Em formação

Laboratório de vírus - Biologia


Objetivos do Laboratório

Na conclusão do laboratório, o aluno deve ser capaz de:

  • Compreenda as propriedades de um vírus
  • Explique como os vírus se espalham por uma população, compartilhando fluidos corporais

Vírus a partir de Lumen Learning

UMA vírus não é considerado um organismo vivo, pois contém apenas DNA envolto por um revestimento de proteína. No entanto, os vírus são agentes infecciosos graves que causam doenças como AIDS, catapora e herpes. Os vírus devem ter uma célula hospedeira viva para se reproduzir. O vírus assume a maquinaria de construção de proteínas da célula para criar novos vírus para espalhar a infecção. Os vírus podem infectar muitos tipos diferentes de organismos, tanto procarióticos quanto eucarióticos.
Uma forma de um vírus se espalhar por uma população é compartilhando fluidos corporais, como saliva, sangue ou sêmen. Vamos demonstrar a rapidez com que um vírus pode se espalhar por meio da atividade de simulação de hoje.

Compartilhando fluidos corporais

Durante este laboratório, você compartilhará “fluidos corporais” com outros alunos do laboratório para simular a propagação de uma doença infecciosa em uma população.

Procedimento

  1. Obtenha um frasco numerado de solução e uma pipeta de plástico com seu instrutor.
  2. Registre o nome do aluno e o número do frasco na folha de dados da classe.
  3. Compartilhe fluidos corporais com outra pessoa no laboratório. Use a pipeta de plástico para retirar a solução do seu frasco e coloque 5 gotas da sua solução no frasco de outro colega. Seu colega de classe também compartilhará fluidos com você da mesma maneira. Volte a colocar a tampa no frasco e inverta para misturar.
  4. Registre o nome da pessoa com quem você compartilhou fluidos corporais na tabela abaixo.
  5. Troque fluidos corporais com outra pessoa seguindo as instruções acima. Registre o nome da pessoa com quem trocou fluidos.
  6. Troque fluidos com outro aluno (diferente dos dois primeiros) e registre seu nome abaixo. Você deve completar três trocas de fluidos no total.

Meu frasco #: _______________________

REGISTRO DE TROCAS DE FLUIDOS CORPORAIS

Troca 1: ______________________________
Troca 2: ______________________________
Troca 3: ______________________________

Seu instrutor de laboratório adicionará uma gota do reagente de teste para determinar se você está infectado com a doença. Se sua amostra ficar rosa, você está infectado. Se ficar amarelo, você não está infectado. Se você for positivo para a doença, você pode ter tido a doença originalmente ou pode ter contraído a doença no laboratório hoje por compartilhar fluidos corporais.

  • Você está infectado?
  • É possível determinar se você foi originalmente infectado ou se contraiu a doença de alguém durante o laboratório de hoje?

Como classe, você preencherá a Tabela 1 abaixo. Inclua o nome de cada pessoa. Se o resultado do seu teste for positivo, coloque um sinal de mais (+) ao lado do seu nome. Se o seu resultado for negativo, coloque um sinal negativo (-) ao lado do seu nome. Para os indivíduos positivos, registre com quem eles trocaram fluidos e se essa pessoa foi positiva ou negativa.

Perguntas

  1. Quantas pessoas na classe estão infectadas?
  2. Você pode determinar quem foi originalmente infectado?
  3. Se puder, quem você acha que foi originalmente infectado?
  4. O que os resultados da aula mostram sobre a propagação de doenças por meio de atividades nas quais os fluidos corporais são compartilhados?

Preencha uma tabela semelhante à Tabela 1 para todos os membros de sua classe. Certifique-se de adicionar tantas tabelas quanto o número de alunos!

Tabela 1. Resultados da classe para atividade de troca de fluidos corporais
Nome do estudanteResultado do teste (+/−)Troca # 1 (+/−)Troca # 2 (+/−)Troca # 3 (+/−)
1.
2.
3.
4.
5.

Depois de concluir a Tabela 1, discuta com seu grupo de laboratório como este experimento simula uma infecção da vida real em uma população e responda às seguintes perguntas.

  1. Quais são algumas das maneiras pelas quais os vírus se propagam?
  2. Quais são algumas doenças que são transmitidas pelo contato com fluidos corporais?
  3. Quais são as maneiras de prevenir a propagação dessas doenças?

LICENÇAS E ATRIBUIÇÕES

CONTEÚDO LICENCIADO CC, ORIGINAL

  • Biology 102 Labs. De autoria de: Lynette Hauser.

    Como os vírus mantêm a infecção continuando

    Há muito se discute se os vírus são uma forma de vida, porque muitos deles são feitos apenas de um pouco de material genético que está dentro de uma embalagem. Esse material genético geralmente tem que ser despejado em uma célula totalmente funcional para gerar proteínas e mais partículas virais ou vírus de vírions podem se replicar por conta própria, sem infectar uma célula hospedeira.

    Os cientistas agora aprenderam mais sobre como alguns vírus, especificamente alguns vírus do resfriado e poliovírus, empacotam seu material genético e criam novas partículas infecciosas ou vírions para que sejam capazes de infectar mais células. As descobertas, que podem abrir novas opções para o tratamento de vírus, foram relatadas em PLOS Pathogens.

    “Este estudo é extremamente importante por causa da maneira como muda nosso pensamento sobre como podemos controlar algumas doenças virais. Se pudermos interromper o mecanismo de formação do vírion, então haverá o potencial de interromper uma infecção em seu caminho ”, disse o co-supervisor do estudo Professor Peter Stockley, ex-diretor do Astbury Center for Structural Molecular Biology da University of Leeds.

    Embora saibamos que as células infectadas geram novos vírions, o que não está claro é como esses vírions são reunidos para que possam infectar outras células e iniciar o processo de geração de novos vírions. Os mecanismos usados ​​para criar novos vírions parecem permanecer estáveis.

    "Nossa análise sugere que as características moleculares que controlam o processo de formação do vírion são geneticamente conservadas, o que significa que não sofrem mutação facilmente - reduzindo o risco de que o vírus possa mudar e tornar qualquer nova droga ineficaz", acrescentou Stockley.

