempo do que os 5 minutos normalmente necessários para a lavagem de três vezes, isso pode resultar em uma redução (diminuição) do sinal.

Referência: http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=western-trouble


Além dos pontos na resposta que @mattdmo deu, é possível enriquecer a proteína de escolha antes da execução do gel. Isso pode ser feito usando proteínas marcadas (possivelmente com a clivagem da etiqueta antes do carregamento) ou fazendo uma imunoprecipitação de sua proteína. O último é interessante quando você tem apenas baixas concentrações de sua proteína presente na célula. O que você basicamente faz é ligar um anticorpo à proteína, ligar o complexo proteína-anticorpo a uma coluna ou grânulos, lavar (em teoria, praticamente você não está obtendo todas as outras proteínas) e então carregar a amostra. Dependendo do enriquecimento, você poderá ver uma banda, onde isso não é possível sem imunoprecipitação.

Então, a lavagem e o bloqueio do borrão desempenham um papel importante. Normalmente você usa leite em pó para preparar a solução de bloqueio, pois é muito barato e funciona muito bem. Mas pode fornecer um background bastante elevado e causar problemas com as fosfoproteínas (embora não necessariamente). Às vezes, é melhor usar soluções mais caras como BSA para bloquear a membrana. A lavagem também é crítica, dependendo de quão rigorosa você lava, você perderá sinal e influenciará o fundo. Aqui você pode jogar com diferentes concentrações de detergentes, bem como com diferentes detergentes.

Além disso, você pode obter muitos sinais diferentes na detecção. Para a detecção baseada em quimiolumincência, você pode usar filmes de raio-X (que são pouco sensíveis) e ter problemas com bandas fortes superando as fracas vizinhas. Eles também são mais difíceis de quantificar, pois a faixa linear em que mais intensidade corresponde a mais sinal é limitada. Com a quimioluminescência, você também pode usar câmeras CCD de alta sensibilidade especiais (que são mais sensíveis e têm uma faixa de detecção linear muito maior) ou placas de fosfo-imager (placas especiais, que armazenam o sinal quimioluminecente em uma placa sensível à luz e que são lidas com um scanner especial).

O mais recente desenvolvimento na tecnologia de detecção são scanners infravermelhos para os quais você usa anticorpos secundários acoplados a um corante que produz fluorescência no comprimento de onda infravermelho. Esses scanners são extremamente sensíveis e também permitem o uso de dois anticorpos secundários marcados de forma diferente ao mesmo tempo, o que pode ser muito útil na análise de interações de proteínas. No entanto, você precisará de anticorpos primários de diferentes espécies. As modernas técnicas de detecção também têm a vantagem de entregar arquivos digitais, enquanto os filmes precisam ser digitalizados antes de serem usados ​​em publicações.


Western Blot Doctor & # 153 - Problemas de força do sinal

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O Western Blot Doctor é um guia de autoajuda que permite solucionar seus problemas de western blot. Nesta seção, você pode encontrar soluções para problemas com detecção de sinal de blot.

Outras seções do Western Blot Doctor:

Problemas e Soluções

Clique na miniatura mais representativa de sua própria mancha para descobrir as causas prováveis ​​e encontrar soluções específicas para o problema.

Problema: Sinal irregular no blot

Algumas seções do blot parecem conter menos proteína.
Causas Possíveis: Soluções:
Membrana não uniformemente molhada antes da transferência
  • Certifique-se de que as membranas estejam uniformemente úmidas antes da transferência
  • Ao usar uma membrana PVDF hidrofóbica, ela deve ser completamente embebida em metanol antes do equilíbrio em tampão de transferência aquoso. Uma membrana PVDF completamente úmida tem uma aparência cinza translúcida
  • Métodos de transferência rápida ou de alta intensidade geram calor que pode fazer com que a membrana seque durante o manuseio. Certifique-se de que as membranas quentes não sequem após a transferência, reduzindo o tempo de manuseio
  • Encha completamente o tanque de transferência com tampão. O tanque de transferência deve conter tampão suficiente para cobrir totalmente a área da mancha
  • Certifique-se de que a membrana está totalmente imersa e agitada durante as incubações
  • Use um agitador para todas as incubações

Problema: sinal de banda saturada

  • Diminui a proteína total carregada no gel
  • Para otimizar o carregamento da amostra, consulte Determinando o carregamento de amostra apropriado para o protocolo Western Blots
  • Diminuir a concentração de anticorpos primários e / ou secundários
  • Otimize suas concentrações de anticorpos primários e / ou secundários usando um protocolo de triagem quadriculado
  • Use uma exposição mais curta
  • Use o recurso de multi-aquisição no software de aquisição de dados
  • Reduza o tempo de incubação com substrato de detecção
  • Use um substrato de detecção menos sensível

Problema: bandas fracas de alto MW

  • Tempo de transferência muito curto
  • Potência de transferência inadequada
  • Formulação de tampão de transferência
  • Veja abaixo em Baixa eficiência de transferência para obter detalhes sobre as condições de transferência
  • Para melhor transferência de proteínas grandes, use um gel de baixa porcentagem, por exemplo, um gel gradiente de 7,5% ou 4 & ndash15% e adicione SDS a 0,05% ao tampão de transferência
  • Detecte qualquer proteína residual remanescente no gel por meio de coloração e imagem do gel após a transferência ou use a tecnologia sem manchas para obter a imagem da proteína total no gel e no blot antes da imunodetecção. Bio-Rad & rsquos V3 Western Workflow & trade permite que você visualize, verifique e valide a separação e transferência de proteínas em cada etapa do procedimento de eletroforese e blotting

