Em formação

6B: Cinética de reações simples e catalisadas por enzimas - Biologia


objetivos de aprendizado

  • escrever equações químicas e diferenciais apropriadas para a taxa de desaparecimento de reagentes ou aparecimento de produtos para reações de 1ª ordem, pseudo primeira ordem, segunda ordem, reversíveis de primeira ordem
  • desenhar e interpretar gráficos para equações de taxas integradas (mostrando as concentrações de reagentes ou produtos em função do tempo) e equações de taxas iniciais (mostrando a velocidade inicial vo como uma função do reagente;
  • derivar constantes de taxas cinéticas de dados e gráficos de taxas integradas e equações de taxas iniciais;
  • escrever as equações químicas, diferenciais e as equações de taxa inicial apropriadas para a taxa de desaparecimento de reagentes ou aparecimento de produtos para uma reação catalisada por enzima simples;
  • diferencie entre suposições de estado rápido e estável;
  • simplificar a equação de taxa inicial contendo constantes de taxa para uma reação catalisada por enzima para substituir as constantes de taxa por kcat e KM, e fornecer definições operacionais e matemáticas dessas constantes;

Enzimas são catalisadores altamente específicos para reações bioquímicas, com cada enzima mostrando uma seletividade para um único reagente, ou substrato. Por exemplo, a enzima acetilcolinesterase catalisa a decomposição do neurotransmissor acetilcolina em colina e ácido acético. Muitas reações de enzima e substrato seguem um mecanismo simples que consiste na formação inicial de um complexo de enzima e substrato, (ES ), que subsequentemente se decompõe para formar o produto, liberando a enzima para reagir novamente.

Figura ( PageIndex <1> ): Uma enzima catalisa a reação de dois substratos e para formar um produto. da Wikipedia.

Isso é descrito no seguinte mecanismo de várias etapas

onde (k_1 ), (k _ <& ndash1> ), (k_2 ) e (k _ <& ndash2> ) são constantes de taxa. A lei da taxa de reação para gerar o produto ([P] ) é

No entanto, se fizermos a medição no início da reação, a concentração dos produtos é insignificante, ou seja,

e podemos ignorar a reação de retorno (segundo termo no lado direito da Equação ( ref <13.21A> )). Então, sob essas condições, a taxa de reação e rsquos é

Para ser analiticamente útil, precisamos escrever a Equação ( ref <13.21> ) em termos dos reagentes (por exemplo, as concentrações de enzima e substrato). Para fazer isso, usamos o aproximação de estado estacionário, em que assumimos que a concentração de (ES ) permanece essencialmente constante. Após um período inicial, durante o qual o complexo de enzima e substrato se forma pela primeira vez, a taxa em que (ES ) se forma

é igual à taxa em que desaparece

onde ([E] _0 ) é a concentração original da enzima. A combinação de Equações ( ref <13.22> ) e ( ref <13.23> ) dá

que resolvemos para a concentração do complexo de enzima e substrato

onde (K_m ) é o Michael é constante. Substituindo a Equação ( ref) na Equação ( ref <13.21> ) nos deixa com nossa equação de taxa final.

Um gráfico da Equação ( ref), como mostrado na Figura ( PageIndex <1> ), é instrutivo para definir as condições onde podemos usar a taxa de uma reação enzimática para a análise quantitativa de uma enzima ou substrato.

Figura ( PageIndex <1> ) : Gráfico da Equação ( ref) mostrando limites para a análise de substratos e enzimas em um método de cinética química catalisada por enzimas. A curva na região destacada em vermelho obedece à equação ( ref <13.27> ) e a curva na área destacada em verde segue a equação ( ref).

Para altas concentrações de substrato, onde ([S] gg K_m ), Equação ( ref) simplifica para

onde (V_) é a taxa máxima para a reação catalisada. Nessas condições, a reação é de ordem zero no substrato e podemos usar (V_) para calcular a concentração de enzima e rsquos, normalmente usando um método de tempo variável. Em concentrações de substrato mais baixas, onde ([S] ll K_m ), Equação ( ref) torna-se

A reação agora é de primeira ordem no substrato, e podemos usar a taxa da reação para determinar a concentração do substrato por um método de tempo fixo.

