Em formação

Regulação dos fatores de virulência de V. cholerae


Portanto, sei que vários sinais ambientais diferentes, como pH, bile e temperatura, regulam a expressão do gene de virulência em V. cholerae. Especificamente, eles controlam a expressão dos genes que codificam a toxina pilus co-regulada (TCP) e a toxina da cólera (CT).

Mas quais são as duas principais (principais) proteínas reguladoras da transcrição que controlam a expressão de TCP e CT, e onde cada uma está localizada na célula bacteriana? Além disso, o que cada proteína faz?

Eu sei que as proteínas envolvidas são ToxR / S, ToxP / H e ToxT, mas não sei quais são as PRINCIPAIS e por quê ...


Os fatores de virulência do V cholerae são regulados por um sistema regulatório hierárquico. As proteínas que você listou em sua pergunta fazem parte desse sistema. Neste artigo é dito que a ativação real de TCP e CT é feita por ToxT - portanto, esta poderia ser sua proteína "chave". Também gostaria de observar que, só porque esses são dois genes diferentes, não significa necessariamente que deva haver dois fatores-chave - essa sua suposição é um pouco falha.

Também porque a ativação dos fatores de virulência é regulada por uma cadeia de eventos, cada elo pode ser considerado igualmente importante, pois se um deles falhar, toda a cadeia é disfuncional.

A breve descrição da cadeia regulatória retirada do artigo vinculado acima:

O regulon ToxR é um sistema regulador hierárquico que ativa a expressão do gene de virulência em resposta a estímulos ambientais (2). A indução do regulon ToxR começa com a ativação da expressão de tcpPH por AphA e AphB (4, 5). AphA e AphB são proteínas regulatórias citoplasmáticas que se ligam cooperativamente ao promotor tcpPH e ativam sua expressão. Uma vez que TcpP é produzido, ele funciona em conjunto com ToxR para ativar a expressão de toxT. TcpP e ToxR são proteínas de ligação ao DNA ligadas à membrana estruturalmente semelhantes que se acredita que modulem a expressão gênica em resposta a estímulos externos (6, 7). Quando estimulados, TcpP e ToxR se ligam ao promotor toxT e ativam sua expressão. O ToxT então ativa diretamente a expressão dos genes que codificam para a produção de CT e TCP (8).

Este artigo também pode ser útil. Infelizmente, só consegui acessar o texto completo desta forma (por meio de researchgate):

Regulação da virulência em Vibrio cholerae: o regulon ToxR. Brandon Childers, Karl E Klose Future Microbiology (Impact Factor: 4.02). 07/2007; 2 (3): 335-44. DOI: 10.2217 / 17460913.2.3.335

Este artigo fornece detalhes sobre a regulação e o mecanismo de ToxT.

Retirado do terceiro artigo vinculado. Como você pode ver, o ativador final de CT (denominado CTX na imagem) e TCP é de fato o ToxT, mas como escrevi anteriormente, cada elo da cadeia é importante.


Departamento de Microbiologia e Imunologia, Dartmouth Medical School, Hanover, NH, 03755

Departamento de Microbiologia e Imunologia, Dartmouth Medical School, Hanover, NH, 03755

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Escola de Medicina da Universidade do Colorado, Aurora, Colorado

Escola de Medicina da Universidade de Nova York, Nova York, Nova York

Resumo

Dos mais de 200 sorogrupos diferentes de Vibrio cholerae que foram isolados, apenas dois deles, O1 e O139, foram identificados como tendo potencial epidêmico e pandêmico. CTXφ carrega os genes para CT (ctxA e ctxB) e o VPI contém os genes (tcpA-E e tcpJ) responsável pela síntese e montagem do pilus coregulado por toxina do fator de colonização essencial (TCP). Como parte do operon acetoína, AphA reprime a expressão de dois genes ativados por PhoB, acgA e acgB, que codificam proteínas que influenciam a motilidade e a formação de biofilme, alterando os níveis de c-di-GMP na célula. O bicarbonato pode ser um importante sinal in vivo que aumenta a atividade do ToxT durante a infecção e induz a expressão do gene de virulência. Uma vez V. cholerae se disseminou para fora do hospedeiro e a expressão do gene de virulência não é mais necessária, os níveis de TcpP e ToxT são diminuídos pela proteólise e o H-NS restabelece a repressão nos vários promotores. Assim, como GbpA, FrhA desempenha um papel importante na V. cholerae no hospedeiro e no ambiente aquático. Um modelo para V. cholerae A infecção envolve bactérias móveis que se ligam à superfície da célula intestinal, após o que regulam positivamente a expressão do fator de virulência e regulam negativamente a motilidade. A hierarquia regulatória flagelar também influencia a expressão do gene de virulência em V. cholerae através do sistema de detecção de quorum. Avanços recentes no desenvolvimento de sequenciamento de cDNA (RNA-seq) facilitaram a geração de perfis abrangentes de transcriptoma de V. cholerae durante a infecção em ambos os modelos de cólera de coelho e camundongo.


Materiais e métodos

Estirpes bacterianas, plasmídeos e condições de cultura.

V. cholerae El Tor cepa C6706 (23) foi usada como cepa parental neste estudo. O método usado para a construção do HapR e luxO mutantes de deleção foi o de Skorupski e Taylor (24). O pHapR plasmídeo foi construído por clonagem do HapR ORF em pBBR1MCS4 (25) a jusante do p constitutivolaca promotor. Um isopropil β-d-tiogalactosídeo (IPTG) indutível HapR-expressando plasmídeo (pJZ146) foi construído por subclonagem do HapR gene em pMal-c2x (New England Biolabs). pMal-c2x contém o ptac promotor e o lacI Q gene. Cromossômico tcpP-lacZ e hapR-lacZ as fusões repórter transcricional foram construídas por PCR amplificando o DNA 5 ′ de tcpP e HapR, respectivamente, e clonando esses fragmentos em pVIK112 (26). Os plasmídeos resultantes foram então integrados ao cromossomo no tcpP e HapR loci, respectivamente, por recombinação homóloga. Quando a produção de CT e TCP era necessária, V. cholerae as cepas foram cultivadas em meio AKI conforme descrito (27). Em todos os outros experimentos, V. cholerae as cepas foram propagadas em LB a 37 ° C.

Experimentos de microarray.

