Em formação

Qual (is) é (são) o (s) mecanismo (s) que impede (m) a fusão das células in vivo?


Acabei de aprender sobre o fenômeno da "fusão celular", no qual duas células somáticas diplóides podem se combinar em alguma célula aneuploide in vitro e continuar a proliferar em cultura. Aparentemente, isso pode até acontecer interespecificamente. Minha pergunta é: o que impede que as células que crescem naturalmente no corpo se fundam o tempo todo e criem células anormais?

Ou isso acontece com alguma frequência e produz células potencialmente cancerosas, que são então destruídas pelos mecanismos reguladores normais do corpo (acho que isso também poderia escapar e se tornar um problema).

Poderia ser por isso que normalmente temos muitos crescimentos benignos ao longo da vida de um animal?

Qualquer leitura relacionada seria super apreciada, obrigado!


Sistema start-stop de células imunológicas de caça

Os neutrófilos (verdes) formam enxames de células e se acumulam nos locais dos tecidos onde precisam conter células danificadas ou micróbios invasores. Trajetórias multicoloridas de caminhos de migração de neutrófilos são exibidas. Crédito: MPI of Immunobiology & Epigenetics / T. Lämmermann

Os neutrófilos pertencem aos primeiros respondentes de nosso sistema imunológico. Eles circulam em nossos corpos e caçam em tecidos infectados para ingerir, matar e digerir patógenos nocivos. Para se tornarem assassinos tão eficazes na situação muito complexa de um tecido inflamado, eles trabalham juntos como um coletivo. Eles liberam sinais químicos para atrair outras células para formar grupos de células e atacar como um enxame. Pesquisadores do Instituto Max Planck de Imunobiologia e Epigenética em Freiburg decifram a biologia básica da enxameação de neutrófilos e agora mostram que as células também desenvolveram um programa molecular intrínseco para autolimitar sua atividade de enxame. O estudo elucida como os neutrófilos do enxame se tornam insensíveis aos seus próprios sinais secretados que uniram o enxame em primeiro lugar. Esse processo é crucial para a eliminação eficiente de bactérias nos tecidos.

O corpo está bem protegido contra a invasão de patógenos por barreiras como a pele. Mas se você se machucar e romper a pele, os agentes patogênicos podem entrar facilmente em seu corpo através da ferida e causar infecções graves. Se isso ocorrer, o sistema imunológico inato assume a primeira defesa rápida com um arsenal eficaz de armas celulares infiltrando-se no tecido ferido em grande número. Como um dos primeiros tipos de células no local, os granulócitos neutrófilos são recrutados dentro de algumas horas da corrente sanguínea para o local da infecção para eliminar potenciais invasores microbianos.

Enxame contra infecções

"Os neutrófilos são muito eficientes na caça e na morte de bactérias", diz Tim Lämmermann. O líder do grupo do MPI de Imunobiologia e Epigenética em Freiburg estuda esse importante tipo de célula. Os neutrófilos são células altamente abundantes que constituem cerca de 50-70% dos glóbulos brancos do corpo humano. Estima-se que 100 bilhões de neutrófilos sejam produzidos a partir de células-tronco na medula óssea em um adulto todos os dias. "Essas células patrulham quase todos os cantos do nosso corpo e são muito eficientes em detectar qualquer coisa potencialmente prejudicial em nosso corpo. Uma vez que os neutrófilos individuais detectam células danificadas ou micróbios invasores no tecido, eles começam a secretar sinais atraentes que agem através dos receptores da superfície celular em neutrófilos vizinhos para recrutar mais e mais células. " Ao usar essa comunicação intercelular, os neutrófilos podem atuar juntos como um coletivo celular e coordenar efetivamente sua eliminação de patógenos como um enxame.

Neutrófilos individuais atraem mais células para iniciar a formação de um enxame de neutrófilos e agrupar em tecido vivo de camundongo. Instantâneos de uma sequência de 30 minutos são mostrados. Neutrófilos individuais (multicoloridos), aglomerados de neutrófilos (vermelho) e componentes estruturais da pele do mouse (azul) são exibidos. Crédito: MPI of Immunobiology & Epigenetics, T. Lämmermann

Uma linha tênue entre a proteção do hospedeiro e a destruição do tecido

No entanto, essa forma de inflamação benéfica também pode ultrapassar os limites e causar danos maciços aos tecidos. Se a intensidade ou a duração da resposta se tornam desreguladas, os mesmos mecanismos que servem para eliminar os patógenos invasores também podem causar danos colaterais aos tecidos saudáveis. Por exemplo, as substâncias que os neutrófilos liberam para matar os patógenos invasores também corroem a malha de proteínas e açúcares, que fornecem suporte estrutural aos tecidos. "Neste estudo, começamos com a pergunta o que impede a resposta da enxameação para evitar o acúmulo descontrolado de neutrófilos e prevenir a inflamação excessiva, que pode contribuir para doenças degenerativas como câncer, diabetes e doenças autoimunes", diz Tim Lämmermann. Em estudos anteriores, ele e sua equipe já descobriram os mecanismos moleculares que iniciam o comportamento de enxameamento coletivo. No entanto, os processos que levam a essa resposta permanecem desconhecidos.

A enxameação de neutrófilos ainda é um tópico relativamente novo nos campos de pesquisa de inflamação e infecção, e os mecanismos subjacentes estão apenas começando a ser investigados. O mais recente estudo do laboratório de Tim Lämmermann agora revela como os neutrófilos autolimitam sua atividade de enxameação em tecidos infectados por bactérias e, assim, equilibram as fases de busca versus destruição para a eliminação eficiente de patógenos.

Ao usar microscopia especializada para a visualização em tempo real da dinâmica das células imunológicas em tecidos vivos de camundongos, os pesquisadores demonstram que os neutrófilos se tornam insensíveis aos seus próprios sinais secretados que iniciaram o enxame. "Identificamos uma quebra molecular nos neutrófilos que interrompe seu movimento, uma vez que eles detectam altas concentrações de atrativos de enxame em grandes aglomerados de neutrófilos", diz Tim Lämmermann. "Isso foi surpreendente, pois a visão predominante sugeria que os sinais externos liberados do ambiente do tecido são críticos para interromper a atividade dos neutrófilos na fase de resolução de uma inflamação", comenta Wolfgang Kastenmüller, cientista colaborador do Grupo de Pesquisa de Imunologia de Sistemas Max Planck da Universidade de Würzburg.

Um sistema start-stop interno para eliminação ideal de bactérias

À luz do sistema start-stop descoberto em neutrófilos, os pesquisadores reavaliaram as visões atuais sobre como os neutrófilos navegam nos tecidos para eliminar bactérias de forma eficiente. Em experimentos com neutrófilos sem o mecanismo de parada, a equipe observou células imunes excessivamente enxameando e escaneando grandes áreas de tecido infectado por bactérias, o que contrastava o comportamento das células com o funcionamento do sistema start-stop. No entanto, esse enxame e varredura amplificados não tornaram essas células melhores destruidoras de patógenos. "Surpreendentemente, fizemos a descoberta oposta. Não é benéfico quando os neutrófilos se movem muito rápido e correm como loucos. Em vez disso, parece mais vantajoso para eles parar e desfrutar juntos de uma boa refeição de bactérias - isso é mais eficiente para conter crescimento bacteriano nos tecidos ", explica Tim Lämmermann.

Com esses resultados, a equipe abre caminho para um melhor entendimento da biologia dos neutrófilos, que é essencial para a defesa do hospedeiro imunológico contra bactérias e pode informar abordagens terapêuticas no futuro. Além disso, o comportamento de enxameação e os mecanismos subjacentes também podem informar outras categorias de comportamento coletivo e auto-organização em células e insetos.


Resumo

Muitos órgãos contêm redes de tubos epiteliais que transportam gases ou fluidos. Um lúmen pode ser gerado por tecido que envolve um espaço extracelular pré-existente ou pode surgir de novo entre células ou dentro de uma única célula em uma posição onde não havia espaço anteriormente. Mecanismos aparentemente distintos de de novo formação de lúmen observada em vitro - em culturas tridimensionais de células endoteliais e de rim canino Madin-Darby (MDCK) - e na Vivo - na vasculatura do peixe-zebra, Caenorhabditis elegans células excretórias e o Drosophila melanogaster traqueia - na verdade, compartilham muitas características comuns. Em todos os sistemas, a formação do lúmen envolve a expansão estruturada da membrana plasmática apical por meio de mecanismos gerais de transporte de vesículas e de regulação do citoesqueleto de microtúbulos e actina.


Células cultivadas: características, parâmetros de crescimento e sincronização

1. As células que normalmente não proliferam in vivo podem ser cultivadas e proliferadas em culturas.

2. As interações entre células nas células em cultura são muito baixas.

3. A arquitetura tridimensional das células in vivo não é encontrada em células em cultura.

4. A influência hormonal e nutricional nas células cultivadas difere daquela nas células in vivo.

5. As células cultivadas não podem desempenhar funções diferenciadas e especializadas.

6. O ambiente das células cultivadas favorece a proliferação e disseminação de células não especializadas.

Influência ambiental nas células cultivadas:

Os fatores ambientais influenciam fortemente as células em cultura. As principais rotas através das quais ocorre a influência ambiental são listadas:

eu. A natureza do substrato ou fase em que as células crescem. Para culturas em monocamada, o substrato é um sólido (por exemplo, plástico), enquanto para culturas em suspensão, é um líquido.

ii. A composição do meio usado para nutrientes de cultura e propriedades físico-químicas.

iii. Adição de hormônios e fatores de crescimento.

4. A composição da fase gasosa.

v. A temperatura de incubação da cultura.

Os aspectos biológicos e outros aspectos das células cultivadas com referência especial aos seguintes parâmetros são descritos resumidamente:

4. Metabolismo de células em cultura.

5. Início da cultura de células.

6. Evolução e desenvolvimento de linhas celulares.

Adesão celular:

A maioria das células obtidas de tecidos sólidos crescem como monocamadas aderentes em culturas. As células, derivadas da agregação de tecido ou subcultura, se fixam ao substrato e então começam a proliferar. Nos primeiros dias das técnicas de cultura, vidros levemente carregados negativamente eram usados ​​como substratos. Nos últimos anos, plásticos como o poliestireno, após tratamento com descarga elétrica de íons, estão em uso.

A adesão celular ocorre por meio de receptores de superfície celular para as moléculas da matriz extracelular. Parece que as células secretam proteínas da matriz que se espalham no substrato. Então, as células se ligam à matriz por meio de receptores. É uma observação comum que os substratos (vidro ou plástico) com cultura de células anterior são condicionados para fornecer melhor área de superfície para adesão.

Moléculas de adesão celular:

Três grupos de proteínas coletivamente referidos como moléculas de adesão celular (CAMs) estão envolvidos na adesão célula-célula e adesão célula-substrato.

Moléculas de adesão célula-célula:

Estas proteínas estão principalmente envolvidas na interação célula a célula entre as células homólogas. CAMs são de dois tipos - dependentes de cálcio (caderina & # 8217s) e CAMs independentes de cálcio.

Essas moléculas medeiam as interações do substrato celular. Integrin & # 8217s possuem receptores para moléculas de matriz, como fibronectina e colágeno.

Estes são receptores de membrana trans de baixa afinidade. Os proteoglicanos podem se ligar ao colágeno da matriz e a fatores de crescimento. As moléculas de adesão celular são anexadas aos citoesqueletos das células cultivadas.

Proliferação celular:

A proliferação de células em cultura ocorre ao longo do ciclo celular, que possui quatro fases distintas (Fig. 35.1)

Nesta fase (M = mitose), as duas cromátides, que constituem os cromossomos, segregam em células-filhas.

Esta fase gap 1 é altamente suscetível a vários processos de controle que determinam se a célula deve prosseguir em direção à síntese de DNA, reentrar no ciclo ou seguir o curso em direção à diferenciação.

Esta fase é caracterizada pela síntese de DNA em que ocorre a replicação do DNA.

Esta é a fase gap 2 que prepara a célula para a reentrada na mitose. A integridade do DNA, seu reparo ou entrada em apoptose (morte celular programada) se o reparo não for possível é determinada por dois pontos de verificação - no início da síntese de DNA e em G2 Estágio.