A constante de Michaelis (K_m ) é a concentração de substrato na qual a taxa de reação está na metade do máximo e é uma medida inversa da afinidade do substrato para a enzima & mdas tem um pequeno (K_m ) indica alta afinidade, o que significa que a taxa se aproximará de (V_) mais rapidamente. O valor de (K_m ) depende da enzima e do substrato, bem como de condições como temperatura e pH.

A constante de Michaelis (K_m ) é a concentração de substrato na qual a taxa de reação está na metade do máximo.

Dos dois últimos termos da Equação ( ref <13.27> ), podemos expressar (V_) em termos de um Número de rotatividade ( (k_)):

onde ([E] _0 ) é a concentração da enzima e (k_) é o número de rotatividade, definido como o número máximo de moléculas de substrato convertidas em produto por molécula de enzima por segundo. Portanto, o número de turnover é definido como o número máximo de conversões químicas de moléculas de substrato por segundo que um único sítio catalítico executará para uma dada concentração de enzima ([E] _o ).

Exemplo ( PageIndex <1> ): Número de turnover da acetilcolinesterase

A acetilcolinesterase (AChE) pode ser uma das enzimas mais rápidas. Ele hidrolisa a acetilcolina em colina e um grupo acetato. Um dos primeiros valores do número de turnover foi (3 vezes 10 ^ 7 ) (moléculas de acetilcolina) por minuto por molécula de enzima. Um valor mais recente a 25 & degC, pH = 7,0, concentração de acetilcolina de (2,5 vezes 10 ^ <& minus3> M ), foi encontrado para ser (7,4 vezes 10 ^ 5 min ^ <& minus1> ) ( J Biol Chem. 236 (8): 2292 e ndash5. )

Pode haver cerca de 30 centros ativos por molécula. AChE é uma serina hidrolase que reage com a acetilcolina perto de a taxa de difusão controlada. Uma reação controlada por difusão ocorre tão rapidamente que a taxa de reação é a taxa de transporte dos reagentes através da solução a & # 65279 s rapidamente quando os reagentes se encontram, eles reagem.


Regulação da enzima

Inibição competitiva e não competitiva

As enzimas podem ser inibidas ou ativadas pela interferência de outros compostos. Estes irão influenciar a reação mudando o (K_m ) ou (V_) da reação. A maioria dos inibidores enzimáticos age reversivelmente e não causa alterações permanentes na enzima. No entanto, também existem inibidores irreversíveis que modificam a enzima alvo de forma covalente e permanente. Eles são chamados de inibidores de suicídio.

Os inibidores podem ser categorizados como competitivo ou não competitivo e isso pode ser determinado comparando a cinética das reações normais com as inibidas.

Figura 1.6: Inibição competitiva vs. não competitiva.

Inibidores competitivos ligar a enzima no sítio ativo e competir com o substrato pela ligação. Muitos funcionam como análogos de substrato. Na presença do inibidor, uma concentração de substrato mais alta é, portanto, necessária para atingir a metade da taxa máxima em que a constante de Michaelis (K_m ) aumenta. Quando as concentrações de substrato são elevadas, isso acabará por deslocar o inibidor e (V_) será alcançado. A taxa máxima, (V_), portanto, não é influenciado por inibidores competitivos. Neste caso, não há mudar em (V_) como a competição pode ser superada pelo aumento da concentração de substrato, mas há um aumento no aparente (K_m ) of 5 Figura 1.5 Gráfico Lineweaver-Burk para ilustrar (K_m ) e (V_). (Adaptado de Marks & rsquo Medical Biochemistry) Figura 1.6 Inibição competitiva vs. não competitiva. (Adaptado de Marks Medical Biochemistry) a reação como uma maior concentração de substrato é necessária para atingir (V_) (Figura 1.6A).

Em contraste, inibidores não competitivos ligar a enzima em um local alternativo ao local de ligação do substrato e, portanto, seus efeitos não podem ser superados pelo aumento do substrato. Neste caso, (K_m ) permanece inalterado, mas (k_) (a taxa de formação do produto) e, portanto, (V_), diminui. Os inibidores irreversíveis geralmente resultam em um tipo de inibição não competitivo porque a concentração da enzima ativa [E] diminui (Figura 1.6B).