    Neste trabalho, os pesquisadores se concentraram em um vírus que infecta vacas, mas não pessoas, e atua como uma espécie de substituto do poliovírus em estudos de laboratório, chamado Enterovirus-E. Os rinovírus, que causam o resfriado comum, são os enterovírus. Os pesquisadores determinaram que existem porções de moléculas de RNA chamadas de sinais de empacotamento de RNA que funcionam com proteínas que ajudam a encerrar o vírus e, juntas, podem montar novos vírions infecciosos.

    Este estudo também identificou locais nas moléculas de RNA que podem estar atuando como sinais de empacotamento. Eles foram capazes de aplicar técnicas de microscopia de ponta para realmente visualizar o processo em ação.

    "Entender em detalhes como esse processo funciona, e o fato de que parece conservado em uma família inteira de patógenos virais, permitirá à indústria farmacêutica desenvolver agentes antivirais que podem bloquear essas interações importantes e prevenir doenças", disse o co-supervisor do estudo Professor Reidun Twarock da Universidade de York.


    Explorador de Vírus

    Este módulo interativo explora a diversidade de vírus com base na estrutura, tipo de genoma, gama de hospedeiros, mecanismo de transmissão, ciclos de replicação e disponibilidade de vacina.

    O Click & amp Learn incorpora modelos 3D envolventes de 10 vírus diferentes - coronavírus, raiva, influenza A, HIV, Ebola, vírus do mosaico do tabaco (TMV), adenovírus, T7, papilomavírus e Zika - que os alunos podem clicar para girar, visualizar de ângulos diferentes, e veja na seção transversal. Os alunos também podem explorar diagramas detalhados dos ciclos de replicação dos vírus. No processo, os alunos aprenderão sobre os critérios que os cientistas usam para classificar os vírus, as características dos diferentes vírus e a prevalência global de infecções virais. O Click & amp Learn inclui uma ilustração dos tamanhos relativos dos 10 vírus, que oferece uma oportunidade para discutir a escala e as unidades.

    A planilha que acompanha orienta a exploração dos alunos.

    O link “Resource Google Folder” direciona para uma pasta do Google Drive de documentos de recursos no formato Google Docs. Nem todos os documentos para download do recurso podem estar disponíveis neste formato. A pasta do Google Drive é definida como “Somente visualização” para salvar uma cópia de um documento desta pasta em seu Google Drive, abra o documento e selecione Arquivo → “Fazer uma cópia”. Estes documentos podem ser copiados, modificados e distribuídos online seguindo os Termos de Uso listados na seção “Detalhes” abaixo, incluindo crédito BioInteractive.


    Laboratório de vírus - Biologia

    Estrutura do vírus e entrada na célula

    Partículas de vírus carregam material genético de uma célula para outra. A principal distinção estrutural é entre os vírus que têm membranas de bicamada lipídica e aqueles que não as possuem & # 8211 & # 8220envolvida & # 8221 e & # 8220não-envelopada & # 8221, respectivamente. Essas diferenças refletem diferentes mecanismos de entrada na célula e diferentes vias de montagem e maturação. Os vírus envelopados entram por fusão da membrana, seja de um compartimento interno após uma etapa endocítica, seja na superfície da célula. Os vírus sem envelope requerem alguma forma de perfuração de membrana & # 8220 & # 8221. Para que esses vírus penetrem na célula, um grande complexo macromolecular (uma partícula subviral ou apenas o genoma viral) deve cruzar uma membrana celular para acessar o citosol, e algum modo de rompimento da membrana local deve acompanhar a translocação. Estudamos os mecanismos de fusão e perfuração da membrana, direcionando nossa atenção atualmente para os flavivírus (especialmente os vírus da dengue e do Nilo Ocidental) e os vírus de RNA de fita dupla (rotavírus, em particular).

    Fusão de membrana viral

    A fusão da membrana é termodinamicamente favorável, mas geralmente apresenta uma barreira cinética alta. As proteínas de fusão diminuem essa barreira e, portanto, são catalisadores para a fusão de duas bicamadas & # 8212 & # 8220suicida & # 8221 catalisadores no caso de proteínas de fusão virais. Medições sensíveis da cinética de fusão, como uma análise cuidadosa da cinética enzimática, podem fornecer informações sobre o mecanismo, examinando os efeitos das mutações direcionadas nas taxas, cooperatividade e assim por diante. Desenvolvemos um ensaio de fusão de partícula única de vírus para estudar a fusão desta forma e o aplicamos ao vírus da influenza (Floyd et al, 2008 Ivanovic et al, 2013 e 2015) e aos vírus do Nilo Ocidental e dengue (Chao et al, 2014 e 2018). Nosso trabalho em andamento é um esforço para vincular estruturas crio-EM das regiões de interação da membrana da proteína do envelope de flavivírus com as etapas da via de fusão e, finalmente, compreender mais profundamente o mecanismo de inibição da fusão por inibidores de moléculas pequenas (Schmidt et al, 2012 Chao et al, 2018).

    Entrada de vírus sem envelope

    O principal objetivo de nossa pesquisa sobre a estrutura do vírus é uma descrição molecular dos primeiros eventos que levam à infecção de uma célula: fixação, absorção e penetração no citosol. O rotavírus, uma das principais causas de diarreia infecciosa infantil, é um vírus sem envelope particularmente adequado para derivar esse & # 8220 filme molecular & # 8221. Usamos a criomicroscopia eletrônica (com Nikolaus Grigorieff, Brandeis) para obter um modelo atômico para a partícula completa do rotavírus, aproveitando uma série de estruturas de alta resolução (da cristalografia de raios-X) de proteínas estruturais individuais e fragmentos de proteínas e do partícula intacta do capsídeo interno. A análise estrutural nos permitiu projetar experimentos usando imagens de células vivas (com Tomas Kirchhausen, Children & # 8217s Hospital: Abdelhakim et al, 2014 Salgado et al, 2017 e 2018) para acompanhar eventos moleculares durante a captação e penetração do vírus nas células em cultura . Nosso trabalho em andamento é um esforço para conectar mudanças conformacionais em componentes da partícula do vírus, conforme definido por estruturas de crio-EM e cristalografia de raios-X, com estágios de entrada definidos por imagens de células vivas.


