Em formação

16.5F: Estrigolactonas - Biologia


As estrigolactonas são fabricadas e secretadas nas raízes e já há algum tempo

  • promover a germinação de algumas sementes de plantas. Infelizmente, isso inclui sementes do gênero Striga (erva-bruxa), cuja raiz em desenvolvimento invade a raiz da planta hospedeira secretora de estrigolactona (por exemplo, arroz, milho e sorgo) roubando nutrientes dela e causando graves perdas de safra.
  • sinalizam que os fungos micorrízicos se conectam ao sistema radicular, formando uma relação mutualística.

No entanto, essas atividades não os qualificam como hormônios vegetais (ambas as atividades ocorrem no solo ao redor das raízes). Somente se puder ser demonstrado que as estrigolactonas são translocadas na planta do local de fabricação (raízes) para outra parte da planta onde exercem um efeito, elas podem ser chamadas de hormônios.

Dois relatórios na edição de 11 de setembro de 2008 da Natureza chegou perto de provar o caso.

As estrigolactonas (ou possivelmente moléculas derivadas delas) suprimem o desenvolvimento de botões laterais e, portanto, inibem a ramificação da planta. Mutações em genes necessários para a síntese de estrigolactonas estimulam o desenvolvimento de botões laterais, produzindo uma planta mais ramificada do que o normal. A aplicação de uma estrigolactona sintética perto da base dessas plantas mutantes inibe o desenvolvimento de botões laterais acima e, portanto, restaura a ramificação normal.

A auxina e, em certas circunstâncias, o ácido abscísico também inibem a ramificação, ou seja, promovem a dominância apical. Mas tanto a auxina quanto o ácido abscísico participam de várias funções diferentes da planta, enquanto o efeito das estrigolactonas na ramificação parece bastante específico.


Estrigolactonas

Este volume apresenta os protocolos de laboratório mais úteis na pesquisa de estrigolactonas (SL). Capítulos orientam os leitores através de caminhos de laboratório úmido, questões sobre estabilidade, protocolos para avaliar a atividade SL, efeitos para os habitantes do solo, como plantas parasitas, fungos micorrízicos e não micorrízicos, bactérias nodulantes e protocolos para avaliar os efeitos no desenvolvimento das plantas são discutidos. Escrito em muito sucesso Métodos em Biologia Molecular formato de série, capítulos incluem introduções aos seus respectivos tópicos, listas dos materiais e reagentes necessários, protocolos de laboratório passo a passo, prontamente reproduzíveis e dicas sobre solução de problemas e evitar armadilhas conhecidas.

Autorizado e de ponta, Estrigolactonas: métodos e protocolos visa fornecer um conjunto claro e padronizado de protocolos experimentais para uma ampla comunidade científica.


RESUMO

Estrigolactonas foram recentemente implicadas nas vias de desenvolvimento acima e abaixo do solo em plantas superiores. Para facilitar as propriedades moleculares e químicas das estrigolactonas em vitro e na Vivo, desenvolvemos uma molécula de estrigolactona fluorescente, CISA-1, sintetizada por meio de um novo método que era robusto, de alto rendimento e usava materiais de partida simples. Demonstramos que CISA-1 tem uma ampla gama de atividades conhecidas de estrigolactona e relatamos posteriormente um ensaio de enraizamento adventício em Arabidopsis que é um método altamente sensível e rápido para testar a atividade biológica de análogos de estrigolactona. Neste ensaio de enraizamento e no ensaio de germinação de Orobanche amplamente utilizado, CISA-1 mostrou atividade biológica mais forte do que o GR24 comumente testado. CISA-1 e GR24 foram igualmente eficazes na inibição da ramificação em Arabidopsis hastes da inflorescência. Em ambos os ensaios de ramificação e enraizamento adventício, também demonstramos que a atividade de CISA-1 é dependente da via de sinalização da estrigolactona máxima. Em soluções de água e metanol, CISA-1 foi cerca de três vezes mais estável que GR24, o que pode contribuir para o aumento da atividade observada nos diversos testes biológicos.


De onde vem o nome?

Estrigolactonas foram descobertas em exsudatos de raízes devido à sua capacidade de estimular a germinação de sementes da planta parasita Striga, a 'erva-bruxa' [1]. Um exemplo desta família de plantas é Striga hermonthica, a erva-bruxa roxa ou gigante (Figura 1). Então onde Striga obteve seu nome de? Witchweeds foram assim chamadas por agricultores de subsistência na África porque eles apareceram sem aviso, aparentemente do nada, e atacaram suas plantações. O nome científico (latino) para essas ervas daninhas deriva de Striga, uma bruxa mítica aparentemente com origens na Roma antiga, mas conhecida em várias partes do sul e centro da Europa. A bruxa Striga era considerada cheia de ódio pelos outros, especialmente crianças, alimentando-se da essência de sua vida ou consumindo-os sem remorso. Striga espécies são membros da família das vassouras (Orobanchaceae), a maioria dos quais são parasitas de outras plantas.

Plantas da erva-bruxa Striga hermonthica parasitar plantas de milho na África. Foto reproduzida com permissão de L J Musselman, retirada de [2].

A parte lactona do nome da estrigolactona refere-se à estrutura química. Em química, uma lactona é um éster cíclico - o produto da condensação de um grupo álcool e um grupo ácido carboxílico na mesma molécula. Na verdade, as estrigolactonas têm dois anéis de lactona (Figura 2). Os membros da família da estrigolactona diferem nas modificações químicas da estrutura do núcleo e em suas conformações estereoquímicas (tridimensionais). Assim, estrigol e orobancol são dois exemplos comuns em que os anéis A e B, respectivamente, são oxidados, e nos quais a estereoquímica do anel B em relação ao anel C é diferente (Figura 2).

Estruturas de estrigolactona. O estrigol e o orobancol ocorrem naturalmente e suas estruturas estereoquímicas são mostradas. GR24 é um análogo sintético e mostrado sem configuração estereoquímica porque é sintetizado como uma mistura racêmica. A convenção de letras para estruturas em anel é mostrada na molécula de estrigol, onde C e D são lactonas.


Estrigolactonas na adaptação de plantas a estresses abióticos: uma via emergente de pesquisa em plantas

Os fitohormônios desempenham um papel central no aumento da tolerância das plantas aos estresses ambientais, que afetam negativamente a produtividade das plantas e ameaçam a segurança alimentar futura. Estrigolactonas (SLs), uma classe de fitohormônios derivados de carotenóides, foram inicialmente descobertos como um "sinal ecológico" para a germinação de sementes parasitas e estabelecimento de relação simbiótica entre plantas e micróbios benéficos. As caracterizações subsequentes descreveram seus papéis funcionais em vários processos de desenvolvimento, incluindo o desenvolvimento da raiz, ramificação do caule, desenvolvimento reprodutivo e senescência da folha. Os SLs recentemente chamaram muita atenção devido aos seus papéis essenciais na regulação de vários processos fisiológicos e moleculares durante a adaptação das plantas aos estresses abióticos. Relatórios sugerem que a produção de SLs em plantas é estritamente regulamentada e dependente do tipo de estresse que as plantas enfrentam em vários estágios de desenvolvimento. Recentemente, evidências de crosstalk entre SLs e outros fitohormônios, como o ácido abscísico, em respostas a estresses abióticos sugerem que SLs participam ativamente de redes regulatórias de adaptação ao estresse de plantas que são governadas por fitormônios. Além disso, foram sugeridos os papéis prospectivos dos SLs no manejo do crescimento e desenvolvimento das plantas sob condições ambientais adversas. Nesta revisão, fornecemos uma discussão abrangente relativa às respostas de plantas mediadas por SL e adaptação a estresses abióticos.

Palavras-chave: adaptação ao estresse abiótico, hormonal crosstalk, deficiência de nutrientes, estresse osmótico, arquitetura da planta, simbiose com estrigolactonas.


Conteúdo

Germinação de planta parasita Editar

As estrigolactonas foram isoladas pela primeira vez em 1966 a partir de plantas de algodão, especificamente das raízes. No entanto, seu papel na germinação de outros organismos não foi determinado até mais tarde. [3] Estudos anteriores com Striga lutea já havia demonstrado que extratos de raízes das plantas hospedeiras eram necessários para que a semente do parasita começasse a germinar, o que deixava claro que uma substância produzida nas raízes estava estimulando esse processo. [3] O isolamento das estrigolactonas levou a uma série de testes que provaram que este composto era a molécula necessária para induzir a germinação de Striga espécies. Mais tarde, foi comprovado que compostos semelhantes produzem o mesmo efeito: sorgolactona e alectrol, ambos apresentando o grupo característico da lactona, por isso foram classificados como estrigolactonas. [4] Para induzir a germinação de plantas parasitas, as estrigolactonas só precisavam estar presentes em pequenas quantidades, da ordem de 5 partes por milhão. [3]

Inibição do hormônio de ramificação do tiro Editar

O papel das estrigolactonas como hormônio inibidor de ramificação foi descoberto por causa do uso de um novo conjunto de plantas mutantes. [5] Esses mutantes apresentaram crescimento excessivo nos botões axilares, o que induziu sua haste terminal a iniciar a ramificação anormal. [5] Anteriormente, pensava-se que as citocininas eram a única molécula envolvida na regulação da ramificação do caule, mas esses mutantes apresentavam produção e sinalização normais de citocininas, levando à conclusão de que outra substância estava agindo nos botões axilares. [5] Diferentes testes que consistiam em inserir parte das plantas mutantes em espécimes selvagens (e vice-versa), foram capazes de demonstrar que os mutantes não eram capazes de reconhecer uma molécula de sinal vinda das raízes e da parte inferior da planta , ou incapaz de produzir as moléculas necessárias para inibir a ramificação. [5] Esta molécula, que estava envolvida na regulação da ramificação, foi posteriormente identificada como uma estrigolactona. [5] A conclusão foi que, na presença de estrigolactonas, a planta seria impedida de crescer demais e desenvolver ramos excessivos, mas quando não estiver presente, o botão axilar começará a induzir ramificações anormais. [5]

