Em formação

De quanto tempo as células INS1-E e MIN6 precisam após a divisão?


Atualmente, estou fazendo um experimento em células para testar a internalização de uma proteína. Normalmente, eu semeava minhas células um dia antes da incubação. Isso funcionou bem para células Hela, CHL ou PANC1. No entanto, quando fiz o mesmo com INS1-E e MIN6 (ambas células beta) após a incubação e a etapa de lavagem, a maioria das células tinha desaparecido. Isso foi melhor no controle onde eu não coloquei o composto, mas ainda assim muitas células foram desprendidas.

Portanto, eu me pergunto se devo semear as células INS1-E e MIN6 mais cedo, mais como 2-3 dias antes. Essas linhas celulares precisam de mais tempo após a divisão para se anexar novamente?


Pesquisar a literatura para ver quais são os protocolos publicados é a melhor aposta. Encontrei um documento simples para células INS-1 aqui. Há também este artigo que descreve o isolamento de uma linha celular 832/13 derivada de Ins-1 com a qual meu laboratório (embora não eu pessoalmente) tenha experiência. As células só devem ser sub-cultivadas quando quase ou totalmente confluentes. Com células Ins-1, isso seria uma proporção de subcultura de 1: 4 a 1: 8 e levará 2-3 dias. Algo a se notar é que as células Ins-1 são pouco aderentes ao plástico de cultura de tecidos. Essa é uma parte normal de sua caracterização. Lembro-me de que os membros do laboratório tiveram que tomar precauções especiais com relação aos ingredientes da mídia para evitar que se desprendessem, bem como adicionar mídia de forma realmente delicada aos pratos, caso contrário, a força da pipetagem muito rápida irá desalojar muitas células e explicar por que elas estão sendo eliminadas.


Já trabalhei com células MIN6 no passado e descobri que elas podem levar pelo menos 12-24 horas para semear completamente (se estiverem sendo cultivadas em poliestirina). Dependendo das especificações de seu experimento, e se isso complicaria seus controles, você também pode tentar revestir a superfície que está tentando semear com laminina. As células MIN6 parecem gostar de crescer sobre poliestirina não revestida e outras proteínas ECM.


Números úteis para cultura celular

Existem vários tamanhos de pratos e frascos usados ​​para cultura de células. Alguns números úteis, como área de superfície e volumes de soluções de dissociação, são fornecidos abaixo para recipientes de cultura de vários tamanhos.

No. do CatálogoÁrea de superfície (cm 2)Densidade de semeadura *Células em confluência *Versene
(mL de EDTA 0,05%). Aproximadamente. volume
Tripsina
(mL de 0,05% de tripsina, 0,53 mM de EDTA). Aproximadamente. volume
Meio de crescimento
(mL). Aproximadamente. volume
Pratos
35mm1504601503188.80,3 x 10 6 1,2 x 10 6 112
60mm15046215028821.50,8 x 10 6 3,2 x 10 6 335
100mm15046415035056.72,2 x 10 6 8,8 x 10 6 5512
150mm1504681683811455,0 x 10 6 20,0 x 10 6 101030
Placas de cultura
6 bem1406759.60,3 x 10 6 1,2 x 10 6 111 a 3
12 poços1506283.50,1 x 10 6 0,5 x 10 6 0,4 a 10,4 a 11 a 2
24 bem1424751.90,05 x 10 6 0,24 x 10 6 0,2 a 0,30,2 a 0,30,5 a 1,0
48 bem1506871.10,03 x 10 6 0,12 x 10 6 0,1 a 0,20,1 a 0,20,2 a 0,4
96 poços1670080.320.01 10 6 0,04 x 10 6 0,05 a 0,10,05 a 0,10,1 a 0,2
Frascos
T-25156367156340250,7 x 10 6 2,8 x 10 6 333–5
T-75156499156472752,1 x 10 6 8,4 x 10 6 558–15
T-1751599101599201754,9 x 10 6 23,3 x 10 6 171735–53
T-2251599341599332256,3 x 10 6 30 x 10 6 222245–68
* A densidade de semeadura é dada para cada tipo de recipiente de cultura da seguinte forma: Pratos e Frascos: Células por recipiente Placas de cultura: Células por poço.

† O número de células em uma placa confluente, prato ou frasco varia com o tipo de célula. Para esta tabela, células HeLa foram usadas.


Resumo

Os receptores de rianodina (RY) nas células β amplificam os sinais pela liberação de Ca 2+ induzida por Ca 2+ (CICR). O papel do CICR na secreção de insulina permanece obscuro, apesar do fato de que a cafeína é conhecida por estimular a secreção. Este efeito da cafeína é atribuído apenas à inibição de cAMP-fosfodiesterases (cAMP-PDEs). Demonstramos que a estimulação da secreção de insulina pela cafeína se deve a uma sensibilização dos receptores RY. A relação dose-resposta da inibição induzida por cafeína de cAMP-PDEs não foi correlacionada com a estimulação da secreção de insulina. A sensibilização dos receptores RY estimulou a secreção de insulina de forma dependente do contexto, ou seja, apenas na presença de alta concentração de glicose. Este efeito da cafeína depende de um aumento na [Ca 2+]eu. Imagens confocais de células β demonstraram um aumento na [Ca 2+]eu induzida pela cafeína, mas não pela forscolina. 9-Metil-7-bromoeudistomina D (MBED), que sensibiliza os receptores RY, não inibiu cAMP-PDEs, mas estimulou a secreção de uma maneira dependente de glicose. A estimulação da secreção pela cafeína e MBED envolveu a primeira e a segunda fases da secreção. Concluímos que os receptores RY das células β medeiam um sinal dependente da glicose distinto para a secreção de insulina e podem ser um alvo para o desenvolvimento de drogas que irão estimular a secreção de insulina apenas de uma maneira dependente da glicose.