    Laboratórios de cultura de vírus e células

    O Departamento de Ciências Biológicas mantém uma instalação de contenção biológica totalmente equipada para trabalhar com vírus e células animais ou tecidos infectados com tais agentes. O laboratório, localizado no quinto andar do Crawford Hall, contém três capelas de cultura de tecidos de risco biológico, seis incubadoras com atmosfera controlada, uma instalação de cultura giratória e microscópios, incluindo sistemas de fotomicroscopia de 35 mm e Poloroid, bem como exibição de vídeo. Além disso, a instalação contém uma sala de preparação completa que inclui uma câmara fria, freezers, uma autoclave, centrífugas, balanças e um contador de células Coulter. Todo o laboratório é equipado com luz ultravioleta para esterilização e é mantido sob pressão negativa.

    O Departamento também mantém várias instalações de cultura de células autônomas e de última geração que abrigam todos os equipamentos necessários para o crescimento, manutenção e análise de células. As instalações possuem salas separadas com capelas de fluxo laminar para o manuseio estéril de células, bem como incubadoras walk-in e várias incubadoras de atmosfera controlada para células em crescimento. Contraste de fase, fluorescência, microscópios de campo claro padrão e contadores de células estão disponíveis para análise de células. Um suprimento de água altamente purificada, câmaras frigoríficas e freezers estão disponíveis para preparação e armazenamento de mídia. Uma cozinha moderna para lavagem e esterilização automatizada é mantida por uma equipe treinada e permanente.


    Não, o coronavírus não foi feito em um laboratório. Uma análise genética mostra que é da natureza

    O vírus SARS-CoV-2 (visto nesta imagem de microscópio eletrônico de transmissão do vírus isolado de um paciente nos EUA), que causa o COVID-19, foi considerado de origem humana, mas os cientistas agora desmentiram essa teoria.

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    A pandemia de coronavírus que circula o globo é causada por um vírus natural, não um feito em um laboratório, diz um novo estudo.

    A composição genética do vírus revela que o SARS-CoV-2 não é uma mistura de vírus conhecidos, como seria de se esperar se fosse de fabricação humana. E tem características incomuns que só recentemente foram identificadas em tamanduás escamosos chamados pangolins, evidência de que o vírus veio da natureza, relatam Kristian Andersen e seus colegas em 17 de março em Nature Medicine.

    Quando Andersen, um pesquisador de doenças infecciosas do Scripps Research Institute em La Jolla, Califórnia, ouviu pela primeira vez sobre o coronavírus causando um surto na China, ele se perguntou de onde o vírus veio. Inicialmente, os pesquisadores pensaram que o vírus estava se espalhando por infecções repetidas que saltavam de animais em um mercado de frutos do mar em Wuhan, China, para humanos e depois eram passados ​​de pessoa para pessoa. A análise de outros pesquisadores sugeriu que o vírus provavelmente saltou apenas uma vez de um animal para uma pessoa e foi espalhado de humano para humano desde meados de novembro (SN: 3/4/20).

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    Mas logo depois que a composição genética do vírus foi revelada no início de janeiro, rumores começaram a borbulhar de que talvez o vírus tenha sido projetado em um laboratório e liberado intencionalmente ou acidentalmente.

    Uma infeliz coincidência alimentou os teóricos da conspiração, diz Robert Garry, virologista da Tulane University em Nova Orleans. O Wuhan Institute of Virology está “muito próximo” do mercado de frutos do mar e conduziu pesquisas sobre vírus, incluindo coronavírus, encontrados em morcegos com potencial para causar doenças em pessoas. “Isso levou as pessoas a pensar que, ah, ele escapou e desceu pelo esgoto, ou alguém saiu do laboratório e foi ao mercado ou algo assim”, diz Garry.

    Lançamentos acidentais de vírus, incluindo SARS, ocorreram em outros laboratórios no passado. Portanto, “isso não é algo que você pode simplesmente descartar imediatamente”, diz Andersen. "Isso seria uma tolice."

    Procurando por pistas

    Andersen reuniu uma equipe de biólogos evolucionistas e virologistas, incluindo Garry, de vários países para analisar o vírus em busca de pistas de que poderia ter sido feito pelo homem, ou cultivado e acidentalmente liberado de um laboratório.

    “Dissemos:‘ Vamos considerar esta teoria - da qual existem várias versões diferentes - de que o vírus tem uma origem não natural ... como uma hipótese potencial séria ’”, diz Andersen.

    Encontrando-se via Slack e outros portais virtuais, os pesquisadores analisaram a composição genética do vírus, ou sequência de RNA, em busca de pistas sobre sua origem.

    Ficou claro "quase da noite para o dia" que o vírus não era de fabricação humana, diz Andersen. Qualquer pessoa que deseje criar um vírus precisaria trabalhar com vírus já conhecidos e projetá-los para ter as propriedades desejadas.

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    Mas o vírus SARS-CoV-2 tem componentes que diferem dos vírus conhecidos anteriormente, então eles tiveram que vir de um vírus desconhecido ou na natureza. “Os dados genéticos mostram irrefutavelmente que o SARS-CoV-2 não é derivado de nenhum backbone de vírus usado anteriormente”, escreveram Andersen e colegas no estudo.

    “Este não é um vírus que alguém teria concebido e remendado. Ele tem muitos recursos distintos, alguns dos quais são contra-intuitivos ”, diz Garry. “Você não faria isso se estivesse tentando fazer um vírus mais mortal.”

    Outros cientistas concordam. “Não vemos absolutamente nenhuma evidência de que o vírus foi projetado ou liberado propositalmente”, diz Emma Hodcroft, epidemiologista molecular da Universidade de Basel, na Suíça. Ela não fazia parte do grupo de Andersen, mas é membro de uma equipe de cientistas da Nextstrain.org que está rastreando pequenas alterações genéticas no coronavírus para saber mais sobre como ele está se espalhando pelo mundo.