Editar propriedades

Embora as estrigolactonas variem em alguns de seus grupos funcionais, seu ponto de fusão costuma estar sempre entre 200 e 202 graus Celsius. [3] A decomposição da molécula ocorre após atingir 195 ° C. [3] Eles são altamente solúveis em solventes polares, como acetona solúvel em benzeno, e quase insolúvel em hexano. [3]

Estruturas químicas Editar

Alguns exemplos de estrigolactonas incluem:

(+) - Strigol (+) - Acetato de estrigila
(+) - Orobanchol (+) - acetato de orobancila
(+) - 5-desoxistrigol Sorgolactone

Via carotenóide via carlactona Editar

A via biossintética das estrigolactonas não foi totalmente elucidada, mas diferentes etapas foram identificadas, incluindo as enzimas necessárias para realizar a transformação química. [6] O primeiro passo é a isomerização da 9ª ligação química do β < displaystyle beta> -caroteno, mudando da configuração trans para cis. [6] Esta primeira etapa é realizada pela enzima β < displaystyle beta> -caroteno isomerase, também chamada de DWARF27 ou D27, que requer ferro como cofator. [6] A segunda etapa é a separação química de 9-cis- β < displaystyle beta> -caroteno em dois compostos diferentes: o primeiro é 9-cis-aldeído e o segundo é β < displaystyle beta> - ionona. [6] Esta segunda etapa é catalizada pela desoxigenase de clivagem do carotenóide 7 (CCD7). [6] Na terceira etapa, outra oxigenase de clivagem de carotenóide, chamada CCD8 (da mesma família que CCD7), catalisa a conversão e o rearranjo do aldeído criado na etapa anterior em 9-cis- β < displaystyle beta> - apo-10 e subsequentemente produzindo carlactona. [6]

Ainda não está claro como exatamente a carlactona é transformada nas diferentes estrigolactonas identificadas até agora, mas vários estudos provaram que a carlactona é definitivamente o precursor das estrigolactonas. [7] Esta última etapa da biossíntese deve envolver a adição de pelo menos duas moléculas de oxigênio para converter a carlactona em 5-desoxistrigol, uma estrigolactona simples, e mais oxidação deve ser necessária para produzir outra estrigolactona mais complexa. A proteína MAX1 tem sido proposta para catalisar a última etapa da biossíntese de estrigolactonas devido ao seu papel no metabolismo oxidativo em plantas. [7]

Papel do ABA na biossíntese Editar

Tanto o ácido abscísico (ABA) quanto as estrigolactonas possuem um grupo comum de enzimas que realizam a síntese dos dois compostos, anteriormente havia sido demonstrada a existência de correlação entre as duas vias de biossíntese, e isso tem sido apoiado por diferentes estudos. [8] [9] A biossíntese de ABA depende de um conjunto de enzimas, denominado 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase (NCED). [9] Mas, as plantas mutantes que eram defeituosas na produção das enzimas NCED, não apenas apresentavam baixos níveis de ABA, mas também apresentavam baixos níveis de estrigolactonas, especificamente nos extratos de raízes onde esse hormônio é principalmente sintetizado. a base para a existência de uma maquinaria enzimática comum, [9] Outros experimentos que consistem no bloqueio das enzimas NCED e usando mutantes incapazes de detectar mudanças ABA, foram usados ​​para apoiar esta teoria. [8] Até o momento, há uma correlação clara de ambas as sínteses que está relacionada ao uso de enzimas NCED em ambas as biossíntese, mas o mecanismo exato em que elas estão conectadas permanece obscuro. [8]

Em plantas, as estrigolactonas são percebidas pelo receptor duplo / proteína hidrolase DWARF14 (D14), um membro da superfamília α / β hidrolase. Apesar de serem consideradas hidrolases com baixo turnover de substrato, uma tríade catalítica intacta é necessária para a função biológica da proteína. [10] Estudos de dinâmica molecular sugeriram que a bolsa de ligação do ligante é flexível e que a tríade catalítica desempenha um papel importante para a ligação e posicionamento do ligante. [11] [12] Vários modelos (em parte concorrentes) foram propostos para o envolvimento da tríade catalítica na percepção do ligante:

  • Hidrólise da estrigolactona, resultando no anel D sendo covalentemente ligado ao sítio ativo serina. [13]
  • Hidrólise da estrigolactona, resultando em um D-ring livre que funciona como uma cola molecular na entrada do receptor, mediando a interação com outra proteína. [14]
  • Ligação de estrigolactona intacta não hidrolisada que gera uma superfície alterada da proteína DWARF14, mediando a interação com outra proteína. [15]
  • Hidrólise da estrigolactona, resultando no anel D sendo covalentemente ligado ao sítio ativo da histidina. [16] [17] [18] [19]
  • A hidrólise da estrigolactona, resultando no anel D sendo covalentemente ligado ao sítio ativo serina e histidina ao mesmo tempo, induzindo uma mudança conformacional de DWARF14, levando à interação com outra proteína. [20]

Os resultados cinéticos sugeriram que a estrigolactona intacta desencadeia uma cascata de sinalização após a qual a hidrólise é realizada como a etapa final para inativar a molécula de estrigolactona. [21]

Germinação de micorriza arbuscular Editar

As estrigolactonas são conhecidas por estimular a germinação de esporos de micorrizas arbusculares. [22] Como eles produzem esse efeito em concentrações extremamente baixas, foi proposto que o mecanismo de ativação deve ser uma via de sinalização. [22] Diferentes estudos com diversos tipos de fungos, descobriram que após a estimulação com estrigolactonas, as células fúngicas apresentam uma maior quantidade de mitocôndrias e um aumento em sua atividade oxidativa. [22] Devido ao papel da mitocôndria no metabolismo oxidativo dos macronutrientes, acredita-se que os esporos permanecem inativos antes de encontrar a planta hospedeira e, uma vez que são estimulados com estrigolactonas, a maquinaria oxidativa na mitocôndria é ativada para produzir energia e nutrientes necessários para a germinação do esporo e ramificação do fungo. [22] Estudos com extratos de raiz apóiam essa hipótese, e até agora as estrigolactonas são as moléculas candidatas que melhor explicam esse aumento na atividade mitocondrial. [22]

Edição de crescimento secundário mediado por auxina

Foi estabelecido que o crescimento secundário da planta é regulado principalmente pela auxina do fitohormônio. [23] No entanto, o mecanismo de secreção de auxina é ao mesmo tempo regulado por estrigolactonas, portanto, esta última pode controlar o crescimento secundário por meio da auxina. [23] Quando aplicada em botões terminais do caule, a estrigolactona pode bloquear a expressão de proteínas de transporte necessárias para mover a auxina através dos botões, essas proteínas são denominadas PIN1. [23] Assim, não foi surpreendente que, ao analisar mutantes deficientes em estrigolactona, eles apresentassem uma superexpressão da proteína PIN1, que facilita o transporte de auxina nos botões terminais. A auxina impediu a atividade mitótica desses botões, interrompendo o planta para iniciar o crescimento secundário e ramificação. [23] Em conclusão, as plantas dependem do transporte de auxina para o início ou inibição do crescimento secundário, mas este mecanismo de transporte é dependente da produção de estrigolactonas, que podem facilmente viajar do local de produção (raízes) para os botões terminais do caule através o xilema. [23]

Interação planta-fungo Editar

As estrigolactonas desempenham um papel fundamental na interação planta-fungo. [24] Um dos primeiros estudos feitos em Lotus japonicus já haviam demonstrado que compostos extraídos da raiz são necessários para o desenvolvimento de fungos micorrízicos arbusculares que irão estabelecer uma relação simbiótica com a raiz da planta. [24] Essas mesmas descobertas foram verdadeiras para diferentes plantas, como milho e sorgo. [24] Posteriormente, foram isolados os compostos responsáveis ​​pela ramificação dos fungos arbusculares, incluindo o 5-desoxistrigol, o estrigol e a sorgolactona, todos pertencentes à família dos compostos da estrigolactona. [25] [24] O processo de ramificação é crucial para estabelecer a simbiose. [24] Como essa ramificação ocorre apenas após a germinação dos esporos e o crescimento inicial da hifa, as estrigolactonas necessárias para a germinação devem ser secretadas pela planta e chegar aos fungos, o que significa que as estrigolactonas também fazem parte do processo de reconhecimento por os fungos. [24]

Como a arbuscula mychorriza pode formar associações simbióticas com a maioria das angiospermas e muitas gimnospermas, espera-se que sejam encontrados diferentes compostos de estrigolactonas distribuídos em uma grande variedade de plantas. [25] Infelizmente, embora as estrigolactonas sejam supostamente encontradas na maioria das plantas, os estudos feitos com estrigolactonas e fungos AM até agora, estudaram apenas uma gama muito limitada de espécies de plantas, principalmente devido à dificuldade de extrair esses compostos e devido à sua facilidade de desintegrar em solução. [25]

As estrigolactonas não são apenas necessárias para o reconhecimento da planta pelos fungos, mas também são exigidas pelo reconhecimento dos fungos pela planta. [26] O mecanismo de reconhecimento de fungos ocorre de maneira semelhante ao reconhecimento de bactérias como Rhizobia sp. [26] Na verdade, foi proposto que o mecanismo de reconhecimento de bactérias evoluiu a partir do mecanismo de reconhecimento de fungos, porque este último é conhecido por ser mais primitivo e antigo. [26] Assim como as bactérias usam fatores Nod, os fungos usam um conjunto de moléculas denominado fator Myc. [26] Esses produtos fúngicos podem ser reconhecidos por plantas diferentes e não são projetados para serem específicos de plantas. [26] Quando esses fatores Myc são reconhecidos pela raiz da planta, eles estimulam a expressão de diferentes genes envolvidos na iniciação da associação simbiótica. [26] No entanto, a secreção do fator Myc pelos fungos ocorre somente após ser previamente estimulado pelas estrigolactonas da planta, demonstrando o papel necessário desses compostos tanto para o reconhecimento (dos fungos quanto da planta). [26] Estrigolactonas também foram relatadas para produzir outras alterações nas células fúngicas, como um aumento na concentração de cálcio intracelular e um aumento nos lipocitoolisacarídeos (LCOs), o último foi provado ser um dos fatores Myc produzidos pelo fungos pelo seu reconhecimento pela planta. [26]

