Em formação

Quantificar a desnaturação da proteína com mudança na solubilidade


Pretendo dirigir um laboratório que compare os impactos do etanol e do metanol, em concentrações variáveis, na desnaturação da proteína do soro do leite.

A mudança na solubilidade em água é um bom indicador do grau de desnaturação em uma proteína, mas a pesquisa online não parece mostrar nenhum método extremamente simples de quantificar uma mudança na solubilidade. A precipitação de proteínas pode ser usada para medir a solubilidade? Nesse caso, tenho acesso a uma centrífuga, sulfato de amônio e praticamente qualquer outro composto químico. Existem métodos melhores, no geral?

A mudança na solubilidade é o único fator que pode refletir a desnaturação? Obrigado


Estabilidade de proteínas à temperatura: Análise de desnaturação irreversível usando calorimetria isotérmica

A estabilidade estrutural das proteínas tem sido tradicionalmente estudada em condições nas quais a reação de dobramento / desdobramento é reversível, uma vez que os parâmetros termodinâmicos só podem ser determinados nessas condições. A obtenção de condições de reversibilidade em experimentos de estabilidade de temperatura freqüentemente requer a realização de experimentos em pH ácido ou outras condições de solvente não fisiológico. Com o rápido desenvolvimento de drogas protéicas, o segmento de crescimento mais rápido na indústria farmacêutica, a necessidade de avaliar a estabilidade de proteínas sob condições de formulação adquiriu urgência renovada. Sob condições de formulação e a alta concentração de proteína necessária (∼100 mg / mL), a desnaturação da proteína é irreversível e frequentemente associada à agregação e precipitação. Neste artigo, examinamos a desnaturação térmica da lisozima de clara de ovo de galinha (HEWL) sob condições irreversíveis e concentrações de até 100 mg / mL usando várias técnicas, especialmente calorimetria isotérmica que tem sido usada para medir a entalpia e cinética do desdobramento e agregação / precipitação a 12 ° C abaixo da temperatura de transição medida por DSC. Nessas temperaturas, a taxa de desnaturação irreversível da proteína e agregação de HEWL é medida como sendo da ordem de 1 dia -1. A calorimetria isotérmica parece uma técnica adequada para identificar as condições da formulação do tampão que maximizam a estabilidade a longo prazo dos fármacos proteicos.


Resumo

Ao contrário da maioria dos sistemas moleculares ordenados, as proteínas globulares exibem uma temperatura de estabilidade máxima, o que implica que a estrutura pode ser interrompida pelo resfriamento. Este fenômeno de desnaturação a frio está geralmente ligado à força motriz hidrofóbica dependente da temperatura para o enovelamento de proteínas. No entanto, apesar do papel fundamental desempenhado pelas interações água-proteína, as mudanças de hidratação durante a desnaturação a frio não foram investigadas experimentalmente. Aqui, usamos o relaxamento de 17 O spin de água para monitorar a dinâmica de hidratação das proteínas BPTI, ubiquitina, apomioglobina e β-lactoglobulina em solução aquosa desde a temperatura ambiente até -35 ° C. Para acessar essa faixa de temperatura sem formação de gelo, contivemos a solução de proteína em gotículas de emulsão de picolitros não perturbadoras. Entre as quatro proteínas, apenas a apomioglobina desestabilizada foi observada desnaturando-se a frio. A ubiquitina foi considerada termodinamicamente estável pelo menos até −32 ° C, enquanto a β-lactoglobulina deve ser instável abaixo de −5 ° C, mas permanece cineticamente presa no estado nativo. Quando desestabilizada por ureia 4 M, a β-lactoglobulina desnatura a frio a 10 ° C, como verificado anteriormente por outros métodos. Como visto a partir do solvente, os estados desnaturados a frio da apomioglobina na água e β-lactoglobulina na ureia 4 M são relativamente compactos e são melhor descritos como penetrados por solvente do que como desdobrados. Esta descoberta desafia a analogia popular entre desnaturação a frio e o aumento anômalo de baixa temperatura na solubilidade aquosa de moléculas não polares. Nossos resultados também sugerem que a desnaturação a frio relatada a −20 ° C da ubiquitina encapsulada em micelas reversas é causada pelo baixo teor de água, e não pela baixa temperatura.