    Essa descoberta desmascara uma análise amplamente contestada, postada em bioRxiv.org antes da revisão por pares, que afirmava encontrar fragmentos de HIV no coronavírus, disse Hodcroft. Outros cientistas rapidamente apontaram falhas no estudo e os autores retiraram o relatório, mas não antes de alimentar a noção de que o vírus foi desenvolvido.

    Alguns trechos do material genético do vírus são semelhantes ao HIV, mas isso é algo que se origina desses vírus que compartilham um ancestral comum durante a evolução, diz Hodcroft. “Essencialmente, a reivindicação deles era a mesma que eu tirando uma cópia do Odisséia e dizendo: 'Oh, esta é a palavra a nele 'e, em seguida, abrindo outro livro, vendo a palavra a nele e dizendo: 'Oh meu Deus, é a mesma palavra, deve haver partes do Odisséia neste outro livro ”, diz ela. “Foi uma afirmação realmente enganosa e uma ciência muito ruim.”

    Encontrando características peculiares

    Em seguida, o grupo de Andersen decidiu determinar se o vírus poderia ter sido acidentalmente liberado de um laboratório. Essa é uma possibilidade real porque pesquisadores em muitos lugares estão trabalhando com coronavírus que têm potencial para infectar humanos, diz ele. “Algumas coisas saem do laboratório às vezes, quase sempre acidentalmente”, diz ele.

    Algumas características inesperadas do vírus chamaram a atenção dos pesquisadores, diz Andersen. Em particular, o gene que codifica a proteína spike do coronavírus tem 12 blocos de construção de RNA extras, ou nucleotídeos, presos nele.

    Este pico de proteína se projeta da superfície do vírus e permite que o vírus se fixe e entre nas células humanas. Essa inserção de blocos de construção de RNA adiciona quatro aminoácidos à proteína spike e cria um local na proteína para o corte de uma enzima chamada furina. Furin é feito em células humanas e cliva proteínas apenas em pontos onde uma combinação particular de aminoácidos é encontrada, como aquela criada pela inserção. O SARS e outros vírus semelhantes ao SARS não têm esses sites de corte.

    Veja toda a nossa cobertura do surto de coronavírus

    Encontrar o local de corte do furin foi uma surpresa: “Foi um momento aha e uh-oh”, diz Garry. Quando os vírus da gripe aviária adquirem a capacidade de ser cortados pela furina, os vírus geralmente se tornam mais facilmente transmissíveis. A inserção também criou locais onde as moléculas de açúcar poderiam ser fixadas à proteína spike, criando um escudo para proteger o vírus do sistema imunológico.

    A proteína spike do vírus COVID-19 também se liga mais fortemente a uma proteína em células humanas chamada ACE2 do que o SARS (SN: 3/10/20) Uma ligação mais forte pode permitir que o SARS-CoV-2 infecte mais facilmente as células. Juntos, esses recursos podem explicar porque COVID-19 é tão contagioso (SN: 13/03/20).

    “É muito peculiar essas duas características”, diz Andersen. “Como explicamos como isso aconteceu? Eu tenho que ser honesto. Eu estava cético [que fosse natural]. Isso poderia ter acontecido na cultura de tecidos ”em um laboratório, onde os vírus podem adquirir mutações à medida que se replicam muitas vezes em placas de laboratório. Na natureza, os vírus que carregam algumas dessas mutações podem ser eliminados pela seleção natural, mas podem persistir em pratos de laboratório, onde mesmo os vírus mais fracos não precisam lutar muito para sobreviver.

    Conquistando o caso para a natureza

    Mas então os pesquisadores compararam o SARS-CoV-2 com outros coronavírus recentemente encontrados na natureza, incluindo em morcegos e pangolins. “Parece que o SARS-CoV-2 pode ser uma mistura de vírus de morcego e pangolim”, diz Garry.

    Os vírus, especialmente os vírus de RNA, como os coronavírus, costumam trocar genes na natureza. Encontrar genes relacionados aos vírus pangolim foi especialmente reconfortante porque a composição genética desses vírus não era conhecida até a descoberta do SARS-CoV-2, tornando improvável que alguém estivesse trabalhando com eles em um laboratório, diz ele.

    Coronavírus que infectam pangolinas deram aos pesquisadores pistas importantes de que o vírus SARS-CoV-2 é natural. 2630ben / iStock / Getty Images Plus

    Em particular, os pangolins também têm os aminoácidos que causam a forte ligação da proteína spike à ACE2, descobriu a equipe. “Então, claramente, isso é algo que pode acontecer na natureza”, diz Andersen. “Eu pensei que era uma pequena pista muito importante. Isso mostra que não há mistério sobre sua ligação mais forte à [proteína] humana porque os pangolins também fazem isso. ”

    Os locais de fixação do açúcar foram outra pista de que o vírus é natural, diz Andersen. Os açúcares criam um “escudo de mucina” que protege o vírus de um ataque do sistema imunológico. Mas as placas de cultura de tecidos de laboratório não têm sistema imunológico, tornando improvável que tal adaptação surja do crescimento do vírus em um laboratório. “Isso meio que explica a hipótese da cultura de tecidos”, diz ele.

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    A semelhança do SARS-CoV-2 com os vírus do morcego e do pangolim é uma das melhores evidências de que o vírus é natural, diz Hodcroft. “Este foi apenas mais um transbordamento de animais para os humanos”, diz ela. “É realmente a explicação mais simples para o que vemos.” Os pesquisadores ainda não têm certeza de qual animal foi a fonte.

    Andersen diz que a análise provavelmente não vai acabar com as teorias da conspiração. Ainda assim, ele acha que valeu a pena fazer a análise. “Eu mesmo era cético no início e ficava cambaleando para frente e para trás”, diz Andersen, mas agora ele está convencido. “Todos os dados mostram que é natural.”

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    Citações

    K. G. Andersen et al. A origem proximal do SARS-CoV-2. Nature Medicine. Publicado online em 17 de março de 2020. doi: 10.1038 / s41591-020-0820-9.