Uma das principais funções dos fungos arbusculares, contidos em associação simbiótica com as plantas, é fornecer às plantas nutrientes do solo, especialmente fosfato. [27] Assim, quando o fosfato na zona de depleção fica muito baixo, a planta depende principalmente dos fungos AM para atender às suas demandas de fosfato. [27] Estudos com tomateiros mostraram que, quando as plantas sofrem um déficit de fosfato, elas produzem maior quantidade de estrigolactonas, que por sua vez aumentam a ramificação dos fungos AM. [27] Espera-se que esse desenvolvimento excessivo dos fungos forneça o fosfato adicional necessário para a planta, uma vez que os fungos agora podem se espalhar para mais áreas do solo. [27] No entanto, como a estrigolactona também estimula a germinação de plantas parasitas, essas plantas deficientes em fosfato também apresentam maior invasão de espécies parasitas, como Striga sp. [27] Provou-se que o fornecimento de fosfato adequado por meio da fertilização do solo reduz a proliferação desses parasitas, pois eles requerem estrigolactona para sua germinação. [27]


Resumo

Estrigolactonas (SLs) são hormônios vegetais derivados de carotenóides e moléculas de sinalização. Quando liberados no solo, os SLs indicam a presença de um hospedeiro para fungos simbióticos e plantas parasitas de raízes. In planta, eles regulam vários processos de desenvolvimento que adaptam a arquitetura da planta à disponibilidade de nutrientes. Mutantes altamente ramificados / afilados em Arabidopsis, ervilha e arroz permitiram a identificação de quatro enzimas biossintéticas SL: a cis/trans-caroteno isomerase, duas dioxigenases de clivagem de carotenóides e um citocromo P450 (MAX1). Ensaios enzimáticos in vitro e in vivo e análises de mutantes mostraram que a via envolve uma combinação de novas reações que levam à carlactona, que é convertida por um homólogo MAX1 de arroz em uma molécula-mãe SL com uma porção de lactona tricíclica. Nesta revisão, nos concentramos na biossíntese de SLs, descrevemos os fatores hormonais e ambientais que determinam esse processo e discutimos o transporte de SLs e a sinalização a jusante, bem como o papel dos SLs na regulação do desenvolvimento das plantas.


Discussão

Várias linhas de evidência indicam que as estrigolactonas desempenham um papel na simbiose do rizóbio de leguminosas [1–6]. Aqui, mostramos aquela expressão de MtD27, um gene que atua na via de biossíntese da estrigolactona, é fortemente elevado pela sinalização induzida por rizóbio LCO. Além disso, descobrimos que este gene é co-expresso com MtCCD7 e MtCCD8 em nódulos primordiais, bem como na zona de infecção de nódulos maduros. Isso sugere uma função putativa para esses genes de biossíntese de estrigolactona durante vários estágios da interação leguminosa-rizóbio.

Estudos com o análogo de estrigolactona GR24 revelaram um efeito de aumento da nodulação quando aplicado exogenamente [1, 5]. Em consonância com isso, uma redução severa nos níveis de estrigolactona endógena devido a mutações em ccd7 ou ccd8 está ligado a uma diminuição moderada na eficiência da nodulação [2–4]. Foo e Davies [2] concluem que, embora as estrigolactonas influenciem a iniciação do nódulo, elas não são essenciais. Não foi possível confirmar esses resultados em MtD27 Raízes knockdown de RNAi de M. truncatula. Não podemos descartar isso em nosso MtD27 Experimentos de RNAi MtD27 a expressão não é suficientemente reduzida para causar tal fenótipo de nodulação moderada. Alternativamente, os fenótipos causados ​​por uma função D27 alterada podem ser mais fracos do que os fenótipos de ccd7 ou ccd8 mutantes. Esta hipótese encontra apoio em estudos em arabidopsis e arroz, onde os fenótipos de ramificação do caule foram muito mais severos em ccd7 e ccd8 mutantes quando comparados a d27 [21, 38]. Com base nisso, Waters et al. [38] especulam sobre compostos bioativos residuais presentes em Atd27 mutantes. Se tal composto bioativo residual também existir em M. truncatula, é possível que sua atividade seja suficiente para o início e desenvolvimento adequados do nódulo.

Ainda não se sabe como as estrigolactonas promovem a iniciação do nódulo. Um possível mecanismo é a promoção da formação de um máximo de auxina nodular. A modelagem matemática prevê que esse máximo é provavelmente criado por meio de uma redução local na capacidade de transporte de auxina no córtex da raiz [49]. Essas reduções na capacidade de transporte de auxina da raiz foram observadas após a inoculação com rizóbio [50, 51]. Mutantes deficientes em estrigolactona de Arabidopsis mostram transporte elevado de auxina tanto nos brotos quanto nas raízes [52]. É proposto que as estrigolactonas atuam alvejando os transportadores de efluxo de auxina do PIN tanto na expressão gênica quanto no nível de proteína [53-57]. Portanto, é possível que a biossíntese de estrigolactona induzida por rizóbio afete o transporte de auxina e, como tal, contribua para criar e / ou manter um máximo de auxina durante a formação do nódulo. No entanto, é improvável que as estrigolactonas sozinhas sejam suficientes para reduzir a capacidade de transporte de auxina após a percepção de LCOs de rizóbio, uma vez que mutantes deficientes em estrigolactona ainda formam nódulos, embora menos numerosos do que as plantas do tipo selvagem [2, 3]. Possivelmente, eles poderiam funcionar redundantemente para outro sinal, como por exemplo citocinina [51, 58-60] ou flavonóides [61].

MtD27 a expressão é elevada em 1-2 h após a aplicação de LCO, pelo que está entre os primeiros genes responsivos. Esta ativação transcricional está sob controle da rede de sinalização rhizobium LCO, que inclui MtDMI2, MtDMI1, MtDMI3 / MtCCaMK, MtNSP1, MtNSP2 e em parte MtERN1. Descobrimos que também expressão de MtCCD7 e MtCCD8 foi induzido após a aplicação de LCOs de rizóbio. No entanto, essas respostas foram menos pronunciadas quando comparadas com MtD27. Expressão de MtCCD7 foi apenas ligeiramente afetado pela aplicação de LCOs de rizóbio, enquanto a indução de MtCCD8 era dependente do sistema de crescimento. A análise da expressão espaço-temporal revelou que em um contexto simbiótico, especialmente MtD27 a expressão é estritamente controlada de maneira espaço-temporal. Sob condições não simbióticas MtD27 é expresso principalmente na estela da raiz, enquanto os LCOs de rizóbio ativam a expressão na epiderme da raiz. Essa regulação espaço-temporal clara não foi observada para MtCCD7 nem MtCCD8 já que ambos os genes têm um padrão de expressão muito mais amplo em condições não simbióticas. Por que MtD27 é estritamente controlado em condições simbióticas permanece desconhecido. Expressão de MtCCD7 e MtCCD8 pode não ser limitante da taxa ou, alternativamente, a indução de MtD27 por rizóbio LCOs pode ser parte de uma resposta priming que prepara as células epidérmicas para o processo de infecção [6].

Nossos dados sugerem um papel putativo para estrigolactonas em nódulos maduros, como MtD27, MtCCD7 e MtCCD8 são coexpressos no meristema do nódulo e na zona de infecção distal. Isso pode sugerir que as estrigolactonas promovem o funcionamento do meristema e / ou infecção rizobiana. Recentemente, foi mostrado que MtD27 e MtCCD8 são induzidos transcricionalmente em fios de cabelo infectados [6]. Nossos dados também indicam a expressão de MtD27 e MtCCD8 em células que contêm fios de infecção em crescimento no nódulo da raiz, apoiando uma função putativa para MtD27 e MtCCD8 no processo de infecção. Além disso, a indução de MtD27 a expressão por LCOs de rizóbio é parcialmente dependente de MtERN1, um fator de transcrição necessário para o desenvolvimento do segmento de infecção [45].

MtD27 também é ativado transcricionalmente por estresse de privação de fosfato e esta indução é dependente de MtNSP1 e MtNSP2 [17]. Estudamos a regulação espacial de MtD27 em resposta à privação de fosfato e descobriu que o padrão de expressão espacial permanece inalterado, mas MtD27 a expressão é aumentada na estela e no meristema da raiz apical. A ativação transcricional de MtD27 em resposta ao status de fosfato no ambiente coincide com um aumento da exsudação de estrigolactonas [29, 30, 34]. Geralmente, é antecipado que esta resposta está contribuindo para a atração de fungos endomicorrízicos, que aumentam a aquisição de fosfato do ambiente [33, 36]. Testamos se a indução de MtD27 por fome de fosfato é dependente da via de sinalização comum, bem como se esta resposta é (parcialmente) dependente de MtERN1. Nenhum dos componentes de sinalização estava envolvido na privação de fosfato induzida MtD27 expressão. Isso indica que as vias de sinalização que regulam a ativação transcricional de MtD27 por rizóbio LCOs e privação de fosfato compartilham apenas NSP1 e NSP2 (Fig. 9). Interessantemente, MtD27 a abundância da transcrição é reduzida em um Mtnsp1Mtnsp2 fundo mutante quando comparado ao tipo selvagem [17]. Além disso, descobrimos que a indução deste gene sob estresse de fosfato ou sinalização LCO ainda ocorre nesses mutantes, embora em níveis muito moderados (Figs. 4e e 8f). Tomados em conjunto, isso suporta a hipótese de que MtNSP1 e MtNSP2 funcionam em uma via paralela para facilitar a indução de MtD27 por LCOs de rizóbio e estresse de fome de fosfato, ao invés de ser parte das cascatas de sinalização primárias [7, 15] (Fig. 9).