A produção de microarrays manchados contendo ORFs de comprimento total derivados de V. cholerae a cepa N16961 foi descrita (28). O RNA foi isolado de células cultivadas em meio AKI usando o reagente TRIzol (GIBCO / BRL), extraído com fenol quente (pH 5,2, 65 ° C) e purificado usando um kit RNeasy (Qiagen, Chatsworth, CA). O cDNA marcado com fluorescência foi preparado por incorporação direta de análogos de nucleotídeos fluorescentes (Cy3-dCTP e Cy5-dCTP) durante uma reação de transcrição reversa iniciada aleatoriamente de primeira fita. Os cDNAs diferencialmente marcados foram combinados e subsequentemente aplicados à superfície da matriz em condições que favorecem a hibridização (28). As lâminas de microarray foram digitalizadas usando um aparelho ScanArray 5000 (GSI Lumonics, Watertown, MA). Para cada ponto específico de ORF, a intensidade de fluorescência resultante de cada um dos marcadores foi medida e comparada usando o sistema de software GENEPIX PRO 3.0 (Axon Instruments, Foster City, CA).

Detecção de CT, TCP e protease de hemaglutinina (HA).

Ensaios de CT imunossorvente ligado à enzima de gangliósido GM1 (29) foram realizados após a incubação de V. cholerae cepas por 5 ha 37 ° C, com aeração em meio AKI. Extratos celulares preparados a partir de culturas usadas para ensaios de CT foram submetidos a SDS / PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose, sondados com anticorpo anti-TcpA (30) e visualizados usando o sistema de detecção de quimioluminescência aprimorada (Amersham Pharmacia). Os ensaios de HA protease azocaseína foram realizados conforme descrito (31). Os zimogramas foram realizados incorporando gelatina a 0,2% (final) em géis de SDS / PAGE a 7%. O tampão de amostra foi adicionado aos sobrenadantes de cultura que subsequentemente foram aplicados aos géis sem ferver. Após a eletroforese, os géis foram enxaguados por 30 min em 2,5% e, em seguida, 1% Triton X-100, seguido por três enxágues em tampão de protease (0,1 M Tris, pH 8 / 0,5 mM CaCl2) A atividade da protease em gel foi deixada prosseguir durante a noite em tampão de protease a 37 ° C, após o que os géis foram corados com azul de Coomassie.

Ensaios de biofilme.

Culturas noturnas de V. cholerae foram inoculados na diluição 1: 100 em caldo LB e incubados em tubos de borosilicato por 18 h a 22 ° C. Posteriormente, os tubos foram enxaguados com água destilada e, em seguida, preenchidos com corante violeta de cristal. Após 5 min, os tubos foram enxaguados. O cristal violeta associado ao biofilme foi ressuspenso com DMSO, e o OD570 da suspensão resultante foi medido.

Ensaio de Colonização de Camundongos Infantis.

O ensaio de colonização de camundongos infantis foi descrito (32). Brevemente, V. cholerae cepas mutantes (Lac +) foram misturadas com a cepa de tipo selvagem (Lac-), e aproximadamente 10 5 células foram inoculadas em camundongos CD-1 de 5 a 6 dias de idade. Após um período de 20 h de colonização, homogenatos intestinais foram coletados, e a proporção de bactérias mutantes / selvagens foi determinada por plaqueamento em ágar LB contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-d-galactosídeo.


3 Mecanismos envolvidos na sobrevivência ambiental

Em geral, presume-se que a associação de V. cholerae com zooplâncton ou massas de ovos pode fornecer alguma proteção contra as condições ambientais relativamente adversas enfrentadas nos habitats aquáticos de células bacterianas planctônicas. Uma variedade de microorganismos, incluindo V. cholerae, são capazes de construir grandes estruturas multicelulares em superfícies sólidas conhecidas como biofilmes. O biofilme fornece um microambiente que favorece a sobrevivência e persistência devido ao aumento da resistência a vários estresses (por exemplo, cloro, antibióticos).

Foi demonstrado que V. cholerae O1 El Tor e O139 são ambos capazes de formar um biofilme tridimensional e superfícies abióticas [32-34] (Fig. 2). A formação de biofilme é provavelmente importante para o ciclo de vida de V. cholerae, facilitando a persistência ambiental dentro de habitats aquáticos naturais durante os períodos interepidêmicos.

Passos em V. cholerae formação de biofilme. A bactéria planctônica foi visualizada por microscopia eletrônica de transmissão (barra = 1 μm), as células aderidas e a microcolônia foram visualizadas por microscopia eletrônica de varredura (barra = 2 μm), e a micrografia de biofilme representa um corte vertical através de um biofilme de 20 μm tirado por microscopia confocal a laser de varredura (barra = 10 μm). (Reproduzido com permissão de P. Watnick [150]).

Passos em V. cholerae formação de biofilme. A bactéria planctônica foi visualizada por microscopia eletrônica de transmissão (barra = 1 μm), as células aderidas e a microcolônia foram visualizadas por microscopia eletrônica de varredura (barra = 2 μm), e a micrografia de biofilme representa um corte vertical através de um biofilme de 20 μm tirado por microscopia confocal a laser de varredura (barra = 10 μm). (Reproduzido com permissão de P. Watnick [150]).

A formação de biofilme por ambas as cepas O1 El Tor e O139 é dependente da expressão de um exopolissacarídeo (VPS) [32, 34, 35]. Cepas contendo defeitos em um dos vps genes necessários para a síntese de exopolissacarídeo podem colonizar uma superfície abiótica, mas não conseguem fazer um biofilme tridimensional, indicando que o exopolissacarídeo é usado como a "cola" para construir um biofilme maduro [33, 34]. A expressão do exopolissacarídeo VPS causa um fenótipo de colônia rugosa e fornece resistência ao cloro aumentada e também resistência ao fago [32, 36, 37]. Curiosamente, a expressão do exopolissacarídeo VPS inibe a colonização intestinal no modelo de cólera de camundongo infantil, sugerindo que a expressão de um fator que aumenta a persistência ambiental na verdade diminui a virulência [34]. Colônias rugosas (ou seja, expressando o exopolissacarídeo VPS) aparecem em números baixos como variantes de fase e sua aparência aumenta durante a privação de carbono [32, 38]. A falta de síntese flagelar causa a expressão de exopolissacarídeo VPS de alto nível (pelo menos em algumas cepas, por exemplo, O139), indicando que a síntese flagelar está acoplada à expressão de VPS. Este efeito é especificamente devido à falta de um flagelo, ao invés de uma falta de motilidade, sugerindo que a perda do flagelo pode ser uma pista de desenvolvimento durante a formação de biofilme [34].