Problema: bandas fracas, sinal fraco ou sem sinal

Problemas de transferência ou ligação de proteínas
  • Verifique a concentração de amostras de proteínas (por exemplo, usando ensaios de proteína de Bradford ou Lowry)
  • Aumente a quantidade de material de origem
  • Fracionar ou concentrar a amostra usando uma ou mais destas técnicas:
  • Confirme a transferência com coloração Ponceau S
  • Confirme a transferência com Bio-Rad & rsquos Stain-Free Imaging Technology
  • Otimize as condições de transferência para o tamanho da proteína alvo
  • Porcentagem de acrilamida de gel inferior
  • Aumente o tempo de transferência
  • Otimize os buffers de transferência para concentrações de metanol e SDS
  • Aumente o tempo de transferência (géis mais espessos requerem tempos de transferência mais longos)
  • Verifique se a corrente no início da execução pode ser muito baixa para uma configuração de tensão específica, indicando composição incorreta do buffer. Consulte as diretrizes de alimentação para aplicações específicas na Tabela 4.1 do Protein Blotting Guide (Boletim 2895)
  • Use dispositivos de blotting de alta intensidade, por exemplo, Semi-Dry e Rapid Blotting Systems, como o Trans-Blot & reg SD ou Trans-Blot & reg Turbo & trade Systems
  • Use uma fonte de alimentação com um limite de corrente alto, como a fonte de alimentação PowerPac & trade HC. Se uma fonte de alimentação incorreta for usada, ela pode não atingir a tensão definida se a corrente da fonte de alimentação estiver em seu limite máximo
  • Proteínas de baixo MW podem ser transferidas completamente através da membrana
  • Proteínas & lt15 kDa podem mostrar diminuição da ligação a membranas de 0,45 & microm.
  • Reduza o tempo de transferência
  • Diminua a voltagem, especialmente se estiver usando um dispositivo de transferência de alta intensidade, por exemplo, Sistemas Semi-Dry e Rapid Blotting, como Trans-Blot SD ou Trans-Blot Turbo Systems
  • Coloque uma membrana adicional no sanduíche de gel para detectar quaisquer proteínas de baixo MW que são transferidas através da membrana
  • Use PVDF ou nitrocelulose 0,2 & microm (tamanho de poro menor)
  • Verifique a capacidade de saída da fonte de alimentação para garantir que a tensão e a saída de corrente correspondam às necessidades do instrumento de blotting. Se não corresponder às suas necessidades, obtenha uma fonte de alimentação com uma capacidade de corrente mais elevada, como PowerPac & trade HC Power Supply
  • Verifique o fusível
  • Verifique se o sanduíche de gel / membrana foi montado na ordem correta
    • Montagem em sanduíche para o blotting do tanque: Boletim 6213
    • Montagem em sanduíche para blotting semi-seco: Boletim 6214
    • Use um tampão de transferência mais básico ou ácido para aumentar a mobilidade da proteína. Uma proteína perto de seu ponto isoelétrico (pI) irá transferir mal (o pH do tampão deve ser 2 unidades de pH mais alto ou mais baixo do que o pI da proteína de interesse para eficiência de transferência ideal)
    • Alta concentração de proteína
    • Baixa solubilidade
    • Dobramento parcial / agregação
    • Use SDS no buffer de transferência. O SDS pode aumentar a eficiência de transferência, mas também pode reduzir a eficiência de ligação à nitrocelulose e afetar a reatividade de algumas proteínas com anticorpos
    • Reduza ou elimine o álcool no tampão de transferência
    • Reduza% T (monômero total) ou% C (reticulador) para aumentar o tamanho dos poros do gel e aumentar a eficiência de transferência. Usar 5% C (com bis-acrilamida como agente de reticulação) produz o menor tamanho de poro
    • Por exemplo, geralmente os géis de proteína têm cerca de 29: 1 de acrilamida para bis-acrilamida. Se você estiver usando 19: 1, deve tentar 29: 1. Se você estiver examinando um grande complexo e usando 29: 1, pode tentar 37,5: 1 ou taxas mais altas. Uma proporção maior de acrilamida para bis resulta em um gel com poros maiores
    • Prepare um novo buffer de transferência (para melhores resultados, nunca reutilize o buffer de transferência)
    • Reduza a quantidade de metanol. Isso pode melhorar a eficiência de transferência de proteínas do gel, mas também pode diminuir a ligação às membranas de nitrocelulose. 20% de metanol é geralmente ideal para a ligação de proteínas
    Problemas de detecção
    • Repita usando maior concentração de anticorpo
    • Otimize a concentração de anticorpos com dot blots
    • Protocolos de triagem quadriculada
    • Reduza o número de etapas de lavagem ao mínimo
    • Reduz a rigidez da lavagem
    • Aumente a concentração de anticorpos 2 & ndash4 vezes mais alta que a diluição inicial recomendada
    • Protocolos de triagem quadriculada
    • Refazer a mancha porque o antígeno pode ter sido removido ou danificado pelo processo de remoção
    • Teste diferentes tempos de exposição
    • Considere mudar para um sistema de imagem digital, como Bio-Rad & rsquos ChemiDoc & trade Imaging Systems
    • Diminuir a porcentagem (p / v) de leite nas soluções de bloqueio e anticorpos
    • Experimente soluções de bloqueio alternativas (por exemplo, albumina, gelatina ou BSA)
    • Aumente a quantidade de proteína aplicada
    • Concentre a amostra antes de carregar
    • Use um sistema de ensaio mais sensível
      • Se estiver usando a detecção colorimétrica, experimente um substrato quimioluminescente aprimorado (ECL), como Bio-Rad & rsquos Clarity & trade ECL Substrate
      • Se estiver usando conjugado de fosfatase alcalina (AP), tente um conjugado de peroxidase de rábano (HRP) (veja nossa seleção de Conjugados HRP e AP)
      • Se estiver usando um substrato ECL geral, tente um substrato ECL de alta sensibilidade
      • Reduza o número de lavagens ou reduza o rigor das condições de lavagem durante as etapas subsequentes do ensaio
        • Reduza o tempo de cada etapa de lavagem
        • Reduza a temperatura de lavagem
        • Reduza a concentração de detergente (geralmente Tween 20) no tampão de lavagem ou remova-o inteiramente do tampão de lavagem
        • Reduza a concentração de sal no tampão
        • Mancha a mancha após a transferência ou use padrões pré-corados para avaliar a eficiência da transferência. Alternativamente, use tecnologia sem manchas para avaliar a amostra que está no blot.
        • Consulte a seção anterior para obter sugestões sobre como melhorar os problemas relacionados à transferência
        • Os anticorpos, especialmente os monoclonais, podem não reconhecer antígenos desnaturados. Se este for o caso, eletroforese e proteínas de transferência sob condições nativas, por exemplo, PAGE azul nativo. Use uma serpentina de resfriamento e um banho de recirculação refrigerado para transferir proteínas sensíveis ao calor
        • Algumas manchas de proteínas totais (como preto de amido e ouro coloidal) interferem no reconhecimento do antígeno pelo anticorpo. Tente uma coloração diferente (por exemplo, Ponceau S) ou Bio-Rad & rsquos Stain-Free Technology
        • Armazene os reagentes nas condições recomendadas em pequenas alíquotas para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, contaminantes bacterianos e inativação por calor
        • Os detergentes podem afetar a ligação de alguns anticorpos. Elimine-os do ensaio, exceto para a lavagem após o bloqueio
        • Se o título de anticorpo for muito baixo, otimize as concentrações usando um experimento dot-blot (consulte Protein Blotting Guide: Microfiltração)
        • Otimize as concentrações de anticorpos usando um protocolo quadriculado.
        • Aumente os tempos de incubação do anticorpo
        • Teste a atividade da primeira solução de anticorpo. Use um ELISA, RID, imunodifusão de Ouchterlony ou teste de precipitação para determinar a reatividade do anticorpo com o antígeno. Se possível, repita o procedimento do ensaio com uma solução de anticorpo primário mais concentrada
        • Teste a atividade da solução de desenvolvimento de cor combinando 1,0 ml da solução de desenvolvimento de cor com 10 µl de conjugado de anticorpo secundário de força total. A reação da cor deve ocorrer imediatamente. Se a cor não se desenvolver em alguns minutos, a solução de desenvolvimento de cor está inativa. Prepare uma nova solução de trabalho e repita o ensaio de desenvolvimento de cor
        • Teste a atividade da solução de conjugado combinando 1,0 ml da solução de desenvolvimento de cor testada acima e 1,0 ml da solução de diluição de conjugado 1: 3.000. Uma coloração azul clara deve se desenvolver em 15 minutos. Se a cor não se desenvolver em 25 minutos, a solução de conjugado é suspeita. Repita o procedimento com uma diluição de conjugado recém-preparada
        • Armazene os reagentes nas condições recomendadas. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, contaminantes bacterianos e inativação por calor
        • A azida sódica inativa a peroxidase de rábano. Use um biocida diferente, como sulfato de gentamicina, em vez
        • Água não destilada pode causar a inativação da enzima. Use apenas água destilada deionizada
        • Se a concentração de conjugado for muito baixa, otimize usando um experimento dot-blot (consulte Bio-Dot & reg e Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus)
        • Otimize as concentrações de anticorpos usando um protocolo quadriculado

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        7 dicas para otimizar suas experiências de Western Blotting

        O Western blotting não é uma ciência exata: obter resultados perfeitos e prontos para publicação imediatamente não é exatamente a norma. No entanto, existem etapas que você pode executar para refinar seus experimentos de blotting e garantir que eles comecem da melhor maneira possível. Esse processo de ajuste fino é conhecido como otimização, e vários estágios do protocolo de Western blotting podem ser submetidos a ele.

        1. SDS-PAGE

        Seus experimentos de Western blotting começam muito antes de você começar a trabalhar com sua membrana. Poderíamos ir tão longe quanto a preparação da amostra, mas no interesse do espaço, vamos começar com a amostra separação. Com isso, você obtém o que colocou - sem um bom gel SDS-PAGE, você não obterá uma boa membrana e tudo se desfará a partir daí. Se você moldar seus próprios géis, tome cuidado extra para garantir uniformidade na maquiagem. Selecione a porcentagem correta de acrilamida (consulte o protocolo Western blot da Proteintech [PDF]). Evite aquele efeito de “sorriso” na frente da tinta resistindo à tentação de usar seus géis em altas tensões e encher poços vazios com um volume equivalente a 1x tampão de amostra.

        Acima de tudo, carregue uma quantidade uniforme de proteína para determinar a concentração de proteína por ensaio e esteja preparado para reduzir sua quantidade de carga se obtiver manchas "entremeadas". O laboratório de validação da Proteintech descobriu que 30 μg de proteína por via geralmente resulta em bandas sem riscos e bem separadas.

        2. Membrana

        Sua escolha de membrana pode fazer uma grande diferença no resultado de seus experimentos de Western blotting.Os dois principais tipos de membrana são PVDF e nitrocelulose, mas agora existem várias versões de cada um no mercado de consumíveis, incluindo, por exemplo, membranas otimizadas para imunodetecção por fluorescência ou proteínas de baixo peso molecular.

        O PVDF é valorizado por sua dureza, estabilidade e resistência à maioria dos ácidos e álcalis (o que significa que é a membrana escolhida para aqueles que desejam remover e testar novamente suas manchas). As membranas de PVDF também oferecem melhor retenção de proteínas do que a nitrocelulose.

        As membranas de nitrocelulose são facilmente bloqueadas e geralmente fornecem altas taxas de sinal-ruído. Você não será capaz de retirá-los e sondá-los novamente, e também prestar atenção ao tamanho dos poros da membrana de nitrocelulose.

        Finalmente, uma palavra sobre a tradição do laboratório: não tenha medo de mudar os tipos de membrana por causa das normas do laboratório. Tentar algo diferente pode ser a chave para o Western blot ideal.

        3. Concentração de anticorpos

        Supondo que você tenha feito o esforço necessário para selecionar seu anticorpo, sua próxima etapa deve ser determinar a concentração ideal de anticorpo de trabalho.

        A taxa de ligação entre o anticorpo e o antígeno (a constante de afinidade) é afetada por suas concentrações relativas na solução (entre outras variáveis, como temperatura e pH). As quantidades de antígeno são geralmente fixadas em Western blotting (ou seja, sua proteína é fixada na membrana), então você frequentemente precisará ajustar a concentração de anticorpo para obter melhores blots. Fazer isso de maneira organizada - testando várias diluições de anticorpo, mantendo todos os outros parâmetros constantes - ajudará a determinar a concentração ideal de anticorpos para seus experimentos.

        Esta etapa é chamada de titulação de anticorpos e deve ser realizada sempre que você usar um novo anticorpo ou conjunto de condições experimentais. Também deve ser feito se você notar que um novo lote de anticorpo policlonal não está apresentando o mesmo desempenho do anterior.