PAs células beta ancreáticas são sensores de combustível que secretam insulina para regular os níveis de glicose plasmática, mesmo durante o jejum. Durante o período pós-prandial, ocorre um aumento na concentração de nutrientes e incretinas, com o que ocorre um aumento na secreção de insulina. A secreção de insulina estimulada por glicose envolve várias formas de alterações na concentração citosólica de Ca 2+ livre ([Ca 2+]eu) em células β. Pelo menos três grupos de canais de Ca 2+ medeiam tais mudanças. Em primeiro lugar, estão os canais de Ca 2+ dependentes de voltagem, localizados em domínios específicos da membrana plasmática próximos aos locais exocitóticos (1). Em segundo lugar estão os receptores de inositol (1, 4, 5) -trisfosfato, que se abrem quando a fosfolipase C específica da fosfatidil inositol é ativada e causa um aumento global na [Ca 2+]eu (1). Terceiro, os receptores de rianodina (RY) foram descritos em células β (2, 3). Esses canais são abundantes nas células musculares, mas muitas células excitáveis ​​e algumas não excitáveis ​​os expressam em níveis variáveis.

Baixas concentrações de cafeína sensibilizam os receptores RY à ativação por Ca 2+, enquanto concentrações mais altas podem ativar diretamente esses canais. A liberação máxima de Ca 2+ pela cafeína, como ocorre no local, é um processo de duas etapas. Na primeira etapa, ocorre uma pequena liberação de Ca 2+. Na segunda etapa, o Ca 2+ liberado atua em um grupo de receptores RY para desencadear uma liberação massiva de Ca 2+ (4). Na maioria das células, a liberação de Ca 2+ induzida por Ca 2+ (CICR) é devido à ativação de receptores RY (5). Uma exceção a isso é o hepatócito onde a cafeína libera Ca 2+ sem o envolvimento dos receptores RY (6), e um canal ainda desconhecido medeia o CICR (7). Em células β intactas, no local a ativação dos receptores RY mostrou ser dependente do contexto (3, 8). Se o contexto apropriado estiver faltando, a cafeína não pode exercer seu efeito usual para causar uma grande liberação de Ca 2+, e este fato pode ser responsável pela conclusão anterior de que as células β não têm receptores RY (9). Enquanto o CICR nas células β é dependente da glicose (3, 10, 11), a glicose per se não sensibiliza os receptores RY. Nossa visão da base molecular do contexto que permite o CICR é a seguinte (8). Como resultado do metabolismo da glicose, há um aumento no pH e uma redução na [Mg 2 +]eu (12) geração de ATP, frutose-1,6-difosfato (13), acilCoA de cadeia longa (14) e ADP ribose cíclica (15) e maior preenchimento do retículo endoplasmático (RE) (16). Os hormônios ligados ao cAMP favorecem o CICR pela fosforilação do canal e pela promoção do enchimento de ER (11, 17). Juntas, essas mudanças constituem um contexto adequado para o desencadeamento de CICR em células β. Em células β, duas isoformas do receptor RY, RY2 e RY3, são expressos (3, 11, 15, 18). No entanto, não há consenso sobre o papel desses canais na secreção de insulina. No entanto, é amplamente conhecido que a cafeína promove a secreção de insulina na presença de glicose elevada. Este efeito da cafeína é atribuído à inibição de cAMP-fosfodiesterases (cAMP-PDEs) e aos efeitos do cAMP na exocitose (19-21). Altas concentrações (& gt10 mM) de cafeína despolarizam a membrana plasmática das células β ao inibir os canais de potássio sensíveis ao ATP (KATP) A entrada de Ca 2+ resultante através dos canais de Ca 2+ dependentes de voltagem aumenta [Ca 2+]eu e desencadeia a secreção (9). Este efeito da cafeína na secreção é independente dos receptores RY, AMPc e dos níveis de glicose prevalecentes (9).

O Ca 2+ que entra através dos canais dependentes de voltagem pode ativar canais a jusante, como os receptores de inositol (1, 4, 5) -trifosfato e os receptores RY, que são essencialmente canais de Ca 2+ dependentes de Ca 2+. Tal CICR amplifica os sinais de Ca 2+ iniciados por Ca 2+ que entra através dos canais de Ca 2+ dependentes de voltagem nas células β (22, 23). Conforme descrito anteriormente, o CICR em células β é um fenômeno dependente do contexto (3, 11), sugerindo que este processo de várias etapas pode constituir um sinal distinto para a secreção de insulina. Até o momento, não há evidência direta de se CICR por meio de receptores RY podem afetar a secreção per se em células β. No presente estudo, examinamos o papel dos receptores RY na secreção de insulina e descobrimos que esses canais integram os sinais para estimular a secreção de uma maneira distinta e dependente do contexto. Além disso, o CICR parece ser um alvo potencial para o desenvolvimento de agentes antidiabéticos que estimulariam a secreção de insulina de uma maneira dependente da glicose.


Introdução

O surgimento de ilhotas pancreáticas com os primeiros vertebrados impôs o desenvolvimento de um sistema de sinalização para coordenar a função das células das ilhotas. Com a evolução, tal sistema de coordenação se desenvolveu em uma rede complexa, na qual sinais difundidos nos espaços intercelulares das ilhotas interagem com cascatas de sinalização que dependem de proteínas de membrana que se concentram nos contatos celulares 1, 2. Esses mecanismos medeiam tanto a comunicação indireta (por exemplo, neurotransmissor, hormônio, íon, nucleotídeo) e a comunicação direta célula-a-célula (por exemplo, molécula de adesão celular-, integrina-, receptor-, mediada por junção), que se combinam para garantir a redundância necessária para reter a secreção vital de insulina e a conversa cruzada que permite a adaptação precisa dessa secreção às necessidades mutáveis ​​do organismo.

Em vertebrados, uma característica consistente desta rede é a sinalização dependente de conexinas (Cxs) 3-6. Essas proteínas formam canais permseletivos célula a célula que se agrupam em domínios de junção de lacuna da membrana da maioria dos tipos de células e que medeiam a troca dirigida por difusão de moléculas citosólicas entre células adjacentes, um evento conhecido como acoplamento iônico e metabólico, respectivamente 3 -6. As Cxs também podem cumprir funções que não requerem comunicação célula a célula e são atribuídas à formação de hemicanais em domínios não juncionais da membrana celular, a uma regulação específica da expressão gênica e / ou a interações com outras células citosólicas e de membrana parceiros 4-9.