Os constituintes do exopolissacarídeo VPS foram identificados, e a galactose foi identificada entre os resíduos de carboidratos [32, 35]. Tentativas recentes de investigar o caminho Gal em V. cholerae nos levou a gerar e caracterizar um galU mutante, que codifica a UDP-glicose-4-epimerase. Descobrimos que o galU mutante perdeu a capacidade de produzir o exopolissacarídeo VPS e é defeituoso para o desenvolvimento de biofilme [37]. Estes resultados são consistentes com um requisito para a síntese de UDP-galactose via UDP-glicose para a biossíntese do exopolissacarídeo VPS.

Além do exopolissacarídeo VPS, V. cholerae O1 El Tor requer o pilus MSHA tipo IV para formar um biofilme normal [33], mas a cepa O139 não [34]. o V. cholerae O1 El Tor também requer motilidade flagelar para a formação de biofilme, enquanto cepas de O139 não flageladas podem eventualmente formar biofilmes tridimensionais, aparentemente por causa da expressão de exopolissacarídeo VPS de alto nível [33, 34]. Watnick et al. postularam um modelo de três etapas em V. cholerae formação de biofilme (ver Fig. 2). A motilidade conduzida pelo flagelar é importante para a etapa de fixação inicial, seguida pela formação da microcolônia auxiliada pelo pili MSHA. A etapa final é a expressão do exopolissacarídeo VPS, que permite a arquitetura tridimensional do biofilme maduro. Uma cepa O139 não flagelada ignora a necessidade de motilidade, presumivelmente porque ela já expressa o exopolissacarídeo VPS, que permite que microcolônias se formem em solução que eventualmente se fixam na superfície sólida. Não está claro por que a cepa O139 não requer MSHA pili, mas pode ser devido ao fato de que as cepas O139 são encapsuladas, ao contrário do O1 El Tor (veja abaixo).

Além da formação de biofilme, V. cholerae possuem a notável habilidade de ser capaz de mudar para um estado viável, mas não cultivável (VNC) em resposta à privação de nutrientes [39, 40]. Tal estado dormente pode servir como uma estratégia de sobrevivência, que pode ser ressuscitada ao receber os sinais apropriados, e. mudança extrema das condições ambientais, como a transição do sistema aquático após a ingestão para o ambiente intestinal humano [6, 39]. Durante os períodos interepidêmicos, epidemia V. cholerae cepas foram postuladas para existir na forma VNC, com condições ambientais desconhecidas servindo para ressuscitar essas células de volta a organismos virulentos de vida livre [18, 41]. Se este nicho ecológico serve como um reservatório comum para toxigênica V. cholerae então, tais cepas devem ser altamente relacionadas. Em contraste com essa suposição, as cepas epidêmicas isoladas são bastante diferentes, com base na ribotipagem e em diferentes propriedades fenotípicas e genéticas (conforme revisado recentemente [6]), portanto, uma origem clonal de um reservatório VNC parece menos provável. Em geral, a existência do estado VNC está em debate, uma vez que não há informações conclusivas diretas sobre os processos moleculares subjacentes ou os fatores genéticos envolvidos.


VIBRIOS | Vibrio cholerae

Introdução

Vibrio cholerae é um bacilo Gram-negativo curvo. O organismo está amplamente distribuído em ambientes aquáticos, onde é um organismo natural de vida livre. Um subconjunto de V. cholerae cepas, carregando os genes para a toxina da cólera (CT) e o Vibrio ilha de patogenicidade (VPI), causa cólera, uma doença caracterizada por diarreia desidratante e severa, virtualmente todas essas últimas 'cepas epidêmicas' estão dentro do grupo O 1 ou do grupo O 139. A cólera continua sendo uma causa persistente de morbidade e mortalidade na Ásia e na África . Em 1998, a Organização Mundial da Saúde (OMS) recebeu notificações de 293 121 casos de cólera e 10 586 mortes em 74 países, com o número real de casos (incluindo os casos não notificados) provavelmente excedendo em muito esse número. A cólera também pode se mover de forma explosiva através de populações que estão livres da doença há gerações, como demonstrado pela ocorrência de mais de 100.000 casos no Peru em 1991 e a rápida disseminação subsequente da cólera para outros países sul-americanos.

V. cholerae cepas que não possuem os fatores de virulência necessários para causar cólera epidêmica ("cepas não epidêmicas") foram, no passado, referidas como não-O1 V. cholerae, não aglutinável (NAG) Vibrio, ou não-cólera Vibrio. Embora a maioria dessas cepas ambientais não epidêmicas pareça não ser patogênica para humanos, algumas foram associadas a doenças humanas.


Patologia

V. cholerae entra no corpo humano através da injeção de alimentos ou água contaminados. A bactéria entra no instestino, penetra nas vilosidades das células intestinais absortivas e libera a toxina da cólera. A toxina da cólera (CT) é uma enterotoxina composta por cinco subunidades B que formam um poro para se ajustar a uma subunidade A. 8 CT é feito do gene do fago filamentoso, CTX & # 966. 9 Um gene de fago também é responsável por outro fator de virulência de V. cholerae, que é pilus co-regulado por toxina (TCP), que atua como um receptor para CTX & # 966. 10


As respostas fisiológicas e os sintomas que seguem a liberação da toxina da cólera incluem a estimulação do revestimento da mucosa do intestino para a secreção de fluidos. Isso causa vômitos e diarreia aquosa com uma qualidade de "água de arroz". A morte pode ocorrer por desidratação extrema e, se não for tratada, ocorre em 50-70% das vezes.


O tratamento inclui reidratação e substituição de eletrólitos perdidos, íons importantes, como sódio e potássio, usados ​​em processos bioquímicos para manter o corpo vivo. Por causa da baixa qualidade do tratamento de água em muitos países assolados pela pobreza, a reidratação com água limpa pode ser impossível sem ajuda médica e suprimentos.


Regulação dos fatores de virulência de V. cholerae - Biologia

Palavras chave: Vibrio cholerae, V cholerae, V cholerae O139, cholera, diarreia.