Controle da proliferação celular:

Para as células em cultura, os sinais ambientais regulam o ciclo celular e, portanto, a proliferação celular. A baixa densidade das células em um meio, juntamente com a presença de certos fatores de crescimento (por exemplo, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento derivado de plaquetas) permite que as células entrem no ciclo celular.

Por outro lado, a alta densidade celular e a aglomeração de células inibem o ciclo celular e, portanto, a proliferação. Além da influência dos fatores ambientais, certos fatores intracelulares também regulam o ciclo celular. Por exemplo, as ciclinas promovem enquanto os produtos dos genes p53 e Rb inibem o ciclo celular.

Diferenciação celular:

As várias condições de cultura de células favorecem a proliferação celular máxima e a propagação de linhas celulares.

Entre os fatores que promovem a proliferação celular, os seguintes são importantes:

ii. Baixa concentração de Ca 2+

iii. Presença de fatores de crescimento

Para que o processo de diferenciação celular ocorra, a proliferação de células deve ser severamente limitada ou completamente abolida.

A diferenciação celular pode ser promovida (ou induzida) pelos seguintes fatores:

ii. Alta concentração de Ca 2+.

iii. Presença de indutores de diferenciação (por exemplo, hidro e shicortisona, fator de crescimento do nervo).

Como é evidente a partir do acima, condições diferentes e quase opostas são necessárias para a proliferação celular e para a diferenciação celular. Portanto, se a diferenciação celular for necessária, dois conjuntos distintos de condições serão necessários.

1. Para otimizar a proliferação celular.

2. Para otimizar a diferenciação celular.

Manutenção da diferenciação:

É agora reconhecido que as células retêm suas funções nativas e originais por muito tempo quando suas estruturas tridimensionais são mantidas. Isso é possível com culturas de órgãos. No entanto, as culturas de órgãos não podem ser propagadas.

Nos últimos anos, alguns trabalhadores estão tentando criar estruturas tridimensionais mesclando culturas monocamadas. Além disso, a cultura in vitro de células em ou em matrizes especiais (por exemplo, celulose, gel de colágeno, matriz de glicoproteínas) também resulta em células com estruturas tridimensionais.

A desdiferenciação se refere à perda irreversível de propriedades especializadas das células quando elas são cultivadas in vitro. Isso acontece quando as células diferenciadas in vitro perdem suas propriedades (Fig. 35.2). Na situação in vivo, um pequeno grupo de células-tronco dá origem a células progenitoras que são capazes de produzir um pool de células diferenciadas (Fig. 35.2A).

Por outro lado, no sistema de cultivo in vitro, predominam as células progenitoras que vão se proliferando. Muito poucas das células recém-formadas podem formar células diferenciadas (Fig. 35.2B). O resultado líquido é uma diferenciação bloqueada. A desdiferenciação implica uma perda irreversível das propriedades especializadas das células. Por outro lado, a desadaptação refere-se à re-indução de propriedades especializadas das células através da criação de condições apropriadas.

Metabolismo de células cultivadas:

O metabolismo de células de cultura de mamíferos com referência especial aos aspectos de energia é ilustrado na Fig. 35.3. As células cultivadas podem usar glicose ou glutamina como fonte de energia. Esses dois compostos também geram importantes precursores anabólicos.

À medida que a glicose é degradada pela glicólise, o lactato é produzido principalmente. Isso ocorre porque o oxigênio está em fornecimento limitado nas condições normais de cultura (ou seja, oxigênio atmosférico e uma cultura submersa), criando uma situação anaeróbica. O lactato, secretado no meio, se acumula.

Alguma quantidade de piruvato produzida na glicólise é oxidada através do ciclo de Krebs. Uma pequena fração de glicose (4-9%) entra na via da pentose fosfato para fornecer ribose 5-fosfato e equivalentes redutores (NADPH) para as vias biossintéticas, e. síntese de nucleotídeos.

A glutamina é uma importante fonte de energia para as células em cultura. Pela ação da enzima glutaminase, a glutamina sofre desaminação para produzir glutamato e íons amônio. O glutamato, na transaminação (ou desaminação oxidativa), forma a-cetoglutarato que entra no ciclo de Krebs.

O piruvato participa predominantemente da reação de transaminação para produzir alanina, que é facilmente excretada no meio. Nas células em cultura de crescimento rápido, a reação de transaminação é uma via dominante do metabolismo da glutamina.

A desaminação da glutamina libera íons de amônio livres, que são tóxicos para as células em cultura, limitando seu crescimento. Nos últimos anos, dipeptídeos glutamil-alanina ou glutamil-glicina estão sendo usados ​​para minimizar a produção de amônia. Além disso, esses dipeptídeos são mais estáveis ​​no meio.

Como já afirmado, o α-cetoglutarato obtido da glutamina (via glutamato) entra no ciclo de Krebs e é oxidado em dióxido de carbono e água. Para o funcionamento adequado do ciclo Curbs, é necessário o balanceamento dos intermediários do ciclo.

Dois metabólitos do ciclo de Kerb, a saber, malato e oxaloacetato, deixam o ciclo e são convertidos, respectivamente, em piruvato e fosfoenol piruvato. Os dois últimos compostos podem reentrar no ciclo de Krebs na forma de acetil CoA. Assim, a continuidade do ciclo Curbs é mantida. A glicose, assim como a glutamina, é metabolizada pelas células em cultura para fornecer energia na forma de ATP.

Iniciação da Cultura Celular:

A cultura de células pode ser iniciada pelas células derivadas de um tecido por meio de tratamentos enzimáticos ou mecânicos. A cultura primária é um processo seletivo que finalmente resulta em uma linha celular relativamente uniforme. A seleção ocorre em virtude da capacidade das células de sobreviverem como culturas em monocamada (por adesão a substratos) ou como culturas em suspensão.

Entre as células cultivadas, algumas células podem crescer e proliferar, enquanto outras são incapazes de sobreviver no ambiente de cultura. As células continuam a crescer em culturas de monocamada, até que a disponibilidade do substrato seja ocupada.

O termo confluência é usado quando as células cultivadas fazem contato próximo umas com as outras, utilizando totalmente a área de crescimento disponível. Para certas células, que são sensíveis à limitação do crescimento devido à densidade, as células param de crescer assim que a confluência é atingida. No entanto, as células transformadas são insensíveis à confluência e continuam a crescer demais.

Quando a cultura se torna confluente, as células possuem os seguintes caracteres:

1. A semelhança morfológica mais próxima com o tecido de origem (ou seja, tecido original).

2. A expressão de funções especializadas das células comparáveis ​​às das células nativas.

Evolução e desenvolvimento de linhas celulares:

A cultura primária cultivada após a primeira subcultura é referida como linha celular. Uma determinada linha celular pode ser propagada por subcultura adicional. À medida que as subculturas são repetidas, as células de proliferação mais rápida dominam, enquanto as células de proliferação lenta ou não proliferativa se diluem e, conseqüentemente, desaparecem.

O evento geneticamente determinado de divisões celulares por um número limitado de vezes (ou seja, duplicação da população), seguido por sua morte em um tecido normal, é referido como senescência. No entanto, as células germinativas e as células transformadas são capazes de proliferar continuamente.Na cultura in vitro, as células transformadas podem dar origem a linhas celulares contínuas.

A evolução de uma linha celular contínua é ilustrada na Fig. 35.4. O número cumulativo de células em uma cultura é representado no eixo Y em uma escala logarítmica, enquanto o eixo X representa o tempo em semanas. O tempo para o desenvolvimento de uma linha celular contínua é variável. Por exemplo, para fibroblastos diplóides humanos, a linha celular contínua surge em cerca de 14 semanas, enquanto a senescência pode ocorrer entre 10 a 20 semanas, geralmente após 30 e 60 duplicações de células.

Desenvolvimento de linhas celulares contínuas:

Certas alterações na cultura, denominadas coletivamente como transformação, podem dar origem a linhas celulares contínuas. A transformação pode ocorrer espontaneamente, induzida química ou viralmente. A transformação envolve basicamente uma alteração nas características de crescimento, como perda de inibição de contato, limitação de densidade de crescimento e independência de ancoragem. O termo imortalização é freqüentemente usado para a aquisição de vida infinita para células em cultura.

A capacidade das células de crescer continuamente em linhagens de células representa a variação genética nas células. Na maioria das vezes, a deleção ou mutação do gene p 53 é responsável pela proliferação contínua de células. Nas células normais, o gene p 53 normal é responsável pela interrupção do ciclo celular. A maioria das linhas celulares contínuas são aneuplóides, possuindo número de cromossomos entre o valor diplóide e tetraplóide.

Células normais e linhas celulares contínuas:

A grande maioria das células normais não é capaz de dar origem a linhas celulares contínuas. Por exemplo, fibroblastos humanos normais continuam a proliferar por cerca de 50 gerações e então param de se dividir. No entanto, eles permanecem viáveis ​​por cerca de 18 meses. E ao longo de sua vida, os fibroblastos permanecem euplóides. Os fibroblastos de pintinhos também se comportam de maneira semelhante. As células epidérmicas e as células linfoblásticas são capazes de formar linhas celulares contínuas.

Caracterização de células cultivadas:

A caracterização de células cultivadas ou linhagens de células é importante para a disseminação de linhagens de células por meio de bancos de células e para estabelecer contatos entre laboratórios de pesquisa e empresas comerciais.

A caracterização de linhas celulares com referência especial aos seguintes aspectos geralmente é feita:

4. Se a linha celular é transformada ou não.

5. Identificação de linhas celulares específicas.

Morfologia das células:

Uma identificação simples e direta das células cultivadas pode ser feita observando-se suas características morfológicas. No entanto, a morfologia deve ser vista com cautela, uma vez que é amplamente dependente do ambiente de cultura. Por exemplo, as células epiteliais que crescem no centro (da cultura) são poligonais regulares com bordas claramente definidas, enquanto as que crescem na periferia são irregulares e distendidas (inchadas).

A composição do meio de cultura e as alterações no substrato também influenciam na morfologia celular. Em um laboratório de cultura de tecidos, os termos fibroblástico e epitelial são comumente usados ​​para descrever a aparência das células, e não sua origem.

Para essas células, o comprimento é geralmente mais do que o dobro de sua largura. As células fibroblásticas são bipolares ou multipolares por natureza.

Essas células são de natureza poligonal com dimensões regulares e geralmente crescem em monocamadas. Os termos fibroblastoide (semelhante a fibroblasto) e epitelóide (semelhante a epitelial) são usados ​​para as células que não possuem caracteres específicos para serem identificadas como células fibroblásticas ou epiteliais.

Espécies de Origem das Células:

A identificação das espécies de linhagens celulares pode ser feita por:

b. Eletroforese de isoenzimas.

c. Uma combinação de ambos os métodos.

Nos últimos anos, a identificação cromossômica está sendo feita com o emprego de sondas moleculares.

Identificação do tecido de origem:

A identificação de linhas celulares em relação ao tecido de origem é realizada com referência às seguintes duas características:

1. A linhagem à qual as células pertencem.

2. O estado das células, ou seja, células estaminais, células precursoras.

Marcadores de tecido para identificação de linha celular:

Alguns dos marcadores de tecido ou linhagem importantes para a identificação da linha celular são descritos resumidamente.

Produtos diferenciados como marcadores celulares:

As células cultivadas, na expressão completa, são capazes de produzir marcadores de diferenciação, que servem como marcadores celulares para identificação.

Alguns exemplos são dados a seguir:

uma. Albumina para hepatócitos.

b. Melanina para melanócitos

c. Hemoglobina para células eritróides

d. Miosina (ou tropomiosina) para células musculares.

Enzimas como marcadores de tecido:

A identificação de enzimas em células de cultura pode ser feita com referência aos seguintes caracteres:

Os marcadores de enzima comumente usados ​​para identificação de linha celular são apresentados na Tabela 35.1.

A tirosina aminotransferase é específica para hepatócitos, enquanto a tirosinase é para melanócitos. A creatina quinase (MM) no soro serve como um marcador para células musculares, enquanto a creatina quinase (BB) é usada para a detecção de neurônios e células neuroendócrinas.