No contexto das células β pancreáticas, um trabalho recente identificou a conexina36 (Cx36) como a proteína que faz as junções comunicantes na Vivo 10, 11 e forneceu uma caracterização inicial dos canais que forma 12-16. O desenvolvimento de novas ferramentas moleculares, celulares e animais permitiu ainda um teste experimental direto da função de Cx36 e acoplamento de células β. Assim, um grande corpo de evidências se acumulou, indicando que uma sinalização dependente de Cx é necessária para a regulação fina da biossíntese, armazenamento e liberação de insulina, tanto em condições basais quanto após estimulação de glicose 2. Mais recentemente, foi demonstrado que a perda de Cx36 resulta em disfunções pancreáticas que são reminiscentes daquelas observadas em pré-diabetes humano e em diabéticos tipo 1 e 2 17. Esses achados, e a presença de junções comunicantes em células β humanas [18 e dados não publicados], indicam que uma desregulação da sinalização dependente de Cx36 pode estar de alguma forma envolvida na fisiopatologia do diabetes. Este capítulo revisa dados publicados e não publicados sobre a ilhota Cx36 e as funções dessa proteína na regulação da secreção de insulina. Além disso, propõe um modelo para entender por que e como essa proteína medeia funções múltiplas e essenciais em ilhotas pancreáticas. Ele eventualmente discute se poderíamos tirar proveito da sinalização dependente de Cx no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para diabetes.


Materiais e métodos

Tipo de reagente (espécie)
ou recurso
DesignaçãoFonte ou referênciaIdentificadores
Linha celular
(Homo sapiens)
HEK293-TRRID: CVCL_0063
Linha celular
(Homo sapiens)
HeLaRRID: CVCL_0030
Linha celular
(Mus musculus)
Min6RRID: CVCL_0431
Linha celular
(Rattus norvegicus)
REF-52RRID: CVCL_6848
Químico
Composto, Droga
ForskolinLaboratórios LCF9929
Químico
Composto, Droga
3-isobutil-1-metilxantina
(IBMX)
SigmaI5879
Químico
Composto, Droga
H-89Laboratórios LCH5239
Químico
Composto, Droga
Crescimento epidérmico
Fator (EGF)
SigmaE9644
Químico
Composto, Droga
U0126SigmaU120
Químico
Composto, Droga
Phorbol 12-miristato
13-acetato (PMA)
Laboratórios LCP-1680
Químico
Composto, Droga
Tetraetilamônio
cloreto (TEA)
SigmaT2265
Químico
Composto, Droga
ionomicinaEMD Millipore407951
Químico
Composto, Droga
TapsigarginaCayman Chemical10522
Químico
Composto, Droga
histaminaSigmaH7250
Kit ComercialLipofectamine-2000Invitrogen11668019
Kit ComercialPolyjetSignaGenSL100688
Recombinante
Reagente de DNA
pCDNA3 AKAR4PMID: 20838685
Recombinante
Reagente de DNA
pCDNA3 EKAR-EVPMID: 21976697
Recombinante
Reagente de DNA
pCDNA3 CKAR1PMID: 12782683
Recombinante
Reagente de DNA
Sensor FRET MLCKPMID: 15071183
Recombinante
Reagente de DNA
pCDNA3 YC3.6 CameleonPMID: 10051607
Recombinante
Reagente de DNA
pCDNA3 ICUE3PMID: 19603118
Tensão
(Escherichia coli)
Códon BL-21
Optimized Plus
New England BiolabsC2527
ProgramasFIJIRRID: SCR_014294
ProgramasMetaFluorRRID: SCR_002285
ProgramasMicromanagerRRID: SCR_000415
ProgramasZeiss ActiovisionRRID: SCR_002677
ProgramasMATLABRRID: SCR_001622
ProgramasGraphPad PrismRRID: SCR_002798

Plasmídeo e construção de construção

A clonagem foi realizada usando o vetor pRSET-B usando métodos de clonagem molecular típicos usando reação em cadeia da polimerase (PCR) com polimerase Phusion (New England Biolabs), digestão com enzimas de restrição e ligação com T4 DNA ligase. Para clonar Venus-cp172Venus FLARE, AKAR4 foi subclonado de um pCDNA3 modificado em pRSET-B entre os locais das enzimas de restrição BamHI e EcoRI. mVenus foi então amplificado por PCR com iniciadores que codificam um local BamHI na extremidade 5 'e um local SphI na extremidade 3', e o produto de PCR resultante foi digerido com BamHI e SphI e ligado a pRSET-B AKAR4 digerido com BamHI e SphI, com o gene mCerulean removido. Venus-cp172Venus FLARE AKAR foi então subclonado de volta em um vetor pCDNA3 modificado usando os locais BamHI e EcoRI. Outras variantes de cor foram criadas substituindo os genes para as proteínas fluorescentes em outras variantes FLARE AKAR em pRSET-B, seja entre os locais BamHI e SphI para a proteína fluorescente N-terminal, ou SacI e EcoRI para proteínas fluorescentes C-terminais. As construções finalizadas destinadas à expressão em mamíferos foram então subclonadas em um vetor de expressão pcDNA3 modificado entre os locais BamHI e EcoRI. Variantes FLARE de outros sensores foram criadas pela amplificação do switch molecular de EKAR-EV, CKAR2, Cameleon e ICUE3 com iniciadores que codificam os locais SphI e SacI, digerindo o produto de PCR com enzimas SphI e SacI e ligando-os ao pRSET-B relevante Plasmídeo FLARE AKAR digerido com SphI e SacI para remover os domínios envolvidos na troca molecular para FLARE AKAR. As construções finais foram então subclonadas em um vetor de expressão de pCDNA3 modificado entre os locais BamHI e EcoRI. Versões direcionadas dos sensores foram criadas por PCR amplificando o sensor com primers contendo a sequência de direcionamento e ligando-o ao vetor de expressão pCDNA3 entre BamHI e EcoRI, ou por subclonagem do construto em um plasmídeo já contendo a sequência de direcionamento. As sequências de direcionamento do terminal N foram colocadas entre HindIII e EcoRI, e as sequências de direcionamento do terminal C entre EcoRI e XbaI. Todas as etapas de clonagem foram realizadas usando a cepa DH5α de E. coli.