Reino: Bactérias
Filo: Proteobactérias
Classe: Gamma Proteobacteria
Ordem: Vibrionales
Família: Vibrionaceae
Gênero: Vibrio
Espécie: V. cholerae

Toxina de cólera ativa a enzima adenilato ciclase nas células da mucosa intestinal levando a níveis aumentados de cAMP intracelular e a secreção de H20, Na +, K +, Cl - e HCO3 - no lúmen do intestino delgado. O efeito depende de um receptor específico, o gangliósido monossialosil (gangliósido GM1) presente na superfície das células da mucosa intestinal. A bactéria produz uma invasina, a neuraminidase, durante a fase de colonização, que tem a interessante propriedade de degradar gangliosídeos à forma monossialosil, que é o receptor específico para a toxina.

A toxina foi caracterizada e contém 5 subunidades de ligação (B) de 11.500 daltons, um ativo (A1) subunidade de 23.500 daltons, e um peça de ponte (A2) de 5.500 daltons que liga A1 às subunidades 5B. Depois de entrar na célula, a subunidade A1 transfere enzimaticamente ADP ribose de NAD para uma proteína (chamada Gs ou Ns), que regula o sistema adenilato ciclase que está localizado no interior da membrana plasmática das células de mamíferos.

Enzimaticamente, o fragmento A1 catalisa a transferência da porção ADP-ribosil de NAD para um componente do sistema adenilato ciclase. O processo é complexo. A adenilato ciclase (AC) é ativada normalmente por uma proteína reguladora (GS) e GTP, entretanto a ativação é normalmente breve porque outra proteína reguladora (Gi), hidrolisa GTP. A situação normal é descrita a seguir.

O fragmento A1 catalisa a ligação de ADP-Ribose (ADPR) à proteína reguladora formando Gs-ADPR a partir da qual GTP não pode ser hidrolisado. Como a hidrólise do GTP é o evento que inativa a adenilato ciclase, a enzima permanece continuamente ativada. Esta situação pode ser ilustrada

Assim, o efeito líquido da toxina é fazer com que o cAMP seja produzido a uma taxa anormalmente alta que estimula as células da mucosa a bombear grandes quantidades de Cl- para o conteúdo intestinal. H2Seguem-se O, Na + e outros eletrólitos devido aos gradientes osmóticos e elétricos causados ​​pela perda de Cl -. O H perdido2O e eletrólitos nas células da mucosa são substituídos do sangue. Assim, as células danificadas por toxinas tornam-se bombas para água e eletrólitos, causando diarreia, perda de eletrólitos e desidratação, características da cólera.

Mecanismo de ação da enterotoxina da cólera de acordo com Finkelstein em Baron, Capítulo 24. A toxina da cólera se aproxima da superfície da célula-alvo. As subunidades B ligam-se ao oligossacarídeo do gangliósido GM1. Ocorre alteração conformacional da holotoxina, permitindo a apresentação da subunidade A à superfície celular. A subunidade A entra na célula. A ligação dissulfeto da subunidade A é reduzida pela glutationa intracelular, liberando A1 e A2. O NAD é hidrolisado por A1, produzindo ADP-ribose e nicotinamida. Uma das proteínas G da adenilato ciclase é ADP-ribosilada, inibindo a ação da GTPase e bloqueando a adenilato ciclase no modo "on".

Colonização do Intestino Delgado

Existem várias características de patogênicos V. cholerae que são importantes determinantes da colonização processo. Esses incluem adesinas, neuraminidase, motilidade, quimiotaxia e toxina Produção. Se as bactérias são capazes de sobreviver às secreções gástricas e ao baixo pH do estômago, elas estão bem adaptadas à sobrevivência no intestino delgado. V. cholerae é resistente aos sais biliares e pode penetrar na camada de muco do intestino delgado, possivelmente auxiliado pela secreção de neuraminidase e proteases (mucinases). Eles suportam a motilidade intestinal propulsora por sua própria capacidade de natação e quimiotaxia dirigida contra a mucosa intestinal.

Aderência específica de V. cholerae para a mucosa intestinal é provavelmente mediada por longas fímbrias filamentosas que formam feixes nos pólos das células. Essas fímbrias foram denominadas Tcp pili (para pili co-regulado por toxina), porque a expressão desses genes do pili é co-regulada com a expressão dos genes da toxina da cólera. Não se sabe muito sobre a interação dos pili Tcp com as células hospedeiras, e o receptor da célula hospedeira para essas fímbrias não foi identificado. Os pili Tcp compartilham similaridade de sequência de aminoácidos com os pili de N-metilfenilalanina de Pseudomonas e Neisseria.

Duas outras adesinas possíveis em V. cholerae são uma proteína de superfície que aglutina os glóbulos vermelhos (hemaglutinina) e um grupo de proteínas da membrana externa que são produtos da acf (fator de colonização acessório) genes. Foi demonstrado que os mutantes acf têm capacidade reduzida de colonizar o trato intestinal. Foi sugerido que V. cholerae pode usar essas adesinas não fimbriais para mediar uma ligação mais forte às células hospedeiras do que a que pode ser obtida apenas com as fímbrias.

V. cholerae produz uma protease originalmente chamada mucinase que degrada diferentes tipos de proteínas, incluindo fibronectina, lactoferrina e a própria toxina da cólera. Seu papel na virulência não é conhecido, mas provavelmente não está envolvido na colonização, uma vez que mutações no gene da mucinase (designado hap para protease de hemaglutinina) não apresentam virulência reduzida. Foi sugerido que a mucinase pode contribuir para o descolamento em vez da fixação. Possivelmente, os vibrios precisariam se desprender das células que estão sendo descamadas da mucosa para se reconectar às células da mucosa recém-formadas.

Organização genética e regulação dos fatores de virulência em Vibrio cholerae

No Vibrio cholerae, a produção de fatores de virulência é regulada em vários níveis. A regulação dos genes no nível transcricional, especialmente os genes para a produção de toxinas e síntese fimbrial, foi estudada nos maiores detalhes.

