Em formação

Receita do buffer de transferência de alta corrente (velocidade)


Alguém conhece uma mistura de buffer eficaz para usar em transferências Western de alta corrente? Estamos usando com sucesso o tampão pré-misturado do fornecedor para transferir uma ampla gama de tamanhos de proteínas para membranas de PVDF a 1A / 25V por 10 min. Obtivemos ótimos resultados com o buffer caro do fornecedor.

Não consegui encontrar uma receita não patenteada que funcionasse. Os melhores que temos mantêm os 25 V, mas depois têm uma diminuição da condutividade (aumento da resistência) onde começarão em 1A, mas cairão para 0,4A no final dos 10 min. O buffer do fornecedor parece manter a alta corrente e resulta em melhores transferências.

Não sei se será útil listar todas as variações que tentei em detalhes, mas eles giraram em torno da modificação de um buffer Towbin tradicional mais SDS, mais glicina / Tris ou MgCl2. Todas essas foram várias sugestões de pessoas do departamento, mas não encontrei muitas evidências publicadas de um amortecedor nessas condições.

Sei que 1A (e não, não quero dizer 1mA) é muita corrente, mas o sistema do fornecedor funciona muito bem. Quaisquer sugestões sobre o que eu poderia tentar / adicionar seriam apreciadas, mesmo se você não tiver um protocolo elaborado.

Editar: as informações do MSDS indicam que tem 3 reagentes:

Lista de componentes perigosos e não perigosos: Reagente proprietário K 10-20% Reagente proprietário EB II 5-10% Reagente proprietário S 1,0-2,5% 7732-18-5 água 50-100% ·… Conteúdo do solvente: Solventes orgânicos: 0,0 % Água: 74,8% Conteúdo de sólidos: 25,2%

[Não tenho certeza se esta informação de MSDS deve ser colocada aqui, só porque estou procurando por alguém que já usou um buffer de alta corrente para o qual conhece a formulação, e não uma adivinhação do que eu tenho.]


Então, depois de muito trabalho em otimização, pensei em postar o que funcionasse melhor para mim. Esta receita de tampão foi capaz de transferir com sucesso EGFR e insulina do mesmo lisado, e uma banda clara para ambos (proteína grande e pequena, respectivamente). Os géis SDS-PAGE 10% foram transferidos a 1A durante 10 min.

Buffer de transferência de alta corrente

  1. 48 mM Tris
  2. 15 mM HEPPS
  3. EDTA 1,0 mM
  4. NaHSO3 1,3 mM
  5. 1,3 mM N, N-dimetilformamida
  6. 25 Mm gLY-GLY
  7. 20% de metanol (v / v)

Espero que isso possa ajudar alguém, e quero colocar Garic et al como um excelente ponto de partida. A publicação deles foi feita depois que eu fiz a pergunta, como @ user4148 apontou.


O tampão SB já existe há um bom tempo, e eu definitivamente já o usei com sucesso antes para os tampões de gel de agarose e PAGE por algum tempo. A única coisa é que você tem que executar o gel em uma sala fria (alta voltagem é igual a alta temperatura) e que você deve otimizar o tempo e as condições para que suas amostras não escorram do gel.


Receita de buffer de transferência de alta corrente (velocidade) - Biologia

WAYNE L. RICKOLL,. ELIZABETH S. HAYES, em Ecdysone, 1986

Eletroforese em gel (SDS – PAGE)

Alíquotas dos extratos de tampão de lise NP-40 foram misturados com tampão de lise NP-40-ureia com a proporção de proteína para tampão de lise NP-40-ureia mantida constante para cada amostra (2 μg de proteína / tampão de μl). A eletroforese bidimensional (2D) foi realizada conforme descrito por O & # x27Farrell (1975). Quantidades iguais de radioatividade (1 × 10 6 cpm) foram carregadas em todos os géis a serem comparados. A segunda dimensão SDS-PAGE foi executada em uma placa de gel de gradiente de acrilamida de 7,5-17,5%, usando um gel de empilhamento de acrilamida 4,5%.

Os extratos de tampão de lise NP-40 também foram analisados ​​em 7,5% SDS-PAGE. Para comparar cada amostra, alíquotas de extratos de tampão de lise NP-40 contendo quantidades iguais de radioatividade foram adicionadas ao tampão de amostra de SDS. A proporção de proteína para tampão de amostra de SDS (tampão de 2 μg / μl) foi mantida constante para cada amostra. Todos os géis foram secos e a autorradiografia foi realizada a -70 ° C usando telas de realce (Dupont Lightning Plus) e filme de raios-X Kodak SB-5. Pelo menos três marcações e separações independentes foram realizadas em células tratadas com hormônio e não tratadas.