Os mutantes de treonina para alanina para Venus-cp172Venus FLARE AKAR e FLARE EKAR foram criados pela realização de mutagênese dirigida ao local usando um protocolo baseado em PCR de iniciador único padrão. A treonina para alanina mutante para Venus-cp172Venus FLARE CKAR, bem como a variante cromóforo morta de Venus-cp172Venus FLARE AKAR, foi criada usando a montagem de Gibson, amplificando o fragmento apropriado com um primer contendo a mutação desejada.

O sensor YFP MLCK FLARE foi criado substituindo a porção CFP de um sensor de duas cores existente (Isotani et al., 2004 Geguchadze et al., 2004) por um fragmento mVenus amplificado por PCR flanqueado por sítios de restrição XhoI e AgeI. Além disso, a sequência de codificação para a sequência CFP D1 ER foi fabricada pela Genewiz. O sensor consiste em duas proteínas oxmCer3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26158227) flanqueando os domínios de detecção de cálcio D1 ER (Palmer et al., 2004) e uma sequência de retenção KDEL ER C-terminal .

Cultura de células e transfecção

As células HEK293T e HeLa foram mantidas usando meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. As células foram semeadas em um prato de imagem com fundo de vidro de 35 mm e incubadas a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono ambiente. As linhas celulares HEK293T, HeLa, MIN6 e REF-52 foram mantidas separadamente de outras células e foram rastreadas regularmente para confirmar a ausência de contaminação por micoplasma usando coloração Hoechst. Como a origem das células não era central para a natureza desses experimentos, não validamos mais a identidade das linhas de células. As células foram transfectadas usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Polyjet (SignaGen) ou fosfato de cálcio e incubadas por 12-48 horas antes da imagem. O meio de crescimento foi removido imediatamente antes da imagem, e as células foram lavadas duas ou mais vezes com tampão de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) com glicose em temperatura ambiente. As células foram fotografadas em tampão HBSS com glicose em temperatura ambiente ou 37 ° C.

Microscopia de polarização de fluorescência

A co-imagem de repórter de anisotropia de fluorescência é descrita em mais detalhes no Bio-protocolo (Ross et al., 2019). As imagens de campo largo foram coletadas usando um Zeiss AxioObserver equipado para microscopia de polarização de fluorescência, usando uma das duas configurações. Na primeira configuração, um polarizador de grade de fio (Meadowlark Optics) foi colocado no caminho de excitação entre os iluminadores de LED e a torre do refletor contendo cubos de filtro específicos para CFP (Zeiss), YFP (Zeiss) e mCherry (Semrock). As imagens foram geralmente coletadas usando uma lente objetiva 20 × 0,75 NA. Polarizações paralelas e perpendiculares às polarizações de excitação foram separadas usando Optical Insights Dual-View usando seu módulo de divisão de polarização. Ambas as imagens foram coletadas simultaneamente em uma única imagem coletada por um Orca-R2 refrigerado a água (Hamamatsu). Na segunda configuração, um polarizador (Chroma) foi colocado na via de excitação entre o arco de xenônio e os filtros de excitação. As imagens foram coletadas usando uma lente objetiva 20 × 0,45 NA. As polarizações foram separadas usando um divisor de imagem Opto-Split II LS, com dois polarizadores de grade de fio (Meadowlark) orientados paralelamente e perpendicularmente ao polarizador de excitação. Imagens de ambas as polarizações foram coletadas usando uma câmera Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS. A imagem de dois fótons foi realizada usando um Zeiss 7 MP com detectores não descoloridos GaAsP alojados nas instalações confocais da Escola de Medicina da Universidade de Maryland. Lasers Coherent Chameleon e OPO foram usados ​​para excitação. A fluorescência foi filtrada usando um filtro de passagem curta ET680 para microscopia de dois fótons (Chroma) antes de separar as polarizações com um cubo divisor de feixe de polarização de banda larga de uma polegada (Thorlabs) montado usando um cubo impresso em 3D personalizado. As imagens foram coletadas usando uma lente objetiva apocromática 10 ×, 0.3 NA Plan. A imagem in vivo foi realizada em camundongos C57Bl / 6 sob anestesia com isoflurano.

Análise de imagem

A análise de imagem foi realizada usando o software de processamento de imagem de código aberto Fiji (ImageJ). As imagens de polarização foram cortadas e alinhadas usando o software Zeiss Axiovision ou o plug-in de registro StackReg integrado de Fiji. Em Fiji, as regiões de interesse (ROIs) foram desenhadas ao redor de cada célula, bem como uma no fundo. As intensidades de ROI foram subtraídas de fundo em cada canal para estimar a intensidade de emissão de fluorescência e a anisotropia foi calculada conforme descrito por Lakowicz (2010). As anisotropias foram calculadas usando a equação convencional (Geguchadze et al., 2004):

Onde g é o fator de correção responsável pelas diferenças nas eficiências de transmissão de polarização dentro do instrumento. O fator g foi calculado usando uma solução isotrópica de fluoresceína, conforme descrito por Piston e Rizzo (2008). A anisotropia foi calculada subtraindo a anisotropia em cada ponto de tempo pela anisotropia no ponto de tempo imediatamente antes da adição do fármaco. A magnitude das alterações da anisotropia foi calculada tomando a diferença entre a anisotropia média quando o sinal atingiu o pico ou platô e a anisotropia média dos pontos de tempo da linha de base antes da droga ser adicionada.

Purificação de proteína

A purificação dos sensores FLARE-Cameleon foi feita usando a cepa BL21-RIL Codon Plus de E. coli, que foram transformados com a construção clonada no vetor pRSET-B, com um marcador Poly-His na sequência de cabeçalho para permitir a ligação do íon metálico. As células cresceram até uma DO de 0,2, quando a expressão foi induzida com IPTG e deixada crescer durante a noite. As células foram então sedimentadas, congeladas, ressuspensas e lisadas por sonicação. A purificação das proteínas foi realizada por cromatografia em coluna com resina Ni-NTA. As frações foram coletadas e analisadas usando SDS-PAGE, as frações mostrando produto de proteína suficientemente puro foram reunidas.