V. cholerae enterotoxina é um produto de ctx genes. ctxA codifica a subunidade A da toxina, e ctxB codifica a subunidade B. Os genes fazem parte do mesmo operon. O transcrito (mRNA) do ctx O operon tem dois sítios de ligação ao ribossomo (rbs), um a montante da região de codificação A e outro a montante da região de codificação B. O rbs a montante da região de codificação B é pelo menos sete vezes mais forte do que o rbs da região de codificação A. Desta forma, o organismo é capaz de traduzir mais proteínas B do que proteínas A, o que é necessário para montar a toxina na proporção 1A: 5B apropriada. Os componentes são montados no periplasma após a translação. Quaisquer subunidades B extras podem ser excretadas pela célula, mas A deve ser anexado a 5B para sair da célula. A subunidade A intacta não é enzimaticamente ativa, mas deve ser cortada para produzir os fragmentos A1 e A2 que estão ligados por uma ligação dissulfeto. Uma vez que a toxina da cólera se ligou ao receptor GM1 nas células hospedeiras, a subunidade A1 é liberada da toxina pela redução da ligação dissulfeto que a liga a A2 e entra na célula por um mecanismo de translocação desconhecido. Uma hipótese é que as 5 subunidades B formem um poro na membrana da célula hospedeira através do qual a unidade A1 passa.

Transcrição do ctxOperon AB é regulado por uma série de sinais ambientais, incluindo temperatura, pH, osmolaridade e certos aminoácidos. Muitos outros V. cholerae os genes são co-regulados da mesma maneira, incluindo o operon tcp, que está relacionado à síntese e montagem fimbrial. Assim, o ctx operon e o tcp operon são parte de um regulon, cuja expressão é controlada pelos mesmos sinais ambientais.

As proteínas envolvidas no controle da expressão deste regulon foram identificadas como ToxR, ToxS e ToxT. ToxR é uma proteína transmembranosa com cerca de dois terços de sua parte amino terminal exposta ao citoplasma. Dímeros ToxR, mas não monômeros ToxR, irão se ligar à região do operador de ctxOperon AB e ativar sua transcrição. ToxS é uma proteína periplasmática. Pensa-se que o ToxS pode responder aos sinais ambientais, alterar a conformação e, de alguma forma, influenciar a dimerização do ToxR, que atua na transcrição do operon. O ToxR e o ToxS parecem formar um sistema regulatório padrão de dois componentes com o ToxS funcionando como uma proteína sensora que fosforila e, portanto, converte o ToxR em sua forma ativa de ligação ao DNA. ToxT é uma proteína citoplasmática que é um ativador transcricional do operon tcp. A expressão de ToxT é ativada por ToxR, enquanto ToxT, por sua vez, ativa a transcrição de genes tcp para a síntese de pili tcp.


Pilus co-regulador de toxinas

Os pili bacterianos estão tipicamente envolvidos na motilidade de superfície, formação de microcolônia, formação de biofilme, adesão de célula hospedeira, sinalização celular, captação de DNA e fixação de fago. Eles geralmente são muito fortes, resistindo a forças de 100 pN ou mais. Pilus co-regulador de toxinas (TCP) é o pilin para V. cholerae, considerado muito importante pela sua virulência. [12]

Estrutura

O TCP é classificado como uma pilina do tipo IVb (ou seja, está presente em bactérias que colonizam o intestino humano), que normalmente tem 1-4 μm de comprimento, 50-80 Å de espessura e é flexível. O TCP é composto de muitas cópias de sua subunidade, TcpA, um polipeptídeo de 199 aminoácidos, a maior subunidade de pilin tipo IV. [13]

TcpA é composto principalmente por um domínio de cabeça globular e uma região D (Figura 3) O domínio da cabeça globular consiste na α-hélice N-terminal, uma segunda α-hélice mais curta e uma folha β antiparalela juntas, elas formam um núcleo hidrofóbico compacto. A cabeça tem dois lados: um é o loop que conecta a hélice α do terminal N à folha β, chamado de loop αβ, e o outro é a região D. A região D é composta por 2 α-hélices e 2 folhas beta antiparalelas. É responsável por interagir com as outras subunidades de TcpA para formar um grande TCP e estabilizar toda a estrutura com ligações dissulfeto. [13]

A montagem da estrutura do TCP é organizada em 3 fitas de proteína idênticas que se torcem para formar um filamento de torção helicoidal. O filamento tem separação axial entre os fios de 45 Å e cada volta do filamento tem 6 subunidades TcpA por fio. Há uma interface polar entre o TcpA ao longo do eixo da fibra, que une os 3 fios. Também existe uma interface hidrofóbica entre as subunidades radialmente. [13]

Papel na Virulência

O TCP, embora não esteja envolvido em causar os sintomas da cólera, demonstrou ser absolutamente necessário para a colonização e subsequente infecção por V. cholerae. tcpA é necessário para a colonização de camundongos CD-1 e humanos. Embora tcpA células mutantes de deleção podem crescer em vitro sem TCP, eles são incapazes de colonizar camundongos, como visto pela análise de homogenatos intestinais. [14] Em humanos, tcpA as células mutantes não causam resposta clínica e não são encontradas nas amostras de fezes (enquanto as células do tipo selvagem são). [15] Embora ainda não provado, há a hipótese de que isso se deva ao papel do TCP na aderência à superfície da mucosa, que o TCP pode mediar usando adesões bacterianas, que ligariam os receptores da superfície das células epiteliais e criariam microcolônias nos epitélios intestinais. A pesquisa mostrou que o TcpA aumenta a hidrofobicidade da superfície das células, o que pode causar autoaglutinação em cultura líquida e microcolônias no intestino. [16] Essa concentração de células na superfície da mucosa é o que permite que a próxima etapa da virulência, a entrega da TC, ocorra (uma vez que atinge 10 7-8 células por grama de superfície da mucosa). [17] Sem tcpA, Os níveis de CT diminuem pela metade no intestino do camundongo. [14] Suspeita-se que essa diminuição seja causada por na Vivo efeitos da mutação, em vez de alterações transcricionais a jusante, como tcpA mutantes não afetam os níveis de CT em vitro também. É hipotetizado que o TCP aumentando a formação de microcolônias no epitélio intestinal permite que os sinais intestinais atinjam a célula e ativem o gene de virulência (como ctx) expressão. [18]

tcpA também demonstrou ter regulação temporal e espacial em modelos de camundongos e coelhos. É expressa no intestino delgado com dois padrões temporais e espaciais distintos. É expresso pela primeira vez quando V. cholerae está no lúmen do trato gastrointestinal superior, mas em níveis muito baixos isso pode causar alguma montagem de TCP. Então, é expresso em mais abundância no intestino delgado. [18] No intestino delgado, há um gradiente crescente de tcpA expressão do gel de muco em direção à superfície do tecido epitelial (Figura 4). [19]