Informações de Apoio

Texto suplementar que fornece informações detalhadas sobre a cultura de levedura, a derivação da eq 2 e um resumo dos resultados obtidos em nossas análises globais dos deslocamentos da curva de desnaturação e alterações da energia livre de dobras, bem como as Figuras S-1 a S-4 (PDF )

Planilha do Excel resumindo as proteínas testadas, calculando as alterações de energia livre de dobramento e os resultados da seleção de acertos do experimento de ligação de CsA em levedura (XLSX)

Planilha Excel resumindo as proteínas testadas, calculando as alterações de energia livre de dobramento e resultados de seleção de acertos do experimento de ligação de geldanamicina em levedura (XLSX)

Planilha Excel resumindo as proteínas testadas, dobrando as alterações de energia livre e os resultados da seleção de acertos dos experimentos de ligação de sinefungina usando as células MCF-7 e uma concentração de ligante de 0,2 mM (XLSX)

Planilha Excel resumindo as proteínas testadas, dobrando as alterações de energia livre e resultados de seleção de acerto dos experimentos de ligação de sinefungina usando as células MCF-7, uma concentração de ligante de 1,2 mM e uma análise das proteínas no sobrenadante (XLSX)

Planilha Excel resumindo as proteínas testadas, dobrando as alterações de energia livre e resultados de seleção de acertos dos experimentos de ligação de sinefungina usando células MCF-7, usando uma concentração de ligante de 1,2 mM e uma análise das proteínas no pellet (XLSX)

Planilha Excel resumindo as proteínas testadas, dobrando as alterações de energia livre e resultados de seleção de acertos dos experimentos de ligação de sinefungina usando células MCF-7 e uma concentração de ligante de 2,5 mM (XLSX)


Ciência da desnaturação de proteínas por calor

As principais alterações nas estruturas secundárias, terciárias e quaternárias sem clivagem das ligações peptídicas da estrutura são consideradas “Desnaturação”. Mudanças sutis na estrutura, que não alteram drasticamente a arquitetura molecular da proteína, são geralmente consideradas “Adaptabilidade conformacional”. A quebra de ligações peptídicas de proteínas em peptídeos ou aminoácidos é “digestão"

A estrutura de uma proteína depende de várias interações atrativas e repulsivas resultantes de várias forças intramoleculares, bem como da interação de vários grupos de proteínas com a água solvente circundante. O estado nativo (de uma única molécula de proteína) é termodinamicamente o mais estável com a menor energia livre possível em condições fisiológicas. Qualquer mudança em seu ambiente, como pH, força iônica, temperatura, composição do solvente, etc., forçará a molécula a assumir uma nova estrutura de equilíbrio.

Compreendendo a estrutura da proteína

Como medimos a desnaturação de proteínas

A desnaturação envolve a transformação de uma estrutura bem definida e dobrada de uma proteína, formada em condições fisiológicas, para um estado desdobrado em condições não fisiológicas. Como sabemos, não podemos medir a estrutura diretamente, ou seja, a medição direta das frações da proteína nativa e desnaturada em uma solução não é possível. Mas, as mudanças conformacionais nas proteínas invariavelmente afetam várias de suas propriedades químicas e físicas, como absorbância ultravioleta (UV), fluorescência, viscosidade, coeficiente de sedimentação, rotação óptica, dicroísmo circular, reatividade de grupos sulfidrila e atividade enzimática. Assim, a desnaturação de proteínas pode ser estudada monitorando as mudanças nessas propriedades físicas e químicas.

Calor como desnaturante

O calor é o agente mais comumente usado no processamento e preservação de alimentos. Quando uma solução de proteína é gradualmente aquecida acima de uma temperatura crítica, ela sofre uma transição brusca do estado nativo para o estado desnaturado. A temperatura no ponto médio de transição, onde a razão de concentração dos estados nativo e desnaturado é 1, é conhecida como temperatura de fusão Tm ou temperatura de desnaturação Td.