Calibração de cálcio in vitro

A calibração in vitro do sensor FLARE-Cameleon foi realizada usando espectroscopia de anisotropia de fluorescência em soluções com concentrações variáveis ​​de cálcio livre em um ambiente com temperatura controlada. Essas soluções foram feitas titulando concentrações conhecidas de EGTA livre e EGTA saturado de cálcio em pH 7,1 (Calcium Concentration Kit # 1 - Thermo Scientific). A anisotropia de fluorescência foi medida usando um espectrofluorômetro Photon Technology International QuantaMaster equipado com uma lâmpada de flash de Xenon, polarizadores de fluorescência e um suporte de cubeta Peltier para controle de temperatura. As anisotropias foram calculadas usando intensidades integradas de espectros de emissão polarizados S e P. O fator de correção G foi medido medindo os espectros de emissão polarizados P e S da fluoresceína, que se presume ser isotrópica, e tomando a razão de suas intensidades de fluorescência integradas medidas. Para determinar a constante de dissociação (Kd) e coeficiente de Hill (n), os dados de anisotropia vs. concentração de cálcio foram ajustados à seguinte equação:


Interações proteína-proteína e interações de proximidade

Numerosas proteínas candidatas que interagem com ALMS1 foram relatadas. Membros da família α-actinina de proteínas de ligação à actina foram identificados em triagens de dois híbridos de levedura (Y2H) usando a região C-terminal de Alms1 murino como isca, e os dados de co-imunoprecipitação suportaram uma interação com α-actinina-4 ( Actn4) no rim de camundongo [76]. ACTN4 e outra proteína identificada na mesma tela Y2H (miosina Vb) são componentes do complexo de reciclagem ou transporte associado ao citoesqueleto (CART), envolvido na reciclagem endossômica [107]. Myo5b também interage com um regulador chave de vias de reciclagem "lentas", Rab11 [108], e compartilha a capacidade de Myo5a de interagir com a proteína ciliopática RPGRIP1L [109]. As α-actininas e outra proteína identificada no mesmo rastreio Y2H, proteína lisossomal semelhante a 1 com interação com Rab (Rilpl1), também foram implicadas em funções ciliares [110, 111].

Um estudo de interactoma humano em andamento com base na purificação de afinidade acoplada à espectrometria de massa (AP-MS) [112, 113] identificou 18 potenciais interatores ALMS1 incluindo a subunidade BBSome BBS7 AVIL (advilina), que separa os filamentos de actina e influencia a ciliogênese [114] RABL2A , cujo ortólogo de camundongo se liga às proteínas CEP19 e IFT [115,116,117] do ciclo de divisão celular 16 (CDC16), um componente do complexo promotor de anáfase dinamina 3 (DNM3), envolvido na fissão da membrana [118] TFDP3, um parceiro de dimerização de E2F fatores de transcrição [119] e proteína 1 de ligação de disbindina / distrobrevina (DTNBP1), uma subunidade do complexo BLOC-1 que está envolvida na reciclagem da formação de endossomo e tráfego de GPCR na via lisossomal, e é necessária para o tráfego de policistina-2 para cílios [120,121,122]. Outro estudo global de AP-MS identificou uma interação com VCIP135 / proteína que interage com a proteína 1 contendo valosina (VCPIP1) [123], uma enzima desubiquitinante que funciona na fusão da membrana [124, 125].

Outros estudos de AP-MS identificaram ALMS1 como um possível parceiro de ligação da subunidade RPB1 da RNA polimerase II (RNAPII) [77] a proteína quinase serina-arginina SRPK2 [126] proteína de classificação associada a GPCR 2 (GPRASP2), implicada na translocação ciliar de Smoothened, um componente-chave da via de sinalização Hh [127, 128] e CEP192, uma proteína envolvida na biogênese do centrossoma [129]. Consistente com o último achado, ALMS1 foi marcado por uma fusão CEP192-biotina ligase (isca) em um estudo de biotinilação dependente de proximidade (BioID) [130]. No entanto, como ALMS1 foi marcado por iscas que representam vários fatores de duplicação de centríolo (PLK4, CEP152, CPAP, CEP63 e KIAA0753), foi sugerido que pelo menos em alguns casos isso pode refletir uma localização dispersa ou alta mobilidade dentro do centrossoma [130]. Em um estudo BioID com foco em centríolos, cílios e satélites centríolos, fatores de montagem de centríolos incluindo CEP152, CPAP, CEP135 e SASS6 estavam entre 11 iscas que produzem interações de proximidade de alta confiança com ALMS1 [131]. Coletivamente, esses dados podem indicar que ALMS1 está presente nas extremidades proximais dos procentríolos nascentes. No entanto, o momento do recrutamento de ALMS1 para centríolos recém-formados é desconhecido e ainda precisa ser determinado se os resultados de BioID refletem interações físicas.

BioID também identificou ALMS1 como um potencial interator / substrato da ubiquitina ligase E3 SCF β-TrCP1 [132], e da separase [133], uma protease que medeia a separação de cromátides irmãs e de centríolos recém-nascidos de seus pais, na mitose [134]. Outro estudo BioID recente sugere ligações a proteínas envolvidas na via de sinalização do Hippo (LATS2 e AMOT [135]). Uma lista atualizada de interações físicas e de proximidade relatadas está disponível online em thebiogrid.org [136].