    Biodiversidade

    Fred Adler colabora com Don Feener (Departamento de Biologia da Universidade de Utah) para entender os mecanismos pelos quais coexistem espécies de formigas que basicamente comem a mesma coisa (adler_lebrun_feener2006). Com Helene Muller-Landau, Fred Adler está estendendo os modelos do efeito Janzen-Connell para entender os padrões de biodiversidade em ecossistemas altamente específicos (adler & mullerlandau2005). Este trabalho combina o estudo do papel das compensações na manutenção da diversidade (adler & mosquera2000, adler2006).

    O projeto de rinovírus começou como uma investigação dos mecanismos pelos quais mais de 100 sorotipos diferentes desses vírus coexistem no mesmo ambiente (o nariz humano, koppelman_adler2005). A compreensão exigirá a combinação de informações sobre transmissão e epidemiologia (rinovírus que causam a maioria dos resfriados no outono e na primavera, em vez de no inverno), imunologia (os rinovírus são bastante bons em induzir apenas um nível mínimo de imunidade de longo prazo) e mutação (como outro RNA vírus, rinovírus têm taxas de mutação extremamente altas e tamanhos populacionais enormes e, portanto, exploram mais o espaço evolutivo do que qualquer outra entidade no planeta). Essa chamada evolução de "quase-espécies" obedece a regras bastante diferentes da evolução laboriosa comum que entendemos de nós mesmos e das moscas-das-frutas (OFallon: 2007: QES)


    A biologia sintética pode trazer uma catapora para todos nós

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    Novos métodos estão tornando mais fácil do que nunca produzir vacinas que salvam vidas & # 8212 e vírus que matam vidas que a humanidade não está preparada para combater. Sinead Kennedy

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    Por volta das 11h30 de 1º de julho de 2014, um cientista da Food and Drug Administration entrou na Sala 3C16, uma área de armazenamento refrigerado do National Institutes of Health Labs em Bethesda, Maryland.

    O FDA usava o espaço desde o início dos anos 1990 para armazenar amostras para pesquisas biológicas, mas o estava limpando na preparação para uma mudança para um campus próximo em Silver Spring.

    O cientista que entrou viu 12 caixas de papelão misteriosas em uma prateleira lotada no canto esquerdo do espaço de armazenamento e abriu uma delas para ver o que continha. Dentro, dezenas de frascos longos foram embalados em rolos de algodão branco e selados com vidro derretido, muitas das etiquetas estavam gastas a ponto de ficarem ilegíveis. O cientista notou um recipiente que continha algum material solto e liofilizado. Seu rótulo trazia uma única palavra decifrável: "variola", outra palavra para varíola - uma doença que o historiador britânico do século 19, Thomas Babington Macaulay, considerou "a mais terrível de todos os ministros da morte".

    O vírus altamente contagioso se espalha através do contato próximo, fluidos corporais ou objetos contaminados. Começa como catapora: a vítima tem febre alta e tem tendência a vomitar. Uma erupção na boca se desenvolve na boca e se espalha rapidamente por todo o corpo, como pequenas bolinhas de gude saindo da pele. Cerca de 30% das pessoas que contraem o vírus morrem em duas semanas. Aqueles que sobrevivem geralmente ficam com cicatrizes, cegos ou desfigurados.

    A varíola devastou o mundo durante séculos. Foi só em 1796 que o médico inglês Edward Jenner descobriu como transformar o sistema imunológico contra a doença. Mesmo assim, levou séculos para que a vacina que ele criou fosse totalmente implantada. A varíola matou cerca de 500 milhões de pessoas nos séculos 19 e 20 antes de ser finalmente erradicada em todo o mundo em 1980. No entanto, aqui neste laboratório desordenado de Maryland estavam seis frascos esquecidos do temido poxvírus, incluindo pelo menos duas amostras vivas ainda capazes de crescer e infectar massas incalculáveis.

    Durante uma investigação de dois anos sobre a origem dos frascos, o FDA determinou que eles datavam de 10 de fevereiro de 1954. Mas a agência não conseguiu descobrir como ou por que eles acabaram em uma câmara frigorífica no NIH. O incidente desencadeou uma busca em todo o governo por outros materiais perigosos que podem ter sido esquecidos e levou a revisões nas políticas do FDA sobre o armazenamento de agentes infecciosos. As cepas de varíola de 60 anos foram destruídas sob a supervisão de funcionários da Organização Mundial da Saúde.

    A existência dos frascos levantou outra possibilidade assustadora: a varíola poderia voltar? Se essas amostras fossem deixadas para trás, quem sabe quantas outras sobrariam. Os EUA mantêm vacinas contra a varíola em quantidade suficiente para proteger todos os 328 milhões de americanos. Mas nas décadas desde que a doença foi erradicada, os cientistas descobriram que vários grupos de pessoas - aqueles com HIV, mulheres grávidas, recém-nascidos e sobreviventes de câncer entre eles - correm o risco de complicações com a vacina, como inflamação do coração e infecções cerebrais . É provável que a maioria dessas pessoas seja aconselhada a evitar tomar o remédio, assim como qualquer pessoa que compartilhe uma casa com elas. Dadas essas limitações significativas, muitas autoridades de saúde e pesquisadores acreditam que há uma necessidade urgente de uma vacina melhor contra a varíola.

    É esta missão que possui David Evans, um virologista veterano da Universidade de Alberta, no Canadá. Filho de um oficial de saúde da colônia britânica da Rodésia do Norte (hoje Zâmbia), Evans estuda os poxvírus há mais de 30 anos.

    Como um dos maiores especialistas mundiais em varíola, Evans acredita que é apenas uma questão de tempo antes que a doença - ou um de seus primos feios da família da varíola - possa ressurgir, trazida à vida por um governo hostil, um terrorista ou um amador biohacker usando edição de genes e fragmentos de DNA disponíveis comercialmente.

    Se isso ocorrer, diz ele, o mundo precisa estar pronto com a vacina mais segura e eficiente possível. A melhor maneira de aperfeiçoar uma vacina é fazer uma derivada do próprio vírus.

