Em formação

Por que a cadeia leve do anticorpo é essencial para a função?


Os humanos e a maioria dos outros mamíferos produzem anticorpos que consistem em duas cadeias pesadas, cada uma ligada a uma cadeia leve. Ambas as cadeias pesada e leve contribuem para a região variável e, portanto, a especificidade do antígeno do anticorpo.

Em contraste, peixes cartilaginosos e camelídeos foram encontrados para produzir anticorpos apenas de cadeia pesada e, graças ao seu pequeno tamanho e facilidade de síntese, os anticorpos de camelídeos (nanocorpos) devem revolucionar a terapêutica de anticorpos.

Isso me faz pensar: por que isso não é possível com anticorpos humanos (geneticamente modificados)? Além do fato de que a remoção da cadeia leve alteraria a especificidade do antígeno, o que impede um anticorpo humano apenas de cadeia pesada de ser funcional? O que é tão fundamentalmente diferente entre a cadeia pesada dos camelídeos (e sua região variável) e o equivalente humano?


Suspeito que tenha a ver com o fato de que, uma vez que os scAbs de camelídeos são expressos in vivo, eles passam pelo processo normal de recombinação e maturação de afinidade como regiões variáveis ​​individuais. Assim, pode-se facilmente isolar mRNAs de scAb de alta afinidade do sangue de um camelídeo adequadamente imunizado e prosseguir com a clonagem e produção.

As cadeias pesadas humanas passam por seleção de afinidade enquanto emparelhadas com cadeias leves e, portanto, os processos in vivo não funcionariam para gerar cadeias pesadas que por conta própria se ligam bem ao antígeno determinado. Suponho que alguém possa gerar uma biblioteca de exibição apenas com genes de cadeia pesada, mas em uma complexidade de biblioteca típica de 10 ^ 7 você não seria capaz de cobrir tanto do "espaço de conformação" como com um processo de maturação de afinidade de cadeia única in vivo .

PS - a parte sobre "revolucionar a terapêutica com anticorpos" parece um exagero de marketing para uma ideia de mais de 20 anos.


Estrutura da molécula de anticorpo (com diagrama)

O anticorpo é um tipo de molécula de proteína produzida pelos linfócitos B em resposta a patógenos. As células T não secretam anticorpos diretamente, no entanto, ajudam as células B a produzi-los. Cada molécula de anticorpo possui quatro cadeias de peptídeos.

Das quatro cadeias estão:

(i) Duas pequenas cadeias chamadas cadeias leves (L).

(ii) Duas grandes cadeias chamadas cadeias pesadas (H).

Um anticorpo é representado como H2eu2 molécula. Em nosso corpo, diferentes tipos de anticorpos são produzidos, como IgA, IgM, IgE, IgG.

A resposta por meio de anticorpos também é chamada de resposta imune humoral. Esses anticorpos são encontrados no sangue.

1. A maioria das classes de prevenção de anticorpos 75-80% do anticorpo total.

2. Protege contra fungos, bactérias, toxinas, etc.

3. Pode atravessar a placenta da mãe para o filho e fornecer proteção imunológica ao recém-nascido.

4. Responsável pelos fatores de UR no sangue.

1. Terceiro anticorpo mais comum. Constitui 5-10% do total de anticorpos.

2. Eles devem ser produzidos primeiro em respostas ao encontro com um patógeno.

3. Responsável pela reação de transfusão de sangue no sistema de sangue ABO.

1. O segundo mais previne anticorpos.

2. É 15% do total de anticorpos.

3. Secretado por partes revestidas por sistema mucoso.

4. Encontrado nas secreções do nariz, olhos, pulmões e trato digestivo, saliva, lágrimas, etc.

5. Também encontrado no colostro, ou seja, leite materno para proteção imunológica de recém-nascidos.

1. O anticorpo menos comum.

2. Representa apenas 0,002% do total de anticorpos e está envolvida em reações alérgicas.


Resumo

  1. Existem 5 classes ou isotipos de anticorpos humanos ou imunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
  2. Os anticorpos mais simples, como IgG, IgD e IgE, são macromoléculas em forma de "Y" chamadas monômeros e são compostas por quatro cadeias de glicoproteínas: duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas.
  3. As duas pontas do monômero "Y" são referidas como fragmentos de ligação ao antígeno ou porções Fab do anticorpo e essas porções fornecem especificidade para a ligação de um epítopo em um antígeno.
  4. No início de seu desenvolvimento, cada linfócito B torna-se geneticamente programado por meio de uma série de reações de splicing de genes para produzir um Fab com uma forma tridimensional única capaz de ajustar algum epítopo com uma forma correspondente.
  5. A porção Fc só se torna biologicamente ativa após o componente Fab ter se ligado ao seu antígeno correspondente. As atividades biológicas incluem a ativação das vias do complemento e a ligação a receptores em fagócitos e outras células de defesa para promover imunidade adaptativa.
  6. IgM é um pentâmero, consistindo de 5 monômeros unidos em suas porções Fc.
  7. IgA é um dímero, consistindo de 2 monômeros unidos em suas porções Fc.

3-1. Os anticorpos IgG consistem em quatro cadeias polipeptídicas

Os anticorpos IgG são moléculas grandes, com peso molecular de aproximadamente 150 kDa, compostas por dois tipos diferentes de cadeias polipeptídicas. Um, de aproximadamente 50 kDa, é denominado o pesado ou Corrente H, e o outro, de 25 kDa, é denominado o luz ou cadeia L (Fig. 3.2). Cada molécula de IgG consiste em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. As duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por ligações dissulfeto e cada cadeia pesada está ligada a uma cadeia leve por uma ligação dissulfeto. Em qualquer molécula de imunoglobulina, as duas cadeias pesadas e as duas cadeias leves são idênticas, dando a uma molécula de anticorpo dois locais de ligação ao antígeno idênticos (ver Fig. 3.1) e, portanto, a capacidade de se ligar simultaneamente a duas estruturas idênticas.

Figura 3.2

As moléculas de imunoglobulina são compostas por dois tipos de cadeia protéica: cadeias pesadas e cadeias leves. Cada molécula de imunoglobulina é composta por duas cadeias pesadas (verde) e duas cadeias leves (amarela) unidas por ligações dissulfeto de modo que cada cadeia pesada seja (mais).

Dois tipos de cadeia leve, denominados lambda (& # x003bb) e kappa (& # x003ba), são encontrados em anticorpos. Uma determinada imunoglobulina tem cadeias & # x003ba ou cadeias & # x003bb, nunca uma de cada. Nenhuma diferença funcional foi encontrada entre os anticorpos com cadeias leves & # x003bb ou & # x003ba, e qualquer tipo de cadeia leve pode ser encontrado em anticorpos de qualquer uma das cinco classes principais. A proporção dos dois tipos de cadeia leve varia de espécie para espécie. Em camundongos, a proporção média de & # x003ba para & # x003bb é de 20: 1, enquanto em humanos é de 2: 1 e em bovinos é de 1:20. A razão para esta variação é desconhecida. Distorções dessa proporção podem às vezes ser usadas para detectar a proliferação anormal de um clone de células B. Todos eles expressariam a cadeia leve idêntica e, portanto, um excesso de cadeias leves & # x003bb em uma pessoa pode indicar a presença de um tumor de células B produzindo cadeias & # x003bb.

Em contraste, a classe e, portanto, a função efetora de um anticorpo é definida pela estrutura de sua cadeia pesada. Existem cinco principais classes de cadeia pesada ou isotipos, alguns dos quais têm vários subtipos, e estes determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo. As cinco classes principais de imunoglobulinas são imunoglobulina M (IgM), imunoglobulina D (IgD), imunoglobulina G (IgG), imunoglobulina A (IgA) e imunoglobulina E (IgE). Suas cadeias pesadas são denotadas pela letra grega minúscula correspondente (& # x003bc, & # x003b4, & # x003b3, & # x003b1 e & # x003b5, respectivamente). IgG é de longe a imunoglobulina mais abundante e tem várias subclasses (IgG1, 2, 3 e 4 em humanos). Suas propriedades funcionais distintas são conferidas pela parte carboxi-terminal da cadeia pesada, onde não está associada à cadeia leve. Descreveremos a estrutura e funções dos diferentes isotipos de cadeia pesada no Capítulo 4. As características estruturais gerais de todos os isotipos são semelhantes e consideraremos IgG, o isótipo mais abundante no plasma, como uma molécula de anticorpo típica.


Função de anticorpos (imunoglobulinas)

A função do anticorpo (Ab) refere-se ao efeito biológico que o anticorpo tem sobre um patógeno ou sua toxina.

Além de se ligarem a um antígeno (Ag), os anticorpos participam de várias atividades biológicas. Embora eles não matem ou removam os patógenos unicamente pela ligação com eles, eles podem iniciar respostas que resultarão na remova do antígeno ou na morte do patógeno. A região variável do anticorpo está envolvida na ligação ao antígeno, a região constante da cadeia pesada (CH) é responsável por várias interações colaborativas com tecidos, células ou proteínas que resultam na função efetora da imunidade humoral.

Lembre-se de que "nem todas as classes de imunoglobulina têm as mesmas funções".

  1. Neutralização da infecciosidade ,,
  2. Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC),
  3. Lise mediada pelo complemento de patógenos ou de células infectadas: os anticorpos ativam o sistema do complemento para destruir células bacterianas por lise
  4. Transcitose, imunidade mucosa e imunidade neonatal

Outra função é exclusiva da Imunoglobulina E (IgE), que é ‘Ativação de mastócitos, eosinófilos e basófilos’.

Neutralização da infecciosidade ou toxinas

Os anticorpos são secretados no sangue e na mucosa, onde podem bloquear a infecciosidade de patógenos (bactérias, vírus, parasitas e fungos), inativar ou neutralizar substâncias estranhas a essas toxinas. A neutralização geralmente ocorre como resultado da interferência na fixação de um organismo aos tecidos do hospedeiro.

Foi demonstrado que alguns anticorpos inibem a infecciosidade ligando-se a organismos e causando sua agregação. A agregação ou aglutinação por IgA pode permitir o aprisionamento mais eficiente de bactérias na mucosa e a eliminação subsequente por peristaltismo. Embora a agregação seja mais provável de ocorrer com IgA e IgM poliméricos, alguns anticorpos IgG neutralizantes podem agregar o vírus da poliomielite e reduzir a infecciosidade. Da mesma forma, os anticorpos contra a gp120 do HIV-1 interferem na ligação da gp120 ao CD4.

Fagocitose

Os anticorpos facilitam a fagocitose de substâncias estranhas por um processo denominado opsonização. A internalização e degradação de patógenos revestidos de anticorpos por macrófagos e neutrófilos via FcRs (Receptores Fc são moléculas de proteínas presentes nas superfícies de macrófagos e neutrófilos que podem se ligar à região constante das moléculas de imunoglobulina) é uma função crítica do anticorpo para a eliminação de patógenos na Vivo.

A ligação de receptores Fc de fagócitos com várias moléculas de anticorpo complexadas com o mesmo alvo inicia uma via de transdução de sinal que resulta na fagocitose do complexo antígeno-anticorpo. Dentro do fagócito, o patógeno se torna o alvo de vários processos destrutivos que incluem dano oxidativo, digestão enzimática, efeitos de desregulação da membrana de peptídeos antibacterianos, etc.