Introdução

A exocitose sináptica ocorre de forma eficiente em zonas ativas, onde neurotransmissores contendo vesículas sinápticas (VS) são encaixados, preparados e liberados [1]. A fusão da vesícula sináptica é mediada pela formação de complexo entre três membros da família da proteína de fusão sensível a N-etil-maleimida (NSF) proteínas do receptor da proteína de fixação (SNARE), Sintaxina-1A e SNAP-25 na membrana pré-sináptica (t- SNAREs) e Synaptobrevin na membrana vesicular (v-SNARE) [2,3]. A sintaxina-1A e o SNAP-25 são conhecidos por formar microdomínios [4,5]. Nesse contexto, estudos de microscopia de super-resolução mostraram que os clusters de Sintaxina-1A têm cerca de 60 nm de largura e estima-se que contenham cerca de 75 moléculas de Sintaxina-1A [6]. Várias hipóteses para o mecanismo de formação de cluster são discutidas, incluindo fracas interações proteína-proteína homofílicas [5,7], interações com outras proteínas de membrana ou esqueleto [8-10], ou componentes de membrana específicos, como colesterol ou fosfoinositídeos [4,11 –15]. Da mesma forma, diferentes papéis dos clusters SNARE no processo de docking, priming e fusão de vesículas foram propostos, mas ainda estão em debate [16-23].

Embora os SNAREs catalisem a exocitose, que ocorre predominantemente em zonas ativas, os agrupamentos SNARE são encontrados em toda a membrana neuronal. Estudos anteriores não forneceram evidências de que as proteínas SNARE ou microdomínios estariam preferencialmente localizados em zonas ativas [24-29], pois as imagens confocais mostram apenas pequenas diferenças nas intensidades entre as regiões sinápticas e extrassinápticas [30]. Vários estudos de microscopia de super-resolução foram realizados em células PC-12 que não possuem zonas ativas. Para exocitose de grânulos contendo insulina, a microscopia TIRF revelou que SNAREs co-localizam com grânulos [11,18,19]. Além disso, experimentos de molécula única e FRAP em neurônios da medula espinhal de ratos [30] mostraram uma mudança na mobilidade da Sintaxina-1A dependendo de sua localização em relação às zonas ativas. As moléculas da sintaxina-1A nas zonas ativas revelam uma difusão mais lenta e confinada com mais pausas. Ribrault et al sugeriram que essas mudanças na dinâmica sejam causadas pela taxa de associação alterada de complexos SNARE, mas afirmaram que os agrupamentos de proteínas SNARE também podem ser responsáveis ​​por essa observação.

Aqui, usamos a microscopia de luz de super-resolução de Depleção de Emissão Estimulada (STED) [31] para investigar as diferenças na distribuição e nos tamanhos dos agrupamentos de Sintaxina-1A entre as zonas ativas e outras regiões da membrana neuronal, em larvas fixas em Drosófila junções neuromusculares (NMJs). Simulações de difusão [32] foram usadas para relacionar a dinâmica da Sintaxina-1A e o agrupamento. Com base neste modelo espaço-temporal, a relevância do agrupamento da sintaxina-1A para a eficiência e sustentabilidade da exocitose é discutida.


Engenharia de superfícies de implantes biocompatíveis: Parte I: Materiais e superfícies

Durante as últimas décadas, um número vasto e continuamente crescente de implantes biomédicos foi introduzido para uso contínuo no corpo humano. Desde as primeiras substituições de quadril cimentadas na década de 1960, tem havido uma disseminação constante de novos materiais e designs cada vez mais complexos estão sendo usados ​​nesses dispositivos de implante. Mesmo assim, a taxa de falha e perda de implantes é indesejavelmente alta e deixa espaço para melhorias. O desafio é entender as interações da superfície do implante com o tecido circundante suficientemente, para ajustar ativamente as interações desejadas. As propriedades do volume e da superfície dos biomateriais usados ​​para implantes mostraram influenciar diretamente e, em alguns casos, controlar as interações dinâmicas que ocorrem na interface tecido-implante. É fundamental reconhecer que os materiais sintéticos têm propriedades ou características específicas de volume e superfície que determinam suas características in vitro e in vivo.

Este artigo revisa o campo interdisciplinar de superfícies de implantes biocompatíveis do ponto de vista da ciência dos materiais, bioquímica e biologia celular. Ele compila uma visão geral sobre as informações básicas sobre as propriedades de volume e superfície de implantes com base em materiais metálicos (particularmente titânio e suas ligas) e modificação de superfície, incluindo funcionalização com adesão e espécies promotoras de crescimento. Ele descreve como as células reconhecem superfícies e respondem a diferentes biomateriais, descreve ensaios comuns sobre o comportamento celular em cultura e relata os tipos de células e proteínas envolvidas na resposta do tecido, respostas agudas e crônicas a biomateriais implantados.


Introdução

A exocitose regulada pelo cálcio é um processo pelo qual vesículas contendo neurotransmissores ou hormônios se fundem com a membrana plasmática (PM). Antes da fusão, as vesículas sinápticas devem passar por várias etapas de maturação que incluem biogênese das vesículas, sua translocação para a zona ativa e sua ligação física ao PM em um processo chamado docking (Augustine et al., 1999 Rettig e Neher, 2002 Richmond e Broadie, 2002 Sørensen, 2004 Sudhof, 2004 Becherer and Rettig, 2006 Toonen et al., 2006). A fraction of the docked vesicles undergo priming, which is a calcium-dependent process (Bittner and Holz, 1992 Burgoyne and Morgan, 1997 Smith et al., 1998 Voets, 2000 Rettig and Neher, 2002 Sørensen et al., 2003) that makes them fusion competent (Robinson and Martin, 1998). An action potential that propagates into the nerve terminal induces the opening of voltage-dependent calcium channels, and the primed vesicles undergo fusion later on, they are recycled by endocytosis. Several groups of proteins coordinate this multistep process. Among them are the soluble NSF attachment receptor (SNARE) proteins that form the SNARE complex, which is thought to force the plasma and vesicular membranes into close proximity, thereby initiating membrane fusion (Sudhof, 2004 Jahn and Scheller, 2006) and possibly mediating formation of the fusion pore (Wang et al., 2001 Bai et al., 2004 Barclay et al., 2004 Han et al., 2004 Cohen et al., 2007).