    Então, dois anos atrás, em uma tentativa de ave-maria de se defender contra vírus potenciais da bioengenharia, Evans e seu associado de pesquisa fizeram algo impensável: eles ressuscitaram um primo extinto da varíola chamado varíola, usando DNA por correspondência.

    O ato frankensteiniano gerou indignação na comunidade científica internacional, que classificou Evans como o Walter White da biologia sintética. Apesar da fúria que provocou, Evans não se arrepende. Melhor ele ser o primeiro a ressuscitar esses espectros mortais, afirma o virologista, do que alguém com intenções nefastas. “Nada impedirá o ator estatal ou país tecnicamente sofisticado que decidir fazer isso”, acrescenta Evans, então é melhor estar preparado.

    Quando a varíola foi eliminada há quase 40 anos, depois que milhões de pessoas receberam a vacina na África, Ásia e América do Sul, ela foi saudada como uma das maiores conquistas da história humana. Em um ato severo de diplomacia da Guerra Fria, as duas últimas amostras de varíola foram armazenadas para estudo futuro nos Centros de Controle e Prevenção de Doenças em Atlanta e no Centro de Pesquisa Estadual de Virologia e Biotecnologia na Sibéria. Desde então, a Organização Mundial da Saúde mantém o controle das amostras para garantir que sejam seguras.

    Em 2001, Evans ingressou no comitê consultivo científico da OMS sobre varíola. O objetivo de muitos no grupo era que a Rússia e os Estados Unidos destruíssem para sempre essas amostras finais de varíola. “A esperança e a expectativa”, diz Evans, “era que o comitê dissesse:‘ Sim, terminamos, eles lidaram com todos esses objetivos de pesquisa. Você pode fechá-lo e autoclave os vírus. '”

    No ano seguinte, no entanto, um experimento de cientistas da Universidade Estadual de Nova York em Stony Brook sugeriu que simplesmente destruir as amostras pode não ser suficiente. Em 11 de julho de 2002, os pesquisadores revelaram que haviam sintetizado o vírus da poliomielite, eliminado nos Estados Unidos em 1979. Foi a primeira vez que um vírus foi criado do zero com DNA sintético. O trabalho foi financiado pelo Pentágono em parte para estabelecer se terroristas poderiam realizar tal façanha. A resposta foi sim. Os pesquisadores do SUNY levaram três anos para remendar o vírus usando DNA e sequências genéticas referenciadas em um banco de dados público online. O sucesso surpreendente do experimento levantou a possibilidade de uma era de guerra biológica no estilo cyberpunk e a possibilidade de que uma doença exponencialmente mais mortal, a varíola, pudesse ser preparada em um laboratório por meio da ciência da biologia sintética.

    Para Evans, o estudo provou que nenhum vírus pode realmente ser considerado extinto. “Eu disse:‘ Sim, bem, há algo escrito na parede para pessoas preocupadas em erradicar a varíola ’”, lembra ele. Após o renascimento da pólio, ele foi um dos primeiros a alertar a OMS sobre a potencial ressurreição da varíola. Mas seus avisos caíram em ouvidos surdos. Though Evans comes across as a measured scientist, his frustrations were mounting. He felt like Chicken Little and feared that action wouldn’t be taken until it was too late. “You know the way the world works,” he tells me. “It focuses on crises, right? It wasn’t a crisis.” Pelo menos ainda não.

    On a crisp falls day in September in Edmonton, Evans sits behind the desk of his cluttered office at the University of Alberta wearing a blue button-down shirt and khakis. He has wispy gray hair and small, round glasses. There’s a large microscope on his windowsill and shelves weighed down by thick books about viruses. Two stickers on his computer capture his natural skepticism—one reads “Really?” and the other “WTF?” (“I’m suspicious of reporters,” he tells me within the first few minutes of our meeting.)

    Buying samples of synthetic DNA is surprisingly easy. The trade is overseen by the International Gene Synthesis Consortium, an industry-­led group that works with government agencies to screen orders and buyers. But such oversight can’t prevent someone from purchasing hazardous DNA samples on the black market. A cursory search online brings up dozens of sources for samples from China, Germany, and beyond. China “is kind of notorious for having unregulated pharmaceutical companies, right?” Evans says. Chinese biohackers could “be quite capable of running an unregulated DNA synthesis company.”

    In June 2015, thanks in part to research by Evans and his colleagues into synthetic biology, public health advisers issued a report warning of smallpox’s potential return. “With the increasing availability of DNA fragments that can be synthesized from simple chemicals, it would be possible to ­re-create variola virus,” the report found, “and that could be done by a skilled laboratory technician or by undergraduate students working with viruses in a relatively simple laboratory.”

    The following year, the US national intelligence director at the time, James Clapper, cited bioengineered pandemics as one of his agencies’ biggest concerns the Worldwide Threat Assessment report added genome editing to its appraisal of current weapons of mass destruction and proliferation—alongside North Korea’s nukes, Syria’s chemical weapons, and Russia’s cruise missiles. As Bill Gates warned in 2017 at the Munich Security Conference, “the next epidemic could originate on the screen of a terrorist intent on using genetic engineering to create a synthetic version of the smallpox virus.”

    If that wasn't enough, a disturbing mystery emerged out of Russia. o Siberian Times reported in early 2017 that professor Ilya Drozdov, the 63-year-old micro­biologist who ran the state research facility where Russia’s sole smallpox sample is held, vanished from his hometown of Saratov in southwestern Russia. No further information has been made public. A WHO spokeswoman said it was not in the organization’s “mandate to confirm or deny the existence of an investigation.”

    David Evans raised alarms about the possibility of reviving poxviruses—and then revived one himself.

    For years, Evans had been urging his colleagues to upgrade their smallpox defenses. But it wasn’t until he met Seth Lederman that he found a like-minded scientist with the will and resources to do something about it. The CEO and cofounder of a New York company called Tonix Pharmaceuticals, Lederman was interested in funding research to develop biodefense technologies and drugs.