A ação dos inibidores pode ser ilustrada claramente no gráfico Lineweaver & # 8210Burk. Neste tipo de gráfico, a interceptação das linhas de aproximação com o eixo y corresponde a 1 / (V_) enquanto a interceptação do eixo x fornece o valor de -1 / (K_m ). É por isso que as linhas retas obtidas na ausência (azul) e na presença de um inibidor competitivo (A, vermelho) se cruzam no eixo y (1 / (V_), inalterado), enquanto os inibidores não competitivos (B, vermelho) resultam em uma linha reta com uma interceptação y superior, mas interceptação x inalterada (1 / (V_) aumentou, (K_m ) inalterado) (Figura 1.6).


Cinética Enzimática

Equações de velocidade para alguns mecanismos birreagentes

Em alguns casos, diferentes mecanismos cinéticos são descritos por diferentes equações de velocidade. (Consulte os textos de cinética enzimática padrão para obter os procedimentos usados ​​para derivar essas equações.) Consequentemente, às vezes é possível distinguir entre os mecanismos das características dos gráficos recíprocos duplos. Por exemplo, a equação de velocidade para um mecanismo de birreagente ordenado sob condições de estado estacionário na ausência de produtos é

Onde KmA e KMB são as constantes de Michaelis dos dois substratos e KI a é a constante de dissociação simples do complexo EA. (Equações de velocidade para mecanismos multirreagentes geralmente contêm os dois tipos de constantes.) Quando [UMA] é variado em diferentes concentrações fixas de B, a dependência da velocidade pode ser escrita na forma da equação de Michaelis-Menten:

Ou, em forma recíproca dupla:

Quando [B] é variado em diferentes concentrações fixas de A, as equações são

A uma concentração fixa de um substrato, por exemplo, A, a dependência da velocidade na concentração do substrato B também pode ser descrita por uma forma simplificada de eqn. (25):

onde o constantes aparentes estão relacionados às constantes verdadeiras ou limitantes conforme mostrado abaixo.

Em outras palavras, o determinado experimentalmente “Km" e "Vmax”Dependem da concentração do co-substrato e não serão iguais aos valores limites, a menos que a concentração seja infinitamente alta (“ saturação ”). Na prática, as constantes cinéticas limitantes são obtidas a partir de replotagens adequadas das encostas e 1 /v- interceptações do eixo dos gráficos recíprocos duplos. (O primeiro é uma repleta de Km, app/Vmax, app o último é um replot de 1 /Vmax, app.) Por exemplo, os replots para a família de 1 /v versus 1 / [B] plotagens em diferentes [UMA] são descritos pelas seguintes equações lineares:

As equações para o mecanismo de birreagente com enzima substituída (ping-pong) na ausência de produtos é

Quando [UMA] é variado em diferentes [B], o Michaelis-Menten e as equações recíprocas duplas são

As equações para variados [B] em diferentes [UMA] são simétricos àqueles mostrados para [UMA] A Figura 3 mostra as famílias de 1 /v versus 1 / [UMA] plota um mecanismo ordenado e um mecanismo de pingue-pongue. Em ambos os mecanismos fixos diferentes [B] valores afetam as interceptações do eixo vertical. No mecanismo ordenado, alterando [B] também afeta as inclinações do 1 /v versus 1 / [UMA] parcelas. Mas no mecanismo de pingue-pongue, mudando o fixo [B] não tem efeito nas encostas. (Observe que as eq. (24) e (33) prevêem esses efeitos.) A ausência de um efeito de inclinação costuma ser suficiente para identificar o mecanismo de pingue-pongue. Mas a presença de ambos os efeitos de inclinação e interceptação (como mostrado na Figura 3A) não é suficiente para diagnosticar o mecanismo conforme ordenado porque na ausência de produtos, um estado estacionário ordenado, um Theorell-Chance e um mecanismo aleatório de equilíbrio rápido todos têm a mesma equação de velocidade. Conseqüentemente, os padrões de plotagem recíproca dupla dos três mecanismos diferentes são os mesmos. Medidas adicionais são necessárias para distinguir entre esses mecanismos. Os estudos de inibição do produto podem ser informativos. Por exemplo, em um mecanismo ordenado de estado estacionário, um dos produtos (P, o primeiro a se dissociar da enzima) não é competitivo em relação a ambos os substratos, mas em um mecanismo aleatório e de Theorell-Chance, cada produto é competitivo em pelo menos um substrato. Os estudos de inibição de beco sem saída também podem ser úteis. Por exemplo, um análogo não reativo que é competitivo com B será não competitivo com A nos mecanismos ordenado e de Theorell-Chance, mas não competitivo com A no mecanismo aleatório. (Isso pressupõe que o inibidor forma um complexo EAI no mecanismo Theorell-Chance e imita o substrato B completamente no mecanismo aleatório ligando-se a E e EA.)