        Como titular um anticorpo

        Muitas empresas fornecem diluições recomendadas em suas folhas de dados de anticorpos, e estes são geralmente bons números aproximados para você começar, no entanto, ainda é aconselhável titular anticorpos, pois as condições usadas para obter essas diluições recomendadas podem ser muito diferentes daquelas que você ' está usando. Se uma folha de dados do produto sugere o uso de uma diluição de 1: 1000, tente uma série de 1: 250, 1: 500, 1: 1000, 1: 2000 e 1: 4000.

        Em geral, se você agrupar a diluição recomendada com uma duplicação e uma redução pela metade (e uma diluição entre cada uma delas), você deve estar no caminho certo. Se não houver diluição recomendada para começar, tente 1 μg / ml de anticorpo purificado como ponto de partida (as concentrações devem estar na folha de dados) e continue a partir daí. Lembre-se de manter todos os outros parâmetros do protocolo iguais, como tipo de amostra, tempos de incubação, tempos de lavagem e temperaturas.

        Uma nota sobre anticorpos secundários

        Pode ser que você tenha que tentar diferentes concentrações de anticorpos secundários também - especialmente no caso de detecção quimioluminescente. A concentração do anticorpo secundário marcado com HRP afeta diretamente o aparecimento das bandas. Pouca enzima HRP resultará em baixo sinal quimioluminescente e luz ou bandas ausentes. Por outro lado, uma concentração muito alta produzirá faixas “queimadas”. Isso é causado por um rápido esgotamento do substrato no centro das bandas. A duração da incubação do reagente quimioluminescente também fará diferença (ver nº 6, Detecção, abaixo).

        4. Condições de bloqueio

        Vários buffers de bloqueio estão disponíveis e nem todos funcionam em todas as situações. É importante tentar vários tampões de bloqueio para cada par de antígeno-anticorpo. Lembre-se de que os tampões de bloqueio à base de leite contêm coisas como biotina endógena, glicoproteínas e enzimas que podem interferir no sinal. Buffers à base de leite, por exemplo, contêm fosfatases ativas que irão sabotar sua detecção de proteínas fosforiladas nesses casos, tente alternativas como bloqueadores à base de albumina de soro bovino.

        5. Lavagem

        Na maioria das vezes, sempre que tenho um sinal de fundo alto, revisar as etapas de lavagem na próxima execução provou ser útil. Normalmente, eu fiz isso aumentando a concentração de Tween-20 de 0,05% para 0,1%. Você também pode alterar a intensidade da lavagem usando qualquer uma das seguintes táticas: aumentar os tempos e os volumes de lavagem, realizar trocas adicionais de tampão ou usar detergentes mais fortes (por exemplo, SDS em vez de Tween 20). Apenas não exagere.

        6. Detecção

        O estágio de detecção é fundamental para a obtenção de um bom sinal de Western blot. Existem muitos reagentes quimioluminescentes por aí - e alternativas quimioluminescentes, como a detecção fluorescente - portanto, há muitas opções se o seu método de detecção atual não atende aos padrões do laboratório. Você pode escolher reagentes com mais sensibilidade ou aqueles que produzem sinal mais duradouro, por exemplo. A última opção aumentará a reprodutibilidade de seus borrões incomensuravelmente.

        Em um nível mais simples, a detecção quimioluminescente pode ser otimizada com os tempos de exposição do filme. Esta é provavelmente a etapa de otimização executada com mais frequência, pois é rápida e fácil. Sempre exponha seus blots para um intervalo de pontos de tempo individuais (mas lembre-se de que depois de cerca de 10 a 15 minutos, todo o substrato HRP será usado). Sua escolha de filme também fará diferença. Sempre achei que os filmes projetados especificamente para a detecção quimioluminescente - em vez de qualquer filme radiossensível padrão - são a escolha ideal.

        7. Corte um passo!

        Faz sentido que, se você tem menos etapas para realizar, há menos coisas que podem dar errado com seu experimento e há menos etapas para otimizar em primeiro lugar. Avanços tecnológicos e modificações simples de reagentes, como imagens de fluorescência e reagentes conjugados com HRP, respectivamente, podem ajudar aqui.

        Embora os sistemas de imagens de fluorescência ainda não estejam disponíveis para todos os laboratórios, pode haver instalações principais ou centrais em sua instituição que oferecem essa tecnologia. Uma vantagem imediata dos sistemas de detecção baseados em fluorescência é que eles permitem a detecção de mais de um anticorpo simultaneamente, eliminando a necessidade de remover e testar novamente seus blots. (Recomendamos veementemente, no entanto, que você não execute suas tentativas iniciais de Western blot usando vários anticorpos primários na mesma incubação - especialmente se a imagem de fluorescência não estiver disponível e você estiver optando por usar a detecção de quimioluminescência. Se você quiser fazer isso eventualmente, deixe até que você conheça suas proteínas e anticorpos muito melhor.)

        Como alternativa, você pode ignorar a detecção secundária de anticorpos primários completamente e agilizar seu protocolo de Western blotting, usando anticorpos primários conjugados com HRP. É certo que eles não estão disponíveis para todos os alvos de proteína, no entanto, aqueles que reconhecem controles de carregamento comuns e etiquetas de proteínas podem economizar muito tempo e podem ser um bom investimento. A Proteintech tem vários deles!

        Resumindo

        Os principais objetivos da otimização são aumentar a relação sinal-ruído de bandas específicas e diminuir bandas não específicas (se houver). É certo que, se você optar por otimizar todas as variáveis ​​acima, levará um tempo considerável, no entanto, mesmo uma ou duas alterações podem fazer a diferença e, na verdade, poupar tempo no longo prazo. No geral, considero a otimização um empreendimento extremamente valioso - e uma estratégia necessária se você deseja obter Western blots com qualidade de publicação.


        1. INTRODUÇÃO

        Western blot é um método experimental comumente usado para determinar a expressão relativa da proteína em amostras biológicas complexas. [1-4] É conduzido pela separação de proteínas de células ou tecidos por eletroforese, transferência de proteínas para a membrana de fluoreto de polivinilideno de suporte de fase sólida (PVDF), e as proteínas são reconhecidas por anticorpo primário específico, então os sinais são amplificados por enzima- anticorpo secundário acoplado, finalmente o indicador cromogênico comercial Luminol é adicionado à membrana, seguido por imagem imediatamente (Figura 1A). [5, 6] No entanto, o indicador cromogênico baseado em quimioluminescência mais comumente usado às vezes apresenta desempenho inferior na detecção precisa da expressão de proteínas devido à fraqueza inerente de faixa linear estreita e reprodutibilidade quantitativa instável (Figura 1B). [7-13] Como os fluoróforos de enxerto direto para os anticorpos primários ou secundários, o indicador de fluorescência relatado recentemente para análise quantitativa de proteínas é muito baixo em concentração para rastrear proteínas. [14-18] Além disso, o fenômeno de têmpera causada por agregação (ACQ) estreita muito a faixa quantitativa linear. [19-26]

        Aqui, um indicador de fluorescência ativável por enzima baseado em emissão induzida por agregação (AIE) foi projetado e construído através da introdução do substrato da fosfatase alcalina (ALP), grupo fosfato hidrofílico, em nosso bloco de construção AIE estabelecido de quinolina-malononitrila (QM). Este AIEgen DQM-ALP "anfifílico" exibe fluorescência "desligada" inicial devido à dispersidade superior em ambientes aquosos e lipídicos, ao passo que poderia ser clivado para liberar QM-OH hidrofóbico para agregar e emitir forte luminescência quando exposto ao ALP acoplado anticorpo secundário na membrana PVDF (Figura 1C). Este indicador de fluorescência ativável por ALP oferece os seguintes recursos: (i) Garantia de alto sinal-ruído (S/N) proporção de anfifílico DQM-ALP através da excelente dispersão em ambos os ambientes hidro / lipofílicos para gerar sinal de fluorescência inicial insignificante (ii) Permitindo alta seletividade devido ao reconhecimento específico entre o anticorpo secundário acoplado a ALP e o grupo fosfato (iii) Expandindo a faixa de quantificação linear com ajuda de AIEgens superando a extinção de luminância induzida por alta concentração (iv) Processamento de reprodutibilidade quantitativa estável como resultado da excelente fotoestabilidade de AIEgens. Todas essas vantagens permitem que o indicador DQM-ALP “anfifílico” quantifique proteínas com sinal estável reproduzível e ampla faixa linear, fornecendo assim uma alternativa prática ao Luminol cromogênico disponível comercialmente no ensaio de Western blot baseado em fluorescência. [27-32]


        Resultados e discussão

        Método de imunoensaio em microescala

        Em métodos de imunoensaio baseados em superfície, a difusão do anticorpo é a etapa determinante da taxa do ensaio, como resultado, longos tempos de incubação são usados ​​para atingir a sensibilidade de detecção máxima. 25 & # x0201332 Mecanismos de transporte de massa para analitos em uma solução reagindo com alvos de ligação de superfície incluem difusão com base em um gradiente de concentração, difusão em um gradiente de temperatura (térmica), difusão em um gradiente de pressão e difusão auxiliada por forças externas agindo sobre um produto químico espécies / analitos incluindo convecção livre e forçada. 51 & # x0201353 Usamos a deposição de fluxo para alcançar o transporte convectivo e a distância de difusão reduzida, resultando em escalas de tempo mais curtas para a ligação do anticorpo. A Figura 1 mostra a montagem da tubulação impressa em 3D e o estágio de vácuo que foi usado para realizar imunoensaios rápidos. A membrana é colocada no estágio de vácuo e a deposição de fluxo das soluções de imunoensaio ocorre através de uma seringa conectada ao tubo, conforme ilustrado na Figura 2.