Modelo esquemático que descreve a indução de MtD27 expressão por privação de fosfato e sinalização induzida por LCO de rizóbio. Rhizobium LCOs ativam a expressão de MtD27 através do módulo de sinalização de simbiose comum que consiste em MtDMI1, MtDMI2 e MtDMI3. A jusante deste módulo MtERN1 é necessário para a indução completa de MtD27. A função MtERN1 é parcialmente redundante, sugerindo que MtERN1 pode funcionar em conjunto com ou redundante para outro regulador transcricional desconhecido, indicado como X. Este fator desconhecido pode ser MtERN2, um regulador transcricional intimamente relacionado ao MtERN1 [48]. O caminho que leva à ativação de MtD27 a expressão por privação de fosfato permanece desconhecida. As proteínas GRAS MtNSP1 e MtNSP2 são necessárias para a expressão de MtD27 durante a privação de fosfato e após a aplicação de rizóbio LCO. Propomos que essas proteínas funcionem em paralelo a ambas as vias de sinalização, como já sugerido anteriormente para a cascata de sinalização LCO [7, 15]

O módulo biossintético D27-CCD7-CCD8 é amplamente conservado em plantas superiores. Como mostramos isso MtD27 é ativado transcricionalmente de maneira espaço-temporal em resposta a LCOs de rizóbio em M. truncatula raízes, este gene pode representar um excelente gene marcador para estudar a sinalização induzida por rizóbio em um contexto filogenético.


Resultados

Max2, d14, e ccd7 plantas, mas não kai2 plantas, produzem mais ramos com caules que acumulam níveis mais elevados de antocianinas

Para explorar o papel da sinalização SL e KAR na resistência da planta a herbívoros perfuradores do caule, primeiro caracterizamos MAX2, o co-receptor da sinalização SL e KAR, em N. Attenuata. Os dois homólogos de MAX2, NaMAX2a e NaMAX2b, foram encontrados para serem localizados no núcleo (S1A e S1B Fig), e ambas as proteínas interagiram com NaD14 na presença de GR24 (S1C Fig). Um experimento de silenciamento de gene induzido por vírus (VIGS) que silenciou independentemente os dois homólogos, embora relativamente fracamente (com 61% de MAX2a e 63% de MAX2b eficiência de silenciamento, respectivamente) sugeriu redundância funcional dos dois homólogos, uma vez que o fenótipo de ramificação característico de linhas deficientes em SL (Fig. 1A e 1B) não foi observado. Dado que ambas as proteínas interagiram com D14, geramos a seguir uma linha transgênica estável expressando uma construção de RNAi, repetição invertida max2, que silenciou ambos MAX2a e MAX2b com uma única construção em tandem de repetição invertida (S1D Fig). Duas linhagens transgênicas homozigotas independentes, max2# 1 e max2# 2 (Fig 1A), cada um abrigando inserções únicas e completas, conforme verificado por várias sondas NanoString (Fig S1E), foram selecionados. Como a eficiência de silenciamento de MAX2a / b foi geralmente baixo (50% -70% de eficiência de silenciamento) (Fig 1C), ensaios de fenotipagem, além dos ensaios de número de tronco / ramo (Fig 1B) foram conduzidos para caracterizar o max2 linhas em maior profundidade: além de maior ramificação, ambas as linhas de max2 as plantas mostraram respostas atenuadas aos tratamentos GR24 e KAR em ensaios que mediram o alongamento do hipocótilo e a germinação das sementes (S1F e S1G Fig.). Três suítes adicionais de linhas transgênicas nas quais os principais componentes das vias de sinalização SL e KAR, incluindo D14, CCD7, e KAI2 genes (S2A e S2B Fig), foram silenciados por RNAi foram gerados (Fig 1A e 1C). Para cada construção de silenciamento, selecionamos duas linhas transgênicas independentes, que abrigavam uma única inserção completa da construção de RNAi de repetição invertida, conforme verificado por várias sondas NanoString (S2C-S2E Fig) [42]. Uma linha transgênica transformada com um vetor vazio (EV) foi usada como plantas de controle [11]. Todas as linhas de SL-insensíveis (max2 e d14) e deficiente em SL (ccd7) as plantas exibiram um número maior de ramos primários e plantas com alturas mais curtas dois kai2 as linhas não diferiram das plantas de controle nestes parâmetros (Fig. 1A e 1B). Consistente com um loop de feedback negativo que controla a produção de SL, transcrições de dois genes biossintéticos de SL, NaCCD7 e NaCCD8, foram regulados positivamente nas raízes de max2 e d14 plantas (S3A e S3B Fig). Quando as plantas foram cultivadas sob baixas taxas de fornecimento de fosfato, os níveis de (±) 2′-epi-orobanchol, a forma ativa de SL em N. Attenuata, foram aproximadamente 20 a 50 vezes maiores nos exsudatos radiculares de d14 e max2 plantas (S3C-S3F Fig) em contraste, este composto era quase indetectável nos exsudatos da raiz de ccd7 plantas (S3F Fig).

(A) Fenótipos de ramificação representativos de EV, duas linhas transgênicas independentes nas quais os genes alvo foram individualmente silenciados: max2# 1 e max2#2, d14# 1 e d14#2, ccd7# 1 e ccd7# 2, e kai2# 1 e kai2# 2 plantas. Barra de escala, 5 cm. (B) Altura da planta e números de ramos primários por planta das plantas indicadas (± SE, n = 12). Ramos com mais de 5 cm foram contados. (C) Eficiência de silenciamento de genes alvo. Abundância relativa da transcrição de MAX2a e MAX2b em gemas axilares de EV, max2# 1, e max2# 2 plantas D14 em gemas axilares de EV, d14# 1, e d14# 2 plantas CCD7 em mudas de EV, ccd7# 1, e ccd7# 2 plantas KAI2a e KAI2b nas folhas de EV, kai2# 1, e kai2# 2 plantas (± SE, n = 3–4) (***P & lt 0,001 estudante bicaudal t teste). Os valores dos gráficos (B) e (C) estão listados nos Dados S1. ccd, clivagem de carotenóide dioxigenase d14, anão 14 EV, vetor vazio kai2, karrikin insensível 2 max2, mais crescimento axilar 2 n.s., RNAi não significativo, RNA de interferência SL, estrigolactona.

Curiosamente, as hastes de max2, d14, e ccd7 as plantas ficaram vermelhas nos estágios de desenvolvimento posteriores da floração (Fig 2A), um fenótipo não relatado anteriormente em outros estudos relacionados ao SL. Consequentemente, os níveis de antocianina foram significativamente mais elevados (2 vezes) nestas três plantas SL-RNAi (Fig 2B). Dado o papel do JAs e da auxina na regulação do acúmulo de antocianinas em N. Attenuata [5], foram quantificados os níveis constitutivos de JAs (JA e JA-Ile) e IAA. Ambos os níveis de JA e IAA foram significativamente aumentados nas hastes de max2, d14, e ccd7 plantas, mas a mudança de dobra de IAA foi globalmente maior do que a de JAs (Fig. 2C). No entanto, nem a cor do caule e o teor de antocianina, nem os níveis de JA e IAA em kai2 as plantas diferiram significativamente das plantas de controle EV (Fig. 2).

(A) Fenótipos de caule representativos de EV de 75 dias, max2, d14, ccd7, e kai2 plantas. (B) Níveis relativos de antocianina na epiderme dos caules das plantas indicadas (± SE, n = 8). (C) Níveis de JA, JA-Ile e IAA em caules de plantas indicadas (± SE, n = 6) (*P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001 estudante bicaudal t teste). Os valores dos gráficos (B) e (C) estão listados nos Dados S1.ccd, dioxigenase de clivagem de carotenóide d14, anão 14 EV, vetor vazio IAA, ácido indol-3-acético JA, jasmonato JA-Ile, ácido jasmônico-isoleucina kai2, karrikin insensível 2 max2, mais crescimento axilar 2 n.s. não significativo.

Max2, d14, e ccd7 plantas, mas não kai2 plantas, são mais suscetíveis às larvas do gorgulho do caule, T. mucorea

O maior conteúdo de antocianinas nas hastes e os maiores níveis de JA nas plantas SL-RNAi sugeriram alterações na defesa da planta nessas linhagens [1,43]. Para explorar essa inferência, investigamos o papel da sinalização SL na defesa de herbívoros com um herbívoro ecologicamente relevante, as larvas neonatas do N. Attenuata especialista T. mucorea gorgulho, que entra no RSJ de N. Attenuata as plantas se alimentam da medula dos caules (Fig. 3A) e provocam acúmulos de antocianina nas camadas epidérmicas do RSJ e nos caules (Fig. 3B). Realizamos ensaios de desempenho larval com um método previamente caracterizado [11]: para imitar como T. mucorea ataca plantas na natureza, ovos recém-coletados foram inoculados nos pecíolos das folhas da roseta, os locais naturais de oviposição de T. mucorea adultos. As larvas neonatas então se enterram através dos pecíolos na medula do RSJ, onde se alimentam endofiticamente dentro dos caules. Em 2 ou 3 semanas pós-inoculação (wpi), quando as larvas em caules de tipo selvagem (WT) estão tipicamente no penúltimo instar [44], caules foram cuidadosamente abertos, as larvas foram recuperadas e a biomassa larval foi quantificada. Para primeiro investigar o papel direto dos JAs na defesa contra T. mucorea, uma linha transgênica deficiente na sinalização de JA, resultante do silenciamento do gene biossintético de JA, óxido aleno ciclase (aoc) plants [45], foi usado para o ensaio de desempenho larval. Em contraste com as plantas EV, aoc as plantas não mostraram nenhum fenótipo de haste vermelha após T. mucorea ataque (Fig 3B), e as larvas tiveram um desempenho muito melhor em aoc plantas (Fig 3C), indicando que JA regula positivamente o acúmulo de antocianina do caule e a defesa contra T. mucorea ataque, conforme relatado anteriormente [11].