Lise mediada por complemento de patógenos ou de células infectadas

Os anticorpos (IgM e a maioria das subclasses de IgG) ativam o sistema do complemento, o que pode resultar na lise de organismos ou de células infectadas. Um importante subproduto da cascata do complemento é o C3b, que é um fragmento de proteína que pode se ligar de forma não específica à célula e aos complexos Ag-Ab. Muitos tipos de células, por exemplo, glóbulos vermelhos ou macrófagos têm receptores para C3b e assim ligam células ou complexos aos quais C3b aderiu.

A ligação de complexos Ag-Ab pelos receptores C3b de uma RBC permite que ela entregue os complexos ao fígado ou baço, onde os macrófagos residentes os removem sem destruir os glóbulos vermelhos. Além disso, organismos ou complexos Ag-Ab ligados pelo complemento podem ser internalizados por células fagocíticas, com a eliminação resultante. A internalização por meio de receptores de complemento em células apresentadoras de antígeno (APCs) também pode resultar no processamento do antígeno para apresentação aos linfócitos T.

Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC)

Os anticorpos mostraram atividade antimicrobiana diretamente ou por meio de interações com FcRs ou complemento. ADCC ocorre quando o anticorpo forma uma ponte entre uma célula alvo infectada (células infectadas com vírus do hospedeiro) e uma célula efetora portadora de FcR, particularmente células assassinas naturais (NK). O resultado dessa interação de três vias é a morte da célula-alvo, seja por lise ou apoptose.

Tanscitose, imunidade mucosa e imunidade neonatal

Alguns anticorpos podem se mover através das camadas epiteliais (depende da propriedade da região constante dessa molécula de anticorpo) por meio de um processo chamado transcitose. IgA é a principal imunoglobulina que sofre transcitose e está disponível na forma secretora (sIgA) nas superfícies mucosas dos tratos respiratório, gastrointestinal e urogenital.

Em espécies de mamíferos, incluindo humanos, a maioria das subclasses de IgG pode cruzar a barreira placentária (uma vez que o sistema circulatório materno e fetal são separados) conferindo assim uma amostra do repertório de anticorpos da mãe ao feto em desenvolvimento como um dote protetor contra patógenos. Esse imunização passiva de desenvolvimento do feto ocorre durante o terceiro trimestre de gestação.