        Desenvolvemos condições para o ensaio realizando dot blots de 3,3 & # x003bcg / mL actina dissolvida em água e condições variáveis ​​de deposição da solução de imunoensaio. Descobrimos que a deposição de anticorpo primário a 20 & # x003bcL / min com uma velocidade de estágio de 4 mm / min deu intensidade de sinal comparável a um método de imunoensaio tradicional durante a noite (Figura S1). O tempo total de ligação do anticorpo primário foi de 25 min e o anticorpo primário total usado foi de 175 ng, uma redução de 40 e 30 vezes, respectivamente, em relação ao método convencional.

        Em seguida, examinamos a etapa de deposição de anticorpos secundários. Deposição de fluxo a 20 & # x003bcL / min com velocidades de estágio de 2 & # x020138 mm / min, resultou em sinal fraco e altos níveis de ruído de fundo. Especificamente, sob essas condições, observamos a formação de grandes manchas fluorescentes na membrana de ligação que não puderam ser facilmente removidas. Foi determinado que o uso de taxas de fluxo mais baixas (3,5 & # x020137,5 & # x003bcL / min) enquanto o estágio se movia para frente e para trás a 70 mm / min de modo que as amostras de membrana e proteína passassem pelo anticorpo secundário várias vezes, resultando em muito menos formação desses pontos de fundo e sensibilidade comparável aos imunoensaios convencionais (Figura S2). Usando 5 & # x003bcL / min, o tempo de deposição de anticorpo secundário total foi de 15 min e o anticorpo secundário total usado foi de 75 ng, uma redução de 4 e 27 vezes, respectivamente, em relação ao método convencional.

        Não está claro por que condições diferentes foram necessárias para a deposição de anticorpos primário e secundário, no entanto, diferenças também são vistas no método de imunoensaio tradicional que parecem se correlacionar com nossas observações. Os tempos de incubação para anticorpos secundários são normalmente muito mais curtos (1 h) do que os anticorpos primários (durante a noite). Os anticorpos secundários fluorescentes são normalmente usados ​​em concentrações mais diluídas do que os anticorpos primários. É provável que vários fatores contribuam para as diferenças na ligação do anticorpo primário e secundário. A cinética de ligação do anticorpo secundário ao primário pode diferir daquela do anticorpo primário ao antígeno ligado à superfície. A presença de marcadores fluorescentes fornece grupos hidrofóbicos no anticorpo secundário que também podem afetar o potencial de ligação não específica e agregação para alterar os sinais de fundo.

        Independentemente da razão para as diferenças, usando esses métodos de deposição e enxágue entre cada deposição enquanto usa vácuo para puxar as soluções através da membrana, conforme mostrado na Figura 2, um imunoensaio dot blot completo é concluído em 1 h (Tabela 1). As relações S / N obtidas por este procedimento abreviado são comparáveis ​​às obtidas usando um tempo de análise de 20 h (Figura 3).

        Comparação entre um imunoensaio tradicional de 20 h (a) e o imunoensaio rápido desenvolvido de 1 h (b) para dot blots de 3,3 & # x003bcg / mL de actina. Os valores S / N (c), sinal (d) e ruído (e) calculados e plotados com n = 3 pontos de proteína são exibidos mostrando detecção comparável entre os dois métodos de imunoensaio. Estatísticas de teste t de Student & # x02019s bicaudais não pareadas foram realizadas com p & # x0003c 0,01 para comparar o S / N (c) dos resultados do imunoensaio tradicional e de fluxo em que os dois conjuntos de dados não são significativamente diferentes.

        Tabela 1.

        Comparação de tempos de análise de método de imunoensaio rápido e tradicional e consumo de anticorpos para membranas dot blotting.

        Imunoensaio TradicionalImunoensaio de fluxo
        Tempo por etapa
        & # x02003 & # x02003Blocking1 h15 min
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo primário17 h25 min
        & # x02003 & # x02003 Lavagem20 minutos2,5 min
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo Secundário1 h15 min
        & # x02003 & # x02003 Lavagem20 minutos2,5 min
        Tempo total20 h1 h
        Consumo de Anticorpos
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo primário5 e # x003bcg175 ng
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo Secundário2 e # x003bcg75 ng

        Esses valores são baseados em um traço de membrana com 7 cm de comprimento.

        Western blotting de microchip com imunoensaio de deposição direta

        O método de imunoensaio de fluxo foi então aplicado a proteínas depositadas por eletroforese em gel de microchip. A Figura 4 exibe um esquema e uma imagem de western blotting de microchip. A amostra é introduzida usando uma injeção controlada e cronometrada, após a qual as proteínas migram através do canal de separação. Neste trabalho, um conjunto externo de fluxo de bainha é usado para aterrar a extremidade do canal de separação, enquanto os canais de fluxo de bainha internos são usados ​​para depositar proteínas separadas em uma tira de membrana de nitrocelulose. Experimentos piloto usando este sistema para depositar actina em um membro resultaram inesperadamente em sinal baixo ou nenhum sinal ao usar o imunoensaio rápido descrito acima. Para determinar a causa dessa perda de sinal, realizamos o processo de fluxo para todas as etapas, exceto a adição do anticorpo secundário, que foi realizada em um agitador por 1 h. Este método de fluxo modificado permitiu a detecção de proteínas de western blotting microchip, mas com um S / N reduzido em comparação com o tradicional imunoensaio de 20 h (Figura S3). Esses resultados sugeriram que a proteína não foi capturada efetivamente com o sistema de deposição em fluxo na presença de gel e foi hipotetizado ser devido ao efeito do gel nas interações das proteínas com a membrana de ligação. Para testar esta hipótese, foram realizados experimentos comparando dot blots de proteína diluída em água e solução de gel. Esses experimentos mostraram menor intensidade de sinal para os dot blots de gel com a abordagem de imunoensaio rápido (Figura S4), apoiando a hipótese de que o gel contribuiu para a perda de sinal.

        Para lidar com a perda de proteínas co-depositadas com matriz de peneiramento de gel, o glutaraldeído foi usado para reticular proteínas para fixação de membrana, um método usado em alguns casos com western blotting convencional. 41,42,45,46 A reticulação para a melhoria da retenção de proteínas nas membranas de ligação é atribuída ao resultado de ligações multiponto das proteínas reticuladas. 43,46,48 Nos métodos de western blot anteriores, o tratamento com 0,5% (v / v) -2,5% (v / v) de glutaraldeído por 15 & # x0201360 min foi usado para melhorar a retenção de proteína nas membranas de blotting. 42,43,45,46 Recentemente, usamos 40% (v / v) de glutaraldeído para obter reticulação em 10 s para estudos de interação proteína-proteína (PPI). 54 Inspirados por esta abordagem, descobrimos que expor as proteínas e membrana a 40% (v / v) de glutaraldeído por 10 segundos e enxágue com água por

        2 min antes do imunoensaio em microescala mitigou os problemas de perda de proteína de modo que os resultados das membranas de Western blotting de microchip fossem comparáveis ​​entre um imunoensaio tradicional e um de fluxo (Figura 5). A Figura S3 compara o nível S / N inicial alcançado com um imunoensaio modificado (1,75 h), com um método não reticulado (1 h) e um método de fluxo reticulado (1 h) com um método tradicional (20 h) imunoensaio mostrando que a reticulação de glutaraldeído é eficaz na prevenção da perda de proteínas do traço de gel do western blotting de microchip.

        Comparação entre um imunoensaio tradicional (a) e o imunoensaio de fluxo reticulado (X-link) (b) para western blotting de microchip de 3,3 & # x003bcg / mL de actina. Imagens de membrana e varreduras de linha do ImageJ são mostradas (traço preto), onde a varredura de linha da escada de proteína FITC (traço vermelho) são sobrepostos. As unidades arbitrárias das intensidades de sinal da escada de proteína FITC foram divididas por 250 para dimensionar a escada para o gráfico acima. As barras de erro representam o desvio padrão da proteína detectado pelos vários métodos de imunoensaio para injeções, separações e deposições repetidas da amostra de proteína do microchip. Os valores S / N (c), sinal (d) e ruído (e) calculados e plotados com n = 3 injetados e picos de proteína detectados são exibidos mostrando detecção comparável entre os dois métodos de imunoensaio. A relação entre S / N e concentração de actina para um imunoensaio tradicional e imunoensaio de fluxo X-link dá um R2 igual a 0,9995 e 0,996, respectivamente (f).Os limites de detecção foram calculados considerando o limite do branco com um LOD de 2 nM para o imunoensaio tradicional e um LOD de 7 nM para o imunoensaio de fluxo X-link. Estatísticas de teste t de Student & # x02019s bicaudais não pareadas foram realizadas com p & # x0003c 0,01 para comparar o S / N (c) dos resultados do imunoensaio tradicional e de fluxo em que os dois conjuntos de dados não são significativamente diferentes.