Publicações

Em Vibrio cholerae, o segundo mensageiro 3 ', 5'-ácido diguanílico cíclico (c-di-GMP) regula vários processos celulares, como a formação de morfologia de colônia ondulada, formação de biofilme, motilidade e produção de fator de virulência. Tanto a síntese quanto a degradação de c-di-GMP na célula são moduladas por proteínas contendo domínios GGDEF e / ou EAL, que funcionam como diguanilato ciclase e fosfodiesterase, respectivamente. A expressão de dois genes, cdgC e mbaA, que codificam proteínas que abrigam os domínios GGDEF e EAL, é maior na variante da fase rugose de V. cholerae do que na variante lisa. Neste estudo, realizamos análises de expressão gênica para determinar os genes regulados por CdgC nas variantes rugosa e de fase lisa de V. cholerae. Determinamos que CdgC regula a expressão de genes necessários para a síntese de polissacarídeos de V. cholerae e dos genes reguladores da transcrição vpsR, vpsT e hapR. CdgC também regula a expressão de genes envolvidos na secreção de proteínas extracelulares, biossíntese flagelar e produção de fator de virulência. Em seguida, comparamos os genes regulados por CdgC e por MbaA, durante as fases exponencial e estacionária de crescimento, para elucidar os processos regulados por eles. A identificação dos regulons de CdgC e MbaA revelou que os regulons se sobrepõem, mas o tempo de regulação exercido por CdgC e MbaA é diferente, sugerindo a interação e complexidade das vias de transdução de sinal c-di-GMP operando em V. cholerae.

PMID: 17122338

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Conteúdo

Initial observations Edit

During the third global pandemic of cholera (1852–1859), there were several scientific research to understand the etiology of the disease. [6] The miasma theory, which posited that infections spread through contaminated air, was no longer a satisfactory explanation. An English physician John Snow was the first to give convincing evidence in London in 1854 that cholera was spread from drinking water – a contagion, not miasma. Yet he could not identify the pathogens, which made most people still belief in the miasma origin. [7]

V. cholerae was first observed and recognized under microscope by a French zoologist Félix-Archimède Pouchet. In 1849, Pouchet examined the stool samples of four people having cholera. [8] His presentation before the French Academy of Sciences on 23 April was recorded as: "[Pouchet] could verify that there existed in these [cholera patients] dejecta an immense quantity of microscopic infusoria." But he made a mistake in believing that the organisms were infusoria, a name then used for microscopic protists, thereby attributing them as Vibrio rigula, a species of protozoan described by Danish naturalist Otto Friedrich Müller in 1786. [9]

Identification of the bacterium Edit

An Italian physician, Filippo Pacini, while investigating cholera outbreak in Florence in the late 1854, identified the causative pathogen as a new type of bacterium. He performed autopsies of corpses and made meticulous microscopic examinations of the tissues and body fluids. From feces and intestinal mucosa, he identified many comma-shaped bacilli. [10] [11] Reporting his discovery before the Società Medico-Fisica Fiorentina (Medico-Physician Society of Florence) on 10 December, and published in the 12 December issue of the Gazzetta Medica Italiana (Medical Gazette of Italy), Pacini stated:

Le poche materia del vomito che ho potuto esaminare seconde e terzo caso di cholera. e di plù trovai degli ammassi granulosi appianati, simili a quelli che si formano all superficie delle acque corrotte, quando sono per svilupparsi dei vibrioni dei quali de fatto ne trovai alcuni del genere Bactéria. Mentre la massima parte, per la loro estrema piccoleza, erano stati eliminati con la decantazione del fluido. [From samples of vomit that I have been able to examined in the second and third cases of cholera. I found smoothed granular masses, similar to those which form on the surface of dirty waters, when vibrioni are about to develop in fact I found a genus of Bactéria. [12] ]

Pacini thus introduced the name vibrioni (Latin vībro means "to move rapidly to and fro, to shake, to agitate"). A Catalan physician Joaquim Balcells i Pascual also reported such bacterium around the same time. [13] [14] The discovery of the new bacterium was not regarded as medically important as the bacterium was not directly attributed to cholera. Pacini also stated that there was no reason to say that the bacterium caused the disease since he failed to make pure culture and perform experiment, which was necessary ‘to attribute the quality of contagion to cholera’. [7] The miasma theory was still not ruled out. [15]

Rediscovery Edit

The medical importance and relationship of the bacterium and cholera was discovered by a German physician Robert Koch. In August 1883, Koch, with a team of German physicians, went to Alexandria, Egypt, to investigate cholera epidemic there. [16] Koch found that the intestinal mucosa of people who died of cholera always had the bacterium, yet could not confirm if it was the causative agent. He moved to Calcutta (now Kolkata) India, where the epidemic was more severe. It was from here that he isolated the bacterium in pure culture on 7 January 1884. He subsequently confirmed that the bacterium was a new species, and described as "a little bent, like a comma." [7] He reported his discovery to the German Secretary of State for the Interior on 2 February, and published in the Deutsche Medizinische Wochenschrift (German Medical Weekly). [17]

Although Koch was convinced that the bacterium was the cholera pathogen, he could not entirely establish a critical evidence the bacterium produced the symptoms in healthy subjects (an important element in what was later known Koch's postulates). His experiment on animals using his pure bacteria culture did not cause the disease, and correctly explained that animals are immune to human pathogen. The bacterium was by then known as "the comma bacillus." [18] It was only in 1959 when an Indian physician Sambhu Nath De in Calcutta isolated the cholera toxin and showed that it caused cholera in healthy subjects that the bacterium-cholera relationship was fully proven. [19] [20]

Edição de taxonomia

Pacini had used the name "vibrio cholera", without proper binomial rendering, for the name of the bacterium. [21] Following Koch's description, a scientific name Bacillus comma was popularised. But an Italian bacteriologist Vittore Trevisan published in 1884 that Koch's bacterium was the same as that of Pacini's and introduced the name Bacillus cholerae. [22] A German physician Richard Friedrich Johannes Pfeiffer renamed it as Vibrio cholerae in 1896. [8] The named was adopted by the Committee of the Society of American Bacteriologists on Characterization and Classification of Bacterial Types in 1920. [23] In 1964, Rudolph Hugh of the George Washington University School of Medicine proposed to use the genus Vibrio with the type species V. cholerae (Pacini 1854) as a permanent name of the bacterium, regardless of the same name for protozoa. [24] It was accepted by the Judicial Commission of the International Committee on Bacteriological Nomenclature in 1965, [25] and the International Association of Microbiological Societies in 1966. [26]

