Em formação

5.2: Liverworts - Biologia


Liverworts, Phylum Marchantiophyta

Morfologia Gametófita

Existem dois tipos distintos de hepáticas: hepáticas folhosas e talóides. Hepáticas folhosas têm folhas dispostas em um plano plano com um conjunto de folhas menores.

Figura ( PageIndex {1} ): a frondosa hepática Porella tem folhas maiores que se estendem uma oposta em cada lado do caule, fazendo com que a hepática pareça achatada. A foto à direita mostra uma visão microscópica das folhas. Observe que não há nenhuma nervura central nessas folhas, o que ajuda a distinguir hepáticas folhosas de musgos. Foto à esquerda de Maria Morrow CC-BY-NC. Foto à direita de Rafael Medina, CC-BY-NC.

Figura ( PageIndex {2} ): Outra característica distintiva das hepáticas folhosas são suas folhas subjacentes. Estas são folhas menores, semelhantes a escamas, que correm ao longo do centro do talo na parte inferior. Esta imagem mostra a parte inferior de um Porella navicularis talo coberto com folhas menores. Foto de Howard Bruner, CC-BY-NC.

Thalloid liverworts não têm folhas e seus gametófitos parecem mais semelhantes aos gametófitos de hornwort. Outra semelhança com as hornworts é a presença de poros simples para a troca gasosa (sem células de guarda, o que significa que os poros estão permanentemente abertos). Ao contrário das hornworts, as células do liverwort têm vários cloroplastos. Muitos gametófitos hepáticos produzem clones assexuados chamados gemas.

Figura ( PageIndex {3} ): O talóide hepático Lunularia tem taças de gemas em forma de crescente. Vários deles estão presentes na imagem acima. As pequenas estruturas verdes que parecem seixos dentro deles são clones assexuados do talo, chamados de gemas. Os gametófitos hepáticos não têm estômatos. Em vez disso, o talo é coberto por saliências onde poros simples estão localizados. Foto de Maria Morrow CC-BY-NC.

Figura ( PageIndex {4} ): O talóide hepático Marchantia tem muitas estruturas complexas. Um grupo de xícaras de gemas está circulado no canto esquerdo inferior. Existem várias estruturas parecidas com palmeiras marrons circuladas e marcadas como arquegonióforos. Essa é a parte do gametófito onde os arquegônios são produzidos. Quando fertilizado, o esporófito crescerá dentro do arquegônio e emergirá na parte inferior do arquegonióforo. Foto de Maria Morrow CC-BY-NC.

Figura ( PageIndex {5} ): esta imagem mostra estruturas de ambos os gametófitos. O anteridióforo está à esquerda, com uma superfície plana na qual a água pode espirrar. Isso carrega os espermatozoides das anterídios incorporados a outras superfícies (esperançosamente, a um óvulo à espera). À direita, há um arquegonióforo fertilizado. Os ramos semelhantes a palmeiras se ergueram. Abaixo deles, esporângios amarelos emergem nas pontas das cerdas transparentes. Foto de Felix Riegel, CC-BY-NC.

Figura ( PageIndex {6} ): Uma micrografia mostrando uma seção transversal através do topo de um anteridióforo. Um antheridium foi indicado com uma caixa preta. Dentro do anterídio, os espermatozoides serão produzidos (na área escurecida), embora nenhum seja visível aqui. Foto de Maria Morrow CC-BY-NC.

Figura ( PageIndex {7} ): Um close up de um arquegônio (delineado em laranja) na parte inferior de um arquegonióforo. O ovo dentro do archegonium foi indicado por uma seta. Foto de Maria Morrow CC-BY-NC.

Morfologia Esporófita

As hepáticas produzem um único esporângio (cápsula) no final de uma cerda, que geralmente é frágil e transparente. O esporângio dehisces, dividindo-se em quatro pedaços. Nas hepáticas talóides, o esporófito pode emergir diretamente do talo ou, como é o caso do gênero Marchantia, de estruturas complexas chamadas anteridióforos e arquegonióforos. Nesse caso, os esporófitos emergem da parte inferior do arquegonióforo.

Figura ( PageIndex {8} ): Os esporófitos de Liverwort são compostos de um pedúnculo chamado cerda e, no topo da cerda, uma única cápsula onde os esporos são produzidos. Nesta hepática (talvez uma Fossombronia), os esporófitos são curtos e robustos com cápsulas globosas. Foto de Maria Morrow CC-BY-NC.

Figura ( PageIndex {9} ): Alguns esporófitos de hepática possuem cerdas longas e transparentes, tornando-as quase semelhantes a fungos. As cápsulas dos esporófitos na imagem também são alongadas. Eles vão secar e descascar, se desfazendo em quatro pedaços triangulares e liberando os esporos. Foto de Maria Morrow CC-BY-NC.

Figura ( PageIndex {10} ): um esporófito produzido na parte inferior de um arquegonióforo. Ele surge de cabeça para baixo e eventualmente se tornará mais horizontal à medida que os ramos do arquegonióforo se elevam. O esporófito se liga ao gametófito em uma região chamada pé. Ele cresce dentro do archegonium, agora rotulado como calyptra. Do pé emerge uma cerda curta, encimada por um grande esporângio. O esporângio é preenchido com fileiras de esporos haplóides produzidos por meiose. Entre essas fileiras de esporos, elaters longos aguardam a deiscência do esporângio para ajudar na dispersão dos esporos. Foto de Maria Morrow CC-BY-NC.