        Uma curva de calibração de western blotting de microchip para actina pelos imunoensaios de fluxo tradicionais e reticulados produz uma resposta linear (Figura 5). A partir desses dados, os limites de detecção de concentração (LODs) foram calculados como 2 nM para o imunoensaio tradicional e 7 nM para o imunoensaio de fluxo reticulado. Uma vez que estimamos que 4,5 nL foram injetados, esta concentração corresponde a um LOD de massa de 9 amol ou 400 fg para o imunoensaio tradicional e 30 amol ou 1 pg para o imunoensaio de fluxo reticulado. Obviamente, 20 & # x003bcL foram usados ​​para encher o reservatório, então mais amostra foi usada para o ensaio. A preparação de amostras miniaturizadas e os métodos de carregamento seriam necessários para tirar o máximo proveito do LOD em massa que é possível.

        A Tabela 2 resume o método de imunoensaio de fluxo reticulado. Experimentos posteriores revelaram que se alguma velocidade pudesse ser sacrificada, as etapas de processamento que afetam a perda de proteína da aderência reduzida de proteínas do traço de gel de deposição de microchip podem ser modificadas de modo que um método de imunoensaio de 2 h seja usado para detecção de proteína sem reticulação, conforme resumido na Tabela 2. Neste caso, o anticorpo secundário é incubado por 1 h com agitação semelhante a um imunoensaio tradicional. Estes diferentes métodos de imunoensaio de fluxo permitem a flexibilidade de usar uma etapa de reticulação antes do imunoensaio ou não. O método não reticulado pode ser útil se a reticulação inibir a ligação do anticorpo, embora isso não tenha sido visto ou relatado anteriormente por outras técnicas ocidentais de reticulação. 48 e # x0201355

        Mesa 2.

        Comparação de tempos de análise de métodos tradicionais, em microescala modificada e de imunoensaio rápido e consumo de anticorpos para membranas de Western blotting de microchip.

        Imunoensaio TradicionalImunoensaio de fluxo modificadoImunoensaio de fluxo X-link
        Tempo por etapa
        & # x02003 & # x02003Cross-Linking--10 s
        & # x02003 & # x02003 Lavagem--110 s
        & # x02003 & # x02003Blocking1 h15 min15 min
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo primário17 h25 min25 min
        & # x02003 & # x02003 Lavagem20 minutos10 min2,5 min
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo Secundário1 h1 h15 min
        & # x02003 & # x02003 Lavagem20 minutos10 min2,5 min
        Tempo total20 h2 h1 h 2 min
        Consumo de Anticorpos
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo primário5 e # x003bcg175 ng175 ng
        & # x02003 & # x02003 Anticorpo Secundário2 e # x003bcg10 e # x003bcg75 ng

        Esses valores são baseados em um traço de membrana com 7 cm de comprimento.

        Além disso, testamos o método em diferentes proteínas. Uma comparação de western blots de microchip para detecção de GAPDH a partir de lisado de células A431 usando o imunoensaio tradicional (20 h), o imunoensaio em microescala, não reticulado (2 h) e o imunoensaio de fluxo (1 h) reticulado são mostrado na Figura 6. Como mostrado, S / N comparável é alcançado para todos os métodos, mas o método de fluxo reticulado reduz o tempo de ensaio em 20 vezes e o uso de reagente por

        30 vezes. Também comparamos os resultados com um método de imunoensaio de 20 h para a detecção de & # x003b2-Tubulina em lisado de células A431 (Figura 7). Como mostrado, também foram obtidos resultados comparáveis ​​para essas proteínas a partir do lisado. Esses resultados sugerem que o método de fluxo pode ser usado de forma confiável para diferentes proteínas com desenvolvimento mínimo de método.

        O Western blotting de microchip de lisado de células A431 de proteína total 100 & # x003bcg / mL foi feito para a detecção de GAPDH. Uma comparação entre um imunoensaio tradicional (a), um imunoensaio de fluxo modificado (b) e o imunoensaio de fluxo reticulado (X-link) (c) para detecção de GAPDH são exibidos. Imagens de membrana e varreduras de linha do ImageJ são mostradas (traço preto), onde a varredura de linha da escada de proteína FITC (traço vermelho) são sobrepostos. As unidades arbitrárias das intensidades de sinal da escada de proteína FITC foram divididas por 2500 para dimensionar a escada para o gráfico acima. As barras de erro representam o desvio padrão da proteína detectado pelos vários métodos de imunoensaio para injeções, separações e deposições repetidas da amostra de proteína do microchip. Os marcadores de peso de molécula de escada de proteína FITC 1 e # x020137 representam: 11, 21, 32, 40, 63, 96 e 155 kDa. Os valores S / N (d), sinal (e) e ruído (f) calculados e plotados com n = 3 injetados e picos de proteína detectados são exibidos mostrando detecção comparável entre os dois métodos de imunoensaio. Estatísticas de teste t de Student & # x02019s bicaudais não pareados foram realizadas com p & # x0003c 0,01 para comparar o S / N (d) dos resultados do imunoensaio tradicional e de fluxo em que os conjuntos de dados de 20 he 1 h não são significativamente diferentes.

        O Western blotting de microchip de 100 & # x003bcg / mL de lisado de células de proteína total A431 foi feito para a detecção de & # x003b2-Tubulina. Uma comparação entre um imunoensaio tradicional (a), um imunoensaio de fluxo modificado (b) e o imunoensaio de fluxo reticulado (X-link) (c) para detecção de & # x003b2-Tubulina são exibidos. Imagens de membrana e varreduras de linha do ImageJ são mostradas (traço preto), onde a varredura de linha da escada de proteína FITC (traço vermelho) são sobrepostos. As unidades arbitrárias das intensidades de sinal da escada de proteína FITC foram divididas por 2500 para dimensionar a escada para o gráfico acima. As barras de erro representam o desvio padrão da proteína detectado pelos vários métodos de imunoensaio para injeções, separações e deposições repetidas da amostra de proteína do microchip. Os marcadores de peso de molécula de escada de proteína FITC 1 e # x020137 representam: 11, 21, 32, 40, 63, 96 e 155 kDa. Os valores S / N (c), sinal (d) e ruído (e) calculados e plotados com n = 3 injetados e picos de proteína detectados são exibidos mostrando detecção comparável entre os dois métodos de imunoensaio. Estatísticas de teste t de Student & # x02019s bicaudais não pareadas foram realizadas com p & # x0003c 0,01 para comparar o S / N (c) dos resultados do imunoensaio tradicional e de fluxo em que os dois conjuntos de dados não são significativamente diferentes.


        Analisando LC3 em Western blot

        A cadeia leve 3 da proteína associada a microtúbulos (LC3) é considerada um dos marcadores definitivos de autofagia, e seu uso é amplamente difundido em laboratórios em todo o mundo. Apesar de sua popularidade, há várias considerações ao empregar anticorpos LC3 em imunoensaios, Western blots em particular.

        LC3 é expresso como um propeptídeo e é subsequentemente clivado para formar LC3-I. A iniciação da autofagia causa a conversão de LC3-I em LC3-II por meio da adição de um grupo fosfatidiletanolamina (PE) ao terminal C. O grupo PE aumenta a taxa de migração da banda em um gel de SDS-PAGE, provavelmente devido à sua natureza hidrofóbica, essa modificação comumente se manifesta como o aparecimento de um dupleto em um Western blot. O caráter lipofílico do grupo PE também facilita a inserção de LC3-II nas membranas de autofagossomos e, como resultado, LC3-II é degradado conforme os autofagossomos são revirados. Um aumento na intensidade da banda LC3-II e uma diminuição na expressão de LC3-I é considerada a marca registrada da autofagia, mas os aumentos em LC3-II podem ser causados ​​por síntese aprimorada de autofagossomo ou reciclagem reduzida de autofagossomo, tornando a interpretação da coloração de LC3 enganosa.

        Validação de Knockout LC3B com Western Blot: Anticorpo LC3B [NB100-2220] - LC3B / MAP1 [NB100-2220] - Detecção de LC3 em lisados ​​de células ES de camundongo. Células ES Atg5 - / - do Dr. Noboru Mizushima [Mizushima, N. et al. J. Cell Biol. 152 (2001)] Foto cortesia da Dra. Beth Levine, UT SW Medical Center.

        A análise de Western blots de LC3 é ainda mais complicada por uma diferença nas afinidades dos anticorpos para LC3-I e LC3-II e pela diferença marcante na expressão de LC3 em vários tipos de células e tecidos. Devido a esses fatores, surgiu um consenso de que a quantidade total de LC3-II só deve ser avaliada e comparada a um controle de carga como meio de avaliação da autofagia. Além disso, muitos pesquisadores incluem extratos de controle coletados de células tratadas com vários inibidores para determinar a eficiência do fluxo autofágico em suas amostras experimentais. O padrão de expressão de LC3 nesses controles indica idealmente a causa do acúmulo de LC3-II (ou sua ausência), dependendo do tipo de inibidor usado. Uma última consideração é a medição do fluxo autofágico ao longo de um período de tempo em oposição à coleta de extratos de um ponto estático. Por exemplo, embora a mudança de LC3-I para LC3-II seja evidente após curtos períodos de estresse, o sinal LC3 desaparece após fome prolongada em muitos tipos de células.