Parte 2: Fragmentos de Anticorpos Incomuns: Os Nanocorpos Camelídeos

00: 00: 0724 Meu nome é Hidde Ploegh.
00: 00: 0824 Sou um Investigador Sênior no Hospital Infantil de Boston no programa de Medicina Celular e Molecular.
00: 00: 1519 E nesta parte da minha apresentação, discutirei alguns trabalhos mais recentes que descrevem
00: 00: 2205 esforços para aproveitar características incomuns de anticorpos produzidos por camelídeos.
00: 00: 3001 Por que isso seria interessante?
00: 00: 3407 Estes são os animais com os quais trabalhamos.
00: 00: 3606 Estas são duas alpacas juvenis, Bryson e Sanchez.
00: 00: 4011 E a razão pela qual esses animais atraíram minha atenção foi gerada por uma palestra que
00: 00: 4507 Eu participei, na qual fui mal atribuído à seção errada.
00: 00: 4813 E é a primeira vez que ouço falar sobre as propriedades incomuns de anticorpos produzidos por espécies de camelídeos,
00: 00: 5322 e isso inclui alpacas, lhamas, guanacos, vicunhas, camelos, dromedários -
00: 01: 0005 todos os camelídeos compartilhavam esta característica única.
00: 01: 0401 O que estou falando é do fato de que, ao contrário das espécies mamíferas típicas, que exclusivamente
00: 01: 0905 produzem anticorpos compostos por cadeias pesadas e cadeias leves, os camelídeos também produzem,
00: 01: 1501 além das formas tradicionais, anticorpos apenas de cadeia pesada.
00: 01: 1816 E isso é relevante porque, para muitas aplicações, o tamanho de um anticorpo de tamanho normal
00: 01: 2520 é incompatível com alguns dos aplicativos que procuramos para eles.
00: 01: 3002 E é por esta razão que tentamos reduzir as moléculas de anticorpo intactas à unidade mínima
00: 01: 3517 que pode reconhecer o antígeno.
00: 01: 3724 Como discutido na apresentação anterior, isso pode ser feito por digestão proteolítica.
00: 01: 4411 Usando papaína, podemos produzir os chamados fragmentos Fab compostos de regiões variáveis
00: 01: 4905 da cadeia pesada e da cadeia leve e um de seus domínios constantes, respectivamente.
00: 01: 5405 Estes retêm propriedades de ligação ao antígeno, mas requer um esforço considerável para
00: 01: 5903 produzi-los de maneira adequada.
00: 02: 0123 Seu amigo, o biólogo molecular, pode ajudá-lo a reduzir ainda mais esses fragmentos Fab,
00: 02: 0610 para criar os chamados fragmentos Fv de cadeia única, em que as regiões variáveis ​​de
00: 02: 1111 a cadeia pesada e a cadeia leve são conectadas por um ligante.
00: 02: 1428 O problema que muitas vezes surge com a expressão desses fragmentos Fv de cadeia única é que
00: 02: 2012 eles não passaram pela via secretora de uma célula eucariótica e, consequentemente
00: 02: 2507 eles tendem a ser propensos à agregação e podem exigir uma otimização considerável antes que você acabe
00: 02: 3013 com um produto estável.
00: 02: 3302 Os anticorpos apenas de cadeia pesada produzidos pelos camelídeos não têm essas desvantagens porque
00: 02: 3805 você pode reduzir o módulo de reconhecimento para apenas a região variável da cadeia pesada.
00: 02: 4220 E ao contrário do que se aplica aos anticorpos tradicionais, todos os recursos de estrutura necessários
00: 02: 4814 para o reconhecimento específico do antígeno estão incorporados nas regiões variáveis ​​da cadeia pesada.
00: 02: 5409 Esses fragmentos são chamados de fragmentos VHH e também são comumente chamados de nanocorpos.
00: 03: 0106 Algumas das propriedades que tornam esses nanocorpos invulgarmente atraentes incluem o fato de que
00: 03: 0706 eles podem ser produzidos em bactérias em alto rendimento.
00: 03: 1012 Muitos deles não requerem nem glicosilação nem ligações dissulfeto para estabilidade.
00: 03: 1413 E seu tamanho pequeno permite aplicações para as quais mesmo Fvs de cadeia única seriam
00: 03: 1927 difícil para a tarefa.
00: 03: 2115 Então, como fazemos esses fragmentos de região variável de cadeia única?
00: 03: 2615 Nós praticamos o que é chamado de imunização multiplex, uma palavra chique para atacar até duas dúzias
00: 03: 3112 antígenos diferentes em um animal.
00: 03: 3327 E após repetidos reforços do animal para obter anticorpos de alta afinidade, isolamos
00: 03: 3925 linfócitos de sangue periférico.
00: 03: 4204 E usando primers projetados para amplificar exclusivamente as regiões variáveis ​​de
00: 03: 4624 esses anticorpos apenas de cadeia pesada, podemos criar uma coleção imortalizada dessas sequências VHH.
00: 03: 5503 Como identificar as sequências VHH de interesse?
00: 03: 5904 Isso é feito clonando-os em um vetor de exibição de fago, onde se pode selecionar o fago que expressa,
00: 04: 0703 como uma fusão da proteína P3, do revestimento do fago, um nanocorpo ou fragmento VHH.
00: 04: 1306 E realizando o que é chamado de reação de panning, por meio da imobilização do antígeno em um suporte sólido,
00: 04: 1816 podemos recuperar aquelas partículas de fago que expressam o nanocorpo de interesse,
00: 04: 2406 específico para o antígeno com o qual revestimos a placa.
00: 04: 2805 Então, embora possamos começar com animais imunizados com duas dúzias de antígenos diferentes,
00: 04: 3208, ao rastreá-los individualmente nessas placas revestidas com antígeno, acabamos com nanocorpos de
00: 04: 3812 especificidade definida e única, que podemos então produzir em bactérias em alto rendimento.
00: 04: 4411 Este é o meio convencional de rastrear os chamados nanocorpos.
00: 04: 4828 Mas consideramos também o fato de que esses nanocorpos não requerem glicosilação
00: 04: 5417 nem ligações dissulfeto, o que possibilita sua expressão no ambiente redutor do citosol.
00: 05: 0006 E isso nos permitiu realizar telas funcionais para selecionar nanocorpos que
00: 05: 0511 perturbar reações dentro do citoplasma de, no meu exemplo, uma célula de mamífero.
00: 05: 1024 Então, deixe-me dar um exemplo.
00: 05: 1210 Aproveitando o fato de que esses nanocorpos geralmente não requerem glicosilação nem ligações dissulfeto,
00: 05: 1818, desenvolvemos um procedimento de triagem que se baseia na expressão citoplasmática desses nanocorpos
00: 05: 2509 para impedir a infecção do vírus.
00: 05: 2820 Neste caso específico, pegamos um animal e o imunizamos com o vírus influenza interrompido
00: 05: 3403 e o vírus da estomatite vesicular, abreviado como IAV e VSV, respectivamente, nas lâminas seguintes.
00: 05: 4211 E após a imunização, e tendo extraído o RNA, em vez de clonar os produtos de PCR
00: 05: 4727 em um vetor de exibição de fago, conforme mostrado no slide anterior, clonamos esses
00: 05: 5228 produtos amplificados em um vetor lentiviral de modo que a expressão do nanocorpo esteja sob o controle
00: 05: 5806 de um promotor indutível da doxiciclina.
00: 06: 0114 Células transduzidas com um vetor lentiviral irão produzir o nanocorpo apenas quando
00: 06: 0600 devidamente exposto à doxiciclina.
00: 06: 0802 Então, transduzimos uma coleção de células de mamíferos com esses vetores lentivirais de modo que,
00: 06: 1409 em média, cada célula receberá uma única construção antiviral.
00: 06: 1825 Após a indução com doxiciclina, essa célula irá produzir o nanocorpo correspondente
00: 06: 2313 em seu citoplasma, e podemos então testar este nanocorpo quanto às suas propriedades funcionais.
00: 06: 2818 Ao expor os transducantes, como uma coleção inteira, a um desafio letal
00: 06: 3319 - neste caso, uma dose lítica do vírus da gripe ou do vírus da estomatite vesicular - podemos selecionar
00: 06: 3915 para os sobreviventes, a lógica subjacente é que qualquer nanocorpo que impeça um aspecto de
00: 06: 4420 o ciclo de replicação do vírus irá conferir uma vantagem de crescimento para essa célula.
00: 06: 4924 Podemos então pegar os sobreviventes e resgatar as sequências de VHH ou de nanocorpo, e então
00: 06: 5506 validá-los por meios independentes.
00: 06: 5722 Então, este é um exemplo de uma tela, onde testamos clones produtores de nanocorpo individuais
00: 07: 0605 na ausência e presença de indução de doxiciclina.
00: 07: 0911 Você verá duas barras para cada linha celular analisada.
00: 07: 1312 As barras abertas indicam a situação na ausência de indução de doxiciclina, e nós
00: 07: 1911 monitorar o estado infectado por meios independentes.
00: 07: 2122 E, como mostram as barras abertas, em toda a linha, na ausência de indução de doxiciclina,
00: 07: 2627 cada uma dessas transduções. os transdutantes são totalmente infecciosos pelo vírus influenza.
00: 07: 3221 Mas, como mostram as barras sólidas, existem vários clones, selecionados neste caso como
00: 07: 3723 protegendo contra a infecção da gripe. infecção, que reduziu drasticamente a capacidade do vírus
00: 07: 4227 para replicar.
00: 07: 4328 Quando testamos esses mesmos clones em resposta a uma infecção com o vírus da estomatite vesicular,
00: 07: 4900 clones que estão totalmente protegidos contra o vírus da gripe não respondem à infecção
00: 07: 5602 com VSV.
00: 07: 5711 Não importa se induzimos a expressão do nanocorpo
00: 08: 0014 a infecção com o vírus irrelevante prossegue normalmente.
00: 08: 0326 Podemos conduzir o experimento inverso, selecionando clones que impedem a replicação do VSV,
00: 08: 0905 e estes, por sua vez, deixam a replicação do vírus influenza un. intocado.
00: 08: 1404 Agora, uma das características atraentes dos nanocorpos, e esta é uma das razões pelas quais os biólogos estruturais
00: 08: 2005 têm se aquecido para eles, é o fato de que muitas vezes servem como acompanhantes de cristalização.
00: 08: 2524 Isso significa que para proteínas que muitas vezes são difíceis de cristalizar, a inclusão de
00: 08: 3020 um nanocorpo com a especificidade apropriada facilitará a cristalização.
00: 08: 3501 Isso, claro, tem a tremenda vantagem de identificar em resolução atômica
00: 08: 4003 exatamente o epítopo ao qual o nanocorpo em questão se liga.
00: 08: 4401 E isso foi feito por Florian Schmidt e Leo Hanke, dois alunos e pós-doutorandos em meu laboratório.
00: 08: 5027 Juntos resolveram a estrutura cristalina, neste caso, do alvo do anti-influenza
00: 08: 5814 nanocorpos que impedem a replicação em complexo com um nanocorpo representativo.
00: 09: 0603 Em vermelho e laranja estão indicadas as sequências na nucleoproteína da gripe que são responsáveis
00: 09: 1308 para interação com RNA - porque o vírus da gripe é um vírus de RNA de fita negativa -
00: 09: 1900 e em ouro o sinal de localização nuclear.
00: 09: 2204 E o que este experimento revela é que o nanocorpo se liga a uma área da proteína NP
00: 09: 2704 não implicado anteriormente como funcionalmente importante.
00: 09: 3017 Nesse sentido, ter este nanocorpo nos fornece um novo ângulo de ataque
00: 09: 3600 no ciclo de vida do vírus.
00: 09: 3701 Agora, se alguém perguntar, por qual mecanismo molecular esse nanocorpo poderia impedir a replicação do vírus ?,
00: 09: 4409 utilizamos uma estrutura publicada para a partícula de ribonucleoproteína viral.
00: 09: 5009 Este é um RNA viral em complexo com a nucleoproteína.
00: 09: 5413 A analogia pode ser de uma histona se ligando ao DNA.
00: 09: 5726 E o que descobrimos é que o nanocorpo, quando ligado à nucleoproteína, obstrui o
00: 10: 0304 sinal de localização nuclear em uma subunidade NP adjacente e, portanto, impede a importação do vírus
00: 10: 1027 partícula de ribonucleoproteína no núcleo, que é uma etapa essencial para a replicação da gripe.
00: 10: 1713 Experimentos semelhantes foram realizados para os nanocorpos inibidores de VSV.
00: 10: 2114 E, neste caso específico, descobrimos novamente que o nanocorpo se liga à proteína N,
00: 10: 2713 que é o equivalente conceitual da proteína NP no vírus da gripe.
00: 10: 3212 Os complexos de proteína N RNA, quase invisíveis aqui como este material vermelho encontrado entre
00: 10: 3806 os dois lóbulos da proteína N.
00: 10: 4019 A proteína N forma um anel decamérico.
00: 10: 4404 E na estrutura cristalina resolvida para o complexo entre a proteína N e o nanocorpo,
00: 10: 5004 encontramos a presença de dois desses anéis decaméricos, cada subunidade dos quais é coroada por
00: 10: 5502 um nanocorpo individual como parte da estrutura cristalina.
00: 10: 5816 Portanto, temos 40 subunidades para a unidade assimétrica.
00: 11: 0202 E esta é uma das maiores estruturas de proteína para a qual meu laboratório contribuiu.
00: 11: 0508 Isso foi feito junto com Tom Schwartz no MIT.
00: 11: 1002 Se perguntarmos agora, esta estrutura particular nos ajudaria a entender exatamente como o nanocorpo
00: 11: 1603 impede a replicação do vírus ?, a resposta é sim.
00: 11: 1908 Acontece que o nanocorpo se liga a um segmento da proteína N ao qual também se liga
00: 11: 2408 o cofator de polimerase P.
00: 11: 2709 Para que o genoma do VSV seja replicado,
00: 11: 2928 a polimerase deve interagir com o cofator P para permitir que a reação prossiga.
00: 11: 3514 E como observamos, o nanocorpo compete pela ligação com esta proteína P, portanto, de forma adequada
00: 11: 4018 explicando porque ele inibe a replicação do vírus.
00: 11: 4418 E o que não é mostrado neste slide é o fato de que, se agora criarmos vírus na presença
00: 11: 4900 deste nanocorpo em particular, podemos selecionar prontamente as variantes de escape que não
00: 11: 5404 são suscetíveis à inibição por este nanocorpo.
00: 11: 5714 E como você pode esperar, as mutações responsáveis ​​por essas variantes de escape mapeiam exatamente
00: 12: 0214 ao local ao qual o nanocorpo se liga sem afetar a ligação do cofator P.
00: 12: 0808 Então temos aqui um ciclo completo, no qual podemos imunizar um animal com alguma preparação antigênica,
00: 12: 1506 conduzir uma triagem fenotípica, identificar o epítopo reconhecido na resolução atômica,
00: 12: 2023 e, em seguida, use um experimento biológico in vivo para validar essas conclusões, selecionando
00: 12: 2517 para variantes de escape.
00: 12: 2817 Um segundo exemplo que explora a capacidade dos nanocorpos de funcionar no citoplasma
00: 12: 3420 de uma célula de mamífero refere-se a nanocorpos que fizemos contra o componente
00: 12: 3926 de uma estrutura altamente complexa que chamamos de inflamassoma.
00: 12: 4314 E sem entrar em detalhes desnecessários, os inflamassomas são conjuntos supramoleculares
00: 12: 4906 necessária para um aspecto particular da imunidade inata.
00: 12: 5225 Quando um inflamassoma detecta um componente microbiano, ele oligomeriza e faz uso de
00: 13: 0009 uma série de adaptadores para recrutar um grande número de uma enzima chamada pró-caspase-1.
00: 13: 0615 Uma vez que este inflamassoma esteja devidamente montado, ele leva à ativação da pró-caspase-1,
00: 13: 1306 e isso, por sua vez, permite a conversão de uma citocina chamada pró-IL-1 em sua contraparte ativa,
00: 13: 1926 IL-1.
00: 13: 2026 Este é um aspecto fundamental da inflamação.
00: 13: 2322 Acontece que os inflamassomas ocorrem em muitas manifestações moleculares, duas das quais
00: 13: 2904 são mostrados aqui.
00: 13: 3004 À esquerda, o inflamassoma NLRP3, composto por repetições ricas em leucina
00: 13: 3506 - essas são essas estruturas repetitivas mostradas no topo
00: 13: 3828 um domínio de pirina por meio do qual recruta o adaptador ASC
00: 13: 4218 e a própria proteína ASC tem ainda outro domínio de interação proteína-proteína chamado
00: 13: 4612 uma ativação de caspase e domínio de recrutamento por meio do qual, como o nome sugere,
00: 13: 5104 caspase é recrutada.
00: 13: 5321 Esses inflamassomas ocorrem em muitos sabores diferentes.
00: 13: 5608 Um segundo, não o único que existe, é o NAI.
00: 14: 0205 NAIP ou inflamassoma NLRC4, onde o envolvimento do adaptador ASC foi considerado em debate.
00: 14: 1222 Então, criamos nanocorpos contra a proteína ASC, descobrimos que esses anticorpos poderiam de fato
00: 14: 2017 impedem a liberação adequada de interleucina-1, sugerindo que de fato tínhamos um anticorpo inibitório,
00: 14: 2806 e novamente, explorando o fato de que os nanocorpos servem como acompanhantes de cristalização,
00: 14: 3404 tivemos a sorte de ser capaz de determinar exatamente como este nanocorpo em particular se liga a
00: 14: 3823 sua contra-estrutura, o domínio CARD da proteína ASC.
00: 14: 4304 O que é digno de nota neste caso particular é que o nanocorpo se liga ao seu alvo
00: 14: 4808 não por meio da região determinante de complementaridade 3, que na maioria das vezes é a principal contribuição
00: 14: 5307 à ligação ao antígeno, mas com uma contribuição muito importante de CDR2 para mediar a interação específica
00: 14: 5923 com o domínio CARD.
00: 15: 0106 E este foi um trabalho realizado em colaboração com Hao Wu no Hospital Infantil de Boston.
00: 15: 0608 Agora, ter um nanocorpo que se liga a esta proteína ASC nos permite fazer uma variedade de
00: 15: 1322 experimentos diferentes.
00: 15: 1505 E um desses experimentos envolve a construção de um sensor que pode informar sobre a montagem
00: 15: 2112 de monômeros inflamassoma e monômeros ASC nas estruturas poliméricas que são um pré-requisito
00: 15: 2718 para ativação.
00: 15: 3006 Ao fundir nosso nanocorpo específico para ASC à proteína fluorescente verde, pela primeira vez
00: 15: 3722 podemos olhar para a distribuição desta proteína ASC em abundância natural.
00: 15: 4122 Uma das complicações do estudo do inflamassoma é que a superexpressão de componentes individuais
00: 15: 4725 pode levar à arte. ativação artefatual e prematura.
00: 15: 5113 E o que gostaríamos de saber é como é o comportamento desses componentes
00: 15: 5526 em condições de abundância natural.
00: 15: 5803 Então, neste caso específico, pegamos uma linha de células humanas monocíticas capaz de sustentar a ativação de NLRP3,
00: 16: 0625, apresentamos o repórter composto pelo nanocorpo específico de ASC fundido a GFP,
00: 16: 1215 e na ausência de estimulação aberta, procuramos a distribuição da proteína ASC
00: 16: 1720 em virtude do fato de que é direcionado por nosso construto de fusão nanocorpo-GFP.
00: 16: 2306 E o que você vê na ausência de qualquer ativação aberta é esta distribuição difusa
00: 16: 2817 da proteína ASC.
00: 16: 3016 Se agora expormos essas mesmas células a gatilhos de inflamassoma, podemos começar a ver
00: 16: 3509 o início da polimerização.
00: 16: 3620 Vemos a formação desses filamentos.
00: 16: 3928 A montagem do inflamassoma não prossegue até a finalização, o que explica
00: 16: 4412 o efeito inibitório deste nanocorpo em particular, mas dá um exemplo de como podemos
00: 16: 4914 usam nanocorpos para relatar, em células vivas, fenômenos que de outra forma seriam muito difíceis
00: 16: 5610 para estudar.
00: 16: 5821 Outro aplicativo importante em que estamos interessados ​​há muito tempo é usar
00: 17: 0302 fragmentos de anticorpo de domínio único ou nanocorpos para fins de imagem.
00: 17: 0718 Se você deseja desenvolver um reagente do tipo anticorpo para imagem, ele precisa atender
00: 17: 1123 um determinado conjunto de critérios.
00: 17: 1408 Ele precisa ser rotulado para que possamos detectar o produto rotulado.
00: 17: 1728 Ele precisa ser removido da circulação rapidamente para atingir a relação sinal-ruído adequada.