Proteínas do filamento como marcadores de tecido:

As proteínas do filamento intermediário são amplamente utilizadas como marcadores de tecido ou linhagem.

Por exemplo:

uma. Os astrócitos podem ser detectados pela proteína glial fibrilar ácida (GFAP).

b. As células musculares podem ser identificadas por desmina.

c. Células epiteliais e mesoteliais por citoqueratina.

Antígenos de superfície celular como marcadores de tecido:

Os antígenos das células cultivadas são úteis para a detecção de tecidos ou células de origem. Na verdade, muitos anticorpos foram desenvolvidos (kits comerciais estão disponíveis) para as linhas de células de identificação (Tabela. 35.2). Esses anticorpos são produzidos contra antígenos da superfície celular ou outras proteínas.

Os anticorpos produzidos contra o antígeno a-fetoproteína secretado servem como um marcador para a identificação de hepatócitos fetais. Anticorpos de antígenos de superfície celular, nomeadamente integrinas & # 8217s, podem ser usados ​​para a detecção geral de linhas celulares.

Células transformadas:

Transformação é o fenômeno da mudança do fenótipo devido à aquisição de novo material genético. A transformação está associada à promoção da instabilidade genética.

As células transformadas e cultivadas exibem alterações em muitos caracteres com referência a:

e. Formação de produtos especializados.

Ao caracterizar as linhas de células, é necessário considerar os caracteres acima para determinar se a linha de células se originou de células tumorais ou sofreu transformação em cultura.

Identificação de linhas celulares específicas:

Existem muitas abordagens em um laboratório de cultura para identificar linhas celulares específicas:

c. Análise de RNA e proteína

A espécie e o sexo dos quais a linha celular é derivada podem ser identificados por análise cromossômica. Além disso, também é possível distinguir células normais e malignas pela análise dos cromossomos. Pode-se notar que as células normais contêm cromossomos mais estáveis. As importantes técnicas empregadas com relação à análise cromossômica são descritas resumidamente.

Por meio dessa técnica, é possível identificar pares de cromossomos individuais quando há pouca diferença morfológica entre eles. A bandagem cromossômica pode ser feita usando coloração Giemsa.

Uma contagem direta de cromossomos pode ser feita por propagação entre 50-100 propagações. Um anexo de câmera Lucida ou um circuito fechado de televisão podem ser úteis.

Cariótipo cromossômico:

Nessa técnica, os cromossomos são cortados, classificados em sequência e, a seguir, colados em uma folha. A imagem pode ser gravada ou digitalizada do slide. A cariotipagem cromossômica é demorada quando comparada à contagem de cromossomos.

A quantidade total de DNA por célula normal é bastante constante e é característica da espécie de origem, e. linhas celulares normais de fibroblastos humanos, de galinha e de hamster. No entanto, o conteúdo de DNA varia nas linhagens celulares normais de camundongo e também nas linhas celulares obtidas de tecidos cancerosos. A maioria das células transformadas são aneuplóides e heteroplóides. A análise de DNA é particularmente útil para a caracterização de tais células. A análise de DNA pode ser realizada por hibridização de DNA e impressão digital de DNA.

A popular técnica de Southern blotting pode ser usada para detectar sequências únicas de DNA. Para este fim, podem ser utilizadas sondas moleculares específicas com radioisótopos, marcadores fluorescentes ou luminescentes. O DNA das linhas celulares desejadas é extraído, cortado com endonucleases de restrição, submetido a eletroforese, transferido para nitrocelulose e, em seguida, hibridizado com uma sonda molecular (marcada) ou um conjunto de sondas. Por esta abordagem, sequências específicas de DNA nas linhas de células podem ser detectadas.

Existem certas regiões no DNA de uma célula que não são transcritas. Essas regiões, chamadas de DNA satélite, não têm funções conhecidas e acredita-se que possam fornecer reservatórios para a evolução genética. As regiões de DNA satélite são consideradas regiões de hiper variabilidade. Estas regiões podem ser cortadas com endonucleases de restrição específicas e detectadas usando sondas de cDNA.

Usando eletroforese e autorradiografia, os padrões de variações de DNA de satélite podem ser detectados. Esses padrões conhecidos como impressões digitais de DNA são específicos da linha celular. Nos últimos anos, a técnica de impressão digital de DNA se tornou uma ferramenta muito popular e poderosa para determinar a origem das linhagens celulares.

Análise de RNA e proteína:

As características do fenótipo de uma linha celular podem ser detectadas por expressão gênica, isto é, identificação de RNAs e / ou proteínas. Os mRNAs podem ser identificados pela técnica de Northern blot, enquanto as proteínas podem ser detectadas pela técnica de Western blot.

Algumas das atividades enzimáticas in vivo são perdidas quando as células são cultivadas in vitro. Por exemplo, a atividade da arginase das células do fígado é perdida poucos dias após a cultura. No entanto, certas linhas celulares expressam enzimas específicas que podem ser utilizadas para a sua detecção, e. tirosina aminotransferase para hepatócitos, atividade da glutamil sintase para astroglia no cérebro. Para mais exemplos de enzimas úteis na detecção de linha celular, consulte a Tabela 35.1.

As múltiplas formas de uma enzima que catalisa a mesma reação são referidas como isoenzimas ou isoenzimas. As isoenzimas diferem em muitas propriedades físicas e químicas - estrutura, propriedades eletroforéticas e imunológicas, Km e Vmax valores.

As isoenzimas podem ser separadas por técnicas analíticas, como eletroforese e cromatografia. Mais freqüentemente, é usada a eletroforese empregando agarose, acetato de celulose, amido e poliacrilamida. A enzima bruta é aplicada em um ponto no meio eletroforético. À medida que as isoenzimas migram, elas se distribuem em diferentes bandas, que podem ser detectadas pela coloração com substratos cromogênicos adequados.

As isoenzimas são características das espécies ou tecidos. Isoenzimas das seguintes enzimas são comumente usadas para detecção de linha celular:

c. Glicose 6-fosfato desidrogenase

d. Aspartato aminotransferase

A análise de isoenzima também é útil para a detecção de contaminação cruzada entre espécies de linhas celulares. Por exemplo, a contaminação da linha de células de camundongo com a linha de células de hamster pode ser identificada usando isoenzimas de peptidase B.

As linhas celulares podem ser caracterizadas pela detecção de marcadores antigênicos por meio do uso de anticorpos. Os marcadores antigênicos podem estar localizados na superfície celular ou secretados pelas células no meio de cultura. Alguns dos anticorpos comumente usados ​​para a detecção de diferentes tipos de células são apresentados na Tabela 35.2 (ver pág. 430).

Medição dos parâmetros de crescimento de células cultivadas:

As informações sobre o estado de crescimento de uma determinada cultura são necessárias para:

uma. Projete experimentos de cultura.

b. Manutenção de rotina da cultura.

c. Medição da proliferação celular.

d. Conheça a hora da subcultura.

e. Determine a resposta da cultura a um determinado estímulo ou toxina.

Alguns dos termos comumente usados ​​em relação à medição do crescimento de células em cultura são explicados.

Tempo de duplicação da população (PDT):

O intervalo de tempo para a população de células dobrar no meio da fase logarítmica (log).

Tempo de ciclo celular ou tempo de geração:

O intervalo de um ponto na divisão celular até o mesmo ponto no ciclo, uma divisão depois. Assim, o tempo do ciclo celular é medido a partir de um ponto no ciclo celular até que o mesmo ponto seja alcançado novamente.

Ele denota o estágio de cultura em que todo o substrato disponível (área de crescimento) é utilizado e as células estão em contato próximo umas com as outras.

Inibição da motilidade celular e irritação da membrana plasmática quando as células estão em contato completo com outras células adjacentes. Isso ocorre principalmente no estado de confluência e resulta na cessação da proliferação celular.

O número de células por ml de meio.

A densidade das células (células / ml 2, área de superfície) na fase de platô.

Ciclo de crescimento de células cultivadas:

O ciclo de crescimento das células em cultura é convencionalmente representado por três fases - a fase de latência, a fase log (exponencial) e a fase de platô (Fig. 35.5). As propriedades das células cultivadas variam nas fases.

A fase de latência representa um período de adaptação durante o qual a célula forma a superfície celular e a matriz extracelular (perdida durante a tripsinização), se fixa ao substrato e se espalha. Há um aumento da síntese de certas enzimas (por exemplo, DNA polimerase) e proteínas estruturais, preparando as células para a proliferação.

Desaparece a produção de produtos especializados, que podem não reaparecer até que cesse a proliferação celular. A fase de latência representa o estágio preparativo das células para a proliferação após a subcultura e a nova propagação.

A fase logarítmica é caracterizada por um crescimento exponencial de células, após a fase latente.

A duração da fase logarítmica depende das células com referência a:

c. Densidade após proliferação.

Durante a fase logarítmica, as células cultivadas estão no estado mais uniforme e reprodutível com alta viabilidade. Este é o momento ideal para a amostragem. A fase de registro termina após a confluência ser alcançada com a adição de uma ou duas duplicações da população.

À medida que as células atingem a confluência, a taxa de crescimento é muito reduzida e a proliferação das células em cultura quase pára.

Este estágio representa platô ou fase estacionária e é caracterizado por:

b. Franzimento reduzido da membrana plasmática.

c. Células que ocupam uma área de superfície mínima.

f. Depleção de nutrientes e fatores de crescimento.

g. Síntese reduzida de proteínas estruturais.

h. Maior formação de produtos especializados.

A maioria das células cultivadas normais que formam monocamadas param de crescer à medida que atingem a confluência. Algumas das células, no entanto, com reposição do meio, continuam a crescer (a uma taxa reduzida) após a confluência, formando multicamadas de células. As células cultivadas transformadas geralmente atingem uma densidade celular mais alta em comparação com as células normais na fase de platô (Fig. 35.6).

Eficiência de chapeamento de células cultivadas:

A eficiência do plaqueamento, que representa a formação de colônias em baixa densidade celular, é uma medida usada para analisar a proliferação e sobrevivência celular.

Quando as células, em baixas densidades, são cultivadas na forma de suspensões de células únicas, elas crescem como colônias discretas. A eficiência de galvanização é calculada como segue.

Eficiência de galvanização = Nº de colônias formadas / Nº. de células semeadas × 100

O termo eficiência de clonagem é usado (em vez de eficiência de plaqueamento) quando cada colônia cresce a partir de uma única célula.

A eficiência de semeadura que representa a sobrevivência das células em densidades mais altas é calculada como segue.

Eficiência de semeadura = Nº de células recuperadas / Nº. de células semeadas × 100

Sincronização de células:

A sincronização significa literalmente fazer duas ou mais coisas acontecerem exatamente ao mesmo tempo. Por exemplo, dois ou mais relógios podem ser sincronizados para mostrar exatamente a mesma hora. As células em diferentes estágios do ciclo celular em uma cultura podem ser sincronizadas para que as células estejam na mesma fase. A sincronia celular é necessária para estudar a progressão das células ao longo do ciclo celular. Várias técnicas de laboratório foram desenvolvidas para alcançar a sincronização de células.

Eles são amplamente categorizados em dois grupos:

1. Fracionamento físico para separação de células.

2. Bloqueio químico para separação de células.

Separação de células por meios físicos:

Estão em uso técnicas de fracionamento físico ou separação de células, com base nas seguintes características:

c. Afinidade de anticorpos em epítopos de superfície celular.

d. Dispersão de luz ou emissão fluorescente por células marcadas.

As duas técnicas comumente usadas, nomeadamente elutriação centrífuga e separação de células ativadas por fluorescência, são descritas resumidamente a seguir.

Elutriação centrífuga:

As características físicas - tamanho da célula e velocidade de sedimentação são operativas na técnica de elutriação centrífuga. O elutriador centrífugo (da Beckman) é um dispositivo avançado para aumentar a taxa de sedimentação para que o rendimento e a resolução das células sejam melhores. A separação das células é realizada em uma centrífuga e rotor especialmente projetados (fig. 35.7). As células no meio são bombeadas para a câmara de separação enquanto o rotor está girando.