O mecanismo de desnaturação induzida pela temperatura é altamente complexo e envolve principalmente a desestabilização das principais interações não covalentes. Ligações de hidrogênio, eletrostáticas e interações de van der Waals são exotérmicas (impulsionadas pela entalpia) por natureza. Portanto, eles são desestabilizados em altas temperaturas e estabilizados em baixas temperaturas. No entanto, como as ligações de hidrogênio peptídicas nas proteínas estão principalmente enterradas no interior, elas permanecem estáveis ​​em uma ampla faixa de temperatura. Por outro lado, as interações hidrofóbicas são endotérmicas (impulsionadas pela entropia). Eles são estabilizados em altas temperaturas e desestabilizados em baixas temperaturas. Portanto, à medida que a temperatura aumenta, as mudanças nas estabilidades desses dois grupos de interações não covalentes se opõem. No entanto, a estabilidade das interações hidrofóbicas não pode aumentar infinitamente com o aumento da temperatura, porque acima de uma certa temperatura, a quebra gradual da estrutura da água acabará desestabilizando também as interações hidrofóbicas. A força das interações hidrofóbicas atinge um máximo em cerca de 60–70 ° C.

Outra grande força que afeta a estabilidade conformacional das proteínas é a entropia conformacional, & # 8211T DSConf, da cadeia polipeptídica. À medida que a temperatura aumenta, o aumento da energia cinética térmica da cadeia polipeptídica facilita muito o desdobramento da cadeia polipeptídica.

Desnaturação de proteínas e composição de aminoácidos
A desnaturação de proteínas pelo calor também depende da composição de aminoácidos das proteínas. As proteínas que contêm uma proporção maior de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, especialmente Val, Ile, Leu e Phe, tendem a ser mais estáveis ​​do que as proteínas mais hidrofílicas. Proteínas de organismos termofílicos geralmente contêm grandes quantidades de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. Também é dito que outros fatores, como ligações dissulfeto e a presença de pontes salinas enterradas em fendas hidrofóbicas, também podem contribuir para a termoestabilidade.

Desnaturação de proteínas e teor de água
A água facilita muito a desnaturação térmica das proteínas [37,95]. Os pós de proteína seca são extremamente estáveis ​​à desnaturação térmica. O valor de Td diminui rapidamente à medida que o conteúdo de água aumenta de 0 para 0,35 g de água / g de proteína. O efeito da hidratação na termoestabilidade está fundamentalmente relacionado à dinâmica das proteínas. No estado seco, as proteínas apresentam uma estrutura estática, ou seja, a mobilidade dos segmentos polipeptídicos é restrita. À medida que o conteúdo de água aumenta, a hidratação e a penetração parcial da água nas cavidades superficiais causam o inchaço da proteína. O inchaço da proteína aumenta a mobilidade e a flexibilidade da cadeia, e a molécula de proteína assume uma estrutura fundida mais dinâmica. Quando aquecida, esta estrutura flexível dinâmica fornece maior acesso de água às pontes de sal e ligações de hidrogênio peptídicas do que é possível no estado seco, resultando em um menor Td.

Desnaturação induzida pelo frio
Diz-se que quanto menor a temperatura, maior será a estabilidade de uma proteína. Existem exceções à esta regra. Aquelas proteínas nas quais as interações polares dominam as interações não polares são mais estáveis ​​em ou abaixo das temperaturas de refrigeração do que em temperaturas mais altas. Por outro lado, as proteínas que são estabilizadas principalmente por interações hidrofóbicas são mais estáveis ​​em torno da temperatura ambiente do que na temperatura de refrigeração.

  • A estabilidade da lisozima aumenta com a redução da temperatura, enquanto a da mioglobina e a lisozima do fago mutante T4 mostram estabilidade máxima a cerca de 30 ° C e 12,5 ° C, respectivamente. Abaixo e acima dessas temperaturas, a mioglobina e a lisozima T4 são menos estáveis. Quando armazenadas abaixo de 0 ° C, essas duas proteínas sofrem desnaturação induzida pelo frio.
  • Quando o leite desnatado é armazenado a 4 ° C, a b-caseína se dissocia das micelas de caseína, e isso altera as propriedades físico-químicas e de coagulação das micelas.

A desnaturação das proteínas é reversível.
Quando o desnaturante é removido da solução de proteína (ou a amostra é resfriada), a maioria das proteínas monoméricas (na ausência de agregação) redobram para sua conformação nativa sob condições de solução adequadas, como pH, força iônica, potencial redox e concentração de proteína .