00: 17: 2323 E precisa alcançar uma penetração adequada no tecido.
00: 17: 2616 E é aqui que seu tamanho pequeno se torna uma característica distintiva chave em comparação
00: 17: 3113 com anticorpos de tamanho normal.
00: 17: 3400 Os anticorpos de tamanho normal têm cerca de 150 kiloDaltons de massa molecular.
00: 17: 3824 Os fragmentos de nanocorpo com os quais trabalhamos têm aproximadamente um décimo do tamanho.
00: 17: 4216 E isso explica sua penetração superior nos tecidos, sua depuração acelerada
00: 17: 4707 da circulação e, portanto, pensamos que esses seriam os agentes ideais para fins de imagem.
00: 17: 5204 Agora, a fim de rotular um fragmento de anticorpo, ou qualquer proteína nesse sentido, você deseja
00: 17: 5820 evitar danos colaterais.
00: 18: 0120 A maioria dos procedimentos de rotulagem de produtos químicos comumente usados ​​envolve o risco de modificação
00: 18: 0717 de resíduos importantes para a função dessa proteína.
00: 18: 1000 E assim, no projeto de nossos agentes de imagem, desejamos evitar a introdução de
00: 18: 1517 qualquer dano químico à proteína de interesse.
00: 18: 1822 Então, para conseguir isso, usamos o que é chamado de reação de sortase.
00: 18: 2410 A enzima sortase é uma transacilase que reconhece uma sequência curta de peptídeo
00: 18: 3107 no ou próximo ao terminal C de qualquer proteína alvo de interesse.
00: 18: 3528 É essencialmente uma protease de tiol que se divide entre a treonina e a glicina,
00: 18: 4020 indicado no código de uma letra neste slide, para resultar em um intermediário de enzima tioacil covalente,
00: 18: 4711 indicado no canto inferior esquerdo, aqui.
00: 18: 4827 Agora, estamos fornecendo, ex vivo, um curto peptídeo sintético, minimamente composto de uma única glicina
00: 18: 5712 - idealmente, dois, três ou mais - ao qual se pode afixar praticamente qualquer carga útil de interesse,
00: 19: 0318 denotado aqui como sonda.
00: 19: 0514 Esses peptídeos sintéticos servem como nucleófilos de entrada que atacam esta enzima tioacila
00: 19: 1015 intermediário.
00: 19: 1123 E isso resulta na formação de uma ligação covalente entre a proteína alvo que você
00: 19: 1617 modificado com esta sequência LPXT (G) n em ligação peptídica perfeitamente boa com a sonda,
00: 19: 2413 anexado por meio deste trecho de oligoglicina.
00: 19: 2626 Então, este é um método que se presta à modificação de praticamente qualquer proteína de interesse,
00: 19: 3200 se otimizado corretamente.
00: 19: 3418 Agora, os tipos de cargas que alguém pode anexar às proteínas são limitados apenas pelo que
00: 19: 4024 seu amigo, o químico. os químicos podem produzir.
00: 19: 4405 Neste exemplo, indiquei algumas das coisas que conseguimos afixar com sucesso
00: 19: 4900 usando esta reação de sortase.
00: 19: 5105 Inclui biotinilação específica do local, o anexo específico do local e quantitativo
00: 19: 5619 de fluoróforos, execução de fusões de proteína-proteína, ligação de moléculas de DNA e,
00: 20: 0300 como será relevante para o que tenho a dizer a seguir, a fixação de radioisótopos.
00: 20: 0926 O importante a lembrar aqui é que a reação ocorre especificamente no local e
00: 20: 1503 quase estequiometricamente, o que o torna muito atraente para fins de engenharia de proteínas.
00: 20: 2023 Então, para que possamos usar nanocorpos contra proteínas de superfície de interesse para fins de imagem,
00: 20: 2924, precisamos instalar um rótulo que nos permita detectá-los.
00: 20: 3321 E sem. sem entrar na física, estamos interessados ​​na tomografia por emissão de pósitrons.
00: 20: 3908 Este é um método que pode ser usado na clínica para diagnosticar metabolicamente ativo a partir de células inativas.
00: 20: 4501 É um método não invasivo.
00: 20: 4702 Mas isso. ele usa isótopos radioativos que às vezes são difíceis de manusear.
00: 20: 5205 Sem entrar em detalhes químicos, desenvolvemos procedimentos para fixar esses isótopos
00: 20: 5625 adequado para imagens PET para nossos nanocorpos usando a reação de sortase.
00: 21: 0120 Então, à esquerda você vê uma química desagradável que resulta na formação de um composto marcado com F-18.
00: 21: 0926 O flúor 18 é o isótopo adequado para imagens PET.
00: 21: 1312 À direita, você vê o fluxo de trabalho para a nossa reação catalisada por sortase para instalar
00: 21: 1727 uma entidade química que agora permite. nos permite combinar os dois sob condições estritamente nativas,
00: 21: 2400 sem infligir qualquer dano colateral à proteína de interesse.
00: 21: 2800 Então, é assim que podemos fazer nanocorpos prontos para geração de imagens por tomografia por emissão de pósitrons.
00: 21: 3327 E o que é mostrado neste pequeno detalhe, aqui, é um camundongo que fizemos a imagem com um anticorpo
00: 21: 3800 contra produtos MHC de classe II.
00: 21: 4102 Estas são moléculas encontradas em células apresentadoras de antígenos.
00: 21: 4328 Neste caso, lidamos com um camundongo portador de tumor, onde a presença de células apresentadoras de antígeno
00: 21: 4920 no tumor pode ser visualizado por este método de imagem não invasivo.
00: 21: 5618 Também estivemos interessados, em particular, em imagens de respostas imunológicas não. de forma não invasiva.
00: 22: 0305 Eu apontei o fato de que os linfócitos T reconhecem o antígeno em virtude deste antígeno específico
00: 22: 0918 receptor que reconhece produtos MHC complexados com o peptídeo apropriado, mas a reatividade
00: 22: 1606 dessas células T pode ser mon. monit. pode ser modulado pela expressão de
00: 22: 2106 as chamadas moléculas coestimulatórias ou de ponto de verificação.
00: 22: 2321 E isso pode ser estimulador ou inibidor.
00: 22: 2610 E para que possamos obter imagens de respostas imunológicas de forma não invasiva, para nos concentrarmos em
00: 22: 3121 essas moléculas coestimulatórias ou de checkpoint tornaram-se um ponto de interesse.
00: 22: 3711 Isso é ainda mais importante quando sabemos agora que essas moléculas de checkpoint são importantes
00: 22: 4219 alvos para imunoterapia de câncer.
00: 22: 4612 Este slide foi retirado do trabalho de Jim Allison, que mostrou que ao bloquear um desses pontos de verificação
00: 22: 5120 moléculas pode-se alcançar uma melhoria notável em uma resposta antitumoral.
00: 22: 5801 Neste caso, você vê o que acontece com o crescimento do tumor, medido como o diâmetro do tumor.
00: 23: 0328 Na ausência de qualquer tratamento, se você administrar um anticorpo que não impeça essa interação regulatória,
00: 23: 1211 nenhum efeito sobre o crescimento do tumor.
00: 23: 1418 Mas se você bloquear uma molécula de checkpoint que confere inibição nas células T de
00: 23: 1926 especificidade apropriada, meramente bloquear essa molécula inibidora dá a você uma melhoria significativa
00: 23: 2526 na resposta antitumoral.
00: 23: 2720 Bem, isso tem sido um grande sucesso na clínica, curas tendo sido alcançadas, mas apenas
00: 23: 3319 uma fração dos pacientes responde a esse tratamento e será muito importante saber
00: 23: 3806 por que certas pessoas respondem à terapia e outras não.
00: 23: 4212 E pensamos que a capacidade de gerar imagens de respostas imunológicas de forma não invasiva pode nos ajudar
00: 23: 4701 fornecem algumas respostas a essa pergunta.
00: 23: 5003 Além da proteína CTLA-4, que foi o foco de atenção do trabalho no laboratório Allison,
00: 23: 5510 muito trabalho desde então se concentrou em outros números da família de checkpoints,
00: 24: 0112 notavelmente a proteína PD-L1.
00: 24: 0302 Então, deixe-me mostrar este exemplo.
00: 24: 0517 Temos aqui um linfócito T que se engaja em uma célula apresentadora de antígeno por meio de seu receptor de célula T
00: 24: 1108 para um antígeno.
00: 24: 1226 Mas se esta célula apresentadora de antígeno também expressa PD-L1, ela se engaja em uma contraestrutura
00: 24: 1908 na célula T, que agora confere um sinal inibitório a essa célula T, tornando-a incapaz de
00: 24: 2505 exercendo suas funções usuais, seja a produção de citocinas ou uma função lítica.
00: 24: 3018 Se alguém tiver anticorpos que bloqueiam PD-1 ou PD-L1, essa inibição pode ser aliviada.
00: 24: 3711 E assim como o exemplo anti-CLTA-4 do qual mostrei o gráfico, bloqueando PD-1 ou PD-L1
00: 24: 4317 demonstrou ter um efeito antitumor significativo.
00: 24: 4800 Então, desenvolvemos nanocorpos contra PD-L1.
00: 24: 5305 E podemos mostrar que o melanoma B16, que é um modelo de melanoma de camundongo frequentemente usado,
00: 24: 5909 expressa a proteína PD-L1.
00: 25: 0213 O que você vê aqui são ratos injetados com um fragmento radiomarcado de um nanocorpo que reconhece
00: 25: 0728 PD-L1.
00: 25: 0922 Estes ratos no ombro esquerdo carregam um tumor.
00: 25: 1315 E a presença da proteína PD-L1 no tumor pode ser claramente revelada por este método não invasivo
00: 25: 1922 método de imagem.
00: 25: 2110 Sempre usamos controles genéticos para inferir a especificidade das reações de marcação que vemos.
00: 25: 2717 À direita, você vê um camundongo nocaute PD-L1 inoculado com o mesmo tumor.
00: 25: 3220 E embora um pouco mais fraco, ainda podemos detectar o sinal PD-L1 nesta configuração também.
00: 25: 3817 A conclusão deste experimento é que PD-L1-positividade no microambiente tumoral
00: 25: 4405 é o resultado líquido da expressão dessa proteína em células invasoras de origem hematopoiética,
00: 25: 5028, bem como pela expressão de PD-L1 pelo próprio tumor.
00: 25: 5504 Então, embora seja possível usar um isótopo radioativo de flúor, F-18, para fins de marcação,
00: 26: 0222 sua meia-vida curta, 110 minutos, apresenta limitações.
00: 26: 0628 Por esse motivo, felizmente temos acesso a outros isótopos que são compatíveis com PET,
00: 26: 1107, como zircônio-89.
00: 26: 1317 E temos os meios químicos para instalá-los especificamente no local também.
00: 26: 1805 No painel A, indicamos a estrutura química do quelante necessária para ligar especificamente
00: 26: 2501 zircônio-89.
00: 26: 2700 E da mesma forma que usamos sortase para instalar o F-18, temos uma química que
00: 26: 3121 nos permite instalar esses compostos marcados com zircônio.
00: 26: 3522 A metade inferior deste slide ilustra a abordagem enzimática básica que seguimos para
00: 26: 4020 anexar este zircônio.
00: 26: 4219 Novamente, usamos uma reação de sortase para instalar a estrutura indicada no painel A.
00: 26: 4727 E temos a capacidade adicional de modificar essas estruturas ainda mais por meio da instalação
00: 26: 5402 de polietilenoglicol, por exemplo, para afetar o equilíbrio hidrofóbico-hidrofílico de
00: 26: 5916 o produto final.
00: 27: 0018 Então, aqui você vê um experimento em que pegamos um nanocorpo que reconhece CD8.
00: 27: 0626 Este é o marcador de glicoproteína para diagnóstico de linfócitos T citotóxicos.
00: 27: 1018 E no canto esquerdo você vê o resultado inicial com um nanocorpo simplesmente rotulado com zircônio-89.
00: 27: 1810 As duas estruturas massivas vistas no fundo são os rins e a bexiga.
00: 27: 2226 E este nanocorpo em particular, quando rotulado, tende a se concentrar nos órgãos de eliminação,
00: 27: 2807 com apenas uma marcação muito fraca visível no timo, os nódulos linfáticos
00: 27: 3127 - exatamente onde você esperaria.
00: 27: 3420 Mas agora adicionando espaços PEG de 5, 10 e 20 kiloDaltons, melhorando assim a hidrofilicidade
00: 27: 4303 do agente de marcação, vemos uma redução maciça dessa captação nos órgãos de eliminação.
00: 27: 4917 E começamos a ver, com grande clareza, as estruturas linfóides desses nanocorpos
00: 27: 5319 foram projetados para detectar em primeiro lugar.
00: 27: 5528 Novamente, usamos um controle genético.
00: 27: 5900 Na extrema direita, você vê um camundongo que não tem nenhum e todos os linfócitos, devido ao fato
00: 28: 0413 que está mutado no próprio locus responsável pelo rearranjo VDJ.
00: 28: 1018 E as estruturas linfóides tão claramente visíveis neste painel estão totalmente ausentes no
00: 28: 1620 nocaute RAG, que não possui linfócitos.
00: 28: 1928 Assim, com esta ferramenta em mãos, podemos finalmente começar a obter imagens de linfócitos T citotóxicos
00: 28: 2504 e faça a pergunta, podemos detectar o influxo de células T assassinas no microambiente tumoral?
00: 28: 3211 O que este slide mostra é um camundongo que foi inoculado com uma linha de células tumorais pancreáticas.
00: 28: 3810 E em seu flanco esquerdo, você pode ver claramente o tumor em virtude do fato de que os linfócitos CD8
00: 28: 4515 infiltrar, mostrando que podemos realmente usar esse tipo de imagem não invasiva. imagiologia
00: 28: 5108 para rastrear o comportamento dos linfócitos T em camundongos vivos.
00: 28: 5418 E o que é realmente importante sobre esse tipo de experimento é o fato de que não
00: 28: 5816 precisa matar o animal para examinar o que se passa dentro dele.
00: 29: 0223 Normalmente, imunologistas, para que eles acessem órgãos linfóides ou linfócitos
00: 29: 0908 que residem no tumor, tem que matar o camundongo, extirpar os órgãos de interesse,
00: 29: 1417 e, em seguida, enumerar e caracterizar os linfócitos que estão presentes.
00: 29: 1810 Com este método de imagem não invasivo, embora com resolução modesta, agora podemos rastrear
00: 29: 2313 um animal ao longo do tempo e observe a resposta imunológica se desdobrar.
00: 29: 2713 Então, este é o nosso famoso rato giratório.
00: 29: 3018 E mais uma vez, você pode ver claramente o tumor no flanco direito.
00: 29: 3511 Na verdade, você também verá que esses pontos representam os nódulos linfáticos.
00: 29: 4024 E os linfonodos que estão próximos ao tumor são marcados de forma mais intensa
00: 29: 4600 do que os nódulos linfáticos. gânglios linfáticos do outro lado, consistente com o tráfego de linfócitos
00: 29: 5018 entre esses diferentes órgãos linfóides.
00: 29: 5226 Então, como podemos usar essas informações para responder a uma das perguntas que fiz anteriormente?
00: 29: 5905 Por que certos tumores respondem a anticorpos bloqueadores de checkpoint,
00: 30: 0318, como anti-CTLA-4 ou anti-PD-1 / PL-L1, e outros não?
00: 30: 0903 Podemos usar este método de imagem específico para lançar alguma luz sobre o que acontece em
00: 30: 1321 aquela configuração particular?
00: 30: 1514 Então, este é um slide complicado, mas o conceito é muito simples.
00: 30: 2027 Usamos nosso modelo de melanoma B16 em um ambiente onde alguns dos animais continuarão
00: 30: 2703 ao crescimento total do tumor e outros responderão ao controle do tumor em resposta a
00: 30: 3322 anticorpos bloqueadores de checkpoint.
00: 30: 3624 Então, neste caso, usamos anticorpos anti-CTLA-4, anticorpos de tamanho normal, como um agente terapêutico.
00: 30: 4301 E simplesmente visualizamos no microambiente tumoral o que acontece com os linfócitos T CD8
00: 30: 4802 que se encontra no local.
00: 30: 4922 E o que encontramos é uma correlação muito forte entre a distribuição dessas células T CD8
00: 30: 5603 e a capacidade de um animal de controlar o tumor.
00: 30: 5906 Se observarmos uma distribuição monofocal de linfócitos T, isso é paralelo a uma redução no tamanho do tumor
00: 31: 0520 e melhora a sobrevivência dos animais.
00: 31: 0824 Em animais que não respondem ao bloqueio do checkpoint, e onde os tumores crescem,
00: 31: 1310 vemos esta distribuição mais heterodispersa de células T CD8, e isso se torna um preditor,
00: 31: 1822 se você quiser, do resultado do experimento final.
00: 31: 2319 Isso foi validado, em colaboração com o laboratório de Bob Weinberg, em um modelo de câncer de mama
00: 31: 2711 onde existem duas variantes.
00: 31: 3010 Um é uma variante epitelial que é imunogênica e é prontamente controlada em resposta ao bloqueio do checkpoint,
00: 31: 3610 e há uma variante mesenquimal que é menos diferenciada, altamente agressiva,
00: 31: 4101 e pouco responsivo ao bloqueio do checkpoint.
00: 31: 4404 Se agora imaginarmos animais de qualquer tipo. você vê um exemplo da variante mesenquimal,
00: 31: 4909 mal controlado por bloqueio de checkpoint. os tumores continuam a crescer, e os animais
00: 31: 5406 não sobrevivem.
00: 31: 5510 Na parte inferior, você vê a variante epitelial, uma distribuição monofocal de células T CD8,
00: 32: 0204 excelente resposta aos anticorpos bloqueadores de checkpoint e, portanto, pensamos que este método para o
00: 32: 0620 pela primeira vez começa a lançar alguma luz sobre o que acontece no microambiente tumoral.
00: 32: 1024 Temos um longo caminho a percorrer e há uma longa lista de moléculas de superfície que gostaríamos de obter imagens.
00: 32: 1618 Há muito que precisamos saber sobre vários aspectos da resposta imunológica.
00: 32: 2015 Mas será importante medir essas coisas no contexto de um animal experimental vivo
00: 32: 2519 e, finalmente, talvez, na clínica.
00: 32: 2725 Assim, o segmento anterior mostrou nossos esforços em obter imagens de um certo aspecto da imunidade adaptativa,
00: 32: 3417 notavelmente células T CD8.
00: 32: 3711 Mas, como eu indiquei, a defesa do host é um sistema integrado que compreende não apenas imunidade adaptativa
00: 32: 4409 mas a imunidade inata também.
00: 32: 4525 E os esforços futuros estão focados em tentar obter imagens dessas respostas imunes inatas de forma não invasiva
00: 32: 5118 também.
00: 32: 5218 Acho que a inflamação tem um aspecto fundamental que se beneficiaria com essa abordagem.
00: 32: 5712 Os nanocorpos que usamos têm algumas vantagens exclusivas:
00: 33: 0028 seu tamanho pequeno torna a imagem possível
00: 33: 0320 facilidade de fabricação em E. coli é uma vantagem
00: 33: 0613 o fato de eles não exigirem nem glicosilação nem ligações dissulfeto nos permite expressá-los
00: 33: 1201 no citoplasma de células de mamíferos e usá-los para realizar triagens fenotípicas, como demonstrei
00: 33: 1900 finalmente, seu pequeno tamanho torna possível explorar a reação da sortase a
00: 33: 2403 instalar praticamente qualquer. qualquer entidade de escolha sem infligir danos ao próprio nanocorpo,
00: 33: 2903 e esse é o método que aplicamos para renderizar nanocorpos adequados para imagens por
00: 33: 3506 tomografia por emissão de pósitrons.
00: 33: 3725 Deixe-me terminar agradecendo as pessoas que fizeram este trabalho.
00: 33: 4123 O trabalho de vírus que resumi foi feito por Florian Schmidt, um pós-doutorado,
00: 33: 4709 e Leo Hanke, um estudante de graduação.
00: 33: 5017 A plataforma de nanocorpos foi estabelecida por Jessica Ingram, atualmente no corpo docente da Dana-Farber.
00: 33: 5611 A radioquímica foi feita por Mohammed Rashidian.
00: 33: 5910 E os experimentos de imunologia do tumor foram conduzidos com uma entrada muito significativa
00: 34: 0406 e participação de Mike Dougan.
00: 34: 0705 Mencionei o fato de que colaboramos com Bob Weinberg em nossos modelos de câncer de mama,
00: 34: 1113 Hao Wu no inflamassoma,
00: 34: 1424 Steve Almo como fonte de proteínas conosco. com qual
00: 34: 1703 podemos imunizar alpacas e obter os anticorpos com os quais trabalhamos.
00: 34: 2107 Muito obrigado.