V. cholerae is a highly motile, comma shaped, gram-negative rod. The active movement of V. cholerae inspired the genus name because "vibrio" in Latin means "to quiver". [27] Except for v.cholerae and v.mimicus, all other vibrio species are halophilic. Initial isolates are slightly curved, whereas they can appear as straight rods upon laboratory culturing. The bacterium has a flagellum at one cell pole as well as pili. It tolerates alkaline media that kill most intestinal commensals, but they are sensitive to acid. It is a facultative anaerobe, and can undergo respiratory and fermentative metabolism. [1] It measures 0.3 μm in diameter and 1.3 μm in length [28] with average swimming velocity of around 75.4 μm/sec. [29]

V. cholerae pathogenicity genes code for proteins directly or indirectly involved in the virulence of the bacteria. To adapt the host intestinal environment and to avoid being attacked by bile acids and antimicrobial peptides, V. cholera uses its outer membrane vesicles (OMVs). Upon entry, the bacteria sheds its OMVs, containing all the membrane modifications that make it vulnerable for the host attack. [30]

During infection, V. cholerae secretes cholera toxin (CT), a protein that causes profuse, watery diarrhea (known as "rice-water stool"). [31] [5] This cholera toxin contains 5 B subunits that plays a role in attaching to the intestinal epithelial cells and 1 A subunit that plays a role in toxin activity. Colonization of the small intestine also requires the toxin coregulated pilus (TCP), a thin, flexible, filamentous appendage on the surface of bacterial cells. Expression of both CT and TCP is mediated by two component systems (TCS), which typically consist of a membrane-bound histidine kinase and an intracellular response element. [32] TCS enable bacteria to respond to changing environments. [32] In V. cholerae several TCS have been identified to be important in colonization, biofilm production and virulence. [32] Small RNAs (sRNA) have been identified as targets of V. cholerae TCS. [32] [33] [34] Here, sRNA molecules bind to mRNA to block translation or induce degradation of inhibitors of expression of virulence or colonization genes. [32] [33] In V. cholerae the TCS EnvZ/OmpR alters gene expression via the sRNA coaR in response to changes in osmolarity and pH. An important target of coaR é tcpI, which negatively regulates expression of the major subunit of the TCP encoding gene (tcpA) Quando tcpI is bound by coaR it is no longer able to repress expression tcpA, leading to an increased colonization ability. [32] Expression of coaR is upregulated by EnvZ/OmpR at a pH of 6,5, which is the normal pH of the intestinal lumen, but is low at higher pH values. [32] V. cholerae in the intestinal lumen utilizes the TCP to attach to the intestinal mucosa, not invading the mucosa. [32] After doing so it secretes cholerae toxin causing its symptoms. This then increases cyclic AMP or cAMP by binding (cholerae toxin) to adenylyl cyclase activating the GS pathway which leads to efflux of water and sodium into the intestinal lumen causing watery stools or rice watery stools.

V. cholerae can cause syndromes ranging from asymptomatic to cholera gravis. [35] In endemic areas, 75% of cases are asymptomatic, 20% are mild to moderate, and 2-5% are severe forms such as cholera gravis. [35] Symptoms include abrupt onset of watery diarrhea (a grey and cloudy liquid), occasional vomiting, and abdominal cramps. [1] [35] Dehydration ensues, with symptoms and signs such as thirst, dry mucous membranes, decreased skin turgor, sunken eyes, hypotension, weak or absent radial pulse, tachycardia, tachypnea, hoarse voice, oliguria, cramps, kidney failure, seizures, somnolence, coma, and death. [1] Death due to dehydration can occur in a few hours to days in untreated children. The disease is also particularly dangerous for pregnant women and their fetuses during late pregnancy, as it may cause premature labor and fetal death. [35] [36] [37] A study done by the Centers for Disease Control (CDC) in Haiti found that in pregnant women who contracted the disease, 16% of 900 women had fetal death. Risk factors for these deaths include: third trimester, younger maternal age, severe dehydration, and vomiting [38] Dehydration poses the biggest health risk to pregnant women in countries that there are high rates of cholera. In cases of cholera gravis involving severe dehydration, up to 60% of patients can die however, less than 1% of cases treated with rehydration therapy are fatal. The disease typically lasts 4–6 days. [35] [39] Worldwide, diarrhoeal disease, caused by cholera and many other pathogens, is the second-leading cause of death for children under the age of 5 and at least 120,000 deaths are estimated to be caused by cholera each year. [40] [41] In 2002, the WHO deemed that the case fatality ratio for cholera was about 3.95%. [35]

V. cholerae infects the intestine and causes diarrhea, the hallmark symptom of cholera. Infection can be spread by eating contaminated food or drinking contaminated water. [42] It also can spread through skin contact with contaminated human feces. Not all infection indicate symptoms, only about 1 in 10 people develop diarrhea. The major symptoms include: watery diarrhea, vomiting, rapid heart rate, loss of skin elasticity, low blood pressure, thirst, and muscle cramps. [42] This illness can get serious as it can progress to kidney failure and possible coma. If diagnosed, it can be treated using medications. [42]

V. cholerae has an endemic or epidemic occurrence. In countries where the disease has been for the past three years and the cases confirmed are local (within the confines of the country) transmission is considered to be "endemic." [43] Alternatively, an outbreak is declared when the occurrence of disease exceeds the normal occurrence for any given time or location. [44] Epidemics can last several days or over a span of years. Additionally, countries that have an occurrence of an epidemic can also be endemic. [44] The longest standing V. chloerae epidemic was recorded in Yemen. Yemen had two outbreaks, the first occurred between September 2016 and April 2017, and the second began later in April 2017 and recently was considered to be resolved in 2019. [45] The epidemic in Yemen took over 2,500 lives and impacted over 1 million people of Yemen [45] More outbreaks have occurred in Africa, the Americas, and Haiti.