Introdução

O lentivírus derivado do vírus da imunodeficiência humana (HIV) pertence à família Retroviridae 1. É caracterizada por incorporar RNA viral no DNA de células em divisão e não em divisão. Para produzir um lentivírus que seja capaz de infectar células hospedeiras, três tipos de vetores devem ser coexpressos em células produtoras de vírus (normalmente células HEK293T): um vetor de backbone contendo o transgene de interesse e regiões 3′-LTR auto-inativadoras, um construto que expressa proteínas de estrutura viral e um vetor que codifica a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVG) para encapsulamento 2. A última geração do sistema lentivírus separa ainda mais o gene Rev de outros genes estruturais, oferecendo maior biossegurança ao reduzir a possibilidade de recombinação reversa 3. Hoje em dia, a tecnologia lentivírus se tornou uma das ferramentas mais eficientes para entregar genes exógenos em vários tipos de células, tanto em vitro e na Vivo 4,5,6,7 .

A purificação de lentivírus de alto título (& gt10 7 TU / ml) a partir de um grande volume de meio contendo vírus é crucial para a aplicação de lentivírus. A concentração de rotina do lentivírus requer ultracentrifugação com força centrífuga relativa (RCF), normalmente excedendo 90.000 g 8,9,10,11,12,13, para remover impurezas e garantir uma alta taxa de infecção, especialmente para na Vivo formulários. Isso pode ser alcançado apenas por uma ultracentrífuga, que não é um instrumento comum em um laboratório. Além disso, a capacidade da centrifugação de baixa velocidade para produzir um vírus de alto título não foi completamente investigada. Assim, a relação entre RCF e a eficiência de concentração do lentivírus foi avaliada sistematicamente e os presentes dados mostraram que a centrifugação de gradiente de sacarose com uma velocidade relativamente baixa (≤10.000 g) produz um vírus de alto título que é comparável a um vírus disponível comercialmente purificado com ultracentrifugação em rendimento e título. Além disso, a concentração ideal de sacarose é de 10%. Assim, um protocolo eficiente para a purificação de lentivírus de alto título que é facilmente alcançado com uma centrífuga de laboratório regular é descrito.


Siga o protocolo de transferência úmida Western Blot

1 Execute as amostras em SDS-PAGE como de costume.
2 Prepare e marque a membrana (tamanho certo, membrana de PVDF ou nitrocelulose) com um lápis, depois mergulhe em metanol por alguns minutos e enxágue com água destilada.
3 Equilibre a membrana, as almofadas, os papéis de filtro (4 peças) e a espuma de transferência em tampão de transferência (armazene a 4 ° C) por 5 minutos.
4 Monte o sanduíche de transferência na seguinte ordem: moldura preta (eletrodo negativo) & gt & gt espuma & gt & gt 3 pedaços de papel de filtro & gt & gt SDS-PAGE gel & gt & gt membrana & gt & gt 3 pedaços de papel de filtro & gt & gt espuma & gt & gt moldura vermelha (eletrodo positivo). Faça o lado marcado da membrana ficar de frente para o gel. Coloque-o no tanque de transferência.

Fig 2. Imagem esquemática do sanduíche de transferência úmida Western Blot
5 Transfira o gel a 80 V por 90 minutos em câmara fria. Como alternativa, use o saco de gelo e a barra de agitação magnética para transferir o gel à temperatura ambiente.
6 Desmonte o pacote de gel e use um lápis para marcar as marcas dos poços na membrana.

REAGENTES E SOLUÇÕES

Placas médias ½ MS

  • 0,5 × meio Murashige & Skoog incluindo vitaminas (Duchefa Biochemie, cat. No. M0255)
  • 15 g / L de sacarose
  • Ajuste o pH para 5,7 com KOH
  • 3 g / L Phytagel (Sigma, cat. No. P8169)
  • Autoclave a 121 ° C por 15 min
  • Resfrie a ∼60 ° C e despeje em pratos
  • Armazenar ≤6 meses a 4 ° C

Solução de descoloração Coomassie Brilliant Blue R-250

Solução de coloração Coomassie Brilliant Blue R-250

  • 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250
  • 25% (v / v) de isopropanol
  • 10% (v / v) de ácido acético
  • Armazenar ≤1 ano à temperatura ambiente

Tampão de extração de proteína nativa

  • 1 × Tampão de amostra NativePAGE ™ (Thermo Fisher Scientific, cat. No. BN2008)
  • 1 × inibidores de protease (Roche, cat. Nº 5056489001)
  • 1% (w / v) n-dodecil-β-D-maltosídeo (DDM Thermo Fisher Scientific, cat. No. BN2005)
  • Prepare fresco imediatamente antes de usar