Calcium ions (Ca 2+ ) trigger the final step of vesicle fusion (Katz and Miledi, 1968 Schneggenburger and Neher, 2000) but also regulate other steps in the synaptic vesicle cycle, such as vesicle priming, vesicle-pool refilling, and endocytosis (Burgoyne and Morgan, 1995 Smith et al., 1998 Wang and Kaczmarek, 1998 Sudhof, 2004). In chromaffin cells, calcium plays an important role in vesicle priming, and elevation of the calcium concentration from 100 to 400 n m increases secretion severalfold (Bittner and Holz, 1992 von Rüden and Neher, 1993 Smith et al., 1998 Voets, 2000). However, the Ca 2+ sensor(s) responsible for vesicle refilling and priming is still not well characterized.

DOC2 proteins were first described by Orita et al. (1995). The name DOC2 relates to the protein's structure: double C2 domain. The DOC2 family of proteins contains three isoforms designated DOC2A, DOC2B, and DOC2C (Orita et al., 1995, 1996). DOC2A, which is exclusively expressed in the CNS (Verhage et al., 1997), is the best-characterized isoform. Coexpression of DOC2A with growth hormone in PC12 cells results in enhanced secretion (Orita et al., 1996, 1997). In neurons, a secretion-enhancing role was suggested after the injection of a peptide that blocks the interaction of DOC2A with Munc13 into rat superior cervical ganglion cells (Mochida et al., 1998) and the calyx of Held (Hori et al., 1999). Mice lacking DOC2A exhibited normal neurotransmission in the hippocampal CA1–CA3 synapses, but abnormal frequency facilitation during prolonged stimulation at 5 Hz (Sakaguchi et al., 1999), suggesting a role for DOC2A during repeated stimulation.

The function of the second isoform, DOC2B, has not been extensively characterized. DOC2B is expressed in several brain regions as well as in endocrine cells, including chromaffin cells, pancreatic β cells, and adipocytes. Recently, DOC2B has been found to enhance glucose-induced secretion of insulin from MIN6 β cells (Ke et al., 2007). We and others found that both DOC2A and DOC2B are regulated by neuronal activity and translocate to the PM after elevation of calcium in the submicromolar range (Groffen et al., 2006 Malkinson and Spira, 2006). This mechanism can be attributed to the Ca 2+ -dependent affinity of the C2A domain for phospholipids (Ubach et al., 1998), a characteristic that is conserved in structurally similar C2 domains such as the C2A domain of synaptotagmin-I (Sutton et al., 1999). Therefore we hypothesized that DOC2B may regulate synaptic transmission in a calcium-dependent manner (Groffen et al., 2006). Despite the above-summarized work, it is still unclear whether DOC2 proteins act in the docking, priming, or fusion step of secretory events in neuroendocrine cells and neurons. Moreover, although DOC2B acts as a sensitive calcium sensor, a direct link between calcium and DOC2B's effects on the exocytotic process is unknown.

The present study aimed to clarify these questions by investigating the effects of DOC2B on catecholamine (CA) secretion from mouse adrenal chromaffin cells. We focused on DOC2B because it is the only DOC2 isoform that is endogenously expressed to a detectable level in chromaffin cells. We demonstrate that overexpression of DOC2B enhances vesicle fusion during stimulation. A mutated form of DOC2B, which is constantly at the PM, also enhanced the exocytotic response, albeit less efficiently, during sustained or repeated stimulation. We conclude that DOC2B acts as a calcium switch in other words, intracellular calcium recruits DOC2B to the PM and therewith “switches on” its secretion-enhancing function.


DISCUSSÃO

Regulation of AMPK plays a key role in events associated with type 2 diabetes and the metabolic syndrome, as well as their associated cardiovascular complications (24, 87). For example, two of the most widely prescribed drugs for diabetes and cardiovascular disease, metformin and statins, are both AMPK activators (82, 95). While these treatments significantly help control diabetes and reduce cardiovascular risk across the population, they are not effective in all patients (10, 37, 79). This suggests that there may be certain pathological conditions in which AMPK becomes uncoupled from its expected cellular actions. Under these conditions (such as the model described here), there may be a need for additional therapeutic targets independent of AMPK.

In this study, we treated primary HAECs with a combination of high glucose and palmitate to model the pathological stress of poorly controlled type 2 diabetes. In this context, we analyzed the role of AMPK in regulation of autophagy, a pathological process implicated in atherogenesis. Consistent with the role of these nutrients in endothelial dysfunction (22, 47) as well as previous studies in HUVECs (8, 9, 41), we found that the combination of glucose and palmitate both predisposed HAECs to apoptosis and increased their inflammatory profile. The subsequent novel findings from our work were as follows: 1) Incubation of HAECs with the same high concentrations of glucose and palmitate that increased apoptosis and inflammation also impaired autophagy. 2) Exposure of HAECs to excess nutrients decreased the activity of AMPK. 3) Unlike low nutrient conditions, chemical activation of AMPK did not restore autophagy in this nutrient-laden environment. 4) Ectopic expression of acid ceramidase prevented nutrient-induced decreases in ULK1 phosphorylation at Ser555, an AMPK-targeted site. Surprisingly, increased expression of acid ceramidase did not alter the effects of AICAR, A769662, or phenformin on ULK1 phosphorylation. This suggests that accumulation of ceramides may directly regulate ULK1, but perhaps not through interfering with the actions of AMPK. Collectively, these data indicate that, in HAECs, high concentrations of glucose and palmitate exert a metabolic stress (perhaps similar to those of patients who do not respond to AMPK activators) under which AMPK activation does not induce autophagy. Intriguingly, restoration of ULK1 phosphorylation by acid ceramidase expression suggests that targeting ceramide or its metabolites may be a potential alternative target to allay nutrient-induced stress in the endothelium.