        Para dicas de solução de problemas do LC3 e respostas técnicas científicas para mais de 25 perguntas frequentes (FAQs) sobre pesquisa em autofagia, leia nossas FAQs - Autophagy e LC3.


        Materiais e métodos

        Materiais

        A ureia, o DTT e os reagentes tampão foram adquiridos à Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Ubiquitina purificada (BML-UW8795), cadeias de ubiquitina (BML-UW0825) e MG-132 (BML-PI102) foram obtidas de Enzo Life Sciences (NY, EUA).

        Cultura de células

        Células cardíacas de rato H9c2 (ATCC, CRL-1446) foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) na presença de 5% de FBS e 0,5% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen) em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO2. O inibidor de proteassoma MG132 (concentração final de 10 μM) foi adicionado ao meio de crescimento e as amostras coletadas 36 h após o tratamento.

        Preparação de amostra

        Camundongos machos foram sacrificados aos 3 meses de idade por inalação de isoflurano a 3% e subsequente deslocamento cervical. Os corações foram removidos, lavados em PBS frio, pesados ​​e congelados rapidamente. Este método demonstrou ser excelente para investigação por Western blotting [16]. Ratos machos Fisher 344-Brown Norway (jovens (10 meses de idade) e velhos (30 meses de idade)) foram designados a um de dois grupos experimentais: grupos normais ou de suspensão de membros posteriores. Foi demonstrado anteriormente que 14 dias de suspensão nos membros posteriores aumentam a predisposição dos ratos a terem arritmias cardíacas, enquanto 21 dias de suspensão nos membros posteriores diminuem significativamente as taxas de renovação das proteínas do músculo cardíaco [17, 18]. É possível que a ISGilação seja afetada em corações de animais suspensos nas patas traseiras, uma vez que algumas das enzimas que promovem a ISGilação também estão envolvidas na conjugação da ubiquitina [19]. Para determinar se os níveis de proteínas ISGylated (proteínas que estão covalentemente ligadas a ISG15) em corações foram afetados pela descarga dos músculos dos membros inferiores, foi utilizado o modelo de suspensão de cauda não invasiva [20]. Os ratos foram mantidos em posição de inclinação da cabeça para baixo com os membros posteriores suspensos por 14 dias. Os corações foram coletados após os ratos serem anestesiados com gás isoflurano. Depois de concluída a remoção do tecido, os ratos foram mortos por exsanguinação. Os corações foram pesados, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C para análise posterior. Esta investigação foi realizada em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Institucional de Animais da Universidade da Califórnia de Davis e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

        Preparação de proteínas polubiquitinadas purificadas e lisado sem proteínas ubiquinadas

        Células H9c2 cardíacas de rato foram expostas a 10μM MG-132 (um inibidor de proteassoma) por 36 h para aumentar drasticamente os níveis de proteínas ubiquinadas. As amostras foram então sonicadas em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de NP-40, 10% de glicerol e inibidores de protease (P2714, Sigma) a 4 ° C. Após centrifugação (14.000xg) por 10 min a 4 ° C, o sobrenadante foi incubado com Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs) ligadas a agarose (TUBE2-agarose) (UM402, obtido de LifeSensors, PA, EUA). TUBEs exibem um aumento significativamente maior na afinidade para frações de poliubiquitina (até 1000 vezes) sobre o único domínio associado de ligação de ubiquitina (UBA) [21]. Para cada mg de proteína total, 25 μl de resina foram utilizados e incubados por 1 h a 4 ° C com agitação. O TUBE-agarose foi recolhido por centrifugação a baixa velocidade (1000xg, 4 ° C) durante 2 min. As contas foram lavadas com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween-20 (TBST) e coletadas por centrifugação em baixa velocidade. A lavagem foi repetida três vezes e as proteínas poliubiquinadas eluídas com glicina HCl 0,2 M, pH 2,5 (3X o volume total de resina peletizada) durante uma hora a 4 ° C. As esferas foram removidas por centrifugação a 10.000xg durante 5 min. As proteínas poliubiquitinadas eluídas foram quantificadas, misturadas com tampão de amostra Laemmli e aquecidas a 95 ° C por 5 min.

        Preparação de Homogenatos Citosólicos Cardíacos e Hepáticos

        Coração de rato pulverizado ou coração de rato picado ou tecido de fígado de rato foi homogeneizado em tampão de homogeneização frio (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, MgCl 5 mM2, DTT 0,5 mM, pH 7,5) com um homogeneizador dounce de vidro (25 cursos), e os homogenatos foram centrifugados a 12.000 xg e 4 ° C durante 30 min. Os sobrenadantes foram removidos, diluídos em concentrações de proteína iguais, combinados com tampão de amostra 4X SDS (8% SDS, 40% glicerol, 0,4% azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol, 240 mM Tris, pH 6,8) e fervidos 4 min a 95 ° C.

        Determinação da concentração de proteína

        As concentrações de proteína de homogenatos cardíacos citosólicos foram determinadas com um Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). O Nanodrop é o método preferido para determinar as concentrações de frações citosólicas uma vez que a contaminação do ácido nucleico, que afeta os valores de absorbância em um Nanodrop, geralmente está ausente nessas amostras.

        Análise Western Blot

        Amostras de proteína (20 μg / poço) e escadas duplas de peso molecular (# 161–0374, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) foram separadas por SDS-PAGE em gel pré-moldado livre de manchas e convencional com 4–15% gradiente (Bio-Rad) durante aproximadamente 60 min a 150 V em tampão de corrida (base Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS a 1%, pH 8,3). Géis sem manchas foram ativados por exposição a UV por 1 min. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose (# 170–4159, Bio-Rad) usando o Bio-Rad Trans-Blot Turbo Transfer System por 7 min. Proteínas totais nas membranas foram detectadas usando o método Stain-free [22, 23] ou com coloração de ponceau S. Todos os procedimentos de Western blotting foram realizados à temperatura ambiente com agitação, exceto quando indicado de outra forma. As membranas foram bloqueadas com 3% de leite desnatado (# 170-6404 Bio-Rad) em TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, contendo 0,05% Tween-20, pH 7,4) ou PBST (10 mM fosfato, 137 mM NaCl , KCl 2,7 mM, contendo Tween-20 a 0,05%, pH 7,4) durante 60 min. As membranas foram então incubadas com anticorpos primários (ver Tabela 1) em TBST ou PBST com 1% de leite magro em temperatura ambiente por 2 h ou a 4 ° C durante a noite. A remoção do excesso de anticorpo primário foi realizada lavando as membranas em TBST ou PBST três vezes durante 5 min cada. O anticorpo secundário (anti-rato conjugado com peroxidase, anti-cabra ou anticorpo secundário IgG anti-coelho (anti-rato Cat. # A9044, anti-cabra # A5420, anti-coelho Cat. # A0545, Sigma-Aldrich, St . Louis, MO, USA)) diluído 1: 5000 foi incubado com a membrana em TBST ou PBST com 1% de leite em pó desnatado por uma hora em temperatura ambiente. O excesso de anticorpo secundário foi removido lavando as membranas em TBST ou PBST três vezes durante 5 min cada. As membranas foram expostas ao reagente de quimioluminescência aprimorada Clarity (ECL) (Cat. # 170–5061, Bio-Rad) por 2 min em temperatura ambiente e visualizadas usando um ChemiDoc MP (Cat. # 170–8280, Bio-Rad). A detecção e quantificação das intensidades das bandas foi realizada usando o software Image Lab 5.0 (Bio-Rad). As bandas foram normalizadas para proteína total dividindo a intensidade da banda pela intensidade da proteína total da mesma amostra no mesmo blot. A correção de fundo foi realizada conforme descrito por Taylor et al. [24]. Pelo menos três réplicas biológicas foram usadas para estudos em ratos jovens e velhos, enquanto pelo menos três réplicas técnicas foram usadas para as comparações de coração e fígado.

        Estatisticas

        Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DP). A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student ou ANOVA de uma via. As comparações gerando um valor de p & lt 0,05 foram consideradas como estatisticamente significativas.


        Conclusões

        Aqui, pela primeira vez, demonstramos que existe uma ligação direta entre METTL3 e ADAR1. Na verdade, METTL3 aumenta o nível de proteína ADAR1 (independentemente de seu mRNA). O alto nível de proteína ADAR1 se correlaciona com a sobrevida do paciente com glioblastoma e aumenta a proliferação celular. Demonstramos que ADAR1 é um dos principais alvos da N 6 -metiladenosina METTL3 que controla a proliferação de células em glioblastoma e sua redução em um fundo de superexpressão de METLL3 inibe o crescimento de glioblastoma in vivo. É importante ressaltar que demonstramos que ADAR1 atua como uma proteína pró-tumoral independentemente de seu domínio desaminase ativo. Vários estudos mostraram uma importante ligação entre o câncer e a capacidade do ADAR1 de gerar inosina, apontando assim para a identificação de moléculas capazes de inibir a atividade enzimática do ADAR1 como terapias anticâncer. Nosso estudo indica que, para uma terapia anticâncer mediada por ADAR, ela poderia ser mais eficiente para atingir a proteína ADAR1 do que sua atividade desaminase.