Solução salina tamponada com fosfato com Tween 20 (PBST)

  • 1,8 mM KH2PO4
  • Na 10 mM2HPO4
  • KCl 2,7 mM
  • NaCl 137 mM
  • Ajuste o pH para 7,2 com NaOH 1 M
  • Esterilizar em autoclave
  • Armazene ≤6 meses à temperatura ambiente
  • Adicionar Tween 20 a 0,1% (v / v) imediatamente antes de usar

Tampão de carga de proteína, 4 ×

  • Tris · HCl 200 mM, pH 6,8
  • 8% (w / v) SDS
  • 40% (v / v) de glicerol
  • 0,032% (w / v) de azul de bromofenol
  • Armazenar ≤1 ano à temperatura ambiente
  • Diluir para 1 × e adicionar 100 mM DTT antes de usar

PROTOCOLO ALTERNATIVO 1

TELA ADITIVA PARA OTIMIZAR A ESTABILIDADE DA PROTEÍNA

Este protocolo secundário é ideal para a triagem de uma ampla variedade de aditivos, uma vez que um buffer otimizado foi identificado no Protocolo Básico.

Materiais

Mesmos materiais do Protocolo Básico 1

Bloco de poço profundo de 96 poços contendo tela de aditivo 5 & # x000d7 de escolha (ver Tabela 2)

Mesa 2

Composição da tela de aditivo de 96 poços

Nós vamosAditivoNós vamosAditivo
A1aguaE1EDTA 5 mM
A2aguaE2Fluoreto de sódio 100 mM
A3aguaE3Fluoreto de potássio 100 mM
A4aguaE4Cloreto de lítio 100 mM
A5Ureia 100 mME5Cloreto de potássio 100 mM
A6Ureia 250 mME6Cloreto de amônio 100 mM
A7Ureia 500 mME7100 mM de iodeto de sódio
A81 M de uréiaE8Iodeto de potássio 100 mM
A9Guanidina HCl 25 mME9Brometo de sódio 100 mM
A1050 mM de guanidina HClE10Cloreto de magnésio 10 mM
A11100 mM de guanidina HClE11Cloreto de cálcio 10 mM
A12250 mM de guanidina HClE12Cloreto de manganês 5 mM
B1500 mM de guanidina HClF1Cloreto de níquel 5 mM
B21% (v / v) DMSOF2Cloreto de ferro (III) 5 mM
B32% (v / v) DMSOF3Cloreto de zinco 5 mM
B42,5% (v / v) de glicerolF4Cloreto de cobalto 5 mM
B55% (v / v) de glicerolF5Formato de sódio 100 mM
B610% (v / v) de glicerolF6Acetato de sódio 100 mM
B715% (v / v) de glicerolF7100 mM de malonato de sódio
B820% (v / v) de glicerolF8Nitrato de sódio 100 mM
B92,5% (v / v) de D-glicoseF9100 mM de tiocianato de sódio
B105% (v / v) de D-glicoseF10Sulfato de sódio 100 mM
B112,5% (v / v) de sacaroseF11Sulfato de amônio 100 mM
B125% (v / v) de sacaroseF12Cloreto de amônio 100 mM
C12,5% (v / v) PEG400G1AMP 2 mM + MgCl 5 mM2
C25% (v / v) PEG400G2ADP 2 mM + MgCl 5 mM2
C32,5% (w / v) PEG1000G3ATP 2 mM + MgCl 5 mM2
C45% (w / v) PEG1000G4AMPPNP 2 mM + MgCl 5 mM2
C52,5% (w / v) PEG4000G5CAMP 2 mM + MgCl 5 mM2
C65% (w / v) PEG4000G6PIB 2 mM + MgCl 5 mM2
C72,5% (v / v) EtilenoglicolG7GTP 2 mM + MgCl 5 mM2
C85% (v / v) EtilenoglicolG82 mM cGMP + 5 mM MgCl2
C91 mM de octil glucosídeoG9NAD 2 mM + MgCl 5 mM2
C10CHAPS 2 mMG10NADH 2 mM + MgCl 5 mM2
C1110 mM L-ProlineG11Betaína 10 mM
C1250 mM L-GlicinaG121 mM de espermina
D1L-Histidina 25 mMH11 mM de espermidina (adicionar fresco a cada vez)
D250 mM L-ArgininaH210 mM & # x003b2-mercaptoetanol (adicionar novo a cada vez)
D350 mM L-GlutamatoH35 mM DTT (adicionar novo a cada vez)
D450 mM L-Arg / 50 mM L-GluH42 mM TCEP (adicionar novo a cada vez)
D525 mM L-GlutaminaH5aberto para aditivos determinados pelo usuário
D650 mM L-LisinaH6aberto para aditivos determinados pelo usuário
D750 mM de L-cisteínaH7aberto para aditivos determinados pelo usuário
D8Taurina 50 mMH8aberto para aditivos determinados pelo usuário
D9Imidazol 50 mM pH 7,6H9aberto para aditivos determinados pelo usuário
D10Imidazol 100 mM pH 7,6H10aberto para aditivos determinados pelo usuário
D11Imidazol 250 mM pH 7,6H11aberto para aditivos determinados pelo usuário
D12Imidazol 500 mM pH 7,6H12aberto para aditivos determinados pelo usuário