  • Parte 1: Imunologia: Noções básicas de diversidade de anticorpos

Discussão

Nós investigamos os efeitos de vários peptídeos de sinal de anticorpos (SP) na produção de anticorpos recombinantes em um sistema transiente de co-transfecção usando células HEK293, normalizando com os mesmos agentes de transfecção e plasmídeos de base para variar apenas os peptídeos de sinal. Descobrimos que o IgE SP geralmente deu melhores rendimentos do que os SPs nativos (Figura 2).

Para estudar os possíveis efeitos dos SPs das cadeias pesadas e leves (13), enxertamos o V & # x3ba1 SP no V & # x3ba1 | VH3 do tipo selvagem do Pertuzumabe e Trastuzumabe recombinantes (Figura 3) para comparação com o SP IgE e o respectivo contrapartes nativas do SP. Ambos IgE e V & # x3ba1 SPs produziram melhores produções. Com a possibilidade de que o mieloma SP pode dar uma produção melhor, estudamos outro SP ligado ao mieloma & # x2013 uma variante de V & # x3ba1 SP -com P18R ou P18S diferente de V & # x3ba1 SP em IMGT (32).

A enxertia do mieloma V & # x3ba1 SP no modelo selvagem V & # x3ba1 | VH3 Pertuzumabe e modelos de Trastuzumabe mostraram que a mutação P18S aumentou a produção no modelo de Trastuzumabe, mas resultou em diminuição da produção no modelo de Pertuzumabe, enquanto a mutação P18R resultou em diminuição da produção em ambos os modelos Trastuzumab e Pertuzumab, em comparação com o V & # x3ba1 SP nativo (Figura 4). Dados esses achados da mutação SP do mieloma, não encontramos suporte para o papel do SP na patogênese da hiperglobulinemia dentro do mieloma, e que permanece uma relação enigmática entre o SP e a produção de anticorpos.

Analisando o conteúdo de nove aminoácidos essenciais (EAA) nas sequências de SP, especialmente considerando que experimentos anteriores mostraram que a adição de suplementos pode ser útil na produção de proteínas, descobrimos que os SPs de cadeia leve têm uma menor variedade e número de uso de EAAs do que os pesados cadeia SPs (Tabela 1), fornecendo uma pista para sua possível contribuição para a produção recombinante.