Marchantia Vida útil

Figura ( PageIndex {11} ): O Marchantia polymorpha vida útil. Começando com a meiose (esquerda, centro): A meiose produz esporos haplóides que crescerão por mitose em gametófitos masculinos ou femininos. Qualquer um desses gametófitos pode produzir copos de gemas--estruturas que contêm clones produzidos assexuadamente do gametófito (gemas) Os gametófitos masculinos produzem estruturas altas com topos achatados chamados anteriodióforos. Muitos anteridia estão embutidos na parte superior plana do anteridióforo. Antheridia produz biflagelados esperma por mitose. Os gametófitos femininos produzem estruturas semelhantes a palmeiras chamadas arquegonóforos. Esses arquegonóforos produzem Arquegônia na parte inferior dos 'ramos', cada um com um único ovo que foi produzido pela mitose. Quando a água atinge o topo plano do anteridióforo, ela pode espirrar esperma em um gametófito feminino. Se o espermatozóide é capaz de nadar através da água até o óvulo, a fertilização ocorre produzindo um diplóide zigoto. O zigoto se transforma em um esporófito de dentro do archegonium. O tecido arquegonial remanescente é chamado de caliptra. Um esporófito maduro terá uma haste estéril chamada de seta e um esporângio contendo células que passarão por meiose para produzir esporos haplóides. Dentro do esporângio (não ilustrado), longas estruturas retorcidas chamadas elaters ajuda a dispersar os esporos por via aérea. Desenho de Nikki Harris CC-BY-NC com cores e rótulos adicionados por Maria Morrow.

Atribuições

Conteúdo de Maria Morrow, CC-BY-NC


A biologia e ecologia da hepática Cephaloziella varians na Antártica

A biologia e a ecologia de Cephaloziella varians, a hepática mais difundida e abundante na Antártica, são revisadas. É fornecida uma descrição da espécie, juntamente com informações sobre sua distribuição geográfica, reprodução, habitats, organismos associados e respostas aos estresses ambientais. Características de sua fisiologia fotossintética também são apresentadas, incluindo dados sobre as taxas de evolução de oxigênio e parâmetros de fluorescência da clorofila a. Substrato e química do tecido, relações hídricas e pigmentos são discutidos, juntamente com dados recentes demonstrando que o pigmento escuro nas folhas apicais de C. varians é a antocianidina riccionidina A. Estudos recentes mostram que o simbionte micorrízico ericoide Rhizoscyphus ericae está presente nos tecidos da planta em uma ampla variedade de locais no mar e subantártico também são descritos. Fica evidente, a partir da literatura revisada, que C. varians possui diversas adaptações que o permitem sobreviver no bioma Antártico, explicando sua sobrevivência em latitudes mais elevadas do que qualquer outro fígado. As principais adaptações da espécie incluem a síntese de riccionidina A nas folhas apicais, permitindo absorção de calor eficiente e proteção contra fotoinibição, e a presença em caules e rizóides de hifas fúngicas, que são potencialmente benéficas para a nutrição hepática e possivelmente também sintetizam crioprotetores.


I. Introdução

Plantas terrestres (embriófitas) evoluíram de algas estreptófitas (carófitas) há cerca de 500 milhões de anos (Delwiche & Cooper, 2015 Harholt et al., 2016). A colonização da terra por plantas levou à sua diversificação no grupo monofilético das briófitas e dos traqueófitos (plantas vasculares) (Renzaglia et al., 2000 Nishiyama et al., 2004 Leebens-Mack et al., 2019). Briófitas incluem hepáticas, musgos e hornworts, enquanto os traqueófitos consistem em licófitas, samambaias, gimnospermas e angiospermas. As hornworts são o clado menor e menos diverso dentro das briófitas, consistindo em c. 220 espécies (Söderström et al., 2016) que estão geograficamente espalhados principalmente em áreas tropicais (Villarreal et al., 2014). Hornworts compreendem a divisão Anthocerotophyta, cujo nome é derivado de três palavras gregas: άνθος / anthos (que significa flor), κenchaς / ceras (que significa chifre) e φυτό / phyto (que significa planta) e se refere à forma semelhante a um chifre do esporófito de hornwort (a fase diplóide multicelular do ciclo de vida).

A inferência sobre o ancestral comum das plantas terrestres é ambígua. Isso se deve, em parte, à profunda divergência dos três grupos de briófitas, bem como briófitas e traqueófitas, que proporcionaram tempo suficiente para que ocorressem ganhos / perdas independentes de genes. A comparação das características de desenvolvimento, fisiológicas e moleculares de hornworts com aqueles de musgos e liverworts fornecerá uma imagem mais precisa da natureza do ancestral comum de briófitas e de todas as plantas terrestres. Também ajudará a compreender a diversidade e a base molecular da evolução e do desenvolvimento entre briófitas e traqueófitas.

Hornworts também possuem um grande número de características únicas que não são encontradas em nenhuma outra planta terrestre. Isso inclui o seguinte. (1) Desenvolvimento do zigoto e esporófito: a orientação da primeira divisão do zigoto é longitudinal, ao contrário de outras plantas terrestres, exceto samambaias leptosporangiadas (Johnson & Renzaglia, 2009). O esporófito difere dos musgos e hepáticas por não possuir uma seta e produzir esporos contínua e progressivamente para cima a partir de um meristema basal, sendo essencialmente um esporângio em crescimento. Os esporófitos apresentam estômatos, que podem ser homólogos aos dos traqueófitos (Renzaglia et al., 2017 Harris et al., 2020). (2) Cloroplasto: é a única linhagem de planta terrestre existente, junto com algumas licófitas (Liu et al., 2020), que tem um único cloroplasto (ou apenas alguns) por célula. O cloroplasto de várias espécies de hornwort pode conter um pirenóide, uma estrutura também encontrada em muitas algas estreptófitas e outras linhagens de algas, mas não em outras plantas terrestres (Li et al., 2017 Meyer et al., 2017). Os genomas de plastídios de Hornwort também têm uma das maiores taxas de edição de RNA entre as plantas terrestres (Pequenas et al., 2019) (3) Simbiose: os hornworts estabelecem relações simbióticas com cianobactérias endofíticas (Renzaglia et al., 2009) e vários parceiros fúngicos (micorriza) (Desirò et al., 2013). Um pequeno número de estudos forneceu insights sobre a morfologia e o crescimento da erva-chifre (Proskauer, 1948a, b Renzaglia, 1978), mas faltam estudos moleculares e genéticos detalhados que examinam o desenvolvimento da erva-chifre.