As concentrações listadas representam a concentração final no ensaio de desvio térmico.

Os estoques devem ser feitos na concentração de 5 & # x000d7.

Nota: Traga 5 & # x000d7 tela aditiva até a temperatura ambiente de armazenamento 4 & # x000b0C antes de usar (

Adicione o suficiente do tampão otimizado (na concentração de 1 & # x000d7, identificada na tela de otimização do tampão inicial acima) ao estoque de proteína em um tubo cônico de 15 ml para obter um volume final de 5 ml, o suficiente para rastrear uma placa de ensaio de 96 poços. Adicionar 4 & # x000b5l de corante SYPRO Orange (concentração de estoque: 5000 & # x000d7). As concentrações finais de proteína e corante na mistura devem ser 5 & # x000b5M e 2 & # x000d7, respectivamente.

Misture bem invertendo o tubo várias vezes e coloque a solução em um reservatório de pipeta multicanal. Use uma pipeta multicanal para transferir 40 & # x000b5l de solução para cada poço da placa de ensaio.

Centrifugue a temperatura ambiente 5 & # x000d7 placa de peneira aditiva a 800 & # x000d7 g por 2 min a 25 & # x000b0C.

Retire com cuidado a película de vedação de alumínio adesiva. Use a pipeta multicanal para adicionar 10 & # x000b5l dos estoques de tela de aditivo 5 & # x000d7 do bloco de 96 poços de profundidade para a placa de ensaio. Misture o conteúdo do poço usando a mesma pipeta e pontas pipetando para cima e para baixo várias vezes.

Projete sua tela de aditivo de 96 poços de modo que haja pelo menos quatro poços sem aditivos (ou seja, água apenas nos poços A1 & # x02013A4 na placa de tela de aditivo de 96 poços) para avaliar a mudança térmica dos aditivos em relação ao tampão otimizado.

Cubra a placa de ensaio com uma folha de adesivo opticamente transparente e sele cuidadosamente cada poço. Selar novamente a tela aditiva com folha de alumínio adesiva e armazenar a 4 & # x000b0C.

Centrifugue a placa de ensaio a 800 & # x000d7 g por 2 min a 25 & # x000b0C para coletar soluções no fundo e remover bolhas dos poços.

Coloque a placa de ensaio no instrumento de PCR em tempo real e inicie um programa de gradiente de temperatura para desnaturação térmica da proteína.

Determine a mudança térmica (& # x00394Tm) de todas as condições relativas ao controle & # x02018no aditivo & # x02019 para identificar aditivos que promovem a estabilização da proteína.


Preparação de coluna e mídia

Equilibre a coluna com 5–10 volumes de coluna de tampão inicial ou até que a linha de base, o pH do eluente e a condutividade estejam estáveis.

O uso de colunas pré-empacotadas é altamente recomendado para garantir o melhor desempenho e resultados reproduzíveis. Uma coluna empacotada uniformemente garante que os picos dos componentes não sejam desnecessariamente alargados à medida que a amostra passa pela coluna para que a melhor resolução possa ser alcançada.

Permita que buffers, mídia ou colunas pré-embaladas atinjam a mesma temperatura antes de usar. Mudanças rápidas de temperatura, por exemplo, remover colunas empacotadas de uma câmara fria e então aplicar tampão em temperatura ambiente, podem causar bolhas de ar na embalagem e afetar a separação.

Lave as soluções de armazenamento e conservantes antes de usar qualquer meio IEX.

Aumente os volumes usados ​​para o equilíbrio da coluna antes da primeira execução se estiver usando tampões contendo detergentes ou um contra-íon diferente daquele no qual o meio foi armazenado.