Estendendo a análise de aminoácidos essenciais e não essenciais (Figuras 5 e 6) para as variantes de Pertuzumabe e Trastuzumabe de comprimento total, descobrimos que a presença de aminoácidos F, H, I, A, N, L e S podem estar subjacentes aos produção insuficiente de variantes de V & # x3ba5 ​​Pertuzumab e Trastuzumab. Por outro lado, os aminoácidos L, R, I, K e D podem permitir uma melhor produção como visto com variantes específicas emparelhadas com V & # x3ba3 (Pertuzumab) e V & # x3ba4 (Trastuzumab). Dentro dessas tendências, havia certas exceções, como Pertuzumab V & # x3ba6 que, apesar de ter contagens semelhantes dos respectivos aminoácidos (por exemplo, F e H), não tinha níveis de produção comparáveis ​​a famílias de melhor produção, como VK1-4l ou Trastuzumab VH2, ambos dos quais tinham contagem semelhante de Q com VH3, 5 e 7 de alta produção, mas resultou em baixa produção.

A formulação DMEM (Tabela 2) forneceu aminoácidos insuficientes para apoiar a produção ideal de anticorpos, especialmente porque EEA: W e NEAAs: A, D, E, N e P não foram fornecidos nem presentes em quantidades inadequadas. Isso, portanto, explicou o aumento na produção quando suplementos como peptona e caseína foram adicionados (34 & # x201337). Em nosso experimento de acompanhamento (Figura 7), também descobrimos que os suplementos de EAA aumentam a produção geral de anticorpos nos modelos de Pertuzumabe e Trastuzumabe, fornecendo assim um possível suplemento para a produção acadêmica e industrial de anticorpos.

Nosso modelo preditivo baseado em contas de aminoácidos (Figura 8) foi capaz de determinar os níveis de produção ordinal (baixo, médio ou alto) com alta precisão (ROC AUC

0,79 e # x20130,95). No entanto, o modelo é sensível aos conjuntos de dados desequilibrados (por exemplo, 15 & # x201320% dos produtores & # x201chigh & # x201d), apesar de otimizar usando parâmetros ponderados. Além disso, é confinado pelas condições de expressão transitória usadas em nossos experimentos. No entanto, outros dados de transfecção semelhantes podem ser incorporados para melhorar ainda mais o modelo para uma aplicabilidade mais ampla em trabalhos futuros.

Com a contagem de aminoácidos sendo um fator nas taxas de produção de anticorpos, a razão subjacente que os genes de anticorpos utilizam um repertório tão grande de SPs pode ser racionalizada. É possível que o repertório possa servir para mitigar a dependência de EAAs específicos que afetam a produção de anticorpos. Considerando que os genes VDJ de anticorpos hipervariáveis ​​(38) utilizam uma ampla permutação dos aminoácidos, um peptídeo de sinal fixo para todos os anticorpos pode aumentar a probabilidade de forte viés para aminoácidos específicos. Tais desvios podem, assim, criar gargalos para certos EAA (s) e dificultar não apenas a produção de anticorpos, mas também a produção de proteínas celulares essenciais. Portanto, ao variar os SPs com diferentes conteúdos de EAA, tais gargalos de EAAs podem ser mitigados, explicando assim uma possível função do grande repertório de SPs em genes de anticorpos.

Em conclusão, o estudo de anticorpos SP com fatores EAA fornece uma nova abordagem sobre a compreensão da produção transiente de proteínas de mamíferos e possíveis insights para o repertório de SPs utilizados por anticorpos. Esses novos fatores de EAA podem ter potencial para uma ampla aplicação em outros sistemas de produção em uma melhor compreensão da produção de proteínas.


Informações de Apoio

S1 Fig.

uma. Mapeamento de tolerância mutacional do anticorpo anti-lisozima D44.1. Mutações que foram enriquecidas, esgotadas ou tinham dados insuficientes no sequenciamento profundo são marcadas em azul, vermelho e cinza, respectivamente. Os aminoácidos de tipo selvagem são indicados em códigos de uma letra para cada posição. As cisteínas ligadas por dissulfeto são marcadas em triângulos pretos e as posições de interface da cadeia leve-pesada nas quais as mutações pontuais exibem um enriquecimento triplo em relação ao tipo selvagem são marcadas em triângulos rosa. b. Titulações de ligação qualitativas usando exibição de levedura para D44.1, D44.1 des e sete mutantes pontuais que compreendem D44.1des usando exibição de superfície de levedura. As intensidades de fluorescência de ligação são relativas à concentração mais alta de 1 μM de lisozima.

S2 Fig.

uma. A estrutura cristalina do D44.1 des (amarelo e verde para cadeias pesadas e leves, respectivamente) mostra alta precisão em relação ao design computacional (lavanda). Densidade de elétrons em 2 σ. b. A análise cristalográfica de D44.1 des mostra alta concordância com D44.1 (desvio médio quadrático da raiz Cα 0,7 Å), incluindo nas orientações dos resíduos da superfície de ligação (varetas D44.1 em cinza).

S3 Fig. Mapeamento de tolerância de mutação computacional enriquece para projetos de baixa energia.

(azul) a distribuição das energias de Rosetta em relação a G6 de uma seleção de & gt150.000 mutantes multiponto únicos em 11 posições codificadas no espaço de sequência tolerado calculado por PSSM (≥-1) e ΔΔG (≤ + 1 R.e.u.) filtros. (verde) um conjunto aleatório de mutantes multiponto em 30 interface vL-vH (todas as posições de interface foram permitidas), onde qualquer uma das 19 mutações de aminoácidos foi permitida em cada posição mutada. Em ambos os conjuntos, o mesmo número de mutantes multiponto foi analisado, e a mesma distribuição do número de mutações em relação ao G6 foi implementada. 37% dos mutantes multiponto tinham energias mais favoráveis ​​do que G6, enquanto menos de 0,03% dos mutantes aleatórios tinham energias mais favoráveis ​​do que G6. Assim, o mapeamento computacional de tolerância à mutação enriquece os mutantes melhorados em mais de 1.100 vezes em relação às mutações multiponto aleatórias.

S4 Fig. G6, G6 des1 e G6 des13 expressão e purificação de Fab.

(a) Após a purificação de Ni-NTA, G6 exibe a banda esperada em 50 kDa, e bandas adicionais em aproximadamente 100 kDa, indicativo de heterogeneidade da amostra. G6 des13 e G6 des1, em contraste, eluem principalmente na faixa de tamanho de 50 kDa sem bandas de massa mais alta detectáveis. (b) Os projetos G6 des13 e G6 des1 após a filtração em gel executar em seus tamanhos esperados. O estado das condições de redução (sem DTT e ebulição) é indicado no fundo dos géis.

S5 Fig. Os anticorpos IgG1 G6 e G6 des13 de comprimento total secretados foram reduzidos e analisados ​​por espectrometria de massa nativa diretamente do meio de crescimento.

Os painéis superiores mostram os espectros completos. As séries de estado de carga dos dois anticorpos são marcadas por círculos azuis escuros e azuis claros, respectivamente. O estado de carga +23 de cada anticorpo foi isolado no quadrupolo e submetido a uma elevação gradual da voltagem de colisão de forma gradativa, variando de 50 a 200 V. As cadeias leves, que gradualmente se dissociaram dos anticorpos intactos, são marcadas com vermelho e círculos laranja.

S6 Fig. Todos os projetos de 20 h492.1 foram expressos e suas atividades de sobrenadantes de cultura foram medidas conforme descrito nos métodos.

Os valores mais altos no blot refletem as maiores quantidades de substrato remanescente no final de um ensaio de atividade da sulfidril oxidase QSOX1, indicando a maior inibição de QSOX1 pelo anticorpo. Devido às diferenças nos níveis de expressão (Fig. 5A e 5B), a atividade inibitória nesta experiência reflete uma combinação de rendimento de expressão e atividade intrínseca. Os projetos com resultados plotados em cores (amarelo e rosa) foram expressos em volumes maiores, purificados e comparados quantitativamente quanto à atividade inibitória em comparação com o anticorpo parental 492.1 purificado de um hibridoma (Fig 5C).


Anticorpos secundários: FAQs

Encontre respostas técnicas científicas sobre as perguntas mais frequentes (FAQs) relacionadas com:

  • Anticorpos secundários
  • Classes e subclasses de anticorpos
  • Formato de anticorpos secundários
  • Seleção de anticorpos secundários
  • Fragmentos F (ab ') 2, F (ab') e F (ab)
  • Anticorpos secundários pré-adsorvidos
  • Solução de problemas de anticorpos secundários
  • Detecção direta e indireta
  1. O que é um anticorpo secundário?
  2. O que são classes / subclasses de anticorpos ou isotipos?
  3. Qual é a diferença entre usar um anticorpo primário diretamente conjugado e um secundário conjugado?
  4. É necessário usar um isótipo / subclasse específico do anticorpo secundário ao usar um anticorpo monoclonal primário?

O que é um anticorpo secundário?
Um anticorpo secundário é um anticorpo dirigido contra outra molécula de imunoglobulina (anticorpo). Em condições ideais de imunoensaio, um anticorpo secundário marcado liga-se especificamente à espécie e classe (isotipo) do anticorpo primário (detecção indireta). Um anticorpo secundário é produzido e colhido de um animal imunizado com um anticorpo de outra espécie. As especificações do anticorpo imunizante (por exemplo, espécie, subclasse, fragmento, etc.) determinam a especificidade do anticorpo secundário produzido. Por exemplo, um anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo (H + L) é produzido imunizando uma cabra com a molécula de IgG inteira ou cadeias pesadas e leves de uma molécula de imunoglobulina de IgG de camundongo (ver Figura 1).

Figura 1. Geração de um anticorpo secundário

Existem diferenças estruturais entre os anticorpos primários e secundários?
Os anticorpos primários e secundários são semelhantes em estrutura e compartilham classes / subclasses semelhantes. Estruturalmente, um anticorpo é uma molécula em forma de Y composta por três regiões de tamanhos iguais. Uma dobradiça flexível une a haste do anticorpo (Fc) aos braços do anticorpo [F (ab)]. Os dois braços funcionam para ligar o antígeno, enquanto a região do pedúnculo determina o isótipo e as propriedades funcionais do anticorpo. Cada braço é composto por uma cadeia pesada e outra leve. Além disso, essas cadeias pesadas e leves são constituídas por um domínio variável (VL ou VH) e um domínio constante (CL ou CH). As regiões variáveis ​​(V) das cadeias pesadas e leves diferem entre os anticorpos e conferem especificidade de anticorpo para seu antígeno complementar. A região do pedúnculo Fc demonstra muito pouca variabilidade, mas é importante para a interação do anticorpo com moléculas e células efetoras (ver Figura 2A). Em termos de nomenclatura, os anticorpos secundários são nomeados de acordo com seu hospedeiro, formato, reatividade, antígeno alvo, especificidade, rótulo e grau de purificação (ver exemplo na Figura 2B).