When visiting areas with epidemic cholera, the following precautions should be observed: drink and use bottled water frequently wash hands with soap and safe water use chemical toilets or bury feces if no restroom is available do not defecate in any body of water and cook food thoroughly. Supplying proper, safe water is important. [46] A precaution to take is to properly sanitize. [47] Hand hygiene is an essential in areas where soap and water is not available. When there is no sanitation available for hand washing, scrub hands with ash or sand and rinse with clean water. [48] A single dose vaccine is available for those traveling to an area where cholera is common.

Existe um V. cholerae vaccine available to prevent disease spread. The vaccine is known as the, "oral cholera vaccine" (OCV). There are three types of OCV available for prevention: Dukoral®, Shanchol™, and Euvichol-Plus®. All three OCVs require two doses to be fully effective. Countries who are endemic or have an epidemic status are eligible to receive the vaccine based on several criteria: Risk of cholera, Severity of cholera, WASH conditions and capacity to improve, Healthcare conditions and capacity to improve, Capacity to implement OCV campaigns, Capacity to conduct M&E activities, Commitment at national and local level [49] Since May the start of the OCV program to May 2018 over 25 million vaccines have been distributed to countries who meet the above criteria. [49]

The basic, overall treatment for Cholera is re-hydration, to replace the fluids that have been lost. Those with mild dehydration can be treated orally with an oral re hydration solution also known as, (ORS). [47] When patients are severely dehydrated and unable to take in the proper amount of ORS, IV fluid treatment is generally pursued. Antibiotics are used in some cases, typically fluoroquinolones and tetracyclines. [47]

V. cholerae has two circular chromosomes, together totalling 4 million base pairs of DNA sequence and 3,885 predicted genes. [50] The genes for cholera toxin are carried by CTXphi (CTXφ), a temperate bacteriophage inserted into the V. cholerae genoma. CTXφ can transmit cholera toxin genes from one V. cholerae strain to another, one form of horizontal gene transfer. The genes for toxin coregulated pilus are coded by the Vibrio pathogenicity island (VPI). The entire genome of the virulent strain V. cholerae El Tor N16961 has been sequenced, [1] and contains two circular chromosomes. [35] Chromosome 1 has 2,961,149 base pairs with 2,770 open reading frames (ORF's) and chromosome 2 has 1,072,315 base pairs, 1,115 ORF's. The larger first chromosome contains the crucial genes for toxicity, regulation of toxicity, and important cellular functions, such as transcription and translation. [1]

The second chromosome is determined to be different from a plasmid or megaplasmid due to the inclusion of housekeeping and other essential genes in the genome, including essential genes for metabolism, heat-shock proteins, and 16S rRNA genes, which are ribosomal subunit genes used to track evolutionary relationships between bacteria. Also relevant in determining if the replicon is a chromosome is whether it represents a significant percentage of the genome, and chromosome 2 is 40% by size of the entire genome. And, unlike plasmids, chromosomes are not self-transmissible. [35] However, the second chromosome may have once been a megaplasmid because it contains some genes usually found on plasmids. [1]

V. cholerae contains a genomic island of pathogenicity and is lysogenized with phage DNA. That means that the genes of a virus were integrated into the bacterial genome and made the bacteria pathogenic. The molecular pathway involved in expression of virulence is discussed in the pathology and current research sections below.

Bacteriophage CTXφ Edit

CTXφ (also called CTXphi) is a filamentous phage that contains the genes for cholera toxin. Infectious CTXφ particles are produced when V. cholerae infects humans. Phage particles are secreted from bacterial cells without lysis. When CTXφ infects V. cholerae cells, it integrates into specific sites on either chromosome. These sites often contain tandem arrays of integrated CTXφ prophage. Em adição ao ctxA e ctxB genes encoding cholera toxin, CTXφ contains eight genes involved in phage reproduction, packaging, secretion, integration, and regulation. The CTXφ genome is 6.9 kb long. [51]

The main reservoirs of V. cholerae are aquatic sources such as rivers, brackish waters, and estuaries, often in association with copepods or other zooplankton, shellfish, and aquatic plants. [52]

Cholera infections are most commonly acquired from drinking water in which V. cholerae is found naturally or into which it has been introduced from the feces of an infected person. Cholera is most likely to be found and spread in places with inadequate water treatment, poor sanitation, and inadequate hygiene. Other common vehicles include raw or undercooked fish and shellfish. Transmission from person to person is very unlikely, and casual contact with an infected person is not a risk for becoming ill. [53] V. cholerae thrives in an aquatic environment, particularly in surface water. The primary connection between humans and pathogenic strains is through water, particularly in economically reduced areas that do not have good water purification systems. [41]

Nonpathogenic strains are also present in water ecologies. The wide variety of pathogenic and nonpathogenic strains that co-exist in aquatic environments are thought to allow for so many genetic varieties. Gene transfer is fairly common amongst bacteria, and recombination of different V. cholerae genes can lead to new virulent strains. [54]

A symbiotic relationship between V. cholerae e Ruminococcus obeum has been determined. R. obeum autoinducer represses the expression of several V. cholerae virulence factors. This inhibitory mechanism is likely to be present in other gut microbiota species which opens the way to mine the gut microbiota of members in specific communities which may utilize autoinducers or other mechanisms in order to restrict colonization by V. cholerae or other enteropathogens.

Outbreaks of Cholera cause an estimated 120,000 deaths annually worldwide. There has been roughly seven pandemics since 1817, the first. These pandemics first arose in the Indian subcontinent and spread. [41]

Two serogroups of V. cholerae, O1 and O139, cause outbreaks of cholera. O1 causes the majority of outbreaks, while O139 – first identified in Bangladesh in 1992 – is confined to Southeast Asia. Many other serogroups of V. cholerae, with or without the cholera toxin gene (including the nontoxigenic strains of the O1 and O139 serogroups), can cause a cholera-like illness. Only toxigenic strains of serogroups O1 and O139 have caused widespread epidemics.

V. cholerae O1 has two biotypes, classical and El Tor, and each biotype has two distinct serotypes, Inaba and Ogawa. The symptoms of infection are indistinguishable, although more people infected with the El Tor biotype remain asymptomatic or have only a mild illness. In recent years, infections with the classical biotype of V. cholerae O1 have become rare and are limited to parts of Bangladesh and India. [55] Recently, new variant strains have been detected in several parts of Asia and Africa. Observations suggest these strains cause more severe cholera with higher case fatality rates.


Assista o vídeo: Vibrio cholerae. (Dezembro 2021).