(A) Diagrama esquemático de um T. m.planta atacada. A medula do caule e a parte RSJ usadas neste estudo estão marcadas. (B) Fotos representativas de EV, max2, e aoc plantas após 3 semanas de T. m. pigmentação vermelha de ataque ocorreu ao longo das hastes após o ataque ou em max2 plantas independentemente do ataque, conforme indicado pelas setas vermelhas. (C) Biomassa de T. m. larvas após atacar EV e aoc plantas por 2 semanas (n = 8–15). (D) Fotos representativas de T. m. larvas após atacar EV, max2# 1, e max2# 2 plantas por 2 semanas e biomassa de T. m. larvas após atacar EV, max2# 1, e max2# 2 plantas por 2 semanas (n = 15). Análise cinética de T. m. acúmulos de biomassa de larvas após 1, 2 e 3 wpi (n = 10–18). Barra de escala, 2 mm. (E) Biomassa de T. m. larvas após atacar EV, d14# 1, e d14# 2 plantas por 2 semanas (n = 16). (F) Imagens representativas e biomassa de T. m. larvas após atacar EV, ccd7# 1, e ccd7# 2 plantas por 2 semanas (n = 20). (G) Biomassa de T. m. larvas após atacar EV, kai2# 1, e kai2# 2 plantas por 3 semanas (n = 20). (H) Abundância transcrita relativa de BRC1a e CCD8 na medula do caule de plantas EV sem (Controle) ou com T. m. ataque (T. m.) por 2 semanas (± SE, n = 4). Níveis de (±) -2′-epi-orobancol em raízes com tratamentos indicados (± SE, n = 8). (I) Níveis de JA e JA-Ile na medula de EV e max2 plantas sem ou com T. m. ataque por 3 semanas (± SE, n = 6–10). (J) Níveis de JA, JA-Ile e IAA na medula de EV, max2, e ccd7 plantas com T. m. ataque por 2 semanas (± SE, n = 6–10) (estudante bicaudal t teste). Os valores dos gráficos (C – J) são listados em S1 Data. aoc, óxido de aleno ciclase BRC1, ramificado 1, ccd, clivagem de carotenóide dioxigenase d14, anão 14 EV, vetor vazio IAA, ácido indol-3-acético JA, jasmonato JA-Ile, ácido jasmônico-isoleucina kai2, karrikin insensível 2 max2, mais crescimento 2 ns RSJ não significativo, junção raiz-parte aérea T. m., T. mucorea wpi, semanas pós-inoculação.

Para avaliar o papel do MAX2 na defesa contra T. mucorea, medimos o crescimento e o tempo das transições instares de larvas que se alimentam em caules de max2 plantas. As larvas eram significativamente maiores quando se alimentavam de max2 (# 1 e # 2) plantas do que em plantas EV (Fig. 3D). Além disso, T. mucorea larvas consistentemente tiveram melhor desempenho em max2# 2 plantas do que em plantas EV, independentemente do período de alimentação (aproximadamente 1-3 wpi) (Fig 3D, S4A Fig), o que implica diferenças constitutivas (em vez de induzidas) entre EV e max2 plantas em resistência a herbívoros. Após a infestação de insetos, tanto EV quanto max2 as plantas não mostraram diferenças no diâmetro do caule, altura da planta e número de ramos primários em comparação com os das plantas não infestadas (Fig S4B). Esses resultados, consistentes com as observações de campo [44], sugerem que T. mucorea o ataque não altera morfologicamente as estruturas da planta. Além disso, as larvas também foram encontradas com mais frequência (aproximadamente 80%) alimentando-se da medula de max2 caules em ensaios de escolha de larvas (Fig S4C). Considerando o envolvimento de MAX2 nas vias de sinalização SL e KAR, d14, ccd7, e kai2 as plantas foram adicionalmente usadas em ensaios de alimentação para dissecar com mais precisão os efeitos da sinalização SL e KAR na resistência aos herbívoros. As larvas alimentando-se nos caules de ambos d14 e ccd7 as plantas eram mais pesadas do que aquelas que se alimentavam nos caules das plantas EV (Fig. 3E e 3F), demonstrando que a sinalização SL está positivamente correlacionada com o desempenho larval. No entanto, o desempenho da alimentação das larvas em EV ou kai2 as plantas não diferiram significativamente (Fig. 3G), indicando que a sinalização KAR não está envolvida nas respostas defensivas contra T. mucorea.

Identificamos respostas fitohormonais mediadas por SL para T. mucorea ataque e mudanças em genes repórter SL e níveis de SL em plantas EV. Em resposta à alimentação das larvas, transcrições abundantes de BRC1a e CCD8 foram significativamente reduzidos para cerca de 25% daqueles em plantas EV não atacadas, e os níveis de (±) -2′-epi-orobancol nas raízes diminuiu em 50% após o ataque (Fig 3H), indicando que T. mucorea O ataque leva à regulação negativa das respostas do SL. Os conteúdos de JA foram dramaticamente elevados de uma maneira dependente de AOC após T. mucorea ataque (Fig 3I). Além das respostas constitutivas de IAA e JAs de max2 plantas (Fig 2C), as indutibilidades de JA (em vez de JA-Ile) e os níveis de IAA nas hastes de max2 e ccd7 plantas em resposta a T. mucorea a alimentação também foi consistentemente mais alta do que a das plantas EV (Fig. 3J).

Para iluminar de forma abrangente os mecanismos responsáveis ​​pela resistência atenuada de plantas insensíveis ao SL a T. mucorea, realizamos um ensaio de microarray para comparar as mudanças transcricionais constitutivas na medula dos RSJs de EV e max2 plantas. Análise de escalonamento multidimensional (MDS) agrupada max2# 1 e max2# 2 juntos e claramente os separou das amostras EV (S5A Fig). Genes expressos diferencialmente (DEGs) incluíram 1.160 DEGs regulados positivamente e 435 DEGs regulados negativamente (| log2FC | ≥ 1, taxa de descoberta falsa (FDR) ≤ 0,05) (S5B e S5C Fig), e estes foram posteriormente usados ​​para calcular o enriquecimento de termos de Gene Ontology (GO). Os termos GO foram altamente enriquecidos em processos associados à regulação do desenvolvimento do meristema, sinalização, metabolismo hormonal e transporte. Entre estes, o metabolismo do fenilpropanóide, a resposta ao ferimento e o transporte e resposta da auxina foram relatados anteriormente como estando envolvidos na defesa da planta (S5D Fig.) [2,5]. Consistentemente, os níveis de transcrição dos genes associados a feridas NaOPR2a, NaOPR2b, e JASMONIC ACID RESISTANT 4 (NaJAR4) e genes relacionados com auxina de NaPIN7, NaPIN6, NaPIN1, YUCCA 6 (NaYUC6), e AUXIN RESISTANT 1 (NaAUX1) foram regulados positivamente em max2 amostras (S5E Fig). As mudanças desses genes foram observadas de forma consistente nos RSJs de d14 e ccd7 plantas, mas não nas de kai2 plantas (S5F Fig). Para resumir, as plantas SL-RNAi são mais suscetíveis a T. mucorea atacar e exibir respostas amplificadas de JAs e IAA nas camadas transcricional e metabólica, independentemente do ataque de herbívoros. Dado o conhecimento comum de que as defesas das plantas são reguladas positivamente pela sinalização JA, essa aparente desconexão foi particularmente intrigante.

O perfil metabólico não direcionado revelou mudanças em setores específicos do metabolismo especializado nos RSJs de max2 plantas

A aparente desconexão entre os níveis mais elevados de JA / JA-Ile observados e a maior suscetibilidade ao ataque de herbívoros em max2, d14, e ccd7 as plantas levaram à previsão de que setores específicos do metabolismo de defesa em plantas SL-RNAi não eram regulados principalmente pela sinalização de JA. Para entender melhor a base metabólica subjacente da resistência a T. mucorea ataque, dois lotes de amostras RSJ de EV, max2#1, max2# 2, e aoc plantas (41 no total) foram analisadas por perfil de metaboloma não direcionado usando cromatografia líquida (LC) acoplada a espectrometria de massa de tempo de vôo quadrupolo (qTOF-MS). Esta análise resultou em uma matriz de dados concatenada que consiste em 5.975 características de massa (m / z sinais detectados em tempos de retenção específicos). Uma análise de componentes principais supervisionada usando análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) separou claramente o max2 amostras, que bem agrupadas (Fig 4A). Para cada lote, Aluno t testes com correções de Benjamin-Hochberg entre comparações com amostras EV foram realizados. Esta análise identificou 226 características de massa reguladas positivamente e 309 reguladas negativamente, que foram posteriormente utilizadas para análises de coexpressão com os seguintes requisitos de significância: | log2FC | & gt 0,58, FDR & lt 0,05 (Fig 4B, Tabela S1).

(A) PLS-DA de metabolomas de EV, aoc, e max2 plantas em dois experimentos independentes (lote 1 e 2). (B) Número de recursos regulados para cima e para baixo no total após a filtragem estatística. (C) Gráfico TOM para visualizar o resultado da coexpressão por WGCNA. (D e E) Sub-redes extraídas visualizadas pelo Cytoscape (painéis à esquerda) e correlações com o conteúdo JA com cada sub-rede foram calculadas como PCC e seus P valores. Os gráficos de barras exibem os compostos representativos de cada sub-rede em todas as amostras de dois lotes (cinza escuro: roxo do primeiro lote: segundo lote). Os valores dos gráficos (D) e (E) estão listados na Tabela S1. aoc, óxido de aleno ciclase CP, N′ -Cafeoilputrescina DCS, N′, N ″-decafeospermidina EV, vetor vazio JA, jasmonato JDC, cluster dependente de JA JIC, cluster independente de JA max2, crescimento mais axilar 2 PCC, coeficiente de correlação de Pearson PLS-DA, análise discriminante de mínimos quadrados parciais RSJ, junção raiz-rebento TOM, topológico matriz de sobreposição WGCNA, análise de rede de correlação ponderada.