Figura 2A. Estrutura de um anticorpo

Figura 2B. Exemplo de nomenclatura do anticorpo secundário

Anticorpo secundário de cabra F (ab) anti-IgG de camundongo (H + L) [HRP] (pré-adsorvido)

Neste exemplo, aqui está o que cada termo significa:

  • Cabra: hospedeiro do anticorpo secundário
  • F (ab): Formato do anticorpo secundário
  • Camundongo: reatividade, o hospedeiro do anticorpo primário
  • IgG: Alvo, a classe Ig do anticorpo primário)
  • H + L: Especificidade, região alvo de Ig sendo reconhecida.
  • HRP: marcador de detecção conjugado ao anticorpo secundário.
  • Pré-adsorvido: grau de purificação do anticorpo

O que são classes / subclasses de anticorpos ou isotipos?
A variação na porção Fc da cadeia pesada do anticorpo permite que os anticorpos sejam divididos em cinco classes exclusivas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. As cadeias pesadas das cinco classes são denotadas por suas letras gregas correspondentes: & alpha (Alpha), & delta (Delta), & epsilon (Epsilon), & gamma (Gamma) e & mu (Mu), respectivamente. Além disso, os isotipos IgG e IgA podem ser divididos em subclasses devido a outras variações da cadeia pesada. Ao contrário das cadeias pesadas de um anticorpo, as cadeias leves, & lambda (lambda) e & kappa (kappa), são compartilhadas entre todas as classes. No entanto, é pertinente notar que cada anticorpo pode ter apenas uma cadeia leve ou a cadeia pesada, mas nunca ambas.

Classes e subclasses de anticorpos secundários

Quais são os principais benefícios do uso de um anticorpo secundário?
Em conjunto com um anticorpo primário específico do antígeno, um anticorpo secundário permite que sequências de aminoácidos altamente específicas dentro de uma proteína alvo sejam detectadas. Portanto, um anticorpo secundário facilita a detecção da expressão da proteína em uma amostra de célula ou tecido. A especificidade de um anticorpo secundário para uma região designada [por exemplo, F (ab)] ou regiões de um anticorpo primário (por exemplo, Fc) permite que vários anticorpos secundários se liguem a um único anticorpo primário, amplificando o sinal e aumentando a sensibilidade do ensaio. A amplificação do sinal decorrente da capacidade de múltiplos anticorpos secundários se ligarem a um único anticorpo primário aumenta a sensibilidade do ensaio. O uso de um anticorpo secundário também proporciona mais flexibilidade na experiência de marcação múltipla, uma vez que os anticorpos secundários disponíveis comercialmente são oferecidos pré-conjugados a diversos marcadores. A amplificação do sinal e o aumento da flexibilidade do ensaio devido à diversidade de anticorpos secundários disponíveis comercialmente marcados são dois benefícios distintos a serem considerados ao projetar seu experimento. Saiba mais sobre: ​​Diferença entre métodos diretos e indiretos de detecção.

Qual é a diferença entre usar um anticorpo primário diretamente conjugado e um secundário conjugado?
O uso de um anticorpo primário conjugado diretamente em vez de uma configuração primária / secundária conjugada padrão permitirá que você dinamize seu experimento e tingir vários alvos em uma única amostra com pouca ou nenhuma interferência de fundo. No entanto, se a proteína de interesse é expressa em uma quantidade baixa na amostra que está sendo examinada, é mais ideal usar um secundário conjugado. O secundário conjugado fornecerá amplificação de sinal significativa porque vários anticorpos secundários podem se ligar a um único primário. Observe que um anticorpo secundário não se liga diretamente ao epítopo da proteína alvo e não confere especificidade ao epítopo alvo, que é determinada pelo anticorpo primário (Figura 3). Um anticorpo secundário marcado determina o método de detecção.

Figura 3. Detecção direta e indireta

Que tipo de anticorpo secundário devo usar?

Um anticorpo secundário deve ser dirigido contra, mas não criado na mesma espécie que o hospedeiro do anticorpo primário correspondente. Como um exemplo, um anticorpo primário de camundongo requer um anticorpo secundário anti-camundongo criado em qualquer espécie diferente de camundongo (por exemplo, coelho-anti-camundongo, cabra anti-camundongo, etc.). Sempre que possível, os anticorpos secundários usados ​​em um experimento de marcação múltipla devem ser derivados da mesma espécie hospedeira. No entanto, todos os anticorpos primários devem ser produzidos em espécies hospedeiras únicas ou diferentes. Isso permite o uso de anticorpos secundários específicos da espécie dirigidos contra um anticorpo primário que limita a reatividade cruzada entre o anticorpo secundário e os anticorpos primários de outras espécies.

Para reduzir o sinal de fundo (coloração não específica), é aconselhável bloquear amostras com soro da mesma espécie hospedeira que o anticorpo secundário. Além disso, para limitar a ligação de um anticorpo secundário a um anticorpo primário criado em uma espécie intimamente relacionada, use um anticorpo secundário pré-adsorvido contra a espécie relacionada. Por exemplo, um anticorpo secundário anti-camundongo pode apresentar reação cruzada com um anticorpo primário de rato em um experimento de marcação múltipla. O uso de um anticorpo secundário anti-camundongo adsorvido contra rato pode reduzir a reatividade cruzada. (Figura 4).

Figura 4. Combinação Ideal de Anticorpos para Experimento de Multi-rotulagem

Como devo escolher um anticorpo secundário para meu anticorpo primário?
Os critérios de seleção de um anticorpo secundário irão variar dependendo do anticorpo primário que você está usando. A regra geral é que você desejará selecionar um secundário que corresponda à espécie do hospedeiro e ao isótipo do anticorpo primário que você está usando. Por exemplo, se o seu primário for um anti-VEGF humano de camundongo com isotipos IgG2a, o anticorpo secundário sugerido pode ser um IgG2a anti-camundongo de cabra marcado com um conjugado de sua preferência. Para obter assistência na seleção de anticorpos secundários, especialmente quando os experimentos envolvem vários anticorpos secundários, você pode entrar em contato com o Suporte Técnico da Novus Biologicals por telefone, e-mail ou chat ao vivo.

Como escolho o formato correto de um anticorpo secundário?
O formato de um anticorpo secundário refere-se à estrutura do próprio anticorpo secundário. O anticorpo inteiro pode ser clivado pela pepsina para eliminar a porção Fc do anticorpo, produzindo um fragmento de anticorpo F (ab ') 2: dois braços do anticorpo e a região de dobradiça. A clivagem adicional do fragmento F (ab ') 2 com β-mercaptoetanol remove um braço do fragmento F (ab') 2, produzindo um fragmento F (ab '): um braço do anticorpo e a região de dobradiça. Observe que um fragmento F (ab ') difere estruturalmente de um fragmento F (ab): um fragmento F (ab) é formado pela clivagem de papaína de imunoglobulina inteira e não possui a região de dobradiça presente em um fragmento F (ab') (Figura 5 ) Ao considerar um anticorpo secundário, é importante não confundir o formato com a especificidade. Considere este anticorpo secundário: Anticorpo secundário de cabra F (ab ') 2 IgG anti-humano F (ab). Neste exemplo, o anticorpo secundário consiste na porção F (ab ') 2 (formato) e é específico para a região F (ab) do anticorpo primário que é direcionado (especificidade).

Figura 5: Formatos / fragmentos de anticorpo

Quando devo usar um anticorpo secundário de fragmento Fab?
Receptores Fc expressos na superfície celular de populações de leucócitos (por exemplo, macrófagos, linfócitos B, células assassinas naturais, etc.) podem se ligar à porção Fc do anticorpo que resulta em uma ligação não específica aumentada (sinal de fundo). Quando o sinal de fundo é muito alto, pode resultar em falsos positivos ou uma interpretação incorreta dos dados. Para lidar com este problema, um anticorpo secundário de fragmento F (ab) é recomendado para ensaios de imunocoloração, especialmente quando a coloração de tecido ou células que expressam grandes quantidades de receptor Fc (por exemplo, nódulo linfático, baço, sangue periférico, etc.). A falta da porção Fc do anticorpo secundário na preparação F (ab) elimina a ligação do reagente secundário aos receptores Fc expressos na amostra (ver Figura 6).

Figura 6: Demonstração da ligação da molécula inteira vs fragmento de anticorpo em imunoensaio

Anticorpo Ig Secundário Inteiro

F (ab ') 2 fragmento de anticorpo secundário

Que rótulo devo escolher para um anticorpo secundário?
A escolha da etiqueta depende da aplicação. Os ensaios que requerem detecção fluorescente (por exemplo, citometria de fluxo, imunocitoquímica, imunofluorescência, etc.) requerem um anticorpo secundário conjugado a um fluorocromo. Os espectros de excitação e emissão de cada fluorocromo devem ser considerados ao projetar cada experimento. Os fluorocromos comuns incluem os corantes FITC, PE, APC, DyLight & trade AlexaFluor & trade ou Atto. A detecção enzimática requer um anticorpo secundário conjugado com HRP, Fosfatase Alcalina (AP) ou biotina. A capacidade da avidina e da estreptavidina de se ligar à biotina e formar um complexo permite a amplificação do sinal independente da espécie hospedeira do anticorpo secundário. Como a peroxidase é econômica e mais estável do que AP, HRP é mais popular para sistemas de detecção quimioluminiscente. No entanto, a maior sensibilidade do AP em comparação com o HRP torna o AP mais comum em ensaios de detecção colorimétrica. Saiba mais em: Anticorpos Conjugados

Que classe ou subclasse de imunoglobulina devo usar para meu anticorpo primário?
Um anticorpo secundário deve ser direcionado contra a classe ou subclasse do anticorpo primário. Por exemplo, um anticorpo primário IgM de camundongo requer um anticorpo secundário IgM anti-camundongo. Às vezes, uma subclasse específica (por exemplo, IgG2, IgG1 humana) pode ser recomendada. Neste caso, um anticorpo secundário direcionado contra a classe mais geral (isto é, IgG anti-humana) pode ser usado para experimentos de marcação única, uma vez que a maioria dos anticorpos secundários específicos de classe reconhecerão subclasses individuais. No entanto, os anticorpos secundários específicos da subclasse devem ser usados ​​para diferenciar entre os anticorpos primários em experiências de marcação múltipla quando mais de um anticorpo primário específico da subclasse é usado. Por exemplo, uma experiência de coloração múltipla usando anticorpos primários IgG2 e IgG1 requer anticorpos secundários anti-IgG2 e anti-IgG1. Quando um anticorpo primário policlonal é usado, um secundário anti-IgG é recomendado, uma vez que a maioria dos anticorpos policlonais são imunoglobulinas da classe IgG.

O que é pré-adsorção?
A pré-adsorção é um método para aumentar a especificidade do anticorpo secundário e minimizar a ligação não específica, passando um anticorpo através de uma coluna contendo proteínas séricas imobilizadas ou imunoglobulinas de espécies potencialmente reativas cruzadas. Os anticorpos reativos ligam-se às proteínas imobilizadas, enquanto os anticorpos não reativos fluem através (ver Figura 7).

Figura 7: Processo de pré-adsorção ilustrado

Qual é a vantagem de usar o anticorpo secundário pré-adsorvido?
Para evitar a ligação não específica, é recomendado o uso de um anticorpo secundário pré-adsorvido ao determinar a expressão da proteína em vários experimentos de marcação ou ao colorir tecidos ou células ricos em imunoglobulina. Usar o anticorpo secundário que é pré-adsorvido contra espécies da amostra a ser examinada (isto é, camundongo, rato, porcino, etc.) irá minimizar a ligação não específica do anticorpo secundário à amostra. Por exemplo, ao colorir um tecido de camundongo, um anticorpo secundário adsorvido contra imunoglobulinas de camundongo ou soro total é recomendado, pois não se liga a imunoglobulinas endógenas na seção de tecido de camundongo.