  • A glicinina, uma das proteínas de armazenamento da soja, agrega e precipita quando armazenada a 2 ° C, então se torna solúvel quando retorna à temperatura ambiente.
  • Várias enzimas oligoméricas, como lactato desidrogenase e gliceraldeído fosfato desidrogenase, perdem a maior parte de sua atividade enzimática quando armazenados a 4 ° C, e isso tem sido atribuído à dissociação das subunidades. No entanto, quando aquecidos e mantidos em temperatura ambiente por algumas horas, eles se reassociam e recuperam completamente sua atividade
  • A desnaturação térmica de proteínas globulares monoméricas é geralmente reversível. Por exemplo, quando muitas enzimas monoméricas são aquecidas acima de suas temperaturas de desnaturação, ou mesmo brevemente mantidas a 100 ° C, e então são imediatamente resfriadas à temperatura ambiente, elas recuperam totalmente suas atividades. No entanto, a desnaturação térmica pode se tornar irreversível quando a proteína é aquecida a 90–100 ° C por um período prolongado, mesmo em pH neutro. Essa irreversibilidade ocorre por causa de várias alterações químicas na proteína, como desamidação de resíduos Asn, clivagem de ligações peptídicas em resíduos Asp, destruição de resíduos de Cys e cistina e agregação.

Palestra sugerida sobre desnaturação de proteínas

Referência: Food Chemistry l1996 l 3rd Ed l Por O R Fennema l Marcel Dekker


Co-expressão de chaperones e / ou foldases.

Duas classes de proteínas desempenham um papel importante na na Vivo dobramento de proteínas.

  • Chaperones moleculares promovem a isomerização adequada e o direcionamento celular interagindo transitoriamente com intermediários de dobramento. Os mais caracterizados E. coli os sistemas são:
    • GroES-GroEL
    • DnaK-DnaJ-GrpE
    • ClpB
    • peptidil prolil cis / trans isomerases (PPI's)
    • dissulfeto oxidoredutase (DsbA) e dissulfeto isomerase (DsbC)
    • proteína dissulfeto isomerase (PDI) - uma proteína eucariótica que catalisa a oxidação da proteína cisteína e a isomerização da ligação dissulfeto. Ele também exibe atividade de acompanhante.

    A co-expressão de uma ou mais dessas proteínas com a proteína-alvo pode levar a níveis mais elevados de proteína solúvel. Os níveis de co-expressão das diferentes chaperones / foldases devem ser otimizados para cada caso individual. DsbA e DsbC também mostraram efeitos positivos nos níveis de expressão quando usados ​​como parceiro de fusão.


    3 Dados para treinar preditores de solubilidade de proteína

    Conjuntos de dados mutacionais para solubilidade de proteínas são muito mais escassos e heterogêneos. A solubilidade da proteína é normalmente definida como a concentração de proteína dobrada em uma solução saturada quando em equilíbrio com a fase sólida. Esta quantidade geralmente é estimada em vitro aumentando a concentração de proteína, e. g. por adição de proteína liofilizada ao solvente ou por ultrafiltração de proteína com subsequente estimativa de frações de proteína no sobrenadante e no pellet, às vezes com a ajuda de vários precipitantes, tais como sais, solventes orgânicos ou polímeros de cadeia longa. 62 Ao mesmo tempo, a solubilidade pode ser definida de forma mais geral como na Vivo expressão, que geralmente é estimada como rendimento de expressão ou seu proxy, e. g. intensidade de fluorescência em sistemas split-GFP 63 ou luminescência em ensaios split-NaNoLuc. 64 A expressibilidade da proteína depende de muitos fatores, visto que muitos componentes de uma célula estão envolvidos em sua síntese e vias de dobramento e qualquer perturbação dessas vias afeta a solubilidade.