Devido à força centrífuga, a célula será empurrada para as bordas. À medida que o meio é então bombeado através da câmara de forma que o fluxo centrípeto seja igual à taxa de sedimentação das células. Devido às diferenças nas células (tamanho, densidade, configuração da superfície celular), as células tendem a sedimentar em taxas diferentes e atingir o equilíbrio em diferentes posições na câmara.

Toda a operação no elutriador pode ser visualizada através da porta, já que a câmara é iluminada por luz estroboscópica. No equilíbrio, a taxa de fluxo pode ser aumentada e as células podem ser bombeadas e separadas em vasos coletores em diferentes frações. É possível realizar a separação das células em meio completo, de forma que as células possam ser cultivadas diretamente após a separação.

Classificação de células ativadas por fluorescência:

A classificação de células ativadas por fluorescência é uma técnica para classificar as células com base nas diferenças que podem ser detectadas por dispersão de luz (por exemplo, tamanho da célula) ou emissão de fluorescência (por DNA pré-tratado, RNA, proteínas, antígenos). O procedimento envolve a passagem de um único fluxo de células através de um feixe de laser para que a luz espalhada pelas células possa ser detectada e registrada. Quando as células são pré-tratadas com uma coloração fluorescente (por exemplo, cromomicina A para DNA), a emissão fluorescente excitada pelo laser pode ser detectada.

Existem dois instrumentos em uso com base no princípio de classificação de células ativadas por fluorescência:

Este instrumento é capaz de separar células (de uma população) em diferentes fases do ciclo celular com base nas medições de uma combinação de tamanho de célula e fluorescência de DNA.

2. Classificador de células ativadas por fluorescência (FACS):

Neste instrumento, os sinais de emissão das células são medidos e as células classificadas em tubos de coleta.

Comparação entre métodos físicos:

Para a separação de um grande número de células, o elutriador centrífugo é preferido. Por outro lado, a classificação de células ativadas por fluorescência é usada principalmente para obter frações de células puras de alto grau a partir de pequenas quantidades de células.

Separação de células por bloqueio químico:

As células podem ser separadas bloqueando as reações metabólicas. Dois tipos de bloqueios metabólicos estão em uso - inibição da síntese de DNA e privação nutricional.

Inibição da síntese de DNA:

Durante a fase S do ciclo celular, a síntese de DNA pode ser inibida pelo uso de inibidores como timidina, aminopterina, hidroxiureia e citosina arabinósido. Os efeitos desses inibidores são variáveis. O ciclo celular é predominantemente bloqueado na fase S que resulta em células viáveis.

Privação nutricional:

A eliminação do soro ou isoleucina do meio de cultura por cerca de 24 horas resulta no acúmulo de células em G1 Estágio. Este efeito de privação nutricional pode ser restaurado por sua adição, momento em que ocorre a sincronia celular.

Alguns destaques da sincronização de células:

uma. A separação de células por métodos físicos é mais eficaz do que procedimentos químicos.

b. O bloqueio químico costuma ser tóxico para as células.

c. As células transformadas não podem ser sincronizadas pela privação nutricional.

d. Um alto grau de sincronia celular (& gt80%) pode ser obtido no primeiro ciclo, e no segundo ciclo seria & lt60%. A distribuição celular pode ocorrer de forma aleatória no terceiro ciclo.

Senescência celular e apoptose:

Conforme as células crescem em cultura, elas envelhecem devido ao envelhecimento e não podem mais proliferar. O fim do ciclo de vida proliferativo das células é conhecido como senescência.

Senescência celular:

O crescimento das células é geralmente medido como duplicação da população (PDs). Os PDs referem-se ao número de vezes que a população de células dobra de número durante o período de cultura e são calculados pela seguinte fórmula.

Registro10 (Nº de células colhidas) & # 8211 log10 (Nº de células semeadas) / log10 2

O fenômeno da senescência tem sido estudado principalmente com culturas de fibroblastos humanos. Após 30-60 duplicações de populações, a cultura é composta principalmente de fibroblastos senescentes. Esses fibroblastos senescentes são incapazes de se dividir em resposta a estímulos mitóticos. Deve-se notar que as células não aparecem repentinamente, mas gradualmente se acumulam e aumentam em número durante a vida útil da cultura.

Os diferentes parâmetros usados ​​para a medição do crescimento celular em culturas estão listados abaixo:

uma. Medida direta do número de células.

b. Determinação do conteúdo de DNA / RNA.

c. Estimativa da concentração de proteína / ATP.

Medição da senescência:

A medição direta de células senescentes é bastante difícil.

Algumas das medidas indiretas são:

uma. Perda de atividade metabólica

b. Ausência de incorporação do precursor marcado (3 H-timidina) no DNA.

c. Certas técnicas histoquímicas.

Associado à senescência βensaio de atividade de galactosidase

Ocorre uma superexpressão da enzima lisossomal β-galactosidase na senescência. Essa elevação da enzima também está associada a um aumento no tamanho da célula, à medida que a célula entra em um estado de não divisão permanente. O número de células senescentes em uma cultura pode ser medido pelo ensaio de β-galactosidase associada à senescência (SA-β).

O ensaio consiste nas seguintes etapas:

1. Lave as células e fixe-as com um fixador (por exemplo, para formaldeído) e lave novamente.

2. Adicione a solução de coloração (pó de X-gal em dimetilformamida dissolvida em tampão) às células fixadas e incube.

3. As células senescentes exibem uma cor azul densa que pode ser contada.

Apoptose:

O processo de morte celular programada (PCD) é conhecido como apoptose. A morte celular pode ser iniciada por um estímulo específico ou como resultado de vários sinais recebidos do meio externo. A apoptose ocorre como resultado de mecanismos celulares inerentes, que finalmente levam à autodestruição. A célula ativa uma série de eventos moleculares que causam uma degradação ordenada dos constituintes celulares com impacto mínimo nos tecidos vizinhos.

Razões para apoptose in situ:

1. Para um desenvolvimento adequado:

A formação dos dedos das mãos e dos pés do feto requer a remoção dos tecidos entre eles. Isso geralmente é realizado por apoptose.

2. Destruição de células que representam ameaça à integridade do organismo:

A morte celular programada é necessária para destruir e remover as células que, de outra forma, podem danificar os organismos.

Alguns exemplos são listados:

uma. Células com DNA danificado durante o desenvolvimento embrionário. Se não forem destruídos, podem resultar em defeitos de nascença.

b. As células do sistema imunológico, após sua função imunológica apropriada, sofrem apoptose. Isto é necessário para prevenir doenças autoimunes, e. artrite reumatóide.

c. As células infectadas com vírus são destruídas por apoptose.

3. Destruição celular devido a sinais negativos:

Existem vários sinais negativos dentro das células que promovem a apoptose. Isso inclui acúmulo de radicais livres, exposição a raios ultravioleta, raios X e drogas quimioterápicas.

Mecanismo de apoptose:

A morte celular programada pode ocorrer devido a três mecanismos diferentes:

1. Apoptose devido a sinais internos.

2. Apoptose desencadeada por sinais externos, por ex. fator de necrose tumoral-α (TNF-α), linfotoxina.

3. Apoptose desencadeada por espécies reativas de oxigênio.

Papel das caspases na apoptose:

Um grupo de enzimas, nomeadamente proteases ativadas, desempenha um papel crucial na morte celular programada. Essas proteases são, na verdade, proteinases específicas do aspartato de cisteinila ou, em resumo, comumente chamadas de caspases. Existem cerca de dez tipos diferentes de caspases agindo em diferentes substratos, levando à morte celular. Por exemplo, a capsase I cliva a interleucina 1β.

Inibição das atividades da caspase:

Uma vez que as caspases estão intimamente envolvidas na apoptose, é possível prevenir a morte celular inibindo suas atividades. Certos peptídeos específicos que podem inibir caspases e, portanto, apoptose foram identificados.

Medição de apoptose:

Uma maneira simples e fácil de detectar células mortas ou moribundas é a observação microscópica direta. As células mortas são arredondadas com corpos densos que podem ser identificados ao microscópio de contraste de fase. As células que sofreram apoptose contêm cromatina fragmentada que pode ser detectada por técnicas de coloração convencionais. Nos últimos anos, técnicas mais sensíveis e confiáveis ​​foram desenvolvidas para medir a apoptose.

Alguns deles são descritos resumidamente:

Determinação da proporção ADP / ATP:

Tanto o crescimento quanto a apoptose das células requerem ATP. Mas quando há parada de crescimento, ocorre uma elevação do ADP. Assim, medir a razão ADP / ATP lançará luz sobre as células mortas. Na verdade, alguns sistemas de ensaio para medir as razões ADP / ATP estão disponíveis comercialmente.

Um evento bioquímico significativo para a apoptose é a ativação da atividade da nuclease endógena. Esta enzima cliva o DNA em fragmentos com grupos 3-hidroxila livres. Os pequenos fragmentos de DNA recém-formados podem ser estendidos empregando-se a enzima DNA polimerase. Se os nucleotídeos marcados forem usados ​​para a extensão do fragmento de DNA, eles podem ser detectados.

TUNEL é uma abreviatura de TdT-mediated dUTP nick end-labeling assay. TUNEL é muito rápido e eficaz para a determinação de fragmentos de DNA formados pela atividade de nuclease endógena. Os núcleos apoptóticos podem ser identificados por uma técnica fluorescente usando isotiocianato de fluoresceína (FITC) e 4, 6-diaminofenilindol.

Durante o curso da apoptose, o DNA genômico é clivado em fragmentos de DNA mono e oligonucleossômicos. Esses fragmentos podem ser separados por eletroforese em agarose e detectados. Os fragmentos nucleossômicos de células apoptóticas fornecem um padrão de escada característico na eletroforese.

Limitações do teste:

O teste de escada de DNA não é muito específico, pois várias células que sofreram apoptose podem não apresentar escada de DNA. Além disso, algumas células não sujeitas à apoptose também podem apresentar escadas de DNA, por essas razões, o teste de escada de DNA é acoplado a algum outro teste para medição de apoptose.


3 células híbridas

A proliferação simultânea de microfluídica, expressão de proteína livre de células, design de circuito de gene e tecnologias de engenharia de membrana significa que agora é possível fundir células vivas e sintéticas para formar entidades híbridas. Isso, por sua vez, permite que as vantagens associadas a cada um sejam combinadas e as desvantagens sejam atenuadas. Pode-se imaginar células e organelas sendo usadas como módulos funcionais que são acoplados a células artificiais, permitindo-lhes aproveitar todo o poder da biologia. O uso direto de células vivas como módulos em um contexto de célula artificial ignora as limitações de fazer novos módulos a partir do zero. Em vez disso, os componentes celulares que foram esculpidos durante a evolução podem ser sequestrados, permitindo uma mudança radical na sofisticação e nas capacidades das células artificiais.

Embora esta área de pesquisa ainda esteja em sua infância, surgiram vários estudos recentes que permitiram alguma generalização a respeito dos diferentes modos com os quais células vivas e sintéticas podem ser acopladas. No geral, três rotas de hibridização diferentes são possíveis, representadas na Figura 2.

Esquema dos principais modos de hibridização biônica celular em que células vivas e sintéticas têm interface química ou física entre si.

Hibridização populacional, onde células biológicas e artificiais distintas se comunicam entre si através do espaço, trocando informações e materiais.

Hibridização incorporada, onde as células vivas são incorporadas dentro de outras sintéticas ou vice-versa, com as células encapsuladas desempenhando funções semelhantes a organelas em seu hospedeiro.

Hibridização em rede, em que células artificiais e biológicas existem como entidades distintas fisicamente ligadas umas às outras em uma rede ou em um arranjo semelhante a um tecido.

Por meio dessas três rotas de hibridização, é possível atravessar escalas de comprimento: do nível molecular ao organelo, celular e nível de material a granel multicelular. Agora segue uma revisão de alguns exemplos marcantes que se enquadram nessas classes.