O Apêndice 3 fornece detalhes sobre o empacotamento da coluna. O volume necessário para o leito compactado é determinado pela quantidade de amostra a ser purificada e a capacidade de ligação do meio. Embale uma coluna que terá aproximadamente 5 vezes o excesso da capacidade de ligação necessária com uma altura de cama de até 20 cm.

Verifique o desempenho da coluna regularmente, determinando a eficiência da coluna e a simetria de pico. Apêndice 3. Observe que isso não se aplica às colunas HiTrap ou HiPrep ™.


Protocolo para S30-ribossomo-lisado

(adaptado de Kigawa et al. (2004), Preparação de extrato de células de Escherichia coli para expressão de proteína livre de células altamente produtivas, J. Struct. Fun. Gen., 5, 63-68)

Cepa de E. coli: BL21 (DE3), BL21 (DE3) CodonPlus RIL ou variantes (não pLysS!)

! cerca de 7 ml de lisado de ribossomo S30 podem ser isolados de 1 litro de cultura!

Por litro de meio:

5,6 g KH2PO4
28,9 g K2HPO4
10 g extracto de levedura
15 mg Tiamina adicionar após esterilização (filtrado estéril)
40 ml 25% de glicose adicionar após esterilização (filtrado estéril)

Todos os tampões e soluções estoque devem ser preparados com H2O tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) (livre de DNAse / RNAse).
Toda a solução estoque pode ser armazenada a -20 e degC por semanas, exceto a creatina quinase. A creatina quinase tem de ser dissolvida em Glicina 30 mM, pH = 9,0 + DTT 20 mM. Após o congelamento em nitrogênio líquido, é estável @ -80 & degC por semanas.
Todos os aminoácidos individuais devem ser dissolvidos conforme descrito na embalagem. A mistura contém 5 mM de cada aminoácido com um pH de 7,5 ajustado com KOH.


PrimerDigital

O procedimento é adequado para todos os tipos de tecidos de uma grande variedade de animais, sangue, espécies de plantas e solo.
O protocolo a seguir é projetado para amostras de tecido pequenas e grandes (volume de tecido 100-200 μl).
Observe que o isolamento do DNA genômico não requer mistura suave porque o DNA não pode ser cortado por vórtice.

Kalendar R, Boronnikova S, Seppänen M 2021. Isolamento e purificação de DNA de amostras biológicas complicadas. Métodos em biologia molecular, 2222: 57-67. DOI: 10.1007 / 978-1-0716-0997-2_3

Protocolo CTAB para o isolamento de DNA

  • CTAB solução: 2% CTAB, 1,5 M NaCl, 10 mM Na3EDTA, ácido HEPES 0,1 M
    100 ml: 2 g CTAB, 2,4 g HEPES-ácido, 2 ml 0,5 M Na3EDTA, 30 ml de NaCl 5 M
  • Mistura de clorofórmio-álcool isoamílico (24: 1)
  • 100% isopropanol (álcool isopropílico, 2-propanol)
  • Etanol 70%
  • 1xTE (EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0)
  1. Tubo de microcentrífuga Eppendorf Safe-Lock de 2 ml com amostra de tecido e esfera de vidro (6 mm), triturar no Moinho Misturador MM300 por 2-10 min a 30 Hz.
  2. Em tubo de 2 ml com sementes / folhas / herbário rompidas mecanicamente ou solução de DNA (CTAB purificação) adicionar 1 ml CTAB solução tampão, misture no MM300 Mixer Mill por 2 min a 30 Hz e incube as amostras a 65 & degC durante 1 hora.
  3. Gire em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 2 minutos, transferiu a solução clarificada para um novo tubo de microcentrífuga de 2 ml que contém um volume igual de clorofórmio.
  4. Misture muito bem por 3 minutos no MM300 Mixer Mill a 30 Hz.
  5. Girar em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 2 minutos, transferir a camada aquosa superior para um novo tubo de microcentrífuga de 2 ml que contém 600 μl de 2-propanol, agitar bem e centrifugar os tubos em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 2 minutos.
  6. Descarte o sobrenadante e lave o sedimento adicionando 1,8 ml de EtOH 70%, agite muito bem no vórtice. Centrifugue na velocidade máxima por 2 min e descarte o etanol.
  7. O pellet de DNA não secou e se dissolveu imediatamente em 300 & mul 1xTE, pH 8,0 a 55 & degC por 5-10 minutos.