Um pipeline de coexpressão bem desenvolvido, a análise de rede de correlação ponderada (WGCNA) [46], foi empregada e seis módulos foram obtidos (potência = 10) (Fig 4C). Amostras dos RSJs de aoc plantas foram usadas para identificar sub-redes JA / JA-Ile-independentes / -dependentes. Com base nisso, as redes de coexpressão foram construídas (matriz de sobreposição topológica [TOM] & gt 0.3) (Fig 4D e 4E e S6 Fig), e os clusters independentes de JA (JICs) / clusters dependentes de JA (JDCs) foram definidos dependendo se as sub-redes foram significativamente correlacionados com os conteúdos de JA / JA-Ile das amostras. Conforme indicado na Fig S6, OOs açúcares -acil foram agrupados agradavelmente no módulo azul e fortemente associados a um padrão de enriquecimento semelhante em todos os grupos, revelando a robustez da construção da rede. No entanto, nesta grande sub-rede, os padrões de expressão de variáveis ​​correlacionados com os conteúdos JA / JA-Ile. No cluster JIC # 1, todos os recursos diminuíram consistentemente em max2 e aoc grupos, independentemente do conteúdo JA / JA-Ile (P = 0,156) (Fig 4D). Curiosamente, no cluster JIC # 1 anotado como alcalóides, descobrimos que os níveis de nicotina diminuíram significativamente em max2 e aoc amostras (Fig 4D). Por outro lado, encontramos compostos com correlações negativas significativas com os conteúdos de JA / JA-Ile em clusters desconhecidos JDC # 1 (PCC = −0,41, P = 0,021) (Fig S6B) e JDC # 2 (PCC = −0,76, P & lt 0,0001) (S6C Fig) e compostos com correlações positivas com os conteúdos de JA / JA-Ile em JDC # 3 (PCC = 0,70, P & lt 0,0001) (Fig 4E), que foram principalmente povoados por estruturas conhecidas de fenolamida. Após essas análises, os recursos associados na maior sub-rede de JIC # 1 e JDC # 3 foram capturados para análise posterior.

O aumento do acúmulo de fenolamida em SL-RNAi RSJ está positivamente relacionado à sinalização de JA

Os níveis de fenolamidas localizados no cluster JDC # 3 foram aumentados nos RSJs de max2 plantas, o que é consistente com a presença de enriquecimento significativo de GO em genes biossintéticos de fenilpropanóides (Figura S5D). É importante ressaltar que os compostos de assinatura de fenolamidas, N′-Cafeoilputrescina (CP) e N′, N ″-decaffeospermidina (DCS), também aumentaram em ccd7 e d14 plantas, mas não em kai2 plantas (Fig 5A). Como as fenolamidas são conhecidas por desempenhar papéis essenciais na defesa contra herbívoros lepidópteros que se alimentam de folhas [12,13,47], realizamos um T. mucorea ensaio de desempenho larval com uma linha transgênica silenciada em MYB DOMAIN PROTEIN 8 (MYB8), um fator de transcrição chave que regula a biossíntese de fenolamida em N. Attenuata [13], para esclarecer se o aumento de CP e DCS na medula de plantas SL-RNAi contribuem para a resistência alterada contra o gorgulho do caule. No entanto, embora os níveis de CP e DCS fossem muito mais baixos nos RSJs de myb8 plantas (Fig 5B), desempenho larval em mby8 as plantas eram semelhantes às das plantas EV (Fig. 5C). Esses resultados indicam que as fenolamidas não funcionam como defesas contra T. mucorea larvas.

(A) Teores relativos de fenolamidas, como CP e DCS nas RSJs das plantas indicadas (± SE, n = 6). (B) Conteúdo relativo de CP e DCS em RSJs de EV e myb8 plantas após o ataque. (C) Biomassa de T. m. larvas após atacar EV e myb8 plantas por 2 semanas (n = 15). (D) Abundância transcrita relativa de MYB8 e DH29 em RSJ de EV e aoc plantas (± SE, n = 4). (E) Conteúdo relativo de CP e DCS na medula de EV e aoc plantas sem (controle) ou com T. m. ataque por 2 semanas. (F) Abundância transcrita relativa de MYB8 e DH29 nos RSJs das plantas indicadas (± SE, n = 4). (G) Conteúdo relativo de CP e DCS na medula de EV e max2# 2 plantas sem (Controle) ou com T. m. ataque por 2 semanas (± SE, n = 6–10) (*P & lt 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001 estudante bicaudal t teste). Os valores dos gráficos (A – G) estão listados nos Dados S1. aoc, óxido de aleno ciclase ccd, clivagem de carotenóide dioxigenase CP, N′ -Cafeoilputrescina d14, anão14 DCS, N′, N ″-decaffeospermidina DH29, ACILTRANSFERASE DH29 EV, vetor vazio JA, jasmonato kai2, karrikin insensível 2 max2, mais crescimento axilar 2 n.s., RNAi não significativo, RNA de interferência RSJ, junção raiz-rebento SL, estrigolactona T. m., T. mucorea.

Consistente com descobertas anteriores em folhas [47], transcrições abundantes de genes-chave na biossíntese de fenolamida, incluindo MYB8 e aciltransferase DH29 (DH29), foram dramaticamente menores na medula de aoc plantas (Fig 5D) e os aumentos nos níveis de CP e DCS após T. mucorea ataque estavam completamente ausentes em aoc plantas (Fig 5E), sugerindo que os níveis diminuídos de JA / JA-Ile reduzem a produção de fenolamidas por regulação negativa da expressão de MYB8 e DH29 genes. Em SL-insensível e SL-deficiente max2, d14, e ccd7 linhas, a abundância de transcrições de MYB8 e DH29 foram regulados positivamente na medula (Fig. 5F). Os níveis de CP e DCS também foram maiores na medula de max2 plantas comparadas com as de plantas EV após T. mucorea ataque (Fig 5G). Tomados em conjunto, os níveis elevados de JA podem ser responsáveis ​​pelos aumentos de fenolamidas por meio da regulação positiva MYB8 e DH29 nas linhas SL-RNAi, essa inferência nos permitiu desvendar a interferência potencial entre as vias de sinalização SL e JA por meio do cruzamento de diferentes linhas de RNAi que visavam genes-chave nessas vias de sinalização.

Acúmulos de fenolamida e antocianina são regulados pela sinalização SL via sinalização JA

Conforme mostrado nas Figs. 2 e 5, antocianina, fenolamidas e JAs superacumulam nas hastes de plantas SL-RNAi, enquanto em aoc plantas, níveis extremamente baixos de JA estão associados a níveis baixos de antocianina e fenolamida (Fig. 3B, Fig. 5E). Para examinar melhor essa interação da sinalização JA-SL, um conjunto de hibridizações genéticas foi projetado. d14 e max2 plantas com seus altos níveis de JA foram cruzadas com o deficiente em JA aoc plantar. Quantificamos os níveis de antocianina e fenolamida em todos os cruzamentos. Os níveis de antocianina nas hastes de EV ×d14 e EV ×max2 as plantas eram significativamente maiores do que aquelas em aoc×d14 e aoc×max2 plantas, um resultado consistente com os níveis mais altos de JA em ambos EV ×d14 e EV ×max2 plantas (Fig 6A e 6B) e demonstrando claramente que as funções de sinalização de JA a jusante de SLs para regular as acumulações de antocianina e fenolamida. Notavelmente, embora os aumentos nos níveis de antocianina em d14 e max2 hastes foram atenuadas em cruzamentos com aoc plantas, os níveis de antocianinas em aoc×d14 e aoc×max2 caules ainda eram significativamente maiores do que aqueles em EV ×aoc hastes (Fig 6A e 6B), sugerindo que outro fator adicional regula os acúmulos de antocianina. Como a auxina é conhecida por regular os níveis de antocianina em N. Attenuata [5] e ocorre em maiores concentrações nos caules de plantas SL-RNAi, inferimos que a auxina contribuiria positivamente para o acúmulo de antocianinas nos caules de SL-RNAi. Em contraste com os resultados de que JA e IAA provavelmente regulam o acúmulo de antocianina, SL regula a produção de fenolamida principalmente por meio da sinalização de JA, já que os conteúdos de fenolamida eram quase indetectáveis ​​em EV ×aoc, aoc×d14, e aoc×max2 medulas, enquanto os níveis de fenolamidas aumentaram dramaticamente em EV ×d14 e EV ×max2 medula depois T. mucorea ataque (Fig 6C). Tomados em conjunto, cruzando plantas SL- e JA-RNAi, dissecamos as consequências funcionais dos níveis de JA acumulados em plantas insensíveis a SL para revelar que as concentrações de antocianina e fenolamidas em caules de plantas insensíveis a SL aumentam de maneira dependente de JA . Essa percepção motivou uma exploração mais profunda do mecanismo molecular envolvido nessa conversa cruzada.

(A) Imagens representativas de hastes de EV, EV ×d14#1, aoc×d14# 1, EV ×max2# 2, e aoc×max2# 2 plantas. (B) Níveis relativos de antocianina na epiderme dos caules das plantas indicadas (n = 8). (C) Teores relativos de CP e DCS na medula do caule das plantas indicadas após 2 semanas de T. mucorea ataque (n = 8) (estudante bicaudal t teste). Os valores dos gráficos (B) e (C) estão listados nos Dados S1. aoc, óxido de aleno ciclase CP, N′ -Cafeoilputrescina d14, anão 14 DCS, N′, N ″-decaffeospermidina EV, vetor vazio max2, mais crescimento axilar 2 JA, jasmonato SL, estrigolactona.

Interação da sinalização SL e JA por meio de interações SMXL6 / 7-JAZ

Com base nos resultados do cruzamento, inferimos que SL sintoniza as respostas da via de sinalização JA por meio de um mecanismo desconhecido para regular a produção de antocianina e fenolamida por meio de COI1 / JAZ e fatores de transcrição, como MYB8 (Fig 7A). Dado que a interação direta de JAZs com proteínas DELLA contribui para a interferência entre a sinalização JA e GA [48], formulamos a hipótese de que as interações físicas entre os supressores de sinalização SL e JA poderiam ser responsáveis ​​pela interação entre a sinalização SL e JA (Fig. 7A ) Depois de BLAST N. Attenuata pesquisas de genoma com sequências publicadas de supressores de MAX2, SMXL6 / 7/8 de Arabidopsis, dois ortólogos (NaSMXL6 e NaSMXL7) foram identificados (Fig. 7B e Fig. S7A). NaSMXLs foram localizados no núcleo e interagiram diretamente com NaD14 na presença do análogo SL sintético rac-GR24 (5 μM) (Fig 7C e 7D, S7B e S7C Fig).