Aqui, revisamos nossa compreensão atual da biologia e do desenvolvimento da erva-chifre, destacando o papel que Anthoceros agrestis poderia ajudar a lançar luz sobre as principais inovações durante a evolução das plantas terrestres.


A biologia e ecologia da hepática Cephaloziella varians na Antártica

A biologia e a ecologia de Cephaloziella varians, a hepática mais difundida e abundante na Antártica, são revisadas. É fornecida uma descrição da espécie, juntamente com informações sobre sua distribuição geográfica, reprodução, habitats, organismos associados e respostas aos estresses ambientais. Características de sua fisiologia fotossintética também são apresentadas, incluindo dados sobre as taxas de evolução de oxigênio e parâmetros de fluorescência da clorofila a. Química do substrato e do tecido, relações hídricas e pigmentos são discutidos, juntamente com dados recentes demonstrando que o pigmento escuro nas folhas apicais de C. varians é a antocianidina riccionidina A. Estudos recentes mostram que o simbionte micorrízico ericoide Rhizoscyphus ericae está presente nos tecidos da planta em uma ampla variedade de locais no mar e subantártico também são descritos. Fica evidente, a partir da literatura revisada, que C. varians possui diversas adaptações que o permitem sobreviver no bioma Antártico, explicando sua sobrevivência em latitudes mais elevadas do que qualquer outro fígado. As principais adaptações da espécie incluem a síntese de riccionidina A nas folhas apicais, permitindo absorção de calor eficiente e proteção contra fotoinibição, e a presença em caules e rizóides de hifas fúngicas, que são potencialmente benéficas para a nutrição hepática e possivelmente também sintetizam crioprotetores.


5,3 Briófitas

Briófitas são um grupo informal que consiste em três divisões de plantas terrestres não vasculares (embriófitas), as hepáticas, as hornworts e os musgos. Eles são caracteristicamente limitados em tamanho e preferem habitats úmidos, embora possam sobreviver em ambientes mais secos. As briófitas consistem em cerca de 20.000 espécies de plantas. As briófitas produzem estruturas reprodutivas fechadas (gametângios e esporângios), mas não produzem flores ou sementes. Eles se reproduzem por meio de esporos. O termo “briófita” vem de bryon “musgo de árvore, verde-ostra” e phyton “planta”.

As características definidoras de briófitas são:

  • Seus ciclos de vida são dominados pelo estágio de gametófito.
  • Seus esporófitos não são ramificados.
  • Eles não têm um tecido vascular verdadeiro contendo lignina (embora alguns tenham tecidos especializados para o transporte de água).

As briófitas apareceram pela primeira vez no início do Paleozóico. Eles só podem sobreviver onde a umidade está disponível por períodos significativos, embora algumas espécies sejam tolerantes à dessecação. A maioria das espécies de briófitas permanece pequena ao longo de seu ciclo de vida. Isso envolve uma alternância entre duas gerações: um estágio haplóide, denominado gametófito, e um estágio diplóide, denominado esporófito. Em briófitas, o esporófito é sempre não ramificado e permanece nutricionalmente dependente de seu gametófito pai. As briófitas têm a capacidade de secretar uma cutícula em sua superfície externa, uma camada cerosa que confere resistência à dessecação. Nos musgos e hornworts, uma cutícula geralmente é produzida apenas no esporófito. Os estômatos não são encontrados em hepáticas, mas ocorrem nos esporângios de musgos e hornworts, permitindo a troca gasosa enquanto controla a perda de água.


5.2: Liverworts - Biologia

São corpos esféricos muito pequenos com uma única membrana unitária. Estes são encontrados em todas as células vegetais, especialmente nas células do endosperma com formato e tamanho de sementes oleaginosas. Eles são esféricos em forma e cerca de 0,5-2,5 & microm em tamanho.

Os esferossomos são organelas esféricas ligadas à membrana que ocorrem na maioria das células vegetais. Eles contêm enzimas hidrolíticas, como a hidrolase, protease, ribonuclease, fosfatase e esterase, etc., os chamados lisossomas vegetais. Possuem estrutura granular fina, rica internamente em lipídios e proteínas. Eles se originam do retículo endoplasmático.

  • Os esferossomos estão envolvidos no metabolismo de lipídios (isto é, síntese e armazenamento de lipídios).
  • Eles também podem atuar como um lisossoma.

Peroxissomos

Os peroxissomos são os microrganismos encontrados em muitas células animais e em uma ampla variedade de plantas. Eles estão presentes em todas as células fotossintéticas de plantas superiores, células hepáticas e renais de vertebrados. Também foram relatados nas células do cérebro, intestino delgado, testículos, córtex adrenal, protozoários, algas marrons, fungos, hepáticas, musgos e samambaias. Estes são variáveis ​​em forma e tamanho, mas geralmente aparecem circulares na seção transversal, tendo o diâmetro entre 0,2 m e micro e 1,5 m e micro.