Protocolo CTAB para o isolamento de DNA de tecidos difíceis (altos níveis de metabólitos secundários ou polissacarídeos), herbário e solo

  • CTAB solução: 3% CTAB, 1,5 M NaCl, 10 mM Na3EDTA, ácido MOPS 0,1 M
    100 ml: 3 g CTAB, 2,1 g MOPS-ácido, 2 ml 0,5 M Na3EDTA, 30 ml de NaCl 5 M
  • Mini coluna spin: HiBind® (Omega Bio-tek) ou NucleoSpin® (MN) ou compatível com os seguintes kits Qiagen: Qiaprep Spin Mini, QiaQuick Gel Extraction, QiaQuick PCR Clean-up, DNeasy Plant DNA
  • Tampão QG (tiocianato de guanidina 5,5 M, Tris-HCl 20 mM pH 6,6)
  • Tampão de lavagem de DNA PE (80% de etanol, 20 mM de NaCl, 2 mM de Tris-HCl, pH 7,5)
  • 96% de etanol
  • Tampão de eluição (EDTA 0,5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0)
  1. Tubo de microcentrífuga Eppendorf Safe-Lock de 2 ml com amostra de herbário (a massa da amostra não deve exceder 50 mg) e bola de vidro (6 mm) triturada no MM300 Mixer Mill por 15 min a 30 Hz.
  2. Adicionar 1 ml CTAB solução tampão, vortex para misturar bem e incubar as amostras a 65 e degC durante 1-2 ou mais horas.
  3. Girar em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 2 minutos, transferiu a solução clarificada para um novo tubo de microcentrífuga de 2 ml contendo um volume igual de etanol 96% (50-100% do volume da solução CTAB). Vortex para misturar bem.
  4. Insira uma coluna HiBind DNA Mini em um tubo de coleta de 2 ml. Transfira até 700 μl de amostra da etapa 3 para a coluna HiBind DNA Mini. Centrifugue em velocidade máxima por 30 segundos em temperatura ambiente.
  5. Usando o mesmo tubo de coleta, repita a etapa anterior até que toda a solução de mistura CTAB tenha passado pela coluna HiBind DNA Mini. Centrifugue na velocidade máxima por 30 seg. Descarte o filtrado e o tubo de coleta.
  6. Adicione 500 μl de etanol a 96%. Centrifugue na velocidade máxima por 30 seg. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
  7. Adicione 500 μl de tampão QG. Centrifugue na velocidade máxima por 30 seg. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
  8. Adicione 700 μl de tampão de lavagem de DNA PE. Centrifugue na velocidade máxima por 30 seg. Descarte o filtrado e reutilize o tubo de coleta.
  9. Usando o mesmo tubo de coleta, repita a etapa anterior para a segunda etapa de lavagem do tampão de lavagem de DNA. Centrifugue à velocidade máxima por 1 minuto.
  10. Transfira a coluna HiBind DNA Mini para um tubo limpo de 1,5 ml. Adicione 200 μl de tampão de eluição e aqueça a 55 ° C por 10 minutos.
  11. Centrifugue na velocidade máxima por 1 minuto. Armazene o DNA eluído a -20 ° C.

Método de Proteinase K para protocolo de extração de DNA

  1. Em tubo Eppendorf Safe-Lock de 2 ml com tecidos animais ou vegetais mecanicamente interrompidos, adicione 500 μl frescos de tampão de extração (tiocianato de guanidina 0,8 M, EDTA 10 mM, Tween 20 5%, Triton X-100 0,5%, ácido HEPES 50 mM * ) com 200 & caneca de proteinase K, vortex muito bem e incubar as amostras a 55 & degC por várias horas ou melhor durante a noite a 37 & deg-55 & degC (quanto mais tempo melhor, até dissolver o tecido) com vórtice ocasional.
  2. Adicionar 700 μl de clorofórmio, agitar muito bem por 1 minuto criando uma emulsão (no Moinho Misturador MM300 a 30 Hz) opcionalmente: incubar as amostras a 55 & degC durante 30 min.
  3. Gire em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 5 minutos.
  4. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 ml contendo 500 µl de 2-propanol e 100 µl de acetato de Na 3M, agite bem no vórtice e centrifugue os tubos em velocidade máxima em uma microcentrífuga por 4 minutos.
  5. Descarte o sobrenadante e adicione 1,8 ml de etanol a 70% no tubo e centrifugue bem o tubo em vórtice por 5 minutos a 14000 rpm e descarte novamente o sobrenadante.
  6. Não seque o pellet de DNA e dissolva imediatamente em 300 μl de 1xTE, pH 8,0 (com RNAse A) a 55 & degC por 10-20 minutos.