3.1 Hibridização da População

Já existe literatura bastante diversa sobre a comunicação entre várias células sintéticas de diferentes classes, incluindo aquelas baseadas em vesículas lipídicas, 16, 34 proteinossomos 23 e polimerssomas. 34 Também houve exemplos de comunicação projetada entre duas espécies diferentes de células artificiais, incluindo entre vesículas e proteinossomas. 12a Predador / presa 35 e relações de resposta / retaliação 36 entre coacervados e proteinossomas também foram demonstradas.

Houve esforços para desenvolver esses exemplos e criar uma comunicação entre populações distintas de células vivas e sintéticas (Figura 3). Alguns deles exigiram que as células fossem incorporadas em uma matriz de gel de ágar para proteger as células artificiais dos efeitos desestabilizadores das bactérias circundantes. 37 Um dos primeiros exemplos envolveu o desenvolvimento de uma célula sintética contendo um protometabolismo capaz de sintetizar uma molécula que eliciou uma resposta de sinalização celular em bactérias. 38 O protometabolismo consistia em uma reação de formose autocatalítica de síntese de açúcar, cujo produto era secretado pela célula sintética e, em seguida, acionava o mecanismo natural de detecção de quorum de Vibrio Harveyi, produzindo uma saída luminescente.

Hibridização de populações. A) Esquema de células artificiais traduzindo um sinal químico (teofilina) em um sinal (IPTG) que E. coli pode sentir e responder por meio da expressão GFP. Resultados de FACS mostrando uma mudança na fluorescência do E. coli população na presença de células artificiais mais teofilina são mostradas abaixo. Imagem modificada com permissão da Ref. 39 B) Esquema de uma comunicação mediadora de células artificiais entre V. fischeri e projetado E. coli por meio da detecção e liberação de diferentes moléculas de detecção de quorum. Resultados FACS mostrando comunicação bem-sucedida por meio da expressão GFP em E. coli são mostrados abaixo. Imagem modificada com permissão da Ref. 40

Esse conceito foi levado a um novo patamar por Lentini et al., Que, em vez de usar reações enzimáticas, incorporaram elementos genéticos e sistemas de expressão livre de células em células artificiais para estabelecer a via de comunicação (Figura 3 A). 39 Suas células baseadas em vesículas continham um programa de DNA que codificava para um riboswitch que ativava a tradução em resposta à presença de uma pequena molécula, a teofilina. Isso então iniciou a síntese da proteína formadora de poros α-hemolisina (αHL), que levou à liberação da molécula indutora IPTG, que por sua vez iniciou a produção de GFP em uma população de E. coli. Teofilina é uma molécula que E. coli normalmente não responderia. As células sintéticas em vigor foram capazes de "traduzi-lo" em um sinal químico que pode ser processado por bactérias, expandindo assim efetivamente a faixa sensorial do E. coli. Tudo isso sem alterar significativamente o conteúdo genético da bactéria.

O mesmo grupo, 40 assim como outros pesquisadores, 41 expandiu este trabalho ao desenvolver células sintéticas que poderiam enviar e receber mensagens químicas de / para bactérias, completando o ciclo de comunicação. Isso foi feito através da reconstituição de vias de detecção de quorum celular em células sintéticas, alcançando assim uma comunicação bidirecional. 40 Esse princípio também foi usado para projetar a comunicação entre três espécies de células, com as células artificiais mediando a comunicação entre duas espécies bacterianas diferentes (Figura 3 B). Curiosamente, os autores usaram a capacidade das bactérias de reconhecer as células sintéticas como uma das suas como um parâmetro para determinar o quão “parecidas com a vida” as células artificiais são, de maneira semelhante ao teste de Turing para inteligência artificial. Os autores propuseram que o grau de resposta da bactéria, um processo que pode ser quantificado por meio da análise do RNA da transcrição, pode ser usado como um proxy de quão “semelhantes à vida” são as células artificiais. Isso demonstra muito bem algumas das implicações filosóficas que podem surgir da hibridização de células vivas e sintéticas.

Outros implantaram a comunicação entre as populações de células vivas e sintéticas para demonstrar aplicações funcionais por meio de estudos de viabilidade. Por exemplo, Krinsky et al. têm mostrado potenciais usos terapêuticos para esta abordagem através da construção de células artificiais que sintetizam proteínas anticâncer que inibem o crescimento do tumor in vitro e in vivo. 42 As tentativas bem-sucedidas de criar um sistema de sentido / resposta de feedback entre células vivas e artificiais também levaram à síntese de peptídeos antimicrobianos que mataram as bactérias circundantes por meio de lise. 41 Finalmente, Amidi et al. exploraram o uso de células artificiais como microrreatores de vacinas geneticamente programáveis ​​por meio da expressão de proteínas livres de células de antígenos. 43 Quando implantados em camundongos, eles mostraram provocar uma resposta imune.

3.2 Hibridização incorporada

O modo de hibridização incorporado envolve a criação de células híbridas por meio de encapsulamento físico (Figura 4). Isso pode envolver o encapsulamento de células vivas em células sintéticas ou vice-versa. Uma analogia pode ser traçada com a origem das organelas eucarióticas, onde organismos de vida livre anteriormente foram absorvidos por um hospedeiro para produzir células eucarióticas por meio de uma relação simbiótica mutuamente benéfica entre os dois. As organelas resultantes existem em um ambiente físico-químico distinto, permitindo que sejam especializadas para executar tarefas específicas. Compartimentos semelhantes a organelas incorporados têm sido usados ​​em um contexto de célula puramente artificial, por exemplo, para transcrição e tradução segregadas espacialmente, 44 para reação enzimática responsiva a estímulos em células à base de vesículas 45 e para engenharia de cascatas de sinalização sintéticas entre compartimentos. 46 Existe agora uma tendência emergente para expandir este conceito para a criação de sistemas vivos / sintéticos híbridos.

Hibridização incorporada. A – C) Exemplos de células vivas encapsuladas em células sintéticas. A) Células eucarióticas projetadas encapsuladas em uma célula artificial contendo um metabolismo sintético. O acoplamento das células vivas e sintéticas desta forma resultou em uma cascata enzimática levando à produção de uma molécula fluorescente (resorufina) dentro do biorreator híbrido. Figura modificada com permissão da Ref. 47 B) Imagens microscópicas mostrando cloroplastos (vermelho) encapsulados em coacervados (verde). Os cloroplastos mantiveram suas capacidades de transporte de elétrons induzido pela luz, conforme demonstrado pela redução de um reagente de Hill (DPIP), representado no esquema. Figura modificada com permissão da Ref. 50 C) Esquema de uma organela cromatóforo extraída de um organismo fotossintetizante e inserida em uma célula sintética. Após a irradiação de luz, isso levou à produção de ATP, que alimentou o aparelho de tradução para produzir mRNA. Figura modificada com permissão da Ref. 51 Copyright 2020, os autores. D) Um exemplo de célula sintética encapsulada em uma viva. As células sintéticas desempenhavam uma função semelhante à organela, degradando H2O2, protegendo assim a célula dos efeitos prejudiciais desta molécula. Imagem modificada com permissão da Ref. 54

3.2.1 Células Biológicas Encapsuladas em Células Sintéticas: "Vivendo em Sintético"

Houve várias demonstrações de células vivas encapsuladas em células sintéticas para a criação de híbridos. Por exemplo, microfluídicos de gotículas foram usados ​​para encapsular células em vesículas lipídicas gigantes, com as células encapsuladas projetadas para ter uma função semelhante a organela. 47 Especificamente, as células do carcinoma do cólon foram modificadas para expressar uma enzima que realizava uma etapa de uma cascata enzimática de várias etapas (Figura 4 A). O produto enzimático foi então posteriormente processado por um metabolismo sintético co-encapsulado na vesícula. Desta forma, a célula encapsulada atuou como um módulo de biorreator dentro das células sintéticas. Esta abordagem foi expandida ainda mais através do encapsulamento de produtos geneticamente modificados E. coli projetado para detectar o lactato nas vesículas. 48 A bactéria agia assim como um módulo biossensor, permitindo a detecção de lactato pela construção de vesícula híbrida. Nestes exemplos, não apenas a célula biológica conferiu funcionalidade à célula sintética, mas a célula sintética também protegeu a célula encapsulada de um exterior tóxico, demonstrando uma relação mutuamente benéfica. Outros pesquisadores encapsularam mitocôndrias em vesículas 49 e cloroplastos viáveis ​​em células sintéticas à base de coacervato (Figura 4 B), 50 levando à possibilidade emocionante de essas organelas serem usadas como módulos de biobateria para alimentar processos bioquímicos encapsulados. Finalmente, em um artigo inovador recente, Altamura et al. extraídos cromatóforos de Rhodobacter sphaeroides e os usou como organelas fotossintetizantes dentro de células artificiais (Figura 4 C). Sob iluminação, estes convertiam ADP em ATP, que por sua vez sustentava a transcrição de DNA em mRNA, abrindo caminho para a regeneração contínua de moléculas transportadoras de energia usando uma fonte de energia externa. 51 Da mesma forma, tem havido esforços recentes para se apropriar das membranas tilacóides e acoplá-las a um ciclo enzimático sintético que fixa o dióxido de carbono nas gotículas de água em óleo, conseguindo assim uma reação anabólica fotossintética em uma construção semelhante a uma célula. 52

3.2.2 Células sintéticas encapsuladas em células biológicas: "Sintéticas em vida"

O motivo arquitetônico acima também pode ser revertido, com organelas sintéticas sendo introduzidas em células vivas, como uma forma de implante celular. Até o momento, as organelas sintéticas dependem de processos enzimáticos e não funcionam com programas de DNA acoplados à expressão de proteínas livres de células.Um exemplo impressionante de híbridos vivos sintéticos envolveu a criação de organelas sintéticas baseadas em polímeros que abrigavam enzimas capazes de produzir uma molécula fluorescente a partir de um precursor não fluorescente. 53 Essas organelas foram projetadas para serem responsivas a estímulos: o fluxo molecular através do poro da proteína projetada OmpF (e, portanto, a ativação da organela) foi acionado quando a estrutura experimentou uma mudança no potencial redox ao entrar no microambiente intracelular. Impressionantemente, foi demonstrado que essas organelas podiam responder aos níveis de glutationa intracelular e eram funcionais in vivo em embriões de peixe-zebra.

Da mesma forma, van Oppen et al. usou um sistema baseado em polimersomos que foi funcionalizado com peptídeos de penetração celular em sua superfície externa, o que facilitou a captação por células renais embrionárias humanas, bem como por fibroblastos primários humanos. 54 As organelas albergavam a enzima catalase no interior, o que lhes permitia degradar as espécies oxidativas reativas adicionadas externamente, protegendo a célula de seus efeitos negativos (Figura 4 D). Uma abordagem semelhante, que se baseou em polimerssomas funcionalizados com canais transmembrana e duas enzimas acopladas, foi usada para imitar os peroxissomos. Essas organelas foram capazes de desintoxicar os radicais superóxidos e H2O2. Estes exemplos são outras demonstrações do potencial da terapia de organela, dado que as espécies oxidativas reativas em geral, e a atividade reduzida da catalase em particular, desempenham um papel em uma série de condições médicas, incluindo Alzheimer, Parkinson, Huntington, acatalasemia, doenças metabólicas e câncer. 55

Outros pesquisadores desenvolveram organelas sintéticas multicamadas compostas de lipossomas e polimerssomas que abrigam enzimas distintas em camadas diferentes. 56 Estes foram capazes de realizar cascatas enzimáticas de várias etapas com glicose como matéria-prima. As organelas sintéticas podem ser internalizadas por macrófagos, onde preservam sua atividade, utilizando uma fonte intracelular de glicose para iniciar uma reação em cascata externa controlada na célula hospedeira. Também houve um exemplo de organelas sintéticas que foram projetadas para reduzir viabilidade celular através da produção de espécies oxidativas reativas usando a enzima glicose oxidase e uma matéria-prima de glicose. 57

Finalmente, em um estudo recente, um conjunto de organelas baseadas em vesículas sintéticas com diversas funcionalidades formadas usando microfluídicos de gotículas foram incorporadas em células vivas. 58 Um tipo de organela mimetizou peroxissomos por meio da incorporação de módulos enzimáticos. Um segundo tipo de organela foi projetado para atuar como um módulo de sinalização responsivo à luz intracelular que poderia liberar os estoques de cálcio, com potencial para atuar como um elemento regulador artificial. Um terceiro tipo de organela foi projetado para dar ao hospedeiro um sentido magnetotático, permitindo que as células se reorientassem e se movessem em resposta a um campo magnético. O último exemplo é uma demonstração poderosa da incorporação de funcionalidades não intrínsecas inteiramente novas, não encontradas de outra forma nas células hospedeiras.