Estes são pequenos corpos esféricos com membranas unitárias constituídas por moléculas de lipídios e proteínas. Eles contêm catalises e oxidases de proteínas finamente granulares ou cristalizadas. A enzima catalisa, catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2) para a água (H2O) e oxigênio (O2), enquanto as enzimas oxidases oxidam compostos orgânicos.

  • Eles protegem as organelas celulares do efeito tóxico do peróxido de hidrogênio (H2O2).
  • Os peroxissomos das plantas também estão envolvidos na fotorrespiração (na síntese de glicina e serina).
  • Em células animais, eles estão envolvidos na oxidação severa de ácidos graxos.

Microtúbulos

Os microtúbulos são os fios finos e proteicos descobertos por Robert e Franchi. Eles são chamados de microtúbulos.

Os microtúbulos são estruturas microscópicas eletrônicas encontradas no citoplasma de células eucarióticas nos seguintes sete locais

  • Cilia e flagelos
  • Centríolos e corpos basais
  • Processos nervosos
  • O aparelho mitótico
  • O córtex das células vegetais meristemáticas
  • Células em alongamento, como durante a formação do cristalino ou durante a espermatogênese de certos insetos.
  • Axostilo de flagelados parasitas, o axonema de Echinosphaerium etc.

Um microtúbulo é uma estrutura cilíndrica oca de cerca de 250 & Aring de diâmetro e cerca do lúmen 150 & Aring. Sua parede tem cerca de 50 graus de espessura. Sua parede é formada por 13 prototúbulos paralelos, cada um sendo formado por uma série linear de moléculas de proteína globular. Quimicamente, um microtúbulo é formado pela proteína tubulina. Uma proteína tubulina é formada por alfa-tubulina e beta-tubulina.

  • Os microtúbulos fazem parte do citoesqueleto e ajudam na forma celular e no suporte mecânico.
  • Eles formam o aparato mitótico e durante a divisão celular e se fixam no cinetocoro dos cromossomos. Sua contração causa o movimento dos cromossomos em direção aos pólos opostos das células.
  • Os microtúbulos dos cílios e flagelos auxiliam na locomoção e alimentação.
  • Eles ajudam na distribuição do pigmento nos cromatóforos, portanto, ajudam na coloração da pele.
  • Os microtúbulos do neuroeixo auxiliam na condução dos impulsos nervosos.
  • Estes controlam a orientação das microfibrilas de celulose da parede celular das plantas.

Microfilamento

Os microfilamentos são estruturas microscópicas eletrônicas, longas, estreitas, cilíndricas, contráteis e protéicas encontradas apenas no citoplasma eucariótico. Estes estão presentes nas microvilosidades, fibras musculares, etc. Também estão associados aos pseudópodes, à membrana plasmática dos fibroblastos, etc. São longos, finos, cilíndricos e filamentos de proteína muito finos, com cerca de 5-6 nm de diâmetro.

Cada microfilamento é um filamento sólido e é formado por uma série helicoidal de moléculas de proteína globular. Geralmente ocorrem em feixes e foram observados no trajeto do citoplasma de fluxo nas células da planta ou abaixo da membrana plasmática. Eles formam uma rede no citoplasma e se estendem até o centro das microvilosidades. Quimicamente, são formados principalmente por proteína actina e uma pequena quantidade de proteína miosina.

  • Estes formam uma parte do citoesqueleto, por isso ajudam na forma celular e no suporte mecânico.
  • Isso ajuda na ciclosis do citoplasma.
  • Microfilamentos de fibras musculares auxiliam nos movimentos e na locomoção.
  • Microfilamentos de microvilosidades auxiliam na movimentação e absorção dos alimentos.
  • Eles ajudam na endocitose através da membrana celular.
  • Eles ajudam na clivagem durante a divisão celular.

Cilia e Flagella

Os cílios e flagelos são microscópicos, estruturas móveis semelhantes a fios de cabelo ou fios apresentam-se extracelularmente, mas se originam intracelularmente dos corpos basais e auxiliam no movimento, locomoção, alimentação, circulação, etc. A presença do flagelo foi o primeiro a relatar a estrutura do flagelo espermático.

Os cílios são encontrados em todos os protozoários ciliados, células da chama de vermes achatados, em algumas formas larvais, e. Larva bipinnaria de estrela do mar, em algumas estruturas do corpo, por exemplo, traqueia, trompas de falópio, etc, epitélio ciliado da metazoa, etc.

Os flagelos são encontrados em todos os protozoários flagelados, células colares de esponjas, células gastrodérmicas de celenterados, espermatozóides de animais e plantas inferiores, zoósporos de algas, etc.

Vacúolos

Os vacúolos verdadeiros ou de seiva são uma estrutura semelhante a um saco cheio de fluido, delimitado por uma membrana chamada tonoplasto. Os vacúolos contêm água, minerais, açúcar, sais, aminoácidos, pigmentos, resíduos, etc. Esses vacúolos ocorrem tanto nas células vegetais quanto animais.

  • Ajuda no armazenamento.
  • Ajuda no alongamento e crescimento celular.
  • Dê turgescência e suporte mecânico.
  • Vacúolos modificados como vacúolos contráteis ajudam na osmorregulação.
  • Os vacúolos alimentares ajudam na ingestão e digestão dos alimentos.
  • Vacúolos gasosos ou pseudo vacúolos ajudam na troca de gases e proporcionam flutuabilidade.