Protocolos

Direito autoral

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Oito dicas principais para imunoprecipitação

A imunoprecipitação, ou IP, é uma técnica bem estabelecida para o isolamento de proteínas de, bem, uma mistura um tanto caótica de muitas outras proteínas em solução. A solução pode ser qualquer coisa, desde um homogeneizado de tecido a um lisado celular, mas o objetivo permanece o mesmo: o isolamento de uma proteína específica e nada mais - ou pelo menos muito pouco mais (como no caso da co-imunoprecipitação). Existem até protocolos adaptados do procedimento de proteína IP para o isolamento de cromatina (ChIP) e RNA (RIP), mas nesta postagem do blog iremos nos concentrar apenas na versão da proteína e fornecer dicas sobre como realizar melhores experimentos de IP.

1. Preparação do lisado

Existe um velho ditado em inglês: você só obtém o que aplica, e esse ditado é verdadeiro para experimentos de IP. Você deseja começar com uma quantidade razoável de material, visando entre 1 e 3 mg de proteína total para cada 0,2-0,5 ml de seu volume de amostra inicial. Você também deve ter como objetivo manter sua proteína-alvo o mais feliz possível durante todo o procedimento perturbador de lise de células ou tecidos. É realmente um ato de equilíbrio: o tampão de lise ideal deixará as proteínas em suas conformações nativas e minimizará a desnaturação dos locais de ligação do anticorpo, mas também liberará proteína suficiente para você capturar e analisar. O laboratório Proteintech geralmente usa tampão RIPA, que permite lise celular eficiente e solubilização de proteínas, evitando a degradação de proteínas e interferência com a imunorreatividade e atividade biológica das proteínas. Usar o tampão RIPA resulta em baixo background no IP e é particularmente útil para a ruptura da membrana nuclear para extratos nucleares, mas pode desnaturar as quinases, portanto, observe se a atividade da quinase é seu objetivo! E não se esqueça de adicionar um inibidor de protease (e um inibidor de fopsatase se você estiver olhando para fosforilação!)

Você pode encontrar nossa receita de buffer RIPA aqui. Se você está procurando uma alternativa ao tampão RIPA, nosso principal conselho é ir devagar com o sal e os detergentes, se possível! Limite-se a buffers experimentados e testados (você pode encontrar muitas receitas em fóruns científicos) e se precisar ajustar um pouco suas receitas de buffer, siga os intervalos abaixo recomendados por Harlow e Lane, página 231 (veja o quadro abaixo).

2. Escolha o seu anticorpo com sabedoria

Em geral, você deve considerar o uso de um anticorpo policlonal, sempre que possível, para a captura de sua proteína-alvo. figura 1 fornece uma boa explicação visual de por que esse é o caso, mas, em geral, você pretende estabelecer um complexo imune antígeno-anticorpo no início do procedimento IP. Como os policlonais se ligam a vários epítopos na proteína alvo, eles retêm uma quantidade maior dela. Como o objetivo é remover quaisquer proteínas e constituintes indesejados posteriormente, as taxas de retenção precisam ser bem altas para não lavar sua amostra também! Portanto, um policlonal de boa qualidade deve ser sua primeira escolha para um procedimento IP.

Figura 1: Policlonal vs Monoclonal como anticorpos de captura. Os policlonais formam complexos imunes de ligação mais rígida com taxas de retenção mais altas.

A vasta gama de policlonais da Proteintech são ideais para IP, pois não apenas se encaixam na descrição do trabalho acima, mas também são bons em reconhecer epítopos intactos nativos. Os epítopos nativos ainda manterão suas confirmações tridimensionais e, como os anticorpos Proteintech são gerados contra proteínas inteiras, eles fazem o trabalho de reconhecer proteínas inteiras e intactas na amostra de IP bastante bem. (Dito isso, é uma boa ideia usar um anticorpo monoclonal para detecção no estágio de Western blotting (WB), mas vamos falar disso mais tarde!)

3. Para pré-limpar ou não pré-limpar

A pré-limpeza é uma etapa que evita que quaisquer proteínas, lipídios, carboidratos ou ácidos nucleicos não específicos que você não deseja se liguem ao suporte sólido que você está usando em seu experimento de IP. A etapa é realizada por incubação do lisado com o suporte sólido (por exemplo, grânulos de agarose) na ausência do anticorpo de captura. O suporte sólido usado para a pré-limpeza e, portanto, qualquer coisa ligada a ele, é então descartado. Esta etapa depende do tipo de suporte sólido. Também se trata de quão bom é o seu anticorpo de detecção e quanto de sua proteína de interesse pode estar no lisado. Alguns suportes sólidos são mais propensos a se ligar não especificamente a certas proteínas, então verifique as recomendações do fabricante primeiro, você pode pular a pré-limpeza.