Como são produzidos os anticorpos purificados por afinidade?
Devido à alta homologia da estrutura do anticorpo entre as classes, é recomendado que os anticorpos secundários específicos da classe sejam purificados por afinidade para minimizar a reatividade cruzada entre as classes. Para produzir anticorpos secundários purificados por afinidade de IgG anti-coelho, IgG anti-coelho é passado por uma coluna contendo IgG de coelho imobilizado. Os anticorpos IgG anti-coelho isolados são então passados ​​por uma coluna adicional (adsorção cruzada) contendo proteínas IgA, IgD, IgE e IgM de coelho. Isso elimina a reação cruzada de anticorpos com isotipos não IgG (ou seja, IgA, IgD, IgE e IgM). O antígeno resultante purificado por afinidade e anticorpo secundário IgG anti-coelho de adsorção cruzada deve demonstrar reatividade mínima com classes de anticorpos diferentes de IgG.

Devo usar um anticorpo de antígeno purificado por afinidade ou uma fração de imunoglobulina inteira?
As frações de imunoglobulina inteiras não purificadas contêm o complemento total de anticorpos. As frações inteiras (geralmente obtidas por purificação da Proteína A) podem ser purificadas por afinidade com o antígeno adicional para remover subclasses de anticorpos ou anticorpos não específicos de antígeno da amostra. Anticorpos secundários purificados por afinidade de antígeno garantem menos ligação não específica e menor sinal de fundo em relação às frações de IgG inteiras. No entanto, o processo de purificação pode eliminar anticorpos de alta afinidade devido à forte afinidade de alguns anticorpos para a matriz de ligação. Portanto, uma fração de IgG é freqüentemente recomendada para alvos de baixa abundância.

Devo usar anticorpos secundários criados na mesma espécie em meu experimento de marcação múltipla?
Sim, se possível, deve-se sempre usar anticorpos secundários criados na mesma espécie em vários experimentos de marcação. A geração de dados precisos em experimentos de marcação dupla ou múltipla requer que cada anticorpo secundário reconheça especificamente um anticorpo primário. Além da reação cruzada com anticorpos primários, um anticorpo secundário pode se ligar a outros anticorpos secundários ou imunoglobulina endógena expressa na amostra sob investigação. Limitar essas reações é a chave para a produção de dados precisos, especialmente em aplicações ICC / IF e IHC.

Quando devo usar os anticorpos secundários específicos do fragmento, como Fc, F (ab) e F (ab ') 2?
Os anticorpos secundários específicos do fragmento podem ser usados ​​quando o anticorpo primário que você está tentando detectar é composto apenas por aquele fragmento específico ou quando você está tentando detectar apenas aquele fragmento específico de uma população de várias moléculas de imunoglobulina. Também pode ser útil quando um anticorpo em consideração tem uma região Fc ou F (ab) exposta, devido à ligação específica desse primário.

Devo usar anticorpos secundários específicos de Fab ao usar um anticorpo primário de camundongo em tecido de camundongo?
Os anticorpos secundários específicos de F (ab) podem ajudar a reduzir o sinal de fundo, eliminando a ligação não específica das proteínas IgG encontradas nos tecidos pelo anticorpo secundário. Você deve ter certeza de que o anticorpo primário que estiver detectando terá uma região F (ab) exposta para detecção pelo secundário. Caso contrário, você pode considerar o uso de um reagente de bloqueio Mouse on Mouse ou um anti-IgG de camundongo não conjugado secundário antes da incubação primária como métodos alternativos para a redução do sinal de fundo.

Estou usando um kit de detecção baseado em polímero em vez de um anticorpo secundário padrão. Estou obtendo um histórico elevado. Você tem alguma recomendação para ajudar a melhorar minha coloração?
Uma etapa de bloqueio de soro pode não ser necessária ao usar um secundário à base de polímero, mas se você estiver tendo problemas de fundo, o bloqueio com 5% de soro de cabra pode ser empregado. Ainda assim, recomendamos realizar uma etapa de bloqueio de peroxidase também se o polímero estiver utilizando um método de detecção de peroxidase.

A conjugação de um anticorpo primário com biotina afetaria sua afinidade com um anticorpo secundário?
Se você estiver usando um acesso / concentração molar baixo de biotina para sua reação de conjugação, não deve haver impacto na afinidade do anticorpo secundário. Além disso, a maioria dos anticorpos secundários são de natureza policlonal e podem se ligar a mais de um epítopo nos anticorpos primários.

No Western blog, posso usar BSA-TBST como um bloqueador e diluente de anticorpos para fosfo-anticorpos e, em seguida, 5% de leite para diluir e incubar anticorpos secundários?
A obtenção de um blot limpo para anticorpos específicos para fosfo com tampão de diluição de anticorpos / bloqueio à base de leite é um desafio que a maioria dos pesquisadores experimenta em seus experimentos. A compatibilidade do anticorpo fosfo com o diluente à base de leite depende de quão fortemente o fosfo-anticorpo se liga a uma proteína de interesse ou se pode ser sequestrado por fosfo-proteínas do leite. O tampão de bloqueio ou diluição baseado em albumina de soro bovino (BSA) é uma escolha recomendada em vez de 5% de leite para a maioria dos alvos.

Por que recebo manchas na minha coloração de imunofluorescência?
Quando usados ​​em uma concentração mais alta / baixa diluição, alguns anticorpos exibem uma tendência para formar agregados que resultam em um sinal pontilhado em ensaios de imunocoloração. Os agregados podem ser removidos do estoque de anticorpos centrifugando o frasco de anticorpo em alta velocidade por 5-10 minutos, seguido por pipetagem cuidadosa do sobrenadante / solução de anticorpo sem tocar o fundo do frasco. Outra fonte de manchas salpicadas é o uso de lâminas e / ou lamínulas que não estão limpas. Se houver suspeita de partículas em suspensão nas lâminas ou nas lâminas de trevo, verifique novamente observando-os ao microscópio. As lâminas podem ser limpas com álcool absoluto e lenços de papel ou um pedaço de algodão.

Que diluição devo usar para minha aplicação?
Isso irá variar dependendo do produto. Você pode encontrar a faixa de diluição recomendada na seção "Aplicações / Diluições" da ficha do produto (veja um exemplo abaixo).

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Tenho algumas sobras de anticorpos secundários que foram diluídos em 5% de leite. Quanto tempo posso armazenar antes que ele perca sua atividade?
A vida útil dos anticorpos secundários pré-diluídos pode variar muito, dependendo do número de usos, temperatura de armazenamento, idade dos buffers de armazenamento e outros fatores de manuseio. Recomendamos manter a maior parte do seu anticorpo secundário em seu frasco original, removendo apenas material suficiente para uso individual. Se você decidir armazenar o secundário pré-diluído, pode ser necessário realizar testes de estabilidade do anticorpo secundário com seus primários para estabelecer um cronograma de trabalho para suas necessidades. Embora ofereçamos 100% de garantia em nossos produtos quando armazenados adequadamente, o armazenamento de um anticorpo em diluente de anticorpo não é o que recomendamos.


Purificação de afinidade específica de classe de anticorpos

Como os anticorpos têm uma estrutura geral evolutivamente conservada, incluindo domínios relativamente invariantes, e sua função nativa envolve ligação e defesa contra patógenos, não é surpresa que certas bactérias patogênicas tenham desenvolvido proteínas com funções de ligação a anticorpos específicas. Várias dessas proteínas de ligação à imunoglobulina foram identificadas e isoladas de certas espécies de bactérias. Da mesma forma que as funções nativas dos anticorpos são úteis como sondas específicas para o alvo para a pesquisa de proteínas, também estas proteínas anti-Ig nativas são úteis como ligandos de afinidade para a purificação de anticorpos.

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Proteína A, G e L ligantes de ligação ao anticorpo

Proteína A, Proteína G e Proteína L são três proteínas bacterianas cujas propriedades de ligação a anticorpos foram bem caracterizadas. Estas proteínas foram produzidas de forma recombinante e usadas rotineiramente para purificação por afinidade de tipos de anticorpos chave de uma variedade de espécies. As formas recombinantes mais disponíveis comercialmente dessas proteínas têm sequências desnecessárias removidas (incluindo o domínio de ligação de HSA da Proteína G) e são, portanto, menores do que suas contrapartes nativas. Uma forma recombinante geneticamente modificada de Proteína A e Proteína G, chamada Proteína A / G, também está amplamente disponível. Todas as quatro proteínas de ligação a Ig recombinantes são usadas rotineiramente por pesquisadores em inúmeras aplicações de imunodetecção e imunoafinidade.

Fontes e características de proteínas nativas de ligação a Ig. As informações nesta tabela são coletadas de várias fontes. Consulte as páginas relacionadas "Saiba mais" para referências e detalhes sobre as formas recombinantes usadas para aplicações de imunoafinidade.
Proteína A (SpA)Proteína G (SpG)Proteína L (SpL)
EspéciesEstafilococo
aureus
Estreptococo spp.
(Grupo C e G)
Peptostreptococcus magnus
Humano
Patologia
Componente da flora do corpo humano causa de infecções por "Staph"Orig. isolado de pacientes com faringite (amígdalas ou sangue)Bactérias Gram-positivas anaeróbicas comensais e / ou patogênicas
Nativo
Tamanho (s)
40 a 60kDa
(números variáveis ​​de domínios repetidos)
40 a 65kDa
(números variáveis ​​de domínios repetidos)
76kDa
Domínios de ligação5 para IgG (forma mais comum)1 a 2 para IgG
0 a 2 para HSA
5 para Ig
Alvo de ligação a Igregião constante da cadeia pesada (Fc) de IgG (região CH2-CH3)cadeia pesada const. região (Fc) de IgG (região CH2-CH3)cadeias leves kappa de Igs (VL-kappa)

Sítios de ligação de proteínas de ligação a anticorpos. As proteínas usadas para imobilizar anticorpos para suporte de esferas mostram especificidade para diferentes domínios de anticorpos. As proteínas A e G ligam-se às cadeias pesadas da região Fc do anticorpo, enquanto a proteína L se liga especificamente às cadeias leves das duas regiões Fab do fragmento de anticorpo F (ab ') 2. † A proteína G também pode ligar fragmentos Fab em certas condições.

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Purificação de anticorpo com proteína A, G e L

Para realizar a purificação de anticorpos com Proteína A, Proteína G, Proteína A / G ou Proteína L, eles são covalentemente imobilizados em resinas porosas (como agarose em esferas) ou esferas magnéticas. Como essas proteínas contêm vários domínios de ligação a anticorpos, quase todas as moléculas individuais imobilizadas, independentemente de sua orientação, mantêm pelo menos um domínio de ligação funcional e livre. Além disso, porque as proteínas se ligam a anticorpos em locais diferentes do domínio de ligação ao antígeno, as formas imobilizadas dessas proteínas podem ser usadas em esquemas de purificação, como imunoprecipitação, em que a proteína de ligação ao anticorpo é usada para purificar um antígeno de uma amostra por ligar um anticorpo enquanto ele está ligado ao seu antígeno.

As proteínas A, G, A / G e L têm diferentes propriedades de ligação, o que torna cada uma adequada para diferentes tipos de alvos de anticorpo (por exemplo, subclasse de anticorpo ou espécie animal). É importante perceber que o uso de Proteína A, G ou L resulta na purificação da imunoglobulina geral de uma amostra bruta. Dependendo da fonte da amostra, o anticorpo específico do antígeno pode representar apenas uma pequena porção da imunoglobulina total na amostra. Por exemplo, geralmente apenas 2–5% do total de IgG no soro de camundongo é específico para o antígeno usado para imunizar o animal.

Usando uma coluna de resina de agarose de proteína A e soro de coelho como exemplo, o procedimento geral para purificação de anticorpos com esses ligantes é o seguinte: