Em formação

28.6: Ferramentas e técnicas - Biologia


Técnicas para estudar as relações da população

Existem vários métodos diferentes para estudar as relações populacionais com dados genéticos. Mesmo que os resultados do estudo estejam corretos, eles também são incertos.

O segundo método de análise de relações de subpopulação é o agrupamento genético. Os clusters podem ser formados usando ancestrais autodefinidos [1] ou o banco de dados STRUCTURE. [3] Este método é usado em demasia e pode ajustar demais os dados; a composição do banco de dados pode influenciar os resultados do agrupamento.

Os avanços tecnológicos e o aumento da coleta de dados, entretanto, produziram conjuntos de dados 10.000 vezes maiores do que antes, o que significa que a maioria das afirmações específicas pode ser refutada por algum subconjunto de dados. Assim, de fato, muitos modelos previstos por filogenia e migração ou agrupamento genético serão refutados em algum ponto, levando a uma confusão de resultados em grande escala. Uma solução para esse problema é usar um modelo simples que faça uma declaração que seja útil e tenha menos probabilidade de ser falsificada.

Extraindo DNA de ossos de Neandertal

Vamos dar uma olhada em como você vai encontrar e sequenciar DNA de vestígios antigos. Primeiro, você precisa obter uma amostra de osso com DNA de um Neandertal. O DNA humano e o DNA de Neandertal são muito semelhantes (somos mais semelhantes a eles do que aos chimpanzés), portanto, ao sequenciar leituras curtas com DNA muito antigo, é impossível dizer se o DNA é de Neandertal ou humano. A caverna onde os ossos foram encontrados é primeiro classificada como humana ou não humana usando lixo ou ferramentas como um identificador, o que ajuda a prever a origem dos ossos. Mesmo se você tiver um osso, ainda é muito improvável que você tenha algum DNA recuperável. Na verdade, 99% da sequência de Neandertais vem de apenas três ossos longos encontrados em um local: a caverna Vindija na Croácia (5,3 Gb, cobertura total de 1,3x).

Em seguida, o DNA é enviado para um laboratório de DNA antigo. Como são ossos de 40.000 anos, resta muito pouco DNA neles. Então, eles são primeiro examinados quanto ao DNA. Se eles encontrarem DNA, a próxima pergunta é se é DNA de primata. Normalmente é DNA de micróbios e fungos que vivem no solo e digerem organismos mortos. Apenas cerca de 1-10% do DNA em ossos velhos é o DNA de primatas. Se for DNA de primata, é contaminação do ser humano (arqueólogo ou técnico de laboratório) que o manipula? Apenas um em 600 bp é diferente entre o DNA de humanos e neandertais. O tamanho das leituras de uma amostra de osso de 40.000 anos é de 30-40 bp. As leituras são quase sempre idênticas para um humano e um Neandertal, por isso é difícil distingui-los.

Em um caso, 89 extratos de DNA foram selecionados para DNA de neandertais, mas apenas 6 ossos foram realmente sequenciados (requer falta de contaminação e uma quantidade alta o suficiente de DNA). O processo de recuperação do DNA requer perfuração abaixo da superfície do osso (para minimizar a contaminação) e coleta de amostras de dentro. Para os três ossos longos, foi possível obter menos de 1 grama de pó de osso. Em seguida, o DNA é sequenciado e alinhado com o genoma de um chimpanzé de referência. Ele é mapeado para um chimpanzé em vez de um humano específico porque o mapeamento para um humano pode causar distorção se você estiver procurando ver como a sequência se relaciona com subpopulações humanas específicas.

As descobertas mais bem-sucedidas foram em cavernas de calcário frio, onde é seco e frio e talvez um pouco básico. A melhor chance de preservação ocorre em áreas de permafrost. Muito pouco DNA é recuperável dos trópicos. Os trópicos têm um grande registro fóssil, mas o DNA é muito mais difícil de obter. Uma vez que a maioria dos ossos não produz DNA suficiente ou bom, os cientistas têm as amostras da tela repetidamente até que finalmente encontrem um bom.