    Lederman shared Evans’ apprehension about the potential for a smallpox epidemic. “There’s an urgent need for a new vaccine,” he says. Smallpox vaccinations ended in 1978, meaning that the roughly 5 billion people worldwide under the age of 40 have not been inoculated.

    Lederman, a former associate professor of medicine at Columbia University, was prepared to commit his company to coming up with a solution. He was convinced that the secret to a better vaccine could be found in horsepox, a lesser-known cousin of smallpox. Horsepox isn’t known to be harmful to humans, but its genetic makeup is closely related to smallpox. In theory, the closer one can get to a virus’s origins, the more effective the vaccine that can be derived.

    Evans was intrigued. But the Centers for Disease Control maintains a single sample of horsepox, extracted from an infected horse in Mongolia in 1976, and Evans said it was unlikely he would be able to use the sample for commercial purposes. There was another option for getting their hands on some horsepox, Evans told Lederman: They could ­re-create the virus from scratch using synthetic DNA, similar to the way researchers had synthesized polio a decade earlier. The horsepox genome sequence had been published by researchers in 2006, offering up a road map for the virus’s revival.

    Evans didn’t know if he could succeed. Despite his Cassandra warnings, no one had ever engineered a virus in the smallpox family. Lederman decided the attempt was worth the gamble. He offered Evans’ lab $200,000 to try to bring horsepox back to life.

    When I ask Evans if he had any doubts about ­re-creating a cousin of smallpox, he hesitates. “You do think about that,” he says, “I don’t like controversy.” He had seen what had happened when polio was synthesized and had spoken with those researchers. Evans accepted that many would not agree with his choice. But he also believed, emphatically, that people already knew how to create such a virus–it was just that no one had achieved it yet. This was his chance, then, to prove that a synthetic version of a poxvirus was not only conceivable but a looming reality. “As long as people kept debating whether it was possible,” Evans notes, “nothing was ever going to be done about it.” It was time to put those questions to rest.

    In 2016, with approval from the University of Alberta’s biosafety office, Evans purchased 10 DNA fragments from GeneArt, a DNA synthesis company based in Regensburg, Germany. The synthetic DNA, which arrived by FedEx as vaporized powder, was harmless. “If you wanted to, you could eat it,” Evans says, “My guess is that it would have a fizzy tang, like Pop Rocks.”

    How worried should we be about warring countries or terrorists turning synthetic viruses, bacteria, and microbes into bioweapons? For some doomsday scenarios—the creation of, say, a wholly manufactured monster mashup of bad viruses—the answer is not very. But there is still plenty to freak out about. Last year, the US Department of Defense commissioned a report from bio­security and synthetic biology experts to assess the threats. Here are some of their most urgent warnings, ranked by concern level. —SARASWATI RATHOD

    REVIVED VIRUSES (HIGHEST): A bioterrorist, armed with basic lab equipment and online databases filled with genetic blueprints for deadly viruses, could conceivably re-create a fatal disease like smallpox or the Spanish flu. Illnesses with relatively small genomes, like polio, are easier to resurrect than more genetically complex diseases like smallpox or herpes.

    MICROBIOME INTERLOPERS (HIGHEST): Microorganisms inhabit our guts, mouths, and skin and help us in many ways. A rogue microbe slipped into the mix could, in theory, cause our good bugs to produce harmful chemicals. In practice, this would be really hard to do, but the novelty of this technique put it on the list of top concerns.

    SOUPED-UP BACTERIA (HIGHEST): Because their genomes are more stable, bacteria tend to be easier to modify than viruses. While you might not be able to get the building blocks for a deadly pathogen (like the one that causes anthrax) from a mail-order genetics company, you could modify a more benign bacterium to make it resistant to antibiotics or able to produce more toxins.

    MUTATED VIRUSES (HIGH): Introducing mutations into a virus’s genome almost always leads to a gentler form of the bug. That’s how a vaccine for measles was created. But scary stuff could also be made. In 2014, researchers found that just five mutations could transform an avian flu into an airborne virus—making it far more likely to spread (at least among ferrets).

    MODIFIED IMMUNE SYSTEMS (MEDIUM): It might be possible to develop and deliver a specially engineered virus or chemical capable of suppressing the body’s defenses or turning them against it. However, the human immune system is highly complex, and we still don’t fully understand it, making manipulation difficult.

    The arduous job of assembling the horsepox genome fell to Evans’ research associate, a young microbiologist named Ryan Noyce. Noyce wears his dark hair short and favors socks that read “Get shit done.” Like Evans, he has devoted his career to studying the nuances of viruses.

    Building a virus from scratch is like assembling Lego blocks. A decade ago, Evans had improved on a process that uses a “helper virus”—another form of a pox­virus—to kick-start the replication of DNA. In this case, once the helper virus started growing inside a cell, Noyce would use pipettes to introduce a solution containing the horsepox DNA. “You’re laying down a piece here, a piece here,” Evans says, “mortaring them together.” The fragments affix to each other using an enzyme called DNA ligase, which acts as a kind of glue. If the DNA fragments are introduced into a cell in the right way, under just the right conditions, they’ll join together through a natural biological process and hopefully grow into a virus.

    Noyce had to get every step of the process exactly right, from the sequence of the fragments to the timing of their insertion into the cell. If any part of the chain fails, the entire process falls apart. “It takes a tremendous amount of planning and timing and design work,” Evans explains.

    Every weekday morning at 7:30, Noyce crossed the University of Alberta campus to reach Evans’ dimly lit lab. He’d don his long white lab coat, then spend 10 hours moving between his computer and a microscope, stitching DNA fragments together based on horsepox’s previously published genome sequence.

    One day, after 18 months of meticulous work in the lab, Noyce looked through his microscope and saw it: a clearing of cells infected with the horsepox virus. He’d successfully re-­created a poxvirus. But the rush of excitement was quickly tempered by the realization of what of was to come. Noyce believed that if they could help develop better vaccines, that “would outweigh the potential negatives” of reviving a pox. But given the history of the virus, Evans says, “We knew that there was going to be controversy.”