(A) Diagrama esquemático da sinalização JA amplificada resultante da sinalização SL silenciada que leva ao acúmulo de antocianinas e fenolamidas. (B) Análise filogenética de NaSMXL família de genes de N. Attenuata. (C) Interações entre as proteínas NaSMXL6 / 7 e NaD14 na presença de rac-GR24 por ensaios Y2H. GAL4 DNA-BD-D14 e AD-SMXL6 / 7 foram co-transformados em levedura. Os transformantes foram cultivados em QDO (SD − Ade / −His / −Leu / −Trp). (D) As interações de NaSMXL6 / 7 e NaD14 na presença de 20 μM rac-GR24 por ensaios pull-down. NaSMXL6 / 7-YFP foi transitoriamente expresso em N. benthamiana sai. Foi usado GST-D14 purificado. A entrada de GST-D14 é mostrada no segundo painel. (E) Interação entre NaSMXL6 / 7 e proteínas NaJAZs por ensaios Y2H. GAL4 DNA-BD-SMXL6 / 7 e AD-JAZs foram co-transformados em levedura. Os transformantes foram cultivados em QDO (SD −Ade / −His / −Leu / −Trp com 40 μg / mL X-α-gal). (F) Abundância transcrita relativa de SMXL6, SMXL7, e aqueles JAZs que codificam proteínas JAZ que interagem com SMXL em diferentes tecidos. Os níveis de expressão foram analisados ​​a partir de dados de microarray. (G) Interações de SMXL6 / 7-YFP e MYC-JAZb por Co-IP in vivo. (H) Degradação de JAZb em EV e max2 (# 1, # 2) proteínas brutas. His-JAZb purificado foi incubado em EV ou max2 proteínas brutas extraídas da medula do caule nos tempos indicados. His-JAZb foi detectado pelo anti-His. A coloração CBB representou os níveis de carga de proteína. (I-J) Degradação de JAZb em EV, d14# 1, ou kai2# 1 proteínas brutas, com a mesma condição mencionada em (H). (K) Interferência de SMXL6 / 7 na interação de JAZb e MYC2a / b pelo ensaio Y3H. A expressão de SMXL6 / 7 foi gradualmente induzida pela adição de quantidades decrescentes de Met. Os transformantes foram cultivados em QDO (SD − Leu / −His / −Trp / −Met com 40 μg / mL X-α-gal). As imagens brutas para manchas são listadas em S1 Raw Images. AD, domínio de ativação ANT, antera BD, domínio de ligação CBB, Coomassie Brilliant Blue COI1, coronatina insensível 1 Co-IP, co-imunoprecipitação COL, corola tardia d14, anão 14 EV, vetor vazio FLB, botão de flor GST, glutationa S-transferase JA, jasmonate JAR4 / 6, JASMONIC ACID RESISTANT 4/6 JAZ, JASMONATE ZIM-DOMAIN kai2, karrikin insensível 2 LDOX, LEUCOANTHOCYANIDIN DIOXYGENASE LEA, folha LT, Leu e Trp LTHA, Leu, Trp, His e Ade max2, mais crescimento axilar 2 Met, metionina MYB8, MYB DOMAIN PROTEIN 8 OFL, flor de abertura OVA, ovário PED, pedicelo QDO, quádruplo dropout médio ROT, raiz SD, meio sintético definido SED, semente SL, estrigolactona SMXL, supressor de max2-like STE, caule STI, estigma Y2H, levedura dois híbridos Y3H, levedura três híbridos YFP, proteína fluorescente amarela.

Para testar se os repressores SL, NaSMXLs, interagem com os repressores JA, NaJAZs, conduzimos ensaios de dois híbridos de levedura (Y2H). Os resultados sugeriram que SMXL6 e SMXL7 interagiram com JAZa, JAZb, JAZd, JAZj e JAZl, enquanto JAZe interagiu apenas com SMXL7 (Fig 7E). A análise de coexpressão foi realizada usando dados de RNA-seq em diferentes tecidos [49] para identificar padrões entre genes, incluindo SMXLs e JAZs (a / b / d / j / l / e). O abundante caule SMXL7 foi encontrado para ser altamente co-expresso com JAZb (Fig 7F), e JAZb foi usado para estudos posteriores. Confirmamos ainda a interação de SMXL6 / 7 e JAZb in vivo usando ensaios de coimmunoprecipitação (Co-IP). MYC-JAZb interagiu fisicamente com SMXL6 / 7-YFP quando expresso transitoriamente em N. benthamiana folhas (Fig 7G).

No max2 plantas, a proteína SMXL6 acumulou-se em níveis mais elevados do que em plantas EV, conforme determinado por immunoblots com anti-SMXL6 (Fig S7D). De acordo com os mecanismos de degradação elucidados em Arabidopsis e arroz [26,50], um maior acúmulo de SMXL7 foi previsto no entanto, devido à falta de anticorpos contra SMXL7, isso não foi determinado. Para determinar se maiores acúmulos de proteínas SMXL6 / 7 em max2 plantas influenciam a degradação de JAZb, realizamos um ensaio de degradação in vitro adicionando His-JAZb recombinante à proteína bruta extraída da medula de EV ou max2 plantas e quantificou a degradação de JAZb após a incubação para os pontos de tempo indicados. His-JAZb degradou-se mais rapidamente em max2 proteína bruta em relação àquela em EV (Fig 7H). Conforme relatado no arroz, mais proteína D53 se acumulou em ambos d14 e max2 plantas [50], portanto, realizamos ensaios de degradação com d14 proteína bruta. Como esperado, JAZb foi degradado mais rapidamente em d14 extratos de proteína bruta (Fig. 7I). Por causa das relações filogenéticas próximas entre D14 e KAI2, kai2 linhas também foram incluídas nos testes de estabilidade do complexo His-JAZb. O padrão de degradação His-JAZb em kai2 extratos de proteína bruta foram encontrados para ser semelhante à sua degradação em extratos de proteína bruta EV (Fig. 7J). Em contraste com a degradação mais rápida de JAZb ao interagir com SMXL6 / 7, His-JAZk, um dos JAZs que não interage com SMXL6 / 7 nos ensaios Y2H, degradou-se a uma taxa semelhante em EV e max2 extratos de proteína bruta (S7E Fig).

Ensaios Y3H adicionais foram realizados para explorar o efeito de SMXL6 / 7 na interação de JAZb e MYC2a / b. Com a diminuição das concentrações de metionina (Met) na mídia, a abundância de SMXL6 ou SMXL7 foi experimentalmente aumentada e a capacidade de ligação de JAZb-MYC2 foi gradualmente enfraquecida até completamente abolida, quando nenhum Met foi adicionado à mídia (Fig. 7K e S7F Fig. ) Este resultado indica que o SMXL6 / 7 superacumulado amortece a ligação entre MYC2 e JAZb.

Em resumo, a proteína SMXL6 / 7 aprimorada em plantas SL-RNAi interage fisicamente com JAZs para desencadear a degradação da proteína JAZ. A produção excessiva da proteína SMXL6 / 7 interfere nas interações de JAZs e MYC2, que facilitam a liberação de MYC2 para ativar o a jusante da cascata de sinalização JA, que resulta em acúmulos aumentados de antocianina e fenolamida em plantas SL-RNAi.

A diminuição da nicotina mediada pelo aumento da auxina é responsável pela suscetibilidade das plantas SL-RNAi a T. mucorea ataque

Mesmo que as fenolamidas aumentadas não sejam responsáveis ​​pela suscetibilidade das plantas SL-RNAi a T. mucorea ataque (Fig 5B e 5C), notamos que outro composto de defesa essencial no módulo JIC # 1, a nicotina, foi diminuído nos RSJs de max2 amostras da análise do metaboloma não direcionado Fig 4D. Os níveis de nicotina foram consistentemente mais baixos na medula de max2 plantas comparadas com as de plantas EV, independentemente de T. mucorea infestação (S8A Fig), eles também foram significativamente mais baixos nas raízes de max2 plantas após o ataque (S8B Fig). Os níveis de JA e IAA foram maiores nas raízes de max2 plantas (S8C Fig), consistente com seus níveis na medula (Fig 2C). Uma análise posterior revelou que os níveis de nicotina diminuíram significativamente nos RSJs de max2, d14, e ccd7 plantas, mas não nas de kai2 plantas (Fig 8A). Para avaliar se a nicotina, que é sintetizada nas raízes, é essencial para a defesa da planta contra T. mucorea larvas, realizamos ensaios de alimentação usando uma linhagem transgênica deficiente em nicotina, putrescina n-metiltransferase (pmt) plantas (Fig 8B) [51]. T. mucorea larvas inoculadas em pmt as plantas ganharam maior biomassa em comparação com aquelas que se alimentaram de plantas EV (Fig. 8C). É conhecido que a sinalização de JA estimula a biossíntese e o acúmulo de nicotina [8,52], no entanto, nos RSJs de plantas SL-RNAi, baixos níveis de nicotina coincidem com altos níveis de JA / JA-Ile (Fig. 8D). A sinalização de auxina é conhecida por suprimir os níveis de nicotina [52,53], o que sugere que os altos conteúdos de IAA causam os baixos níveis de nicotina em plantas SL-RNAi (Fig. 8E).