    As primeiras tentativas de coletar dados de solubilidade sistematicamente nas escalas adequadas para ML geral foram feitas para sequências completas. Em 2009, um esforço colaborativo do Targeted Proteins Research Project resultou no banco de dados eSoL que compreende dados de solubilidade de cerca de 4000 Escherichia coli proteínas medidas usando o sistema de expressão livre de células PURE. 65 A mais prolongada Protein Structure Initiative resultou no banco de dados TargetTrack com mais de 300.000 proteínas expressas e anotadas. 66 Embora visando uma determinação de estrutura em larga escala, ele fornece um proxy para a quantificação da solubilidade da proteína com base na expressibilidade. A principal limitação dos dois bancos de dados em nosso contexto é a ausência de dados mutacionais. Enquanto alguns estudos demonstraram potencial na previsão de efeitos mutacionais na solubilidade após o treinamento em sequências de tipo selvagem apenas, 67 o maior esforço na área foi focado em reunir dados mutacionais da literatura existente (Tabela 2), semelhantes aos conjuntos de dados usados ​​para treinar preditores de estabilidade de proteínas e treinar um preditor baseado em ML nesses conjuntos de dados, mesmo apesar do tamanho modesto dos dados.

    137 no total: 59 aumentaram 78 diminuíram

    Classificação binária para mutantes de ponto único e múltiplo de 15 estudos publicados, com IDs de PDB fornecidos. Entre 105 mutantes de ponto único, 61 diminuíram e 44 aumentaram a solubilidade em comparação com os tipos selvagens. No total, 121 mutantes eram solúveis antes e depois da mutação, mas a extensão da solubilidade mudou. Também 26 mutantes têm alterações de estabilidade relatadas.

    63 no total: 53 aumentaram 7 neutros 3 diminuíram

    Classificação binária para mutantes de ponto único e múltiplo de 4 estudos publicados, com sequências de tipos selvagens e mutantes fornecidas. Entre 40 mutantes de ponto único, 1 diminuiu e 38 aumentou a solubilidade em comparação com os tipos selvagens.

    129 no total: 87 aumentaram 42 diminuíram

    Classificação binária para mutantes de ponto único e múltiplo de 28 estudos publicados, com PDB IDs fornecidos. Entre 106 mutantes de ponto único, 37 diminuíram e 69 aumentaram a solubilidade em comparação com os tipos selvagens.

    443 no total: 85 aumentou 222 neutro 136 diminuiu

    Classificação de cinco níveis para mutantes de ponto único de & gt80 estudos publicados usando uma pesquisa de literatura em várias etapas e ferramentas de mineração de dados. Mutações que afetam a agregação foram excluídas devido a um fenômeno físico-químico diferente. Links para sequências de tipo selvagem são fornecidos para todas as proteínas e PDB IDs para 14 proteínas. Entre 136 mutações que diminuem a solubilidade, 46 foram classificadas como diminuindo significativamente. Entre 85 mutações que aumentam a solubilidade, 27 foram classificadas como aumentando significativamente.

    145 no total: [b] 61 aumentou 84 diminuiu

    Todas as mutações neutras, bem como exemplos ambíguos, como aqueles com incompatibilidades de sequência, foram excluídos do conjunto de dados PonSol. Apenas proteínas com uma identidade de sequência de pares máxima de & lt30% com o conjunto de dados CamSol foram mantidas. Links para sequências de tipo selvagem são fornecidos.

    • [a] Os dados com sua atribuição a conjuntos de dados individuais estarão disponíveis no banco de dados SoluProtMut DB: loschmidt.chemi.muni.cz/soluprotmutdb. [b] 142 relatados no artigo original e 145 disponíveis em http://protein.bio.unipd.it/soda/about.

    Em relação à sua estrutura, esses conjuntos de dados mostram apenas um ligeiro desequilíbrio, exceto para o conjunto de dados CamSol com apenas três mutações diminuindo a solubilidade. Eles foram compilados a partir de várias publicações independentes e as diferentes escalas para classificar as alterações de solubilidade revelam que é necessário um esforço considerável para tornar os valores compatíveis. No maior conjunto de dados PonSol, o número de mutantes por proteína varia de 52 para Interleucina-1β a menos de 3 para uma dúzia de proteínas. As mais comuns são as substituições de alanina (16%) e as substituições de leucina (11%) e lisina (10%), aproximadamente metade dos pares de substituição possíveis não estão representados. Pode-se observar uma sobreposição significativa dos dados entre os diferentes conjuntos, o que dificulta uma comparação adequada dos preditores de ML treinados em diferentes conjuntos. Isso indica que a comunidade se beneficiará significativamente de um banco de dados com curadoria que resolve as sobreposições e também absorve dados publicados mais recentemente. Para resolver essa limitação, estamos trabalhando no banco de dados com curadoria manual SoluProtMut DB (loschmidt.chemi.muni.cz/soluprotmutdb) que compreenderá os dados coletados sistematicamente de fontes publicadas e os dados experimentais coletados em nosso laboratório.