Há também uma técnica de pré-limpeza que envolve a adição de um anticorpo não específico do mesmo isotipo do anticorpo de captura - isso pode ser feito para remover qualquer coisa que também possa se ligar não especificamente ao anticorpo de captura durante a precipitação.

Em geral, não pré-limpamos lisados ​​no laboratório da Proteintech ao realizar nossas validações de IP, pois a pré-limpeza é difícil de controlar quando você está realizando um grande número de IPs regularmente (consulte também a parte sobre a qualidade de o anticorpo de detecção acima). Nem sempre é necessário e requer uma avaliação cuidadosa da quantidade de reagentes de pré-limpeza necessários para evitar a perda desnecessária de amostra.

4. Lavagem e eluição - lembre-se de como você vai!

O efeito da centrifugação no resultado de um experimento IP é frequentemente subestimado. A centrifugação do complexo imune em uma velocidade muito alta interromperá as interações anticorpo-antígeno no complexo imune e causará perda de amostra antes da eluição. Por esse motivo, recomendamos que a centrifugação seja totalmente omitida das etapas de lavagem e eluição. Em vez disso, execute a lavagem e obtenha eluições usando fluxo gravitacional através de colunas de filtro carregadas em tubos de microcentrífuga.

5. Amostras eluídas vs amostras fervidas

As medidas tradicionais para melhorar as relações sinal-ruído visam reter o máximo possível de proteína alvo em detrimento da separação eficiente de imunocomplexos nos estágios finais de IP. As etapas tomadas para este fim geralmente envolvem a omissão de agentes redutores do tampão de eluição ou a etapa de ebulição antes da SDS-PAGE. Às vezes, a eluição é totalmente omitida, e as amostras ainda ligadas à fase sólida são fervidas após as fases de lavagem (ver Figura 2A ) Os resultados são WBs que podem ter melhorado o sinal do alvo, mas grandes quantidades de coloração não específica contribuíram com a presença da fase sólida (ver Figura 2 ) Recomendamos fortemente que você não faça isso e elua suas amostras do suporte sólido antes de carregar o gel.

Figura 2: Mostra a comparação de amostras em ebulição (ainda fixadas ao suporte sólido) imediatamente após a lavagem (A) e após a eluição (B) usando tampão PH 2 (glicina 150 mM, NaCl 500 mM) e neutralizadas antes de carregar em um gel SDS-PAGE . O anticorpo de captura e detecção foi anti-NFKBIA (cat. No. 10268-1-P), a detecção secundária foi feita usando Proteína A conjugada com HRP (consulte a seção sobre métodos de detecção alternativos). Lisado celular: HeLa.

6. Guarde suas frações!

É aconselhável manter todas as suas frações de IP (incluindo amostras de qualquer pré-limpeza que você realizar) para analisar por SDS-PAGE mais tarde, caso suas tentativas iniciais de imunopreciptação sejam malsucedidas.

7. Pares de anticorpos

O uso de pares de anticorpos, ou seja, um anticorpo de captura de uma espécie e um anticorpo para detecção de WB de outra, é um fator adicional a considerar ao planejar um experimento de IP. O processo de seleção de anticorpos envolvido deve garantir que ambos os anticorpos reconheçam epítopos diferentes da proteína alvo, além de serem originários de espécies diferentes. O tipo de anticorpo (isto é, policlonal ou monoclonal) também é importante. Sugerimos uma combinação de um anticorpo de captura policlonal e um anticorpo monoclonal para detecção, sempre que possível, isso garante a máxima eficiência de captura com alta especificidade de detecção. Veja o exemplo em Figura 3 .

Figura 3: Comparação do uso de um anticorpo de captura policlonal (10782-2-AP) e um anticorpo de detecção monoclonal (60019-1-Ig) (A) com o mesmo anticorpo (10782-2-AP) para captura e detecção (B ) A detecção secundária foi realizada usando HRP-cabra anti-rato (A) e HRP-cabra anti-coelho (B). O lisado celular usado foi o lisado de células inteiras K-562.

8. Experimente um método de detecção alternativo!

Qualquer pessoa que já fez um experimento de IP antes saberá que a cadeia pesada (HC) e a cadeia leve (LC) do anticorpo de captura podem interferir com seu sinal alvo. Este é um artefato inevitável de ter que usar o mesmo anticorpo para captura e detecção, e então usar um anticorpo específico da espécie em cima daquele para detecção secundária.

Referências

Harlow, Ed e David Lane. Usando anticorpos. Cold Spring Harbor, Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28, New York: John Wiley, 2001.


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