        Discussão

        Neste estudo, o peptídeo sinal de secreção previsto de Cry1Ia (Iasp) foi fundido ao terminal N de eGFP e mCherry para produzir novas proteínas fluorescentes, IeGFP e ImCherry. Estas proteínas fluorescentes de fusão não foram construídas para translocação através da membrana após a expressão, mas para identificar o efeito positivo do Iasp na expressão da proteína no citoplasma de células procarióticas.

        Iasp pode melhorar o nível de expressão de eGFP e aumentar sequencialmente o sinal fluorescente das células procarióticas testadas. Sob regulamentação de Pac promotor, a intensidade fluorescente da cepa TAc-IeGFP foi significativamente maior do que a da cepa TAc-eGFP, assim como as cepas Bt correspondentes. No E. coli células testadas, a expressão de proteínas fluorescentes reguladas por Pac não pode ser identificado facilmente pela análise SDS-PAGE que sugeriu uma atividade mais fraca de Pac que o T7 promotor. Mas foi o suficiente para alterar a pigmentação das células hospedeiras. Da mesma forma, Iasp também pode aumentar o nível de expressão de mCherry nas bactérias testadas e a intensidade fluorescente das células hospedeiras. Esses resultados indicaram que o Iasp pode melhorar o nível de expressão de proteínas fluorescentes. As proteínas fluorescentes de fusão, como IeGFP e ImCherry construídas neste estudo, podem se acumular dentro das células hospedeiras e, portanto, ser usadas como novas variantes de proteínas fluorescentes.

        A sequência de codificação Iasp pode afetar a estabilidade do mRNA e / ou melhorar a eficiência da tradução. Os altos níveis observados de transcrições de Iegfp gene foram provavelmente responsáveis ​​pelo aumento do nível de expressão de IeGFP. Além disso, Kudla et al.[27] relataram que a estrutura da sequência líder 5 'do mRNA alvo desempenhou um papel importante em influenciar a eficiência da tradução, especialmente os nucleotídeos próximos ao códon inicial (- 4 a + 37). Os autores fundiram uma sequência líder de 28 códons com estrutura secundária baixa no 5 'de diferentes sequências de codificação de GFP. Esses genes de fusão produziram níveis de expressão uniformemente elevados. A forte correlação entre a energia de dobramento do mRNA e o nível de expressão sugere que as mensagens fortemente dobradas obstruem o início da tradução e, portanto, reduzem a síntese de proteínas [27, 48]. De acordo com os resultados de predição do software RNAstructure [47], a participação da sequência de codificação Iasp diminuiu a estabilidade termodinâmica da estrutura secundária próxima ao códon inicial (- 4 a + 37). Curiosamente, no relatório de Kudla, o gfp variantes de genes resultantes de altas intensidades fluorescentes mostraram o nível de energia de dobramento semelhante com o egfp construção usada neste estudo (cerca de - 5,0 kcal / mol). Isso implicava que a sequência de codificação Iasp poderia otimizar a estrutura secundária desta região ainda mais e melhorar sequencialmente a eficiência de tradução. O resultado também foi consistente com o relatório de Boël G et al. [49]. Por análise de expressão de proteína de alto rendimento, os autores descobriram que vários fatores, incluindo o dobramento da cabeça do mRNA e o uso de códons perto desta região, afetaram a eficiência da tradução em E. coli. O uso do códon da sequência de codificação 5 '(CDS) não apenas regula a estrutura secundária do mRNA, mas também influencia o encaixe eficiente do ribossomo. Portanto, Iasp também pode ser usado como um marcador de fusão para melhorar o nível de expressão de outras proteínas recombinantes, como duas proteínas de difícil expressão MMP13 e GDF8 testadas neste estudo.

        As interações entre o peptídeo nascente e as chaperones aliviariam a tendência de agregação dos peptídeos altamente expressos e forneceria a eles mais oportunidades ou ajudaria diretamente a dobrar na estrutura 3D correta. Por exemplo, a co-expressão de algumas chaperonas e co-chaperonas pode evitar o dobramento incorreto de proteínas eucarióticas no sistema procariótico [50, 51]. Zhang et al. [25] relataram que a combinação de DnaK, DnaJ e GrpE (K / J / E) ajudou a dobrar o peptídeo nascente N-terminal e melhorou a solubilidade do parceiro GFP na proteína de fusão. Consequentemente, a fluorescência da proteína de fusão foi aumentada em E. coli. Outros chaperones, como o novo Spy [26], ou proteínas parceiras com interação de chaperones, como o MBP clássico e NusA [17], podem ser usados ​​nas proteínas de fusão para aumentar sua solubilidade. Para proteínas secretoras, os peptídeos de sinal também interagem com chaperones correspondentes que não apenas transferem os peptídeos nascentes para a máquina de translocação, mas também evitam a agregação. Foi provado que a alternância de peptídeos de sinal ou modificação adequada melhorou a eficiência de expressão-secreção de proteínas recombinantes simultaneamente [52, 53]. No entanto, alguns dos peptídeos de sinal utilizando o translocon SecYEG, que apenas translocam os peptídeos não dobrados, foram relatados como afetando negativamente a estabilidade e o dobramento das proteínas alvo. Por exemplo, o peptídeo sinal de MBP (malE) e pelB levou à desestabilização termodinâmica do MBP maduro C-terminal ou tiorredoxina (Trx) devido às interações hidrofóbicas entre os peptídeos sinal e os peptídeos não dobrados. As interações foram consideradas necessárias para manter o estado desdobrado antes da translocação [54,55,56,57]. Embora a via de secreção relacionada do Cry1Ia não esteja clara e os componentes envolvidos na maquinaria ainda permaneçam descobertos, o Iasp interagiria com o (s) acompanhante (s) correspondente (s) em sua via de secreção. Neste estudo, a expressão solúvel de IeGFP regulada por T7 promotor foi observado e o rendimento de produção da fração solúvel foi superior ao de eGFP. O efeito de aumento da solubilidade do Iasp no eGFP foi semelhante aos conhecidos marcadores de fusão NusA, MBP e Trx. No entanto, tanto Iasp ou Trx fundido MMP13 (I-MMP13 ou T-MMP13) e GDF8 (I-GDF8 ou T-GDF8) foram expressos na forma insolúvel. O resultado da expressão de T-MMP13 e T-GDF8 foi consistente com o relatório anterior [19]. Portanto, a adequação do efeito de aumento da solubilidade de Iasp em diversas proteínas recombinantes precisa ser investigada mais detalhadamente. Várias hipóteses foram sugeridas para explicar os mecanismos de aumento da solubilidade por marcadores de fusão, incluindo a formação de estruturas semelhantes a micelas, atraindo chaperons, exercendo uma atividade semelhante a chaperons intrínseca ou carregada em rede (revisado em [17]). Como um peptídeo sinal, a interação de Iasp com o (s) chaperon (es) correspondente (s) seria suposta e a mutação de deleção em sua proteína original Cry1Ia poderia fornecer uma pista. Após a remoção do Iasp, as proteínas Cry1Ia truncadas (Cry1IaD44) se acumularam dentro das células Bt e apresentaram perfil de degradação diferente em comparação com a Cry1Ia intacta. Curiosamente, em E. coli Cepa BL21-star (DE3), nenhuma diferença visível entre elas foi observada por análise SDS-PAGE além das bandas esperadas de Cry1Ia, Cry1Ia44 e Cry1Ia73. O resultado pode ser atribuído à diferente constituição de protease entre E. coli e células Bt, e o fenômeno implicou no efeito do Iasp na prevenção da proteína Cry1Ia de atacar por algumas proteases direta ou indiretamente.

        Iasp não pode translocar o eGFP de forma eficiente em E. coli. Por microscopia confocal, a maioria das proteínas IeGFP acumuladas no citosol de E. coli células que eram consistentes com a análise de Western blot. De acordo com os relatórios anteriores, a saturação da via secretora correspondente levou ao acúmulo de proteínas recombinantes no citosol [41, 42]. Embora uma fração das moléculas de IeGFP tenha sido detectada como uma banda menor que provavelmente representava as moléculas translocadas para o periplasma, nenhum sinal fluorescente neste local foi capturado por microscopia confocal. Da mesma forma, a expressão de pelB-eGFP foi detectada por análise de western blot, mas nenhum sinal fluorescente foi observado no citoplasma ou no espaço periplasmático. A análise de Western blot mostrou que quase todas as proteínas pelB-eGFP expressas foram digeridas em uma banda de 27 kDa que era igual à eGFP expressa individualmente. Portanto, concluímos a translocação eficiente de eGFP guiada pelo peptídeo sinal pelB regulado por Pac. No entanto, a alta eficiência de translocação de pelB-eGFP sobrecarregaria o SecYEG-translocon e resultaria no retardo de crescimento da cepa TAc-pelBeGFP. Das variantes conhecidas de GFP, o sfGFP é o único que pode se dobrar em sua forma fluorescente após a translocação via SecYEG-translocon [15, 29, 30]. O mecanismo de dobramento pós-translocação foi provavelmente responsável pela observação de E. coli células que expressam pelB-eGFP. O Iasp guiaria algum peptídeo eGFP no periplasma por meio de uma via análoga, além de que a maioria dos peptídeos IeGFP não poderia ser capturada pela (s) chaperona (s) correspondente (s) em sua via secretória por razões desconhecidas e, em seguida, dobrada na forma fluorescente no citoplasma. O sinal fluorescente de torA-eGFP pode ser detectado embora fraco. O peptídeo sinal de torA pode translocar as proteínas alvo para o periplasma pelo sistema Tat. Ao contrário do SecYEG-translocon, o sistema Tat apenas orienta a translocação de proteínas totalmente dobradas e / ou co-fatoriais [31, 32]. Este mecanismo de translocação diferente explicou a capacidade de fluorescência completamente oposta de pelB-eGFP e torA-eGFP in vivo. A polarização da fluorescência de torA-eGFP observada por microscopia confocal indicou a localização do periplasma e o fenômeno resultou da plasmólise de E. coli células em resposta ao choque osmótico quando ressuspensas em tampão PBS [33]. Além disso, quando o Iasp estava localizado no terminal C de eGFP (eGFP-I), sua função de translocação e os efeitos no aumento do sinal fluorescente foram perdidos.