(A) Teores relativos de nicotina nos RSJs das plantas indicadas (± SE, n = 6). (B) Níveis relativos de nicotina na medula de EV e pmt plantas (n = 6). (C) Imagens representativas e biomassa de T. mucorea larvas após atacar EV e pmt plantas por 2 semanas (n = 15). Barra de escala, 2 mm. (D) Relação dos níveis de JA e nicotina em RSJ de aoc, EV e SL-RNAi (max2, d14, e ccd7) plantas. Os dados coletados das mesmas amostras são indicados por linhas cinza. (E) Relação de IAA e níveis de nicotina em RSJ de EV e SL-RNAi (max2, d14, e ccd7) plantas. Os dados coletados da mesma amostra são conectados com uma linha cinza. (F) Diagrama esquemático da biossíntese de nicotina regulada por auxina e JA-Ile. (G) Níveis de JA-Ile, JA e IAA em raízes de plantas EV sem (Controle) ou com tratamento de decapitação por 3 dias (n = 6-8). Conteúdo de nicotina nos RSJs de plantas EV com ou sem tratamentos de decapitação por 3 dias (n = 5-6). Biomassa de larvas que atacaram plantas EV intactas ou decapitadas por 2 semanas (n = 12). (H) Níveis de JA-Ile, JA e IAA em raízes de plantas EV sem (Controle) ou com tratamentos com o inibidor de transporte de IAA CFM por 3 dias (n = 6). Níveis de nicotina em RSJ de EV sem ou com tratamento com CFM por 3 dias (n = 6). Bioensaio de preferência de medula com T. mucorea larvas entre as metades do caule EV (Controle) -EV (Controle), EV (Controle) -EV (tratamento CFM) (± SE, 3 repetições, cada repetição inclui 8–10 plantas). (I) Abundância transcrita relativa de genes biossintéticos de nicotina BBL e A622 em EV e aoc mudas sem (Mock) ou com tratamento IAA de 10 μM por 8 horas (± SE, n = 4). (J) Teores de nicotina em RSJ de aoc plantas sem (Controle) ou com tratamento de decapitação (n = 6). Biomassa de larvas que atacaram aoc plantas de controle ou plantas decapitadas por 2 semanas (n = 12) (estudante bicaudal t teste). Os valores dos gráficos (A – E e G – J) são listados em S1 Data. A622, PROTEÍNA SEMELHANTE A ISOFLAVONE REDUTASE-LIKE aoc, óxido de aleno ciclase BBL, BERBERINE BRIDGE COMO ENZIMA ccd, clivagem de carotenóide dioxigenase CFM, metil-2-cloro-9-hidroxifluoreno-9-carboxilato COI1, CORONATINA INSENSITIVO 1 d14, anão 14 EV, vetor vazio IAA, ácido indol-3-acético JA, jasmonato JA-Ile, ácido jasmônico isoleucina JAR, JASMONIC ACID RESISTANT kai2, karrikin insensível 2 max2, mais crescimento axilar 2 n.s., não significativo OPR, OPDA redutase pmt, putrescina n-metiltransferase RNAi, RNA de interferência RSJ, junção raiz-rebento SL, estrigolactona.

Para testar se a quantidade diminuída de nicotina em max2 plantas resultaram de níveis aumentados de IAA, nós manipulamos os níveis de auxina por decapitação ou usando o inibidor de transporte de auxina metil-2-cloro-9-hidroxifluoreno-9-carboxilato (CFM) (Fig 8F). Três dias após a decapitação das plantas EV, não houve mudanças significativas nos níveis de JA e JA-Ile, enquanto o IAA diminuiu cerca de 2 vezes (Fig. 8G). A quantidade de nicotina aumentou significativamente nos RSJs em plantas EV decapitadas (Fig. 8G). Além disso, T. mucorea as larvas tiveram pior desempenho em plantas EV decapitadas em comparação com as de plantas intactas (Fig. 8G). Em seguida, depois de usar CFM para bloquear o transporte de IAA da parte aérea à raiz, os níveis de IAA diminuíram em plantas EV sem alterar os níveis de JA ou JA-Ile (Fig. 8H). A quantidade de nicotina nas RSJs de plantas EV após o tratamento com CFM foi maior do que nas plantas de controle (Fig. 8H). Em ensaios de preferência de medula, mais de 70% das larvas preferiram se alimentar de medula de plantas submetidas ao tratamento CFM do que da medula de controle (Fig. 8H). Para avaliar melhor se a auxina regula os níveis de nicotina independentemente da sinalização de JA, tratamos aoc mudas com IAA por 8 horas. Níveis de transcrição dos genes biossintéticos da nicotina BBL e A622 diminuiu em graus semelhantes (aproximadamente 30%) em ambos EV e aoc mudas (Fig. 8I). Além disso, aoc as plantas ainda acumulavam mais nicotina em seus RSJs após a decapitação, novamente levando a um menor ganho de biomassa larval (Fig. 8J).

Para entender melhor o papel dos níveis aumentados de auxina na max2 plantas em T. mucorea resistência, estudamos a resposta da biossíntese de nicotina de max2 plantas para auxina. Transcrições de BBL e A622 foram mais baixos em max2# 2 do que em mudas EV (S8D Fig), sugerindo que a biossíntese de nicotina em max2 as plantas foram diminuídas. Após o tratamento com auxina, a expressão de BBL e A622 ainda estava diminuído em max2 plantas, como em plantas EV (S8D Fig). Após a decapitação, a quantidade de nicotina foi aumentada nos RSJs de max2# 2 plantas, resultando em desempenho larval significativamente inferior em comparação com plantas não decapitadas (Fig S8E). Esses resultados demonstram que max2A maquinaria de biossíntese de nicotina ainda responde a mudanças nos níveis de auxina.

Em resumo, esses resultados revelam que o efeito inibitório da auxina no acúmulo de nicotina é pelo menos parcialmente independente da sinalização de JA, e é a mudança nos níveis de nicotina associada ao silenciamento do SL que mais profundamente determina o desempenho larval.

A sinalização SL equilibra a produção metabólica de setores especializados por meio de sua interação com JA e auxina

Voltamos aos módulos de metabólito JDC e JIC para entender a relação regulatória ternária dissecada pelo d14, aoc, e d14 × aoc linhas. Como mencionado anteriormente, o cerne da d14 exibiram níveis aumentados de auxina e JA, aoc medula tinha JA mais baixo, mas níveis normais de auxina, e d14 × aoc medula exibiu auxina mais alta, mas níveis mais baixos de JA. Conforme indicado na Fig 4E, JDC # 3 (setor de fenolamida) foi predominantemente correlacionado com os níveis de JA, e a produção de antocianina também foi principalmente correlacionada com os níveis de JA, embora IAA também estivesse envolvido nesta regulação (Fig 9A). O módulo JIC # 1 (setor alcalóide) incluiu nicotina e agrupado com aoc em grande parte por causa do efeito de inibição de níveis mais elevados de auxina do d14 fundo. Os módulos JDC # 1 e JDC # 2 correlacionaram-se negativamente com os níveis de JA (S6B e S6C Fig) e agruparam-se distintamente devido ao maior efeito de repressão de níveis mais altos de JA em d14 plantas (Fig 9A). Esta análise ilustrou claramente que os perfis metabólicos da medula refletem o equilíbrio entre vários reguladores, e esse equilíbrio é ajustado por fatores adicionais, como a sinalização SL.

(A) Uma análise ternária que ilustra as distribuições de metabólitos em três genótipos: aoc, d14, e aoc×d14 plantas. Para JIC # 1 e JDC # 1–3, consulte a Fig. 4 e S6. Fig. (B) Um modelo do papel dos SLs como reguladores que ajustam a resistência a gorgulhos endofíticos que se alimentam do caule interrompendo a homeostase mediada por SL entre auxina e sinalização JA. No N. Attenuata, SL-deficiente (d14, max2, e ccd7) as plantas produzem mais ramos (painel direito) em relação ao EV (painel esquerdo), têm níveis mais baixos de nicotina na medula e níveis mais altos de antocianina e fenolamina, e são mais suscetíveis a T. mucorea ataque. Em plantas EV, os níveis de SL mantêm a homeostase de auxina e JA, mas uma vez que a sinalização de SL é prejudicada, os níveis de auxina e JA aumentam e se tornam desequilibrados, diminuindo os níveis de nicotina na medula e aumentando a suscetibilidade ao ataque larval. Os valores do gráfico (A) são listados em S1 Data. aoc, óxido de aleno ciclase CP, N′ -Cafeoilputrescina d14, anão14 DCS, N′, N ″-decaffeospermidina EV, vetor vazio JA, jasmonato IAA, ácido indol-3-acético JDC, cluster dependente de JA JIC, cluster independente de JA max2, crescimento mais axilar 2 SL, estrigolactona.

Conforme resumido no modelo proposto (Fig. 9B), os RSJs de plantas SL-RNAi acumulam repressores SL SMXL6 e SMXL7, que interagem diretamente com JAZs, acelerando a degradação de JAZ, liberando a inibição de MYC2 de JAZ para amplificar a sinalização de JA e aumentando o produção de fenolamidas e antocianinas através da regulação mediada por MYB8. Enquanto isso, a auxina também pode contribuir para a produção de antocianinas [5].No entanto, esses aumentos nas respostas de defesa não atenuam o crescimento das larvas perfuradoras do caule. Mesmo que as linhas SL-RNAi (max2 / d14 / ccd7) exibiram respostas de JA aumentadas, que regularam positivamente a biossíntese de nicotina, os aumentos simultâneos nos níveis de IAA neutralizaram completamente os efeitos de JA para diminuir os níveis de nicotina na medula, o que representou o maior desempenho larval.


Estrigolactonas - Biologia e Aplicações

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Prof. Hinanit KoltaDesde 2001, é Cientista Pesquisador Sênior da Organização de Pesquisa Agrícola, Volcani Center, Rishon LeZion, Israel. Ela é membro da International Parasitic Plant Society e atua no Conselho Editorial de várias revistas científicas internacionais. Além disso, o Prof. Koltai é autor de mais de 80 publicações revisadas por pares, incluindo mais de 30 capítulos de livros.
Prof. Cristina Prandi é Professora Titular de Química Orgânica na Universidade de Torino, onde também atua como Diretora Adjunta de Pesquisa. Seus principais interesses são em química organometálica, catálise de ouro e síntese orientada a alvos. Tem conduzido pesquisas sobre a síntese de análogos de fitohormônios bioativos, com foco em estudos de SAR (Structure Activity Relationship) e no desenho de derivados ativos. Recentemente, ela também investigou o uso de análogos de metabólitos vegetais por seus potenciais benefícios anticâncer. Ela é autora de mais de 100 publicações científicas e detém três patentes.
Prof. C. Prandi e H. Koltai presidiu uma COST ACTION exclusivamente dedicada a estrigolactonas (FA1206 2012-2017, Strigolactones, funções biológicas e aplicações).