3.3 Hibridização em rede

O modo de hibridização em rede envolve células artificiais e biológicas discretas fisicamente interligadas umas às outras em um arranjo espacial distinto. Até o momento, houve apenas alguns exemplos disso, descritos abaixo. Isso contrasta com as redes interligadas de células puramente sintéticas, das quais há mais exemplos, incluindo a criação de redes autodobráveis ​​semelhantes a tecido compostas por milhares de compartimentos ligados em duas camadas, 59 expressão gênica ativada por luz em células individuais de um tecido sintético, 60 compartimentos de células sintéticas em rede para ativação e liberação controlada de pró-fármacos 61 e grupos de proteinossoma termorresponsivos capazes de expansão e contração cíclicas. 30c

Um dos poucos exemplos de estruturas em rede híbridas vivas / sintéticas envolveu células artificiais e biológicas que se comunicaram umas com as outras de uma maneira dependente de sua conectividade geométrica precisa. 62 Neste trabalho, os compartimentos em rede foram baseados em gotas de água em óleo que foram conectadas em uma cadeia linear. Gotas na rede continham E. coli ou um sistema de expressão livre de células e um programa de DNA. Tanto as células sintéticas quanto as biológicas foram projetadas para possuir genomas que poderiam produzir moléculas indutoras ou responder a elas por meio da expressão de GFP, com o mecanismo de detecção regulado por meio do operon lux. Os autores foram capazes de obter a expressão gênica dependente da posição usando um gradiente de morfogênio, criando assim uma forma de diferenciação celular artificial que foi determinada por sua localização em relação a suas vizinhas.

Outro exemplo envolveu o uso de padrões de ondas estacionárias acústicas para ligar células sintéticas baseadas em vesículas e bactérias. 63 A tecnologia permitiu que as geometrias, dimensões da rede e ocupação de armadilhas de estruturas fossem controladas. Usando esta configuração, os autores puderam formar redes de células sintéticas que produziram H2O2 através de uma cascata enzimática. Este produto de reação então se difundiu através dos poros de proteína incorporados para adjacentes E. coli células, levando à morte celular. Esta abordagem foi estendida para projetar a comunicação entre redes 1D e 2D de células sintéticas e glóbulos vermelhos. 64 Sistemas semelhantes envolvendo proteinossomos carregados positivamente, que mostram uma interação programada dependente da temperatura e do sal com seres vivos E. coli, foi desenvolvido. 65 Estes demonstraram ser capazes de capturar e liberar micróbios da superfície do colóide de uma maneira responsiva a estímulos. Finalmente, tem havido esforços para gerar materiais híbridos semelhantes a tecido estendidos usando impressão 3D de tecidos sintéticos compostos de chassis de células sintéticas revestidas com membrana lipídica. Essas construções continham células de mamíferos incorporadas, uma abordagem que permite a padronização de alta solução de células em um material impresso e tem aplicações potenciais na medicina regenerativa. 66


Mecanismo milagroso permite que as células vegetais distribuam direcionalmente o hormônio de crescimento auxina

imagem: Bryce Benda

Leiden e pesquisadores austríacos conseguiram descobrir como uma célula vegetal passa o hormônio do crescimento auxina de uma maneira direcional para a próxima célula. Três proteínas que se aglomeram em um cacho parecem ser essenciais para esse importante processo de transporte. "Esta descoberta resolve uma peça crucial do quebra-cabeça", disse o professor Remko Offringa.

O hormônio auxina pode ser visto como o motor de crescimento de uma planta. Auxin determina como e onde uma planta cresce, tanto nos brotos quanto nas raízes. Mas como esse hormônio do crescimento vai parar nos lugares certos da planta? Até agora, sabia-se que as proteínas de transporte transmitem auxina de célula para célula. Essas proteínas são uma espécie de minicanais móveis na membrana celular - a "superfície externa" da célula.

"Imagine uma célula vegetal como uma caixa retangular", diz Remko Offringa, professor de genética do desenvolvimento de plantas. "As proteínas de transporte se reúnem em uma das quatro superfícies externas para passar a auxina de uma maneira direcional para a próxima célula. Esta célula então passa a auxina da mesma maneira para a próxima célula." É assim que uma planta garante que a auxina seja transportada das células produtoras de hormônios para as células onde ocorre o crescimento.

Anteriormente, o grupo de Offringa descobriu que as chamadas proteínas quinase rotulam as proteínas de transporte com grupos fosfato. Essa marcação determina em que lado da célula as proteínas de transporte se reúnem e, portanto, em qual direção a auxina é bombeada.

Uma história clara, você pensaria. No entanto, ainda havia algo faltando, diz Offringa. "Como ocorre o acúmulo de proteínas de transporte em um lado da membrana celular? Junto com colegas do Instituto de Ciência e Tecnologia da Áustria, descobrimos um importante elo que faltava neste processo." A equipe publicou esta descoberta na edição de março do renomado jornal Biologia Atual.

O problema está nas proteínas de transporte. Eles estão localizados na membrana da célula vegetal e podem se mover dentro dessa membrana. As proteínas podem, portanto, ser encontradas não apenas na parte superior ou inferior da célula, mas também nas laterais. "Descobrimos que há outro grupo de proteínas envolvidas neste processo, as proteínas MAB. Uma única proteína MAB interage com uma proteína de transporte marcada e uma proteína quinase para formar uma espécie de cluster. Como esse cluster é bastante volumoso, ele apenas move-se lentamente na membrana e permanece no lado correto da célula.

Os pesquisadores demonstraram isso comparando células vegetais normais com células vegetais mutantes que não tinham proteínas quinase ou proteínas MAB. Nos dois últimos casos, não houve acúmulo de proteínas de transporte em um lado da célula. Os pesquisadores provaram, assim, que tanto a quinase quanto as proteínas MAB são essenciais para o transporte correto da auxina.

“Nossa publicação é um bom exemplo de como a ciência pode funcionar”, diz Offringa. “Trabalho com Jiri Friml, o líder do grupo austríaco, há quase 20 anos, então o conheço muito bem. Mas por acaso estávamos pesquisando proteínas MAB independentemente um do outro. Durante uma conferência, descobrimos que nós estávamos trabalhando no mesmo assunto. Então, ficou claro que nossos dados se complementavam. " Para Offringa, trabalhar junto era a única continuação lógica. "Poderíamos ter escolhido cada um publicar por conta própria, mas então ambos teríamos uma história incompleta. Ao combinar nossos dados, temos uma publicação muito mais forte e todos recebem o reconhecimento que merecem."


Quais são os mecanismos que impedem as células de se fundirem in vivo? - Biologia

A descoberta e o desenvolvimento, na última década, de proteínas fluorescentes de uma ampla variedade de organismos marinhos deu início a uma revolução no estudo do comportamento celular, fornecendo marcadores convenientes para a expressão gênica e direcionamento de proteínas em células e organismos vivos. A mais amplamente usada dessas proteínas fluorescentes, a proteína fluorescente verde (GFP) isolada pela primeira vez da água-viva Aequorea victoria, pode ser anexada a virtualmente qualquer proteína de interesse e ainda dobrar em uma molécula fluorescente. O produto de fusão GFP resultante pode ser usado para localizar proteínas anteriormente não caracterizadas ou para visualizar e rastrear proteínas conhecidas para entender melhor os eventos celulares. O uso de proteínas fluorescentes como uma ferramenta minimamente invasiva para estudar a dinâmica e função das proteínas foi estimulado pela engenharia de variantes genéticas com brilho melhorado, fotoestabilidade e propriedades de expressão (ver Figura 1). As células que expressam produtos gênicos marcados com proteínas fluorescentes podem ser visualizadas com baixa intensidade de luz ao longo de muitas horas para fornecer informações úteis sobre as mudanças na distribuição de estado estacionário de uma proteína ao longo do tempo.

Introdução às Proteínas Fluorescentes - A descoberta da proteína fluorescente verde no início da década de 1960 finalmente anunciou uma nova era na biologia celular, permitindo que os investigadores aplicassem métodos de clonagem molecular, fundindo a porção fluoróforo a uma ampla variedade de alvos proteicos e enzimáticos, a fim de monitorar processos celulares em sistemas vivos usando microscopia óptica e metodologia relacionada. Quando acoplados a recentes avanços técnicos em fluorescência de campo amplo e microscopia confocal, incluindo câmeras digitais ultrarrápidas de baixo nível de luz e sistemas de controle de laser multitracking, a proteína fluorescente verde e seus derivados genéticos com mudança de cor demonstraram um serviço inestimável em muitos milhares de experimentos de imagem de células vivas .

A paleta de cores de proteínas fluorescentes - uma ampla gama de variantes genéticas de proteínas fluorescentes foi desenvolvida nos últimos anos, apresentando perfis espectrais de emissão de fluorescência que abrangem quase todo o espectro de luz visível. Esforços extensivos de mutagênese na proteína original da água-viva resultaram em novas sondas fluorescentes que variam na cor do azul ao amarelo e são algumas das moléculas repórter in vivo mais amplamente utilizadas na pesquisa biológica. Proteínas fluorescentes de comprimento de onda mais longo, emitindo nas regiões espectrais laranja e vermelha, foram desenvolvidas a partir da anêmona marinha Discosoma striata e corais de recife pertencentes à classe Anthozoa. Ainda outras espécies foram mineradas para produzir proteínas semelhantes com emissão de fluorescência em ciano, verde, amarelo, laranja, vermelho e vermelho. Esforços de pesquisa de desenvolvimento estão em andamento para melhorar o brilho e a estabilidade das proteínas fluorescentes, melhorando assim sua utilidade geral.

Proteínas fluorescentes derivadas de Aequorea victoria - Apenas na última década, testemunhamos uma expansão verdadeiramente notável na paleta de proteínas fluorescentes baseadas em Aequorea, em grande parte impulsionada pelos estudos inovadores do laboratório de Roger Tsien. Agora temos proteínas de água-viva que abrangem uma porção de espectro visível de 80 nanômetros do azul profundo ao verde-amarelo, fornecendo uma ampla escolha de marcadores geneticamente codificados para estudos em biologia celular. A maioria das proteínas fluorescentes comumente usadas hoje em dia foram modificadas por mutagênese para otimizar sua expressão em sistemas biológicos. Esforços contínuos usando abordagens de evolução direcionada sem dúvida irão melhorar as características espectrais, fotoestabilidade, tempo de maturação, brilho, resistência a ácidos e utilidade das etiquetas de proteína fluorescente para imagens celulares.

Proteínas Fluorescentes Anthozoa - Embora candidatos promissores estejam agora disponíveis em todas as classes espectrais de proteínas fluorescentes Anthozoa, na maioria dos casos não permanece nenhum equivalente de EGFP, em termos de fotoestabilidade e outras áreas críticas de desempenho (com exceção de estabilidade de pH). Novos acréscimos às regiões azul e ciano apresentam brilho e fotoestabilidade substancialmente aprimorados, e qualquer uma das proteínas fluorescentes laranja são excelentes opções para imagens multicoloridas de longo prazo. Além disso, embora mais brilhante do que EGFP, fotoestabilidade ainda é subótima para as proteínas fluorescentes amarelas, enquanto as variantes vermelhas e vermelhas distantes estão entre as mais escuras em todas as classes espectrais. Para agravar ainda mais o problema, está o potencial para artefatos de agregação devido ao mal dobramento das proteínas, independentemente da classe espectral ou das características supostamente monoméricas. Dado que a maioria dessas proteínas só foi introduzida nos últimos dois anos, continuamos otimistas de que, no futuro, adições brilhantes e fotoestáveis ​​estarão disponíveis para todas as classes espectrais.