        Em células Bt, o IeGFP não pôde ser translocado para fora das células ou em baixa eficiência porque seu imunoblot ou sinal fluorescente emergiu no mesmo ponto de tempo que o eGFP. O resultado indicou que as proteínas-alvo não seriam apenas liberadas pela via secretora correspondente, mas também pela lise das células-mãe. Kostichka et al. [40] relataram que a proteína Cry1Ia no hospedeiro natural AB88 não foi detectada em amostras de cristal puro isoladas de uma cultura de 52 h, mas foi detectada em peletes de células de 26 h. Portanto, especulamos que algumas proteínas Cry1Ia solúveis que permaneceram nas células-mãe da cepa Bt podem ser liberadas diretamente no sobrenadante durante a maturação dos esporos. A liberação dos componentes solúveis também seria um dos fatores que levariam ao declínio da intensidade fluorescente dos precipitados ressuspensos das culturas de células BAc-eGFP e BAc-IeGFP nas últimas 12 h, principalmente nas 72 h após a inoculação. O aumento dramático da intensidade fluorescente de 72 h sobrenadante de BAc-eGFP e BAc-IeGFP também pode apoiar a especulação. Além disso, durante o período de esporulação, o Pac O promotor pode acelerar a síntese das proteínas recombinantes que estimulariam a formação de corpos de inclusão insolúveis. Neste estudo, os acúmulos rápidos de eGFP e IeGFP após 48 h de incubação foram indicados pela análise de imunoblot. Portanto, a formação de corpos de inclusão seria o segundo fator que levaria à inconsistência entre a diminuição significativa da intensidade fluorescente e o rápido acúmulo dos produtos proteicos. O terceiro fator seria a flutuação do pH nas células Bt no último estágio de esporulação. No Bacillus subtilis, a intensidade fluorescente de uma proteína de fusão β-GFP, incluindo a subunidade β da polimerase de RNA procariótica localizada no terminal N de GFP, foi dramaticamente enfraquecida durante o estágio de esporulação V-VI pela diminuição do pH dentro das células-mãe [58]. O período representou a última vez antes da liberação do esporo maduro. O mCherry é mais tolerante a uma queda no pH [58]. No entanto, a intensidade fluorescente das células BAc-IeGFP ressuspensas manteve 3,5 a 4,1 vezes a de BAc-eGFP durante todo o período de cultura, exceto as primeiras 9 h, que foram maiores do que as diferenças entre TAc-IeGFP e TAc -IeGFP (1,5 a 2,4 vezes).

        Também observamos a degradação das proteínas eGFP e IeGFP nas cepas Bt. Nas células em 9 ou 12 h após a incubação, as proteínas IeGFP ou eGFP intactas foram observadas. Mas durante as 12 a 36 horas após a inoculação, parte deles foi digerida por protease (s) desconhecida (s). Após 48 h, as proteínas recombinantes se acumularam rapidamente e aproximadamente metade delas foram processadas por esta (s) protease (s). O gênero Bacilo pode produzir diversas proteases e o Bt também é uma excelente fonte de proteases [59]. Geralmente, a atividade geral da protease das cepas de Bt segue um aumento lento nas 12 horas iniciais e, em seguida, aumenta gradualmente até o pico por volta das 30 horas após a inoculação [59]. A variação da atividade da protease seria parcialmente responsável pelo processo de degradação do eGFP e IeGFP retido nas células Bt.

        No sobrenadante da cultura de células das cepas Bt correspondentes, o fragmento de 26 kDa, ligeiramente menor que o eGFP intacto (27,9 kDa), foi o produto principal. A análise do terminal N revelou que o fragmento de 26 kDa começou com aminoácidos GKGEELFT e, portanto, outro (s) local (is) de clivagem se localizariam no terminal C da proteína eGFP. A deficiência do terminal C das proteínas eGFP seria parcialmente responsável pela intensidade fluorescente mais fraca de eGFP e IeGFP no sobrenadante em comparação com as células coletadas. Exemplo de Fox, com a perda dos 11 aminoácidos do terminal C, a superfolder expressa GFP 1-10 era insolúvel e não pode apresentar fluorescência [60]. Além disso, os sinais imunológicos da proteína ImCherry no sobrenadante da cultura celular e dentro das células Bt eram diferentes em peso molecular. O resultado provou que havia diferentes proteases respondendo à degradação de ImCherry e IeGFP dentro e fora da célula Bt. As proteínas ImCherry intactas expressas pelas células procarióticas testadas eram ligeiramente maiores do que seu peso molecular calculado (33,0 kDa). Isso pode ser atribuído à (s) modificação (ões) pós-tradução desconhecida (s).

        No momento, pouca atenção tem sido dada ao uso de SPs com baixa eficiência de translocação para a produção de proteína recombinante. Foi comprovado que a sequência de sinal torA dirige a expressão de proteínas recombinantes em corpos de inclusão, mesmo que o alvo seja uma proteína bem solúvel em E. coli [34]. Esta pequena etiqueta de corpo de inclusão pode ajudar a expressar as proteínas recombinantes tóxicas ou instáveis. Mas o peptídeo sinal de torA e Iasp pertenceria a diferentes vias secretoras porque as sequências de sinal do sistema Tat compartilham a sequência conversada clássica (S / T-RRXFLK), especialmente o motivo de arginina dupla, que não existe no Iasp [43, 44,45]. Mais importante ainda, Iasp pode guiar a expressão de eGFP em um nível mais alto do que o peptídeo sinal torA sob controle de Pac promotor neste estudo.

        Em conclusão, identificamos a capacidade do SP da proteína Cry1Ia (Iasp) em melhorar a expressão das proteínas eGFP e mCherry em E. coli e Bt células. A inserção da sequência de codificação do Iasp otimizou a estrutura secundária próxima ao códon inicial e, em seguida, facilitou o docking do ribossomo. O recrutamento mais eficiente do ribossomo seria responsável pela estabilidade do mRNA e pela síntese rápida das proteínas fluorescentes de fusão. Enquanto isso, o Iasp consegue manter uma fração considerável das proteínas fluorescentes de fusão solúveis dentro das células que garantem o correto dobramento das proteínas fluorescentes. Portanto, a maior produção de IeGFP e ImCherry solúvel gerou o sinal fluorescente mais intenso dentro das células bacterianas e essas proteínas de fusão poderiam ser usadas como candidatos ideais de variantes de proteínas fluorescentes. Além disso, a função do Iasp em melhorar a expressão das proteínas recombinantes também deve ser destacada e digna de maiores investigações. Este estudo também sugeriu a versatilidade de alguns peptídeos de sinal.


        Opções de imagem para detecção de Western Blot por quimioluminescência

        A exposição à luz imprime uma imagem no filme de raios-X. A quantidade de luz que atinge o filme determina a imagem, com uma luz mais brilhante e intensa produzindo uma imagem mais forte. No Western blotting, essa luz vem da marcação de proteínas com sinais quimioluminescentes ou radioativos. Na marcação quimioluminescente, os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) reagem com reagentes de quimioluminescência intensificada (ECL) para emitir luz. A intensidade da impressão em um filme de raios X é proporcional ao sinal. Por sua vez, esse sinal está relacionado à quantidade de proteína presente na membrana do Western blot, o que permite a quantificação.

        A imagem da câmera CCD é adequada para quimiluminescência e detecção de fluorescência. Essa técnica usa uma fonte de luz para iluminar a membrana, quando necessário, ou excitar os fluoróforos em comprimentos de onda específicos. As lentes coletam a luz resultante do campo de imagem, focalizando-a em uma matriz CCD bidimensional. A imagem digital resultante é essencialmente um padrão de carga proporcional à luz da reação de quimioluminescência ou corantes fluorescentes. A intensidade da imagem é proporcional à quantidade de luz produzida, indicando a quantidade de proteína.

        Além disso, a Sino Biological oferece uma gama de anticorpos secundários conjugados com enzimas HRP. Esses anticorpos secundários podem ser usados ​​na detecção de Western Blot por quimioluminescência.


        Assista o vídeo: Western Blotting-Immuno Blotting Techniques-Pceutical Biotechnology-Unit 4- B. Pharmacy 6 (Dezembro 2021).