Figura 3 . Gráficos recíprocos duplos de 1 /v versus 1 / [UMA] em diferentes concentrações fixas de B. A é chamado de substrato variado B é chamado de substrato fixo variável. (A) Um mecanismo sequencial. Os gráficos podem ser para um estado estacionário ordenado, Theorell-Chance, ou um mecanismo aleatório de equilíbrio rápido. (B) Mecanismo de pingue-pongue. Para os mecanismos acima, os gráficos de 1 /v versus 1 / [B] em diferentes fixos [UMA] têm a mesma aparência que para 1 / [UMA] As constantes cinéticas limitantes, KmA, KMB, KI a, Vmax, etc., são obtidos por replotagem das encostas e / ou 1 /v-eixo intercepta dos gráficos recíprocos duplos contra o recíproco da mudança de concentração de substrato fixo.


Conteúdo

Em 1901, o físico químico francês Victor Henri descobriu que as reações enzimáticas eram iniciadas por uma ligação (mais geralmente, uma interação de ligação) entre a enzima e o substrato. [4] Seu trabalho foi retomado pela bioquímica alemã Leonor Michaelis e pelo médico canadense Maud Menten, que investigou a cinética de um mecanismo de reação enzimática, invertase, que catalisa a hidrólise da sacarose em glicose e frutose. [5] Em 1913, eles propuseram um modelo matemático da reação. [6] Envolve uma enzima, E, ligando-se a um substrato, S, para formar um complexo, ES, que por sua vez libera um produto, P, regenerando a enzima original. Isso pode ser representado esquematicamente como

onde k f < displaystyle k_> (constante de taxa de avanço), k r < displaystyle k_> (constante de taxa reversa) e k c a t < displaystyle k _ < mathrm >> (constante de taxa catalítica) denotam as constantes de taxa, [7] as setas duplas entre S (substrato) e ES (complexo enzima-substrato) representam o fato de que a ligação enzima-substrato é um processo reversível, e a única seta para frente representa a formação de P (produto).

Sob certas suposições - como a concentração da enzima sendo muito menor do que a concentração do substrato - a taxa de formação do produto é dada por

O modelo é usado em uma variedade de situações bioquímicas além da interação enzima-substrato, incluindo ligação antígeno-anticorpo, hibridização DNA-DNA e interação proteína-proteína. [9] [12] Ela pode ser usada para caracterizar uma reação bioquímica genérica, da mesma forma que a equação de Langmuir pode ser usada para modelar a adsorção genérica de espécies biomoleculares. [12] Quando uma equação empírica desta forma é aplicada ao crescimento microbiano, às vezes é chamada de equação de Monod.

Os valores dos parâmetros variam amplamente entre as enzimas: [13]

Enzima K M < displaystyle K _ < mathrm >> (M) k cat < displaystyle k _ < text>> (s -1) k cat / K M < displaystyle k _ < text> / K_ < mathrm >> (M −1 s −1)
Quimotripsina 1.5 × 10 −2 0.14 9.3
Pepsina 3.0 × 10 −4 0.50 1.7 × 10 3
T-RNA sintetase 9.0 × 10 −4 7.6 8.4 × 10 3
Ribonuclease 7.9 × 10 −3 7.9 × 10 2 1.0 × 10 5
Anidrase carbônica 2.6 × 10 −2 4.0 × 10 5 1.5 × 10 7
Fumarase 5.0 × 10 −6 8.0 × 10 2 1.6 × 10 8

A constante k cat / K M < displaystyle k _ < text> / K_ < mathrm >> (eficiência catalítica) é uma medida de quão eficientemente uma enzima converte um substrato em produto. Enzimas de difusão limitada, como fumarase, funcionam no limite superior teórico de 10 8 - 10 10 M −1 s −1, limitado pela difusão do substrato no sítio ativo. [14]

A cinética de Michaelis-Menten também foi aplicada a uma variedade de esferas fora das reações bioquímicas, [7] incluindo a eliminação alveolar de poeiras, [15] a riqueza dos pools de espécies, [16] a eliminação de álcool no sangue, [17] a fotossíntese- relação de irradiância e infecção de fago bacteriano. [18]

A equação também pode ser usada para descrever a relação entre a condutividade do canal iônico e a concentração de ligante. [19]

Aplicando a lei da ação de massa, que afirma que a taxa de uma reação é proporcional ao produto das concentrações dos reagentes (ou seja, [E] [S] < displaystyle [E] [S]>), dá-se um sistema de quatro equações diferenciais ordinárias não lineares que definem a taxa de mudança dos reagentes com o tempo t < displaystyle t> [20]

Aproximação de equilíbrio Editar

Em sua análise original, Michaelis e Menten assumiram que o substrato está em equilíbrio químico instantâneo com o complexo, o que implica [6] [21]

A partir da lei de conservação de enzimas, obtemos [21]

Combinando as duas expressões acima, nos dá

Após a simplificação, obtemos

Aproximação de estado quase estacionário Editar

Uma análise alternativa do sistema foi realizada pelo botânico britânico GE Briggs e pelo geneticista britânico JBS Haldane em 1925. [22] [23] Eles assumiram que a concentração do complexo intermediário não muda na escala de tempo de formação do produto - conhecido como a suposição de quase-estado estacionário ou a hipótese de pseudo-estado estacionário. Matematicamente, esta suposição significa k f [E] [S] = k r [ES] + k c a t [ES] = (k r + k c a t) [ES] < displaystyle k_[< ce >] [< ce >] = k_[< ce >] + k_ < mathrm > [< ce >] = (k_+ k_ < mathrm >) [< ce >]>. Isto é matematicamente igual à equação anterior, com k r < displaystyle k_> substituído por k r + k c a t < displaystyle k_+ k_ < mathrm >>. Portanto, seguindo as mesmas etapas acima, a velocidade v < displaystyle v> da reação é [21] [23]

é conhecido como a constante de Michaelis.

Suposições e limitações Editar

A primeira etapa da derivação aplica a lei da ação de massa, que depende da difusão livre. No entanto, no ambiente de uma célula viva, onde há uma alta concentração de proteínas, o citoplasma frequentemente se comporta mais como um gel viscoso do que como um líquido de fluxo livre, limitando os movimentos moleculares por difusão e alterando as taxas de reação. [24] Embora a lei de ação de massa possa ser válida em ambientes heterogêneos, [25] é mais apropriado modelar o citoplasma como um fractal, a fim de capturar sua cinética de mobilidade limitada. [26]

Em contraste, a análise de quase-estado estacionário de Briggs-Haldane é válida se [20] [27]

Portanto, é válido se a concentração da enzima for muito menor do que a concentração do substrato ou K M < displaystyle K _ < mathrm >> ou ambos.

Também é importante lembrar que, embora a irreversibilidade seja uma simplificação necessária para produzir uma solução analítica tratável, no caso geral a formação do produto não é de fato irreversível. A reação enzimática é mais corretamente descrita como

Em geral, a suposição de irreversibilidade é boa em situações em que uma das opções a seguir é verdadeira:

1. A concentração do (s) substrato (s) é muito maior do que a concentração dos produtos: [S] ≫ [P] ⋅ < displaystyle < ce <[S] gg [P]. >>>

Isso é verdade no padrão em vitro condições de ensaio, e é verdade para muitos na Vivo reações biológicas, particularmente quando o produto é continuamente removido por uma reação subsequente.

2. A energia liberada na reação é muito grande, ou seja, Δ G ≪ 0. < displaystyle Delta ll 0.>

Em situações em que nenhuma dessas duas condições se mantém (ou seja, a reação é de baixa energia e existe um pool substancial de produto (s)), a equação de Michaelis-Menten quebra e a modelagem mais complexa aborda explicitamente as reações direta e reversa em consideração deve ser levado em conta para compreender a biologia enzimática.

Antes que os recursos de computação para realizar a regressão não linear se tornassem disponíveis, foram usados ​​métodos gráficos envolvendo a linearização da equação. Vários deles foram propostos, incluindo o diagrama de Eadie-Hofstee, o gráfico de Hanes-Woolf e o gráfico de Lineweaver-Burk destes, o gráfico de Hanes-Woolf é o mais preciso. [28] No entanto, embora úteis para visualização, todos os três métodos distorcem a estrutura de erro dos dados e são inferiores à regressão não linear. [29] Assumindo um erro semelhante dv 0 < displaystyle dv_ <0>> em v 0 < displaystyle v_ <0>>, uma representação inversa leva a um erro de dv 0 / v 0 2 < displaystyle dv_ <0> / v_ <0> ^ <2>> em 1 / v 0 < displaystyle 1 / v_ <0>> (Propagação da incerteza). Sem a estimativa adequada dos valores de d v 0 < displaystyle dv_ <0>>, a linearização deve ser evitada. Além disso, a análise de regressão usando mínimos quadrados assume que os erros são normalmente distribuídos, o que não é válido após uma transformação de valores v 0 < displaystyle v_ <0>>. No entanto, seu uso ainda pode ser encontrado na literatura moderna. [30]

Em 1997, Santiago Schnell e Claudio Mendoza sugeriram uma solução de forma fechada para a análise da cinética do curso do tempo da cinética de Michaelis-Menten com base na solução da função Lambert W. [31] Ou seja,

Onde C é a função Lambert W e

A equação de Michaelis-Menten tem sido usada para prever a taxa de formação do produto em reações enzimáticas por mais de um século. Especificamente, ele afirma que a taxa de uma reação enzimática aumentará à medida que a concentração de substrato aumenta e que o aumento da desconexão dos complexos enzima-substrato diminuirá a taxa de reação. Enquanto a primeira previsão está bem estabelecida, a segunda é mais elusiva. A análise matemática do efeito da desvinculação enzima-substrato em reações enzimáticas no nível de uma única molécula mostrou que a desvinculação de uma enzima de um substrato pode reduzir a taxa de formação do produto em algumas condições, mas também pode ter o efeito oposto. À medida que as concentrações de substrato aumentam, um ponto de inflexão pode ser alcançado onde um aumento na taxa de desacoplamento resulta em um aumento, ao invés de uma diminuição, da taxa de reação. Os resultados indicam que as reações enzimáticas podem se comportar de maneiras que violam a equação clássica de Michaelis-Menten, e que o papel do desligamento na catálise enzimática ainda precisa ser determinado experimentalmente. [34]


E2. Princípios Básicos de Análise de Controle Metabólico (MCA)

  • Contribuição de Henry Jakubowski
  • Professor (Química) no College of St. Benedict / St. John's University

Uma variedade de entradas são necessárias para tais análises computacionais:

uma. Caminhos definidos. Eles estão disponíveis em muitos bancos de dados. Um exemplo das vias KEGG para a glicólise de levedura é mostrado abaixo

b. Um programa de modelagem computacional para inserir todos os parâmetros, equações, modelos e calcular as concentrações para todas as espécies em função do tempo. Programas gratuitos para download que fazem isso incluem COPASI, Virtual Cell e Cell Designer. Um exemplo de um modelo mapeado do Cell Designer para a glicólise de levedura com várias reações adicionais que se ramificam da via glicolítica clássica é mostrado abaixo.

Os resultados computacionais das análises para a glicólise de levedura foram capazes de ajustar os dados experimentais apenas se corrigidos pela adição de várias reações de ramificação (mostradas nas figuras acima e abaixo):

c. Uma lista de todas as espécies envolvidas na via (mostrada na figura abaixo para glicólise e reações de ramificação).

d. Uma lista de todas as reações (mostrada abaixo para glicólise e reações de ramificação, tirada da COPASI)

e. Parâmetros de todas as espécies. Um exemplo é mostrado abaixo para hexoquinase (retirado da COPASI).

f. Equações que podem ser usadas para calcular a mudança nas concentrações de todas as espécies com o tempo. Estas são geralmente equações diferenciais ordinárias (ODE), conforme descrito no Capítulo 6B - Cinética de reações simples e catalisadas por enzimas, Seções B1: Reações de etapa única.) As ODEs são fáceis de escrever, mas requerem um computador para resolver conforme o número de espécies em interação aumenta .

Um exemplo de reação química e um conjunto de ODEs para cada espécie é mostrado abaixo.

Se uma reação remove a espécie X, o lado direito da ODE para o desaparecimento dessa espécie tem um sinal & ndash para esse termo. Da mesma forma, se uma reação aumenta a espécie X, o lado direito tem um sinal +. Os exemplos acima mostram reações unimoleculares (C a D, C a A + B) e bimoleculares (A + B a C).

Um exemplo de ODE retirado da COPASI é mostrado abaixo para a mudança na concentração de glicose-6-fosfato.

Bancos de dados contendo modelos com curadoria com todas as informações acima foram desenvolvidos para muitos caminhos. O modelo de glicólise de levedura descrito acima pode ser encontrado no banco de dados Biomodels. O modelo, BIOMD0000000064, pode ser baixado como um arquivo de linguagem de marcação de biologia de sistemas (SBML) e importado para qualquer um dos programas descritos acima.
Os gráficos abaixo mostram as concentrações para selecionar e todas as espécies em função do tempo para a glicólise de levedura usando COPASI.


1 Análise cinética de estado transiente das vias de reação enzimática

Este capítulo fornece uma justificativa para o projeto e a interpretação de experimentos cinéticos transitórios para estabelecer as vias enzimáticas por meio da análise direta das etapas individuais da reação. De muitas maneiras, a cinética transitória é direta e os resultados experimentais podem ser entendidos em termos de princípios simples derivados da cinética de primeira ordem. A aplicação desses métodos à cinética enzimática é ilustrada por uma série de exemplos. Isso é especialmente útil para aqueles casos em que os dados cinéticos podem ser ajustados a um único modelo completo, o mais notável sendo 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintase, DNA polimerase e triptofano sintase. A aplicação de métodos cinéticos transitórios para a solução de mecanismos enzimáticos aumentou devido aos avanços recentes na instrumentação e na superexpressão e purificação de novas enzimas. A cinética transitória está se tornando o método de escolha para a avaliação de mutantes enzimáticos dirigidos ao local e para questões detalhadas sobre as relações entre a estrutura da proteína e a função observável. Em conjunto com os avanços nos métodos de análises estruturais e genéticas, a análise cinética de estado transiente forma a base para o que pode ser chamado de "nova enzimologia". O perigo na interpretação dos dados cinéticos decorre da tendência de incluir uma etapa de reação adicional para explicar um resultado cinético incomum, quando muitas vezes o novo resultado poderia ter sido explicado por um modelo mais simples baseado em uma compreensão mais profunda das sutilezas da cinética .


Discussão

A atividade enzimática medida indiretamente pelo aumento da temperatura seguiu um padrão de cinética enzimática padrão, conforme esperado. Acreditamos que os procedimentos laboratoriais aqui apresentados resolvem vários desafios para o ensino da cinética enzimática no laboratório introdutório à biologia. Primeiro, os procedimentos são simples e baratos. O equipamento e suprimentos necessários podem ser facilmente obtidos e nenhum treinamento especial é necessário para seu uso. Portanto, esses exercícios podem ser usados ​​com alunos em muitos níveis diferentes e em diversos tipos de instituições. Em segundo lugar, nenhum material perigoso é usado nesses procedimentos, eliminando riscos para os alunos e a necessidade de práticas especializadas de descarte. Finalmente, esses procedimentos fornecem dados quantitativos robustos e altamente replicáveis ​​que os alunos podem usar para análises gráficas.

Os gráficos podem ser iniciados em aula com a orientação do instrutor ou dados como lição de casa, dependendo do nível acadêmico dos alunos. Concluímos que esses procedimentos se alinham com a ênfase atual no desenvolvimento de habilidades quantitativas no ensino de biologia (AAMC-HHMI Committee, 2009 Labov et al., 2010 Woodin et al., 2010).