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Coisas para lembrar
  • Os microfilamentos são estruturas microscópicas eletrônicas, longas, estreitas, cilíndricas, contráteis e protéicas, encontradas apenas no citoplasma eucariótico.
  • Os vacúolos verdadeiros ou de seiva são uma estrutura semelhante a um saco cheio de fluido, delimitado por uma membrana chamada tonoplasto.
  • Os flagelos são encontrados em todos os protozoários flagelados, células colares de esponjas, células gastrodérmicas de celenterados, espermatozóides de animais e plantas inferiores, zoósporos de algas, etc.
  • Uma proteína tubulina é formada por alfa-tubulina e beta-tubulina.
  • Os peroxissomos são os microrganismos encontrados em muitas células animais e em uma ampla variedade de plantas. Eles estão presentes em todas as células fotossintéticas de plantas superiores, células hepáticas e renais de vertebrados.
  • Os esfero-somes são organelas esféricas delimitadas por membrana que ocorrem na maioria das células vegetais. Eles contêm enzimas hidrolíticas, como a hidrolase, protease, ribonuclease, fosfatase e esterase, etc., os chamados lisossomas vegetais.
  • Inclui todas as relações que se estabelecem entre as pessoas.
  • Pode haver mais de uma comunidade em uma sociedade. Comunidade menor que a sociedade.
  • É uma rede de relações sociais que não pode ser vista ou tocada.
  • interesses comuns e objetivos comuns não são necessários para a sociedade.

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Métodos

Materiais vegetais

P. appendiculatum thallus (algumas pequenas amostras foram coletadas originalmente da província de Sichuan, China e depois cultivadas e propagadas em nossa casa de vegetação, e autenticadas pelo Professor Xuesen Wen. Uma amostra de voucher com o nº 20091010–01 foi depositada na Escola de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Shandong. Nenhuma licença específica foi necessária para coletar esta amostra para fins de pesquisa.) Foi criada em casa de vegetação com temperatura constante de 25 ° C e fotoperíodo de 12 horas na Universidade de Shandong. Talos de dois meses de idade foram colhidos e congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 ° C. Talos e calos axênicos foram elevados, respectivamente, em meio Murashige e Skoog (1962) (MS) [27] suplementado com 0,5 mg L - 1 6-benziladenina. As culturas foram expostas a fotoperíodo de 12 horas e regime de temperatura dia / noite de 22 ° C / 20 ° C. A. thaliana As plantas do ecótipo Col-0 (adquiridas no Arabidopsis Biological Resource Center) foram criadas em uma câmara de crescimento sob fotoperíodo de 16 h a uma temperatura constante de 22 ° C. o Nicotiana benthamiana (Doado pelo Professor Fengning Xiang da Escola de Ciências da Vida, Universidade de Shandong) as plantas necessárias para experimentos de expressão transiente foram cultivadas no solo por 5-6 semanas sob fotoperíodo de 12 horas e regime de temperatura dia / noite de 24 ° C / 22 ° C .

Extração de ácido nucléico e isolamento de gene

O RNA total foi extraído de P. appendiculatum talo ou A. thaliana mudas usando, respectivamente, um método baseado em CTAB [28] e o reagente RNAiso Plus (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japão). O cDNA foi sintetizado a partir de preparações de RNA total usando PrimeScript ™ RT Master Mix (Takara, Otsu, Japão), de acordo com o protocolo do fabricante. UMA PabHLH1 fragmento sem a região de codificação completa foi identificado a partir de P. appendiculatum banco de dados de sequenciamento de transcriptoma (SRP073827). O método 3'-RACE foi então aplicado para recuperar a sequência 3 'ausente: o modelo para esta reação foi o cDNA 3'-Ready e o par de iniciadores era PabHLH1-NGP (sequências fornecidas no arquivo adicional 1: Tabela S1), junto com o primer UPM fornecido no kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech, EUA). Uma vez que a sequência completa do quadro de leitura aberta (ORF) de PabHLH1 tinha sido adquirido, foi amplificado de P. appendiculatum tal cDNA usando o par de iniciadores PabHLH1-F / R (sequências fornecidas no arquivo adicional 1: Tabela S1) o amplicon foi então inserido em pMD19-T e sequenciado para fins de validação.

Análise de sequência

A sequência de polipeptídeo PabHLH1 prevista foi alinhada com aquelas de seus homólogos de plantas A. thaliana TT8 (CAC14865), Ipomoea purpurea IpIVS (BAD18982) e Vitis vinifera MYC1 (EU447172) usando o software DNAMAN v5.2.2 (Lynnon Biosoft, Quebec, Canadá). Uma análise filogenética foi conduzida com base no método de máxima verossimilhança implementado no software MEGA v4.0 [29], com base em 1000 réplicas de bootstrap.

Tratamento de estresse de P. appendiculatum talo

Cento e dois meses de idade P. appendiculatum talos foram irradiados com uma lâmpada de banda estreita UV-B 311 nm (Philips, PL-S 9 W / 01 / 2P, Polônia) (60 mJ / cm 2) ou ácido salicílico 1 mM (SA) por 10 min, e então colhidos após 0, 6, 12, 24, 36, 48 e 60 h. O material foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C até ser processado para os ensaios de qRT-PCR, conforme descrito acima.

Análise quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR)

A abordagem qRT-PCR foi usada para caracterizar o comportamento transcricional de PabHLH1 em três tecidos diferentes. A expressão de PabHLH1 juntamente com o de uma série de genes da via fenilpropanóide, genes estruturais de flavonóides e os genes de síntese de bibenzil foram analisados ​​usando qRT-PCR tanto em tipo selvagem quanto em transgênicos P. appendiculatum e A. thaliana. O modelo de cDNA necessário foi derivado de extratos de RNA, conforme descrito acima, e os qRT-PCRs foram realizados usando um Eppendorf Mastercycler ep realplex RealTime PCR System (Eppendorf, Alemanha). Os primers relevantes estão listados no arquivo adicional 2: Tabela S2. Cada reação de 10 μL compreendeu 2 μL de SYBR, 1 μL do cDNA modelo, 0,5 μL de cada par de primer (10 μM) e 6,5 μL de dH livre de RNase2O. O gene de referência para o P. appendiculatum amostras codificam um fator de alongamento, conforme amplificado pelo par de primer P. appendiculatum alongamento F / R [30]. Todas as amostras foram avaliadas em três experimentos independentes.

Localização subcelular e ensaio de atividade transcricional

O ORF de comprimento total (sem o códon de parada) foi amplificado por PCR usando primers incluindo um local de recombinação attB (sequências fornecidas no arquivo adicional 1: Tabela S1), e o amplicon foi submetido a uma reação de clonase BP a fim de inseri-lo no vetor pDONR207 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Os plasmídeos recombinados foram processados ​​em uma reação de clonase Gateway LR (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) com o vetor pGWB5 para criar uma fusão PabHLH1-GFP conduzida pelo promotor CaMV 35S [31]. A construção foi transferida para Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 usando o método de congelamento / descongelamento e daí em N. benthamiana células epidérmicas da folha ou células epidérmicas da cebola [26] para sua expressão transitória. As células epidérmicas da cebola foram incubadas com 0,1 mg ml - 1 DAPI durante 10 min para a coloração do núcleo. A fluorescência GFP e DAPI foi monitorada por meio de microscopia confocal de varredura a laser (LSM 700, Carl Zeiss, Inc., Nova York, EUA) ou microscópio de fluorescência (Olympus IX71 Olympus Co., Tóquio, Japão). Quatro segmentos diferentes de PabHLH1 foram gerados por Nde EU-BamH eu ou Nco EU-BamRestrição H I para produzir fragmentos de genes correspondentes aos resíduos 1–261, 262–460, 461–702 e 1–460 da sequência polipeptídica completa, estes foram ligados separadamente ao plasmídeo pGBKT7 (Clontech, EUA). A sequência de comprimento total de PabHLH1 não possui os locais de endonuclease de restrição disponíveis, então uma única substituição de nucleotídeo (a957c) foi criada usando o método de mutagênese direcionada ao local Stratagene QuickChange. Os iniciadores mutantes necessários projetados pelo software do iniciador X (www.bioinformatics.org/primerx) (Tabela S1). O produto de PCR resultante foi purificado em gel e digerido com Dpn I (Thermo Scientific, EUA) a 37 ° C por 4 h, e uma alíquota foi transformada em E.coli DH5α. Depois de sequenciado, o gene mutado (PabHLH1-a957c) foi inserido no vetor pGBKT7 (Clontech, EUA) após digerido com Nde I e Nco I (os primers usados ​​neste estudo estão listados na Tabela S1). Cada construção foi então transformada na cepa de levedura AH109 usando o método PEG / LiAC [32]. Os transformantes de levedura foram cultivados em um meio drop-out sintético sem triptofano (SD-Trp). Após sua validação baseada em PCR, as colônias transformadas foram testadas quanto à capacidade de crescimento em meio SD de seleção tripla sem triptofano, histidina e adenina (SD-Trp-His-Ade).

Transformação de plantas

o PabHLH1 sequência de codificação abrigada dentro de pDONR207 foi colocada no vetor pGWB5 sob o controle do promotor CaMV 35S pela técnica de clonagem Gateway [32], então introduzida em A. tumefaciens EHA105. Uma alíquota de 1 mL de um pernoite A. tumefaciens a cultura foi inoculada em 100 mL de meio de peptona de extrato de levedura contendo 50 mg / L de canamicina e mantida a 30 ° C com agitação até a DO600 atingiu 1,5–2,0. As células foram colhidas por centrifugação (4000 g, 5 min) e, em seguida, ressuspenso em 50 mL de meio MS líquido com meia força (pH 5,2) contendo 100 μM de acetosiringona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Cerca de cinquenta P. appendiculatum talos foram cortados em pequenos pedaços e incorporados ao A. tumefaciens suspensão. A mistura foi mantida por 1 h com agitação, em seguida, cultivada por 72 h no escuro a 22 ° C em meio MS sólido com meia força (pH 5,6-5,8) contendo 100 μM de acetosiringona. Os pedaços de talo foram enxaguados três vezes em água desionizada estéril, depois transferidos para um meio MS de meia força contendo 25 mg / L de higromicina e 200 mg / L de cefotaxima. Após 2-3 semanas, os talos sobreviventes foram subcultivados em meio MS de meia dosagem contendo 50 mg / L de higromicina e 50 mg / L de cefotaxima, com o meio sendo atualizado em dois intervalos semanais. A. thaliana ecótipo Col-0 foi transformado com A. tumefaciens GV3101 abrigando o transgene usando o método de mergulho em flores [33]. As plantas regeneradas foram criadas a 22 ° C sob um fotoperíodo de 16 h, e T1 os transformantes foram validados por PCR usando o par de primer PabHLH1-vetor-F / −R (sequências fornecidas no arquivo adicional 1: Tabela S1).

Análise de composição de P. appendiculatum talo

Transgênicos e não transgênicos P. appendiculatum talo, cultivado em meio MS de meia força por cerca de 20 dias, foi liofilizado. Uma alíquota de 25 mg foi suspensa em 500 μL de metanol e ultra-sônica por 1 h para extrair a fração de bibenzilas (baicaleína foi adicionada como padrão interno). Após a centrifugação, um volume de 20 μL de sobrenadante foi separado por meio de uma coluna de fase reversa Luna 5u C18 (2) 100A (4,6 × 250 mm, Phenomenex, CA, EUA) usando o sistema Agilent 1260 series (Agilent, CA, EUA). Os parâmetros de HPLC foram: solvente A: ácido fórmico aquoso a 0,1% (v / v), solvente B: acetonitrila, os solventes foram fornecidos a uma taxa de fluxo de 0,8 mL / min. A mistura de solvente inicial foi 60% A / 40% B, seguido por 45 min de 33% A / 67% B, em seguida 5 min de 10% A / 90% B e, finalmente, 5 min de 100% B. O comprimento de onda de detecção foi de 280 nm. Os principais bibenzilos, ácido lunular, riccardina C e riccardina D, foram identificados com base nas amostras padrão correspondentes e quantificados de acordo com a curva padrão do composto correspondente. Para análise de flavonóides, 10 mg de talo liofilizado foi suspenso em 800 μl de metanol a 80% e ultrassom por 1 h (miricetina foi adicionada como padrão interno). O teor de flavonóides foi determinado como agliconas pela preparação de extratos hidrolisados ​​com ácido. Uma alíquota de 400 μL do sobrenadante foi hidrolisada com ácido pela adição de 120 μL de 3NHCl, incubada a 90 ° C por 1 h e, em seguida, misturada com 200 μL de metanol. Um sistema de HPLC Agilent 1260 series equipado com uma coluna Luna 5u C18 (2) 100A (4,6 × 250 mm, Phenomenex, CA, EUA) foi usado para análise cromatográfica. As condições de HPLC foram as seguintes: a fase móvel consistia em solvente A (acetonitrila) e solvente B (1% de ácido acético em água, v / v). O programa de eluição de gradiente foi: 0–10 min, 30% solvente A 10–30 min, 30–45% solvente A 30–35 min, 45–100% solvente A 35–45 min, 100–30% solvente A. O o comprimento de onda de detecção foi estabelecido em 330 nm. O flavonóide foi quantificado como o conteúdo relativo no tipo selvagem e transgênico P. appendiculatum talo de acordo com a área do pico. Todas as amostras foram avaliadas em três experimentos independentes.

Determinação de flavonóides e lignina em transgênicos A. thaliana

Transgênico e tipo selvagem com dez dias de idade (WT) A. thaliana as mudas foram liofilizadas e moídas até um pó fino. Para a determinação da composição dos flavonóides, uma alíquota de 15 mg do pó foi extraída por sonicação (1 h) em 800 μL de metanol: água (80:20, v / v) [34]. Following centrifugation (16,000 g, 4 °C, 15 min), the supernatant was subjected to reverse phase HPLC using an Luna 5u C18(2) 100A column (4.6 × 250 mm, Phenomenex, CA, USA). The mobile phase was 5–85% acetonitrile and 95–15% water (0.1% v/v formic acid) provided at a flow rate of 0.8 mL/min over 40 min. The detection wavelength was 364 nm. Peaks were identified as specific kaempferol derivatives using MS and UV spectral analysis [34]. Chrysin was used as the internal standard to normalize the peaks and calculate the relative contribution of the various flavonols. Seedlings were visually screened for anthocyanin accumulation after 5 days of culture on anthocyanin gene induction media half strength MS (pH 5.8) consisting of sucrose (3%, w/v) and agar (0.8%, w/v). For the total anthocyanins analysis of transgenic and wild type lines, 100 mg fresh plant material was suspended in 400 μL methanol with 1% HCl (v/v) and ultrasonicated for 1 h. After centrifugation (15,000 g, 10 min), the supernatant was transferred to a fresh tube and the total anthocyanin was determined by measuring the OD at A530 and A657 by using a spectrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). The quantity of anthocyanin was determined by calculating absorbance A = (A530–0.25 × A657). The concentration of anthocyanin pigment in the original sample was calculated using the following formula: anthocyanin pigment (mg/L) = (A × MW × DF × 1000)/(ε × 1), where MW is the molecular weight of cyandindin-3-glucoside (449.2), DF is the dilution factor, and ε is the molar absorptivity of cyanindin-3-glucoside (26,900) [35]. The pattern of lignin distribution present in five- to seven-leaf stage plants was obtained by staining stem sections following the previous procedure [36]. The lignin content of the stem tissue was quantified by spectrophotometric (280 nm) analysis of an acetyl bromide extract. The samples were ground into powder in liquid nitrogen and extracted, in turn, with 70% ethanol, chloroform/methanol (1:1 v/v) and acetone for cell wall preparation. According to the acetyl bromide method [37], 6 mg dried samples were digested with 1 mL 25% acetyl bromide in 70 °C for 30 min, and sequentially added 5 mL acetic acid after cooled in an ice bath for 10 min. Then 300 μL supernatants were mixed by 400 μL of 1.5 M NaOH and 300 μL of 0.5 M hydroxylamine hydrochloride, followed 1.5 mL acetic acid to dilute. The extinction coefficient for A. thaliana lignin was 23.35 g − 1 L cm − 1 at 280 nm. All samples were evaluated in three independent experiments.