Remontando DNA Antigo

O DNA extraído de ossos de Neandertal tem leituras curtas, cerca de 37 pb em média. Existem muitos buracos devido a mutações causadas pela erosão do DNA pelo tempo. É difícil dizer se uma sequência é o resultado de contaminação porque humanos e neandertais diferem apenas em uma de mil bases. No entanto, podemos usar o dano ao DNA característico do DNA antigo para distinguir o DNA antigo do novo. O DNA antigo tem tendência para erros de C para T e G para A. O erro C para T é de longe o mais comum e é visto cerca de 2% das vezes. Com o tempo, um grupo metil é eliminado de um C, o que faz com que ele se pareça com U. Quando o PCR é usado para amplificar o DNA para sequenciamento, a polimerase vê um U e o repara em T. Para combater esse erro , os cientistas usam uma enzima especial que reconhece o U e corta a fita em vez de substituí-la por um T. Isso ajuda a identificar esses locais. As mutações G para A são o resultado de ver isso na fita oposta.

O tamanho médio do fragmento é bastante pequeno e a taxa de erro ainda é de 0,1% - 0,3%. Uma forma de combater as mutações é observar que em um fragmento de fita dupla, o DNA é desgastado nas extremidades, onde se torna de fita simples por cerca de 10 bp. Tende a haver altas taxas de mutações nas primeiras e últimas 10 bases, mas DNA de alta qualidade em outros lugares, ou seja, mais mutações C para T no início e G para A no final. Em chimpanzés, as mutações mais comuns são as transições (purina para purina, pirimidina para pirimidina) e as transversões são muito mais raras. O mesmo vale para os humanos. Uma vez que as mutações de G para A e C para T são transições, pode ser determinado que há cerca de 4x mais mutações no antigo DNA de Neandertal do que se fosse recente, observando o número de transições vistas em comparação com o número de transversões vistas (por comparação de Neandertal com DNA humano). As conversões têm uma taxa de ocorrência bastante estável, de modo que essa proporção ajuda a determinar quanto erro ocorreu por meio de mutações C para T.

Agora somos capazes de reduzir a contaminação humana do DNA do artefato para cerca de ( text {i} 1 \% ). Quando o DNA é trazido, assim que é removido do osso, ele recebe um código de barras com uma etiqueta de 7 bp. Essa etiqueta permite evitar a contaminação em qualquer ponto posterior do experimento, mas não antes. A extração também é feita em sala limpa com luz ultravioleta, após lavagem do osso. O DNA mitocondrial é útil para distinguir qual porcentagem da amostra está contaminada com DNA humano. O DNA mitocondrial é preenchido com locais de eventos característicos porque humanos e neandertais são reciprocamente monofilogenéticos. A contaminação pode ser medida contando a proporção desses locais. No DNA do Neandertal, a contaminação estava presente, mas era ( text {¡} 0,5 \% ).

No sequenciamento, a taxa de erro é quase sempre maior do que a taxa de polimorfismo. Portanto, a maioria dos sites na sequência que são diferentes dos humanos são causados ​​por erros de sequenciamento. Portanto, não podemos aprender exatamente sobre a biologia do Neandertal por meio da sequência gerada, mas podemos analisar SNPs específicos, desde que saibamos para onde olhar. A probabilidade de um determinado SNP ser alterado devido a um erro no sequenciamento é de apenas ( frac {1} {300} ) para 11000, portanto, dados utilizáveis ​​ainda podem ser obtidos.

Depois de alinhar o chimpanzé, o Neandertal e as sequências humanas modernas, podemos medir a distância dos Neandertais aos humanos e chimpanzés. Esta distância é apenas cerca de 12,7% da sequência de referência humana. Uma amostra francesa mede cerca de 8% de distância da sequência de referência e uma bosquímano cerca de 10,3%. O que isso diz é que o DNA do Neandertal está dentro de nossa faixa de variação como espécie.


4squareviews

Este processo é onde as atividades fornecidas na lista de atividades, a saída do processo anterior 6.2 Definir Atividades, são analisadas para ver quais delas devem logicamente vir antes das outras. Existem três técnicas básicas, o método de diagramação de precedência (PDM), determinação e integração de dependências e adição de oportunidades e atrasos entre as atividades, conforme necessário. A ferramenta básica desse processo é o Sistema de Informação de Gerenciamento de Projetos ou PMIS (como o Microsoft Project).

6.3.2 Sequenciar Atividades: Ferramentas e Técnicas

6.3.2.1 Método de Diagrama de Precedência (PDM)

O método de diagramação de precedência representa atividades por caixas chamadas de nós. Se uma determinada atividade vem logicamente antes de outra atividade da qual depende, isso é chamado de atividade predecessora. E, inversamente, se uma determinada atividade vier logicamente após outra atividade em um cronograma, isso é chamado de atividade sucessora. É a próxima técnica, Determinação e integração de dependência, que pode ajudar a determinar quais atividades estão conectadas logicamente dessa maneira.