Parâmetros de imagem para proteínas fluorescentes - O amplo espectro de proteínas fluorescentes e derivados descobertos até agora são bastante versáteis e têm sido empregados com sucesso em quase todas as disciplinas biológicas, desde microbiologia até fisiologia de sistemas. Essas sondas exclusivas têm se mostrado extremamente úteis como repórteres para estudos de expressão gênica em células de cultura e animais inteiros. Em células vivas, as proteínas fluorescentes são mais comumente utilizadas para rastrear a localização e a dinâmica de proteínas, organelas e outros compartimentos celulares, bem como um traçador de tráfego intracelular de proteínas. A imagem quantitativa de proteínas fluorescentes é prontamente realizada com uma variedade de técnicas, incluindo amplo campo, confocal e microscopia multifotônica, para fornecer uma janela única para expor os meandros da estrutura e função celular.

Proteínas Fluorescentes de Marcador Óptico - Cromóforos de proteína que podem ser ativados para iniciar a emissão de fluorescência a partir de um estado quiescente (um processo conhecido como fotoativação), ou são capazes de ser opticamente convertidos de uma largura de banda de emissão de fluorescência para outra (fotoconversão), representam talvez o mais promissor abordagem para a investigação in vivo de tempos de vida de proteínas, transporte e taxas de renovação. Apropriadamente denominadas marcadores moleculares ou ópticos, as proteínas fluorescentes fotoativadas geralmente exibem pouca ou nenhuma fluorescência inicial sob excitação no comprimento de onda de imagem, mas aumentam dramaticamente sua intensidade de fluorescência após a ativação por irradiação em um comprimento de onda diferente (geralmente inferior). Os marcadores ópticos de fotoconversão, por outro lado, sofrem uma alteração no perfil da largura de banda de emissão de fluorescência após alterações induzidas opticamente no cromóforo. Esses efeitos resultam no realce direto e controlado de pools moleculares distintos dentro da célula.

Considerações práticas para o uso de proteínas fluorescentes - as proteínas fluorescentes são sondas de imagem bastante versáteis e têm sido empregadas com sucesso em praticamente todas as disciplinas biológicas, desde microbiologia até fisiologia de sistemas. Estas sondas ubíquas são extremamente úteis como repórteres para estudos de expressão gênica em células cultivadas, tecidos excisados ​​e animais inteiros. Em células vivas, as proteínas fluorescentes são mais comumente usadas para rastrear a localização e a dinâmica de proteínas, organelas e outros compartimentos celulares, enquanto também podem ser usadas para avaliar as interações proteína-proteína por meio do uso de técnicas de transferência de energia de ressonância (FRET). Esta revisão fornece algumas dicas gerais para os aspectos práticos do uso e geração de imagens da proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) e membros mais novos da paleta de cores.

Tutoriais Java Interativos

Escolhendo combinações de filtros para proteínas fluorescentes - as combinações de filtros de fluorescência projetadas para criar imagens de proteínas fluorescentes devem ser cuidadosamente escolhidas para maximizar o nível de intensidade de emissão apresentado ao detector, reduzindo simultaneamente o número de fótons indesejados de autofluorescência ou vazamento por outros fluoróforos. Os amplos perfis espectrais de absorção e emissão exibidos pela maioria das proteínas fluorescentes oferecem uma ampla variedade de opções de filtros, que geralmente são otimizados para uso com um sistema de detecção específico (olho humano, câmera digital ou fotomultiplicador). Este tutorial interativo é projetado para permitir a identificação de parâmetros de filtro críticos, incluindo o comprimento de onda central, região de largura de banda e comprimento de onda de corte de espelho dicromático, que são necessários para a geração de imagens de proteínas fluorescentes.

Escolhendo Proteínas Fluorescentes para Experimentos de Dupla Rotulagem - Os amplos perfis espectrais de excitação e emissão exibidos por proteínas fluorescentes e suas variantes genéticas com mudança de cor frequentemente requerem considerações especializadas ao projetar experimentos de imagem de células vivas usando duas ou mais dessas sondas exclusivas simultaneamente. A principal preocupação são os artefatos de vazamento potenciais resultantes do grau significativo de sobreposição espectral de emissão geralmente exibida por combinações de proteínas fluorescentes. Este tutorial interativo explora proteínas fluorescentes correspondentes para investigações de dupla marcação com relação à largura de banda espectral e sobreposição, eficiência de excitação, dimensões da janela de emissão e outros parâmetros necessários para projetar experimentos lógicos.

Transferência de energia de ressonância de fluorescência com proteínas fluorescentes - as proteínas fluorescentes estão cada vez mais sendo aplicadas como sondas não invasivas em células vivas devido à sua capacidade de serem geneticamente fundidas com proteínas de interesse para investigações de localização, transporte e dinâmica. Além disso, as propriedades espectrais das proteínas fluorescentes são ideais para medir o potencial de interações moleculares intracelulares usando a técnica de microscopia de transferência de energia de ressonância (FRET) de F rster (ou fluorescência).Como a transferência de energia é limitada a distâncias de menos de 10 nanômetros, a detecção de FRET fornece informações valiosas sobre as relações espaciais das proteínas de fusão em uma escala de sub-resolução. Este tutorial interativo explora várias combinações de proteínas fluorescentes como potenciais parceiros FRET e fornece informações sobre parâmetros críticos de transferência de energia de ressonância, bem como sugestões para filtro óptico de microscópio e configuração de fonte de luz.

Proteínas Fluorescentes de Marcador Óptico - Proteínas fluorescentes fotoativadas geralmente exibem pouca ou nenhuma fluorescência inicial sob excitação no comprimento de onda de imagem, mas aumentam dramaticamente sua intensidade de fluorescência após ativação por irradiação em um comprimento de onda diferente (geralmente inferior). Os marcadores ópticos de fotoconversão, por outro lado, sofrem uma alteração no perfil da largura de banda de emissão de fluorescência após alterações induzidas opticamente no cromóforo. Este tutorial interativo explora a conversão óptica de várias sondas de realce úteis e simula como essas proteínas seriam vistas em um microscópio confocal real.

Mecanismos de maturação do fluoróforo da proteína fluorescente - A formação autocatalítica do fluoróforo (também referido como um cromóforo) dentro do ambiente protegido da estrutura polipeptídica durante a maturação da proteína fluorescente segue um mecanismo surpreendentemente unificado, especialmente considerando as diversas origens naturais dessas sondas biológicas úteis. Logo após a síntese, a maioria das proteínas fluorescentes amadurecem lentamente por meio de um processo de várias etapas que consiste em dobramento, ciclização do anel fluoróforo inicial e modificações subsequentes do fluoróforo. As propriedades espectrais das proteínas fluorescentes dependem da estrutura do fluoróforo, bem como das interações localizadas de resíduos de aminoácidos na vizinhança imediata e, em alguns casos, resíduos bem removidos do fluoróforo. Os tutoriais interativos nesta seção exploram a formação de fluoróforo em uma ampla variedade de proteínas fluorescentes espectralmente diversas deduzidas de estudos cristalográficos.

Fotoativação do cromóforo PA-GFP - As propriedades fotofísicas altamente exclusivas da proteína fluorescente verde do tipo selvagem (GFP do tipo selvagem) foram exaustivamente investigadas durante meados da década de 1990 e serviu como base para a criação do primeiro iluminador óptico útil projetado especificamente para estudos de fotoativação. Denominado PA-GFP (para P hoto A ctivatable G reen F luorescent P rotein), este iluminador óptico foi desenvolvido melhorando a eficiência de fotoconversão do cromóforo nativo de uma forma predominantemente neutra para uma espécie de caráter aniônico. Ao substituir a treonina na posição 203 por um resíduo de histidina (T203H) na GFP de tipo selvagem, os pesquisadores produziram uma variante com absorbância insignificante na região entre 450 e 550 nanômetros, aumentando assim dramaticamente o contraste entre as espécies não ativadas e ativadas.

Dronpa Fluorescent Protein Chromophore Photoswitching - A proteína fluorescente photoswitchable mais proeminente e bem estudada é chamada Dronpa (nome devido a uma fusão do termo Ninja para desaparecimento e fotoativação), que é uma variante monomérica derivada de um tetrâmero de coral rochoso. A proteína fluorescente Dronpa exibe um máximo de absorção em 503 nanômetros (decorrente do cromóforo aniônico desprotonado) com um pico menor em 390 nanômetros (do cromóforo protonado neutro). O cromóforo aniônico emite fluorescência verde com um máximo de 518 nanômetros e tem um nível de brilho quase 2,5 vezes maior do que o de EGFP. O photoswitching Dronpa ocorre em parte por interconversão entre as formas desprotonada (no estado brilhante) e protonada (no estado escuro escuro). A iluminação a 488 nanômetros leva Dronpa para as espécies escuras, após o que a proteína fluorescente pode ser posteriormente ligada novamente por uma breve iluminação a 405 nanômetros. Este ciclo pode ser repetido várias centenas de vezes sem fotodegradação significativa.

Fotoconversão de marcadores Kaede / Eos - Uma das classes mais úteis de marcadores ópticos abrange o número crescente de proteínas fluorescentes relatadas para sofrer fotoconversão de um comprimento de onda de emissão para outro. Ao contrário das proteínas fluorescentes fotoativáveis, essas sondas são prontamente rastreadas e visualizadas em seu estado de emissão nativo antes da fotoconversão, tornando mais fácil identificar e selecionar regiões para realce óptico. O primeiro relatório de um marcador fotoconversível foi uma proteína fluorescente tetramérica isolada do coral rochoso de cérebro aberto, Trachyphyllia geoffroyi, que pode ser fotoconvertida de emissão de fluorescência verde para vermelha por iluminação com luz ultravioleta. A descoberta deste marcador de texto foi acidental, assim como muitas descobertas importantes. Aconteceu quando os pesquisadores deixaram acidentalmente um tubo de ensaio contendo a proteína em uma bancada de laboratório perto de uma janela e, em seguida, observaram astutamente a mudança do verde para o vermelho. A transição de cor incomum levou os investigadores a nomear a proteína Kaede, após as folhas do bordo japonês que mudam de verde para vermelho no outono.

Transferência de prótons de estado excitado - Entre as características mais exclusivas da proteína fluorescente verde de tipo selvagem (wt-GFP) está o fato de que a iluminação com luz ultravioleta ou azul-ciana dá origem à fluorescência verde com um comprimento de onda máximo de aproximadamente 507 nanômetros. O espectro de absorção bimodal de wt-GFP apresenta um grande pico em 395 nanômetros (a banda A) e um pico muito menor em 475 nanômetros (a banda B). A banda B menor corresponde ao cromóforo aniônico, que demonstra fotofísica normal, enquanto a banda A predominante corresponde ao cromóforo neutro que normalmente seria esperado para emitir luz azul (com pico de aproximadamente 450 nanômetros) mediante excitação no ultravioleta. No entanto, quando excitado com luz variando de 370 a 400 nanômetros, o resíduo de tirosina no cromóforo neutro de wt-GFP torna-se um ácido forte e transfere um próton através de uma nova rede de ligações de hidrogênio para gerar um ânion de estado excitado (um processo conhecido como excitado - transferência de prótons de estado ESPT). É a forma aniônica do cromóforo que emite luz verde.

Fontes de Literatura

Referências gerais sobre proteínas fluorescentes - As disciplinas da biologia celular e molecular estão sendo rápida e dramaticamente transformadas pela aplicação de proteínas fluorescentes desenvolvidas a partir de organismos marinhos como marcadores de fusão para rastrear o comportamento das proteínas em células vivas. A mais amplamente usada dessas sondas, a proteína fluorescente verde, pode ser ligada a virtualmente qualquer alvo de interesse e ainda dobrar em uma espécie fluorescente viável. A quimera resultante pode ser empregada para localizar proteínas previamente não caracterizadas ou para visualizar e rastrear proteínas conhecidas para compreender melhor os eventos críticos nos níveis celular e molecular. Esta seção apresenta uma bibliografia de fontes de literatura para artigos de revisão e relatórios de pesquisa originais sobre a descoberta, aplicações e desenvolvimento contínuo de proteínas fluorescentes.