35 Growth and development 2017

Nayoung Lee , Giltsu Choi , in Current Opinion in Plant Biology , 2017

The phy–PIF signaling module is conserved in Marchantia

Marchantia also possesses a phy–PIF signaling module like the one in Arabidopsis [ 46 •• ]. Marchantia has a single PIF (MpPIF) that clusters with Arabidopsis PIFs and the four Physcomitrella PILs (PpPILs) ( Table 1 ). diferente Arabidopsis PIFs, however, MpPIF and the PpPILs possess conserved APA motifs but not APB motifs. Interestingly, MpPIF preferentially interacts with the Pfr form of MpPhy via this APA motif, suggesting the APB-dependent interaction of PIFs with phyB is a derived feature of seed plants. No Arabidopsis, this interaction leads to the degradation of PIF by the 26S proteasome in response to both red (phyA, phyB) and far-red light (phyA). No Marchantia, the Mpphy–MpPIF interaction also leads to the degradation of MpPIF by the 26S proteasome in response to red but not far-red light. Functionally, MpPIF inhibits gemma germination and represses the expression of LHCB e POR mRNA in the dark [ 46 •• ]. Thus, when red light and Mpphy cause the degradation of MpPIF, there is a de-repression of spore germination and the expression of LHCB e POR mRNAs. Together, these indicate the key aspects of the phy–PIF signaling module in Arabidopsis — phy-interaction and light-induced degradation — are conserved in Marchantia. It is still unclear, though, whether red light induces the rapid phosphorylation and ubiquitination of MpPIF before its degradation by the 26S proteasome [ 13 ]. It is also unknown whether Mpphy dissociates MpPIF from its target promoters [ 9 ]. One recent report suggested the N-terminal signaling modules of seed plant phys have an intrinsic kinase activity toward PIFs and that this kinase activity is necessary in Arabidopsis phyA for the degradation of PIF3 in response to far-red light [ 11 •• ]. The amino acid residues in Arabidopsis phys that are proposed to bind ATP are completely conserved in Mpphy. It will be interesting to determine whether Mpphy also shows intrinsic kinase activity toward MpPIF and whether this is necessary for MpPIF's red light-induced degradation.


MATERIALS AND METHODS

The One Thousand Plants Project (1KP project onekp.com) used various Illumina sequencing technologies to generate approximately 2 Gbp of sequence from each of approximately 1400 RNA-seq libraries built in most cases from vegetative samples (leaves for vascular plants or leaves and stems for tracheophytes with microphyllous leaves) collected from taxonomically diverse Viridiplantae. These data were filtered and assembled with SOAP-denovo-Trans (Wickett et al., 2014 ), and these assemblies were the starting point of the present study.

To obtain the plastid gene sequences from the SOAP-denovo-Trans transcriptome assemblies, we developed a new pipeline. We first used BLASTX (v. 2.2.29, Altschul et al., 1990 ) searches against each of the 78 protein-coding genes over 100 bp long typical of plastid genomes from the data set of Ruhfel et al. (2014). BLAST hits having e-values <10 × e −25 were used to extract the matching gene regions from scaffolds. Any fragment that had BLAST hits to multiple plastid genes was discarded. Because the plastid data were found to contain many transcripts that did not correspond to the correct taxon (likely due to either misassembly or contamination), we performed a BLASTN search, initially against the Ruhfel et al. ( 2014 ) data set. Samples were divided into 13 broad groups (“algae”, nonseed land plants, gymnosperms, basal angiosperms, monocots, basal eudicots, Saxifragales, campanulids, Caryophyllales, Cornales and Ericales, malvids, fabids, and lamiids), and if the best BLAST hit was to a sample outside these groups, the fragment was discarded. To take advantage of the increased coverage provided by the 1KP data added in the initial round, a second round of BLASTN searches and filtering was conducted, using the Ruhfel et al. ( 2014 ) data, plus the new fragments that had passed the initial filter above. This approach was used to increase sampling in the BLAST database across the phylogenetic breadth and reduce the chances of missing true matches where the initial data set may have had limited samples to match in some under-represented groups. All fragments that passed this second BLAST filter were retained. As many samples had multiple fragments for each gene, these were aligned to the Ruhfel et al. ( 2014 ) data for the corresponding gene using the –add option of Mafft (v. 7.125, Katoh and Standley, 2013 ). A single sequence for each taxon was obtained by joining non-overlapping fragments with gap characters and computing the consensus of overlapping portions of fragments. Fragments with greater than 5% sequence divergence in regions of overlap were discarded.

Data from all complete plastid genomes in GenBank as of 27 December 2014 were downloaded and parsed into gene files based on their annotations. Our data set thus consisted of the original Ruhfel et al. ( 2014 ) samples (360), additional genomes in GenBank (380), and 1KP samples (1139) (Appendix S1, see the Supplemental Data with this article). We used 52 red and brown algal samples to root the tree, leaving 1827 representatives of Viridiplantae.

Ruhfel et al. ( 2014 ), as well as initial analyses of our own data, found that shifts in GC content over the tree result in unconventional placement of some groups (e.g., Lycopodiophyta) in analyses of DNA sequences (see also Smith, 2009 ) thus, we restricted our analyses to an amino acid data set and did not conduct analyses removing third positions, or RY-coding as was done in Ruhfel et al. (2014). All gene sequences for all samples were therefore translated to amino acids using transeq (EMBOSS v. 6.5.7.0, Rice et al., 2000 ).

The amino acid data sets for each gene were aligned using Mafft. Each gene alignment was then processed with TrimAL (v. v1.4.rev15, Capella-Gutiérrez et al., 2009 ) using the gappyout option to remove poorly aligned positions. The individual gene alignments were concatenated, and samples with a concatenated total of fewer than 1000 amino acids were removed from the data set.

The resulting data set was analyzed in EXaML (v. 3.0.14, Kozlov et al., 2015 ). For the maximum likelihood (ML) analysis, 10 random and 10 parsimony starting trees were used. The per-site rate category model (PSR) was used. One hundred bootstrap (BS) data sets were analyzed each bootstrap replicate used a single, randomly selected starting tree from the 10 random trees used for the ML search.


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