Esta é a & # 8220precedência & # 8221 parte do método. A seguir, vem a parte da diagramação, onde as atividades são representadas por caixas retangulares chamadas de nós. Esses nós são então vinculados dependendo do tipo de dependência ou relacionamento lógico entre eles.

Existem quatro tipos de relacionamentos lógicos entre uma atividade predecessora e uma atividade sucessora. Dois são relacionamentos em série, em que as atividades são realizadas uma após a outra. Dois são relacionamentos paralelos, em que as atividades se sobrepõem parcialmente no tempo.

Com as quatro designações a seguir que consistem nas duas letras & # 8220F & # 8221 (para & # 8220finish & # 8221) e & # 8220S & # 8221 (para & # 8220start & # 8221), a primeira letra se refere à atividade predecessora e a segunda letra refere-se à atividade sucessora.

  • Término para iniciar (FS) & # 8211 este é o tipo mais comum de relacionamento lógico, em que uma atividade sucessora não pode ser iniciada até que a atividade predecessora seja concluída.
  • Do término ao término (FF) & # 8211 este é o próximo tipo mais comum de relacionamento lógico, em que uma atividade sucessora não pode terminar até que a atividade predecessora termine. No entanto, as atividades podem se sobrepor no tempo. O exemplo usado no Guia PMBOK® é onde você deve terminar de escrever um documento (a atividade predecessora) antes de terminar de editá-lo (a atividade sucessora). No entanto, depois de escrever algumas páginas do documento, você pode começar a editar essas páginas antes de continuar a escrever o resto do documento, de forma que a escrita e a edição de um documento possam ocorrer sobrepondo-se no tempo.
  • Start-to-start (SS) & # 8211este é o próximo tipo mais comum de relacionamento lógico, em que uma atividade sucessora não pode ser iniciada até que a atividade predecessora seja iniciada. O exemplo usado no Guia PMBOK®, a atividade de nivelamento do concreto (a atividade sucessora) não pode começar até que a fundação (atividade sucessora) comece. Embora você possa começar a nivelar o concreto que já foi despejado em uma seção da fundação enquanto outra seção da fundação está sendo despejada, você não pode nivelar o concreto antes de ser despejado.
  • Início ao fim (SF) & # 8211 este é o tipo menos comum de relacionamento lógico, em que uma atividade sucessora não pode ser iniciada até que a atividade predecessora seja iniciada. Isso é muito raramente usado, embora o exemplo usado no Guia PMBOK® seja que um novo sistema de contas a pagar (atividade sucessora) deve ser inicializado com sucesso antes que o antigo sistema de contas a pagar seja encerrado (atividade predecessora).

6.3.2.2 Determinação e integração de dependência

As dependências entre atividades podem ser caracterizadas por certos atributos, alguns dos quais são mutuamente exclusivos. As dependências podem ser a) obrigatórias ou discricionárias eb) externas ou internas.

  • Dependências obrigatórias & # 8211dependências legal ou contratualmente exigidas ou inerentes à natureza do trabalho.
  • Dependências discricionárias & # 8211dependências estabelecidas por meio de práticas recomendadas gerais em uma área de aplicativo específica.

As dependências discricionárias não estão & # 8220 definidas na pedra & # 8221 como as dependências obrigatórias. Isso é importante porque eles podem ser modificados se necessário, enquanto as dependências obrigatórias não podem ser modificadas.

Aqui está o outro conjunto de atributos mutuamente exclusivos.

  • Dependências externas & # 8211dependências que geralmente estão fora do controle de uma equipe de projeto & # 8217s
  • Dependências internas & # 8211dependências que geralmente estão dentro de uma equipe de projeto & # 8217s controle

Essas dependências internas que estão dentro do controle de uma equipe de projeto & # 8217s são, portanto, mais facilmente modificadas, se necessário, em comparação com as dependências externas.

Um lead é a quantidade de tempo que uma atividade sucessora pode ser avançada em relação a uma atividade predecessora. Uma antecipação de duas semanas para uma atividade sucessora significaria que ela poderia ser iniciada duas semanas antes da conclusão da atividade predecessora.

Um atraso é a quantidade de tempo que uma atividade sucessora pode ser atrasada em relação a uma atividade predecessora. Um atraso de duas semanas para uma atividade sucessora significaria que ela só poderia ser iniciada duas semanas após a conclusão da atividade predecessora.

Se desejar ver um exemplo de questão de exame envolvendo o método de diagramação de precedência, incluindo leads e atrasos, você pode ir para a seguinte postagem que fiz ao revisar a 5ª edição do Guia PMBOK®.

6.3.2.4 Sistema de Informação de Gerenciamento de Projetos (PMIS)

Este é o software de agendamento que você usa para ajudar a sequenciar as atividades (como o Microsoft Project ou Primavera).


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Novas ferramentas para manipular a biologia

A enzima ânion-π consiste em um cofator de areno pobre em elétrons (representação em bastão cinza) embutido em uma proteína (exibida como superfície)

A química forneceu muitas ferramentas e técnicas essenciais para a comunidade biológica nos últimos vinte anos. Agora podemos fazer proteínas nas quais a Mãe Natureza nunca pensou, criar imagens de partes únicas de células vivas e até mesmo ver células em animais vivos. Esta semana na ACS Central Science, três grupos de pesquisa independentes da Universidade de Genebra (UNIGE) e um da Universidade de Basel (UNIBAS) levam essas realizações um passo adiante, relatando avanços em como as proteínas são feitas e como você pode ver seus padrões de expressão em animais vivos.

As proteínas são os cavalos de batalha de cada célula. Eles são feitos de blocos de construção chamados aminoácidos que são ligados e se dobram em máquinas funcionais para alimentar todos os principais processos celulares. Para fazer essas tarefas, a natureza depende de vinte desses blocos, juntamente com alguns "cofatores" especiais, geralmente vitaminas. No entanto, os químicos descobriram maneiras inteligentes de expandir o repertório de uma proteína, criando aminoácidos ou cofatores diferentes do que você encontraria na biologia natural. Stefan Matile, Thomas Ward e colegas de trabalho desenvolveram um novo cofator que reverte uma interação de proteína clássica chamada cátion-Π, significando a estabilização de uma carga positiva em um plano molecular rico em elétrons. A natureza usa essas interações cátion-Π para preparar moléculas tão importantes quanto esteróides, hormônios, vitaminas, pigmentos visuais ou fragrâncias, para transduzir sinais no cérebro, reconhecer antígenos e assim por diante. Usando seu novo cofator e a proteína artificial resultante, os grupos de Matile e Ward colaboraram para criar a primeira enzima "ânion-Π", onde aquele plano molecular rico em elétrons é substituído por um plano pobre em elétrons para estabilizar um negativo em vez de um positivo carga durante uma transformação molecular. Em um tubo de ensaio, as proteínas com esta funcionalidade inédita na natureza foram capazes de superar os catalisadores orgânicos tradicionais em uma reação de adição importante, mas desfavorecida, com alta especificidade e seletividade. Eles acreditam que sua abordagem pode ser movida para funcionar em células e pode ajudar a tornar realidade outras transformações químicas atualmente impossíveis.

Enquanto isso, Nicolas Winssinger e seu laboratório reconheceram a oportunidade de usar reações químicas para visualizar mRNA em animais vivos. Todas as proteínas vêm do mRNA, portanto, embora o DNA seja o projeto da vida, os mRNAs fornecem as ordens de trabalho que são posteriormente reguladas por microRNAs. Ser capaz de ver isso pode dizer muito sobre o que está acontecendo com células e animais em tempo real. No entanto, existem poucas ferramentas que atualmente permitem que você veja o RNA em animais vivos, e as que existem geralmente dependem de estratégias genéticas complicadas. As equipes de Winssinger e Gonzalez-Gaitan projetaram uma reação-modelo que produz marcadores fluorescentes para RNAs específicos de interesse. Sua química é tão suave que funciona em embriões de peixe-zebra vivos sem perturbá-los e, como não requer organismos geneticamente modificados, pode ser rapidamente adaptada para outros sistemas. Finalmente, eles postulam que seu método poderia ser expandido para teragnósticos, onde você poderia simultaneamente ver e direcionar tratamentos para a localização da base molecular da doença.


Assista o vídeo: Biología - Qué técnicas moleculares se utilizan para la extracción de ADN en insectos bibliófagos? (Dezembro 2021).