Biblioteca de referência de proteínas fluorescentes ZEISS Campus - A aplicação da classe crescente de proteínas fluorescentes capazes de formar um cromóforo intrínseco para a observação de células e animais vivos quase que sozinha lançou e alimentou uma nova era na biologia e na medicina. Essas poderosas ferramentas de pesquisa forneceram aos investigadores um mecanismo de fusão de uma sonda óptica geneticamente codificada a uma variedade praticamente ilimitada de alvos proteicos, a fim de examinar sistemas vivos usando microscopia de fluorescência e tecnologia relacionada. As referências listadas abaixo apontam para artigos de revisão que devem fornecer o ponto de partida para um entendimento completo da tecnologia de proteínas fluorescentes.

Biossensor Fluorescent Protein References - Ao acoplar diretamente a técnica microscópica avançada de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) à onipresente proteína fluorescente verde e suas variantes multiespectrais fundidas com biopolímeros selecionados, pesquisadores engenhosos criaram uma nova classe de biossensores capazes de elucidar mecanismos de sinalização , clivagem enzimática e outras funções críticas em células vivas. Esta seção apresenta uma bibliografia de fontes de literatura para artigos de revisão e relatórios de pesquisa originais sobre a construção, aplicações e desenvolvimento contínuo de proteínas fluorescentes de biossensores.

Referências de proteínas fluorescentes de marcadores ópticos - A capacidade de iniciar ou alterar seletivamente perfis de emissão de fluorescência em proteínas de marcadores ópticos de fotoconversão torna essas sondas excelentes ferramentas para explorar o comportamento de proteínas em células vivas. Como a intensidade de fluorescência (ou espectro de cores) dos marcadores ocorre apenas após a conversão mediada por fótons, os pools de proteínas não fotoativadas recentemente sintetizadas permanecem não observados e não complicam os resultados experimentais. Esta seção lista fontes de artigos de revisão e relatórios de pesquisa originais sobre proteínas fluorescentes de marcadores ópticos.

Referências de fotodegradação de proteínas fluorescentes - O campo da biologia celular está sendo rapidamente transformado pela aplicação de proteínas fluorescentes como marcadores de fusão para rastrear o comportamento dinâmico em células vivas. A este respeito, a recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) é frequentemente empregada para destruir seletivamente moléculas fluorescentes dentro de uma região de interesse com um laser de alta intensidade, seguido pelo monitoramento da recuperação de novas moléculas fluorescentes na área branqueada durante um período de tempo com luz laser de baixa intensidade. A informação resultante pode ser usada para determinar as propriedades cinéticas, incluindo o coeficiente de difusão, fração móvel e taxa de transporte das moléculas marcadas com fluorescência. As referências selecionadas nesta seção apontam para fontes de literatura importantes para informações sobre FRAP com proteínas fluorescentes.

Fluorescent Protein FRET References - Compreender as interações dinâmicas entre as proteínas dentro das células vivas é fundamental para um conhecimento básico dos conceitos subjacentes que orientam a biologia molecular e celular. Nos últimos anos, o rápido desenvolvimento de proteínas fluorescentes e sua aplicação como produtos de fusão e biossensores expandiu significativamente o kit de ferramentas moleculares disponível para sondar os mistérios da fisiologia e patologia celular. A este respeito, a transferência de energia de ressonância de fluorescência (ou F rster) (FRET) está emergindo como uma técnica de microscopia óptica poderosa para examinar processos fisiológicos com alta resolução temporal e espacial. As referências listadas nesta seção destacam fontes de literatura importantes para artigos de revisão e relatórios de pesquisa originais sobre a construção e aplicações de proteínas fluorescentes para experimentos de transferência de energia de ressonância.

Educação baseada na Internet sobre proteínas fluorescentes - Apesar do crescimento explosivo da Internet (em termos da World Wide Web) como um recurso informativo para a literatura científica original relativa às investigações de proteínas fluorescentes, permanece um vazio óbvio em sites educacionais direcionados ao início alunos e novatos no campo. Para resolver esse problema, sites educacionais dedicados à microscopia óptica e imagem digital que estão sendo construídos e hospedados na The Florida State University estão voltando sua atenção para a aplicação crescente de proteínas fluorescentes para estudos de imagem de células vivas. O foco principal desse esforço é criar novas seções dos sites que abordem a estrutura e as propriedades das proteínas fluorescentes, bem como otimizar sua utilidade em experimentos de imagem.

Recursos da Internet

Fontes comerciais de vetor de proteína fluorescente - Uma variedade de proteínas fluorescentes, disponíveis como vetores de plasmídeo de DNA recombinante projetados para transfecção de células de mamíferos ou transformação de bactérias, estão comercialmente disponíveis em vários distribuidores. A maioria dos vetores contendo sequências de DNA de proteínas fluorescentes foram otimizados por códons para expressão em células de mamíferos e contêm genes de antibióticos para seleção de mutantes estáveis ​​com níveis de expressão relativamente constantes. Os vetores geralmente contêm múltiplas sequências de clonagem que permitem aos pesquisadores inserir facilmente seu gene de interesse para a fusão com a proteína fluorescente. Outras características comuns em vetores de proteínas fluorescentes incluem um promotor de citomegalovírus humano (CMV), um local de iniciação da tradução Kozak, um sinal de poliadenilação de mRNA precoce e um gene antibiótico bacteriano.

Imagem de células vivas - um dos principais alvos nas ciências da vida é entender a estrutura, função e comportamento dos organismos vivos, e com os avanços em evolução da tecnologia, como o desenvolvimento de microscopia confocal e sondas fluorescentes, tornou-se possível perseguir esse objetivo nos níveis celular e subcelular. Ainda assim, trabalhar e obter imagens de células vivas pode ser uma tarefa complexa, senão assustadora, para microscopistas não familiarizados com as técnicas e ferramentas disponíveis. A seguir está uma compilação de recursos que oferecem visões gerais, informações básicas, fóruns interativos, perguntas frequentes, protocolos e dicas que devem ajudar qualquer microscopista que tente entrar neste campo importante e florescente.

Câmaras de espécimes microscópicas - As demandas da microscopia confocal moderna, especialmente aquelas envolvendo imagens de células e tecidos vivos, exigem que os pesquisadores tomem precauções especiais com seus espécimes. Na verdade, lâminas de microscópio simples são inadequadas para muitas aplicações, resultando no desenvolvimento de uma ampla gama de câmaras de espécimes, que podem fornecer a flexibilidade de que um microscopista precisa. A lista de recursos nesta seção exemplifica a grande variedade de câmaras de espécimes disponíveis atualmente e deve ajudar os visitantes a localizar os produtos mais adequados para suas atividades científicas específicas.

Filtros de fluorescência - a microscopia de fluorescência depende muito da capacidade de selecionar uma região de comprimento de onda específica para excitação do espécime e coleta de emissão secundária durante a formação da imagem. Avanços recentes no projeto de filtros de interferência resultaram em filtros de alta precisão que cobrem uma ampla gama de perfis de passagem de banda, variando de apenas alguns a dezenas e centenas de nanômetros. Abaixo está uma compilação de fabricantes que projetam, fabricam e fornecem filtros de fluorescência para a comunidade de microscopia. Os produtos que eles oferecem atenderão à maioria dos requisitos do sistema, mas se um aplicativo especializado precisar de um filtro com uma faixa espectral incomum ou outras especificações exclusivas, muitas das empresas fabricarão filtros personalizados.

Investigadores do princípio da proteína fluorescente - Muitos dos cientistas envolvidos com pesquisas direcionadas a vários aspectos da biologia celular estão usando proteínas fluorescentes como sondas de imagem para a estrutura, função e dinâmica celular. Vários dos investigadores principais construíram extensos websites detalhando seus laboratórios, e esses sites são bastante úteis para visitantes interessados ​​em aprender mais sobre esta área de pesquisa emocionante e em rápida evolução. Incluídos nas informações da maioria dos sites vinculados a seguir estão os interesses de pesquisa atuais, curriculum vitas, publicações, listas de pessoal de laboratório, informações de contato, tutoriais educacionais, galerias de imagens e vídeos digitais.

Jennifer Lippincott-Schwartz e George H. Patterson - Divisão de Biologia Celular e Metabolismo, Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Maryland, 20892.

David W. Piston - Departamento de Fisiologia Molecular e Biofísica, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, 37232.

Richard N. Day - Departamento de Fisiologia Celular e Integrativa, Escola de Medicina da Universidade de Indiana, 635 Barnhill Dr., Indianapolis, Indiana, 46202.

Robert E. Campbell - Departamento de Química, Universidade de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá, T6G2G2

Matthew J. Parry-Hill, Nathan S. Claxton e Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


Estatísticas de Altmetric.com

A tuberculose ainda continua sendo um grande problema de saúde em todo o mundo. 1 Em 2000, 1,7 milhão de pessoas morreram desta doença (tabela 1). Estas são 3% de todas as mortes prematuras que ocorreram naquele ano - mais do que diabetes mellitus (1,4%), anomalias congênitas (1,2%), doença de Alzheimer (0,5%) e artrite reumatoide (0,01%) juntas. Além disso, o número de anos de vida perdidos devido à tuberculose é enorme: 33,3 milhões de homens-ano (2,3% de todas as perdas), mais do que homens-anos perdidos devido a diabetes mellitus (1%), doença de Alzheimer (0,7%) e reumatóide artrite (0,3%) juntos. Os números são ainda mais dramáticos se considerarmos a perigosa ligação entre a tuberculose e a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Meio milhão de pessoas morreram no ano passado por causa da coinfecção com Mycobacterium tuberculosis e o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O problema é ainda mais complicado pelo número crescente de cepas multirresistentes (MDR). Mais de 50 milhões de pessoas já estão infectadas com cepas MDR de M tuberculosis, e em muitos estados mais de 15% de todos os casos de tuberculose são causados ​​por cepas MDR. Isso complica enormemente os difíceis calendários de tratamento e aumenta o custo do tratamento de US $ 100 para US $ 100.000 nos países industrializados. Em muitos países em desenvolvimento, a tuberculose MDR praticamente não pode mais ser curada. As prisões e campos de trabalho na Rússia são os principais centros de reprodução da tuberculose MDR.

Tuberculose: ainda uma grande ameaça global já que entramos no novo milênio


A sincitina é uma proteína do envelope retroviral em cativeiro envolvida na morfogênese da placenta humana

Muitos vírus de mamíferos adquiriram genes de seus hospedeiros durante sua evolução 1. A justificativa para essas aquisições geralmente é bastante clara: os genes capturados são subvertidos para fornecer uma vantagem seletiva ao vírus. Aqui, descrevemos a situação oposta, em que um gene viral foi sequestrado para cumprir uma função importante na fisiologia de um hospedeiro mamífero. Esse gene, que codifica uma proteína que chamamos de sincitina, é o gene do envelope de um retrovírus defeituoso endógeno humano recentemente identificado, o HERV-W 2. Descobrimos que os principais sites de sincitina expressão são sinciciotrofoblastos placentários, células multinucleadas que se originam de trofoblastos fetais. Nós mostramos que a expressão de recombinantes sincitina em uma ampla variedade de tipos de células induz a formação de sincícios gigantes, e que a fusão de uma linha celular trofoblástica humana expressando endógena sincitina pode ser inibida por um anti-soro anti-sincitina. Nossos dados indicam que a sincitina pode mediar a fusão do citotrofoblasto da placenta na Vivoe, portanto, pode ser importante na morfogênese da placenta humana.


Conclusões

A identificação de dioxigenases dependentes de 2-OG e seus papéis fora dos fatores de transcrição HIF abriu novos caminhos para a pesquisa, bem como intervenções terapêuticas em áreas onde O2 é predominante. Portanto, novos e emocionantes conhecimentos adicionais estarão chegando em um futuro próximo nessas áreas. Dado o nosso conhecimento atual dessas enzimas, pode-se especular que o baixo teor de O2 está envolvido em quase todos os aspectos da regulação da expressão gênica (Fig.3), da cromatina ao destino do RNA, bem como a estabilidade da proteína.


Assista o vídeo: Odc. 12: Kluczowe błędy popełniane w procesie przejęcia spółki zagranicznej (Janeiro 2022).