The complex interactions between ULK1, AMPK, and mTORC1 that regulate starvation-induced autophagy are incompletely understood, but even less is known about their relationships when there is an excess of nutrients (13, 63). The inability to restore autophagic flux in HAECs by chemically activating AMPK contrasts with previous observations in rodent myocardial cells (34) and macrophages (88). He and colleagues (34) observed that hyperglycemia, induced by streptozotocin or incubating myoblasts in a high-glucose media (30 mM for 48 h), suppressed autophagy likewise Wen and colleagues found that 24 h of exposure to 0.5 mM palmitate, following stimulation with lipopolysaccharide, suppressed autophagy in rodent macrophages (88). In each of these contexts, autophagy impairment induced by a single nutrient was overcome by AMPK activation. AMPK activation in our human endothelial cell model may have been insufficient to rescue nutrient-induced loss of autophagy due to the presence of a double nutrient (glucose with palmitate), rather than a single nutrient (glucose or palmitate)-induced inhibition of flux. The increased severity of a double nutrient—compared with a single nutrient—stress is supported by data from the β-cell, in which a combined exposure to glucose and palmitate produced a more severe inhibition of autophagic flux than exposure to palmitate alone (58). In addition to the presence of a double nutrient stress, our model differs from the above mentioned studies in its use of a chronic glucose treatment. Exposure of HAECs to high concentrations of glucose during cell division and throughout the lifetime of the newly generated cells may alter their epigenetic profile, as shown in other types of cells (67), thus altering their responses to chemical activators such as AICAR.

Given that acid ceramidase expression did not facilitate additional ULK1 phosphorylation or autophagosome formation with AICAR or A769662, the mechanism by which glucose and palmitate alter the interaction between AMPK and autophagy remains an open area of investigation. There may be separate pools of AMPK in which signaling to its respective targets (ACC or ULK1) is differentially regulated. This could be a result of glucose- and palmitate-induced posttranslational modifications on AMPK and/or ULK1 that prevent interactions between these two molecules. Interestingly, in the presence of excess nutrients, acid ceramidase expression restored phosphorylation of ULK1 (Fig. 6C and data not shown) and ACC, but not AMPK (data not shown), suggesting that acid ceramidase may be involved in both of these signaling pathways, perhaps independent of AMPK. There are several potential mechanisms by which ceramides or other sphingolipid metabolites may be impairing autophagy, including activation of protein phosphatases (65, 85) and increased levels of endoplasmic reticulum stress (5, 28, 61). Further study is needed to focus on the contribution of these lipids, as well as other processes such as the inhibition of Sirtuin-1 (SIRT1) (31, 53, 59, 83) or generation of oxidative stress (78) to nutrient-induced autophagy impairment.

In addition to modulating the initiation stages of autophagy through ULK1, excess nutrients may also affect initiation and autophagosomal membrane elongation through inhibition of SIRT1, an NAD + -dependent histone deacetylase. We and others have shown that high concentrations of glucose or palmitate impair AMPK activity (35, 36, 91) as well as SIRT1 activity (2, 18, 71, 80). AMPK and SIRT1 have also been shown to regulate one another (11, 39, 55). In the nucleus, SIRT1 may activate autophagy by deacetylating several members of the forkhead family of transcription factors, FOXO1 and FOXO3 (31, 53). In the cytosol, em vitro studies indicate that Atg5, Atg7, and Atg8, autophagy proteins required for the formation and elongation of the autophagosomal membrane (46), are also targets of SIRT1 (59). In mouse embryonic fibroblasts, overexpression of wild-type SIRT1, but not deacetylase-deficient SIRT1, increased basal autophagy (59). Consistent with this autophagy-activating characteristic of SIRT1, inhibition of SIRT1 in human THP-1 cells impaired autophagy (83).

Perhaps related to SIRT1 inhibition, excess concentrations of glucose and palmitate may also impair autophagy through the generation of oxidative stress (4, 8, 15, 40, 72). Reactive oxygen species inhibit the activity of Atg4 (78), an enzyme required both for the maturation of LC3 prior to its incorporation into the forming autophagosomal membrane and for LC3 cleavage from the outside of the autolysosome to be recycled for future use (46). Thus, inhibition of Atg4 via reactive oxygen species may impair the incorporation of both newly synthesized and recycled LC3 into autophagosomes. LC3 is critical for the elongation of the autophagosomal membrane and depletion of LC3 has been associated with smaller autophagosomes (92), which would consequently degrade fewer substrates.

In addition to decreasing autophagosome size, glucose and palmitate may also impair substrate degradation in the autolysosome by interfering with lysosomal proteases, such as cathepsin L (Fig. 2D) Evidence from pancreatic β-cells and hepatocytes suggests that nutrient-induced loss of degradative capacity may be due to inhibition of lysosomal acidification (58) or increased lysosomal permeabilization (25).

In summary, we have identified autophagic dysregulation as a new mechanism linking glucose and palmitate exposure with inflammation and apoptosis in HAECs. Our HAEC model of poorly controlled type 2 diabetes, which utilizes chronic exposure to glucose in combination with acute palmitate treatment, revealed that these nutrients impair ULK1 phosphorylation, autophagosome formation, and cathepsin L activity (Fig. 7). Similar to the effects of glucose and palmitate on AMPK activity in rat adipocytes (35), cardiomyocytes (36), and bovine aortic endothelial cells (91), we found that these nutrients decreased AMPK activity in HAECs. However, activation of AMPK was not sufficient to restore autophagy in this nutrient-rich environment. Thus, unlike the role ascribed to AMPK in starvation-induced autophagy, AMPK is uncoupled from autophagy under nutrient excess conditions. Rather than exclusively targeting AMPK, ceramide or its metabolites may be additional targets for therapies aimed at preventing autophagic dysregulation in excess nutrient conditions. Moreover, an improved understanding of the particular types and magnitudes of stress under which AMPK activation can restore cellular homeostasis and those in which it cannot, may lay the foundation for improved treatments for a variety of metabolic pathologies in which AMPK plays a critical role.

Fig. 7.Excess nutrients impair autophagic flux and uncouple AMPK from autophagy. Established regulators of starvation-induced autophagy are depicted in white boxes whereas effects of excess nutrients are shown in light gray. High concentrations of glucose and palmitate decrease phosphorylation of ULK1 at Ser555, impair autophagosome formation, and decrease lysosomal protease activity, resulting in an overall decrease in autophagic flux. Glucose and palmitate also reduce AMPK activity, but chemical activation of AMPK does not restore ULK1 phosphorylation or autophagosome formation in the presence of these nutrients. Overexpression of acid ceramidase restores ULK1 phosphorylation, suggesting that ceramides are involved in nutrient-induced regulation of ULK1.


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