As atividades propostas aqui podem ser seguidas por um exercício de investigação guiada em que os alunos recebem o procedimento de linha de base e, em seguida, eles projetam uma investigação para medir a alteração da atividade enzimática por variações nos fatores examinados na primeira semana. A compreensão do aluno sobre o procedimento de linha de base pode ser avaliada com um breve questionário ou discussão em classe, permitindo que o instrutor esclareça quaisquer pontos de confusão. Em seguida, equipes de alunos podem ser encarregadas de projetar procedimentos para examinar os efeitos de várias manipulações sobre a atividade dessa enzima. Por exemplo, os alunos podem escolher avaliar o efeito de 10 × substrato ou 0,25 × concentração de enzima ou pH 9. Nessa situação, o procedimento de linha de base serve como ponto de partida e os alunos devem aplicar seu conhecimento da cinética enzimática e das práticas científicas em a fim de resolver o problema.

Para alunos mais jovens ou aqueles que têm experiência limitada com projeto experimental, pode ser necessário que o instrutor sugira ou atribua diretamente o projeto de certos procedimentos aos grupos. Por exemplo, um grupo pode ser encarregado de investigar o efeito da alteração do pH e outro da investigação do efeito da alteração da concentração do substrato. Os alunos mais maduros podem ter mais liberdade para projetar procedimentos de acordo com seus próprios conhecimentos e interesses. Além disso, os alunos mais avançados também podem optar por investigar novos fatores, como inibidores competitivos ou não competitivos. O instrutor estará disponível para orientação durante o período de aula, mas os próprios alunos são responsáveis ​​por selecionar os parâmetros experimentais apropriados, incluindo tempo, temperatura, pH, números de amostra e controles. Uma vez que seu projeto experimental seja aprovado pelo instrutor, os alunos podem realmente realizar seus procedimentos e compartilhar seu projeto experimental e os dados obtidos com outros grupos da classe. Isso representa uma oportunidade de ensino entre pares e, portanto, uma ferramenta de envolvimento do aluno. Como os resultados são quantitativos, eles podem realizar uma análise gráfica de suas descobertas. Como avaliação final, os alunos podem realizar uma tarefa escrita, como um relatório de laboratório. Rissing e Cogan (2009) relataram ganhos de aprendizagem significativos em alunos que participaram de um módulo de laboratório de investigação guiada semelhante, em comparação com alunos que participaram de um exercício de laboratório padrão, estilo “livro de receitas”.

Em conclusão, um processo econômico e não perigoso pode ser empregado para estudar quantitativamente a cinética enzimática. Além disso, este processo pode ser aumentado para aumentar o investimento do aluno se os alunos tiverem a oportunidade de projetar seus próprios experimentos e avaliar parâmetros além daqueles ditados por um manual de laboratório. A atividade serve como uma atividade de aprendizagem experiencial, uma vez que os alunos estão aprendendo editando o projeto experimental, realizando seus próprios experimentos e apresentando os resultados em forma gráfica. Para que esta atividade baseada em equipe seja realizada com sucesso, os alunos devem pensar criticamente, resolver problemas com o experimento e estar abertos e utilizar o feedback do instrutor orientador.


Princípio:


A enzima alfa-amilase pode catalisar a hidrólise da ligação alfa-1,4-glicosídica interna presente no amido com a produção de açúcares redutores. No estudo da concentração de substrato na cinética da enzima, a enzima é mantida constante, enquanto a concentração de amido é medida em ordem crescente. Conforme a concentração de substrato aumenta, a quantidade de produtos produzidos em cada tubo sucessivo também aumenta. This was explained by Michealis and others that an enzyme catalyzed reaction at varying substrate concentrations is diphasic i.e. at low substrate concentration the active sites on molecules (enzyme) are not occupied by substrate and the enzyme rate varies with substrate molecules concentration (phase1). As the number of substrate molecules increases, the enzyme attains the saturation level, since there is no more reaction sites remaining for binding. So the enzyme can work with full capacity and its reaction rate is independent of substrate concentration. (Phase II).


This Enzyme &ndash substrate reaction can be determined by measuring the increase in reducing sugars using the 3, 5 Dinitro salycilic acid reagent. In an alkaline condition, the pale yellow colored the 3, 5- dinitro salicylic acid undergo reduction to yield orange colored 3- amino -5-nitrosalicylic acid. The absorbance of resultant solutions is read at 540nm. The intensity of color depends on the concentration of reducing sugars produced.


&alpha Amylase
Starch Maltose + glucose


Assista o vídeo: Vinheta Cinética das Reações - Isadora Rigo (Novembro 2021).