    Desnaturação

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    Desnaturação, em biologia, processo que modifica a estrutura molecular de uma proteína. A desnaturação envolve a quebra de muitas das ligações ou ligações fracas (por exemplo., ligações de hidrogênio), dentro de uma molécula de proteína que são responsáveis ​​pela estrutura altamente ordenada da proteína em seu estado natural (nativo). As proteínas desnaturadas têm uma estrutura mais solta e aleatória, sendo a maioria insolúvel. A desnaturação pode ser provocada de várias maneiras—por exemplo., por aquecimento, por tratamento com álcali, ácido, ureia ou detergentes e por agitação vigorosa.

    A estrutura original de algumas proteínas pode ser regenerada após a remoção do agente desnaturante e restauração de condições que favorecem o estado nativo. As proteínas sujeitas a esse processo, denominado renaturação, incluem a albumina sérica do sangue, a hemoglobina (o pigmento transportador de oxigênio dos glóbulos vermelhos) e a enzima ribonuclease. A desnaturação de muitas proteínas, como a clara do ovo, é irreversível. Uma consequência comum da desnaturação é a perda da atividade biológica (por exemplo., perda da capacidade catalítica de uma enzima).

    The Editors of Encyclopaedia Britannica Este artigo foi revisado e atualizado mais recentemente por Adam Augustyn, Editor Gerente, Reference Content.


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    Ensaio de desnaturação

    . Desnaturação (bioquímica) Desnaturação é a alteração de um proteína moldar-se por meio de alguma forma de estresse externo (por exemplo, pela aplicação de calor, ácido ou álcali), de forma que não seja mais capaz de realizar sua função celular. Veja também: Plantas e animais Biologia celular Genética Biologia molecular Matéria e bioquímica Energética Química orgânica Termodinâmica Desnaturada proteínas pode apresentar uma ampla gama de características, desde a perda de solubilidade até a agregação comunal. Proteínas são filamentos muito longos de aminoácidos ligados entre si em sequências específicas. UMA proteína é criado por ribossomos que "lêem" códons no gene e montam a combinação de aminoácidos necessária a partir da instrução genética, em um processo conhecido como tradução. O recém-criado proteína a fita então sofre modificação pós-tradução na qual átomos ou moléculas adicionais são adicionados, por exemplo cobre, zinco, ferro. Uma vez que este processo de modificação pós-tradução foi concluído, o proteína começa a se dobrar (espontaneamente, e às vezes com assistência enzimática), enrolando-se sobre si mesmo de modo que os elementos hidrofóbicos do proteína estão enterrados profundamente dentro da estrutura e os elementos hidrofílicos acabam no lado de fora. A forma final de um proteína determina como ele interage com seu ambiente. Para mais informações sobre o assunto.


    Enrolamento de proteínas e biologia de tRNA

    Os polipeptídeos podem dobrar em estruturas terciárias enquanto são sintetizados pelo ribossomo. Além da sequência de aminoácidos, o enovelamento da proteína é determinado por vários fatores dentro da célula. Entre outros, a via de dobramento de um polipeptídeo nascente pode ser afetada por interações transitórias com outras proteínas, ligantes ou o ribossomo, bem como pela translocação através dos poros da membrana. Particularmente, a máquina de tradução e a população de tRNA sob diferentes respostas fisiológicas ou adaptativas podem afetar dramaticamente o enovelamento de proteínas. This review summarizes the scientific evidence describing the role of translation kinetics and tRNA populations on protein folding and addresses current efforts to better understand tRNA biology. It is organized into three main parts, which are focused on: (i) protein folding in the cellular context (ii) tRNA biology and the complexity of the tRNA population and (iii) available methods and technical challenges in the characterization of tRNA pools. In this manner, this work illustrates the ways by which functional properties of proteins may be modulated by cellular tRNA populations.

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    Assista o vídeo: Experiência de Desnaturação de Proteína (Dezembro 2021).