    The trio published their findings in the scientific journal PLOS One in January 2018—and the blowback was swift and brutal. Critics accused Evans and Noyce of opening a Pandora’s box that could send humanity back to the dark ages of disease. The Washington Post’s editorial board wrote that “the study could give terrorists or rogue states a recipe to reconstitute the smallpox virus.” Tom Inglesby, director of the Center for Health Security at the Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, denounced the research on National Public Radio: “Anything that lowers the bar for creating smallpox in the world is a dangerous path.” Gregory Koblentz, director of the biodefense program at George Mason University, warned in the journal Health Security that the synthesis of horsepox “takes the world one step closer to the reemergence of smallpox as a threat to global health security.”

    o PLOS One paper also triggered calls for tighter regulation. Elizabeth Cameron, vice president of global biological policy and programs for the Nuclear Threat Initiative, a nonprofit that works to prevent attacks by weapons of mass destruction, issued an ominous warning that “the capability to create and modify biological agents is outpacing governmental oversight and public debate.”

    Evans still bristles over the criticism, which he feels missed the point. “One of the very irritating things on the reporting on our work was the idea that somehow it was so easy,” he says. “No it’s not. Ryan busted butt to make this.” For now, synthesizing a virus, as Evans and Noyce have, requires a high level of expertise. But while such a feat may be difficult to achieve, even Evans admits that “you make it more accessible to people simply by letting them know it can be done.”

    The research paper seemed to spur the federal government to shore up its defenses against the threat that someone could create and unleash a synthetic virus. In June, the US National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine released a 231-page study warning that even existing viruses like the common flu could be tweaked in a lab to evade immune responses and resist therapeutics (see sidebar). Several efforts are now underway to better assess potential threats before it’s too late.

    Darpa has launched an initiative called Safe Genes to protect service members from the accidental or intentional misuse of genome-editing technologies. The agency is trying to develop military tools to both counter and reverse the effects of synthetically created bioweapons. The Office of the Director of National Intelligence has announced its own initiative to find better methods for detecting and evaluating synthetic bioweapons. The system is designed to prevent rogue actors from getting their hands on the building blocks needed to make a dangerous virus.

    To make better screening tools, the government enlisted Ginkgo Bioworks, a biotech startup founded by a group of MIT PhDs. Based in an old Army warehouse along Boston Harbor, Ginkgo’s main business is making custom microbes for use in everything from sustainable agriculture to perfumes. But with its government contracts, the biotech company helped build an algorithm that can recognize any genetic sequence on the “threat list” of potentially harmful viruses and bacteria. The software—a literal antivirus program—would be voluntarily installed on the servers of every company that synthesizes DNA. It’s like a wanted list for genetic riffraff. “If somebody tries to synthesize horsepox, alarm bells go off,” says Patrick Boyle, Ginkgo’s 34-year-old head of codebase. At that point, the DNA company can ask questions of the buyer and, if warranted, deny the sale.

    Of course, even these automated checks can’t prevent determined buyers from obtaining samples through less scrupulous vendors on the black market. As with computer viruses, new strains appear from the ether before society is aware they exist. The same is true for trying to keep ahead of potentially lethal synthetic DNA.

    The scientists at Ginkgo never expected to be policing the DNA trade. But as tools like Crispr allow for cheaper and easier creation of new biological organisms, technology is quickly surpassing enforcement measures. In 20 years, Boyle predicts, it will be possible to synthesize smallpox from home. He likens this moment to the early days of computing, when the concept of computer viruses was still new: “If I was working for the US government, I would have wanted to fund an effort in antivirus software in 1975,” he says. “That’s exactly the thinking we’re doing now,” but with synthetic biological viruses.

    At this uncertain juncture, synthetic biology is entering new territory. It’s only a matter of time before others with the skill and wherewithal follow Evans and Noyce’s lead and replicate other viruses. Although not all viruses are deadly, scientists and bioengineers are in a race to predict and defend against new threats. There’s no telling when a manufactured disease will become a reality. If that occurs, the culprit might be a lab-trained terrorist or a basement biohacker, a bumbling grad student or a Russian microbiologist on the lam.


    COVID-19 / SARS-CoV-2 Resources

    The ongoing COVID-19 pandemic caused by SARS-CoV-2 is rapidly escalating emergency. To gain insights into the emergence, spread, transmission, and evolution of the virus, we are working with a large number of public health agencies, hospitals, biotechs, and academic partners. With funding from the CDC and NIH, we are sequencing hundreds of samples a week and all the data are made publicly available every week.

    In response to the emergence of new variants of SARS-CoV-2, we have made several visualization tools to make the genomic data more useful to the public, scientists, and outbreak responders. Some of our primary tools include:


    AAV Biology


    One area of interest of our lab is the biology of adeno-associated virus (AAV). Adeno-associated virus is a small, non-pathogenic virus that shows great promise as a vector for gene therapy applications. AAV is a non-enveloped virus of the family Parvoviridae with a single-stranded DNA genome and an icosahedral capsid composed of the structural proteins VP1, VP2, and VP3. A particularly attractive feature of AAV is that — at least in “postmitotic” tissues such as the liver and the heart — AAV transduction results in the persistent expression of the target gene even in the absence of genome integration.

    Our lab is interested in understanding the cellular mechanisms that underlie the cell and tissue specificity of AAV. The different AAV serotypes can transduce several cell types and tissues, the precise nature of which depends on the specific serotype. These serotype-specific expression patterns can be explained only partially by variations in receptor densities in different tissues and cell types. In contrast, it is likely that other cellular barriers are playing a role in these differences. Our goal is to improve our understanding of the cellular roadblocks that prevent the efficient transduction of certain cell types.

    Our recent work in this area has concentrated on two aspect of the infectious entry of AAV, namely the mechanism of endocytosis and the subsequent trafficking of AAV to the perinuclear area of the cell.

    Mechanism of Endocytosis of AAV.

    It has been reported in the past that AAV, at least serotype 2, is endocytosed via clathrin mediated endocytosis. However, our own research in this area has demonstrated that clathrin mediated endocytosis is likely not a major entry pathway for AAV that leads to successful transduction of a cell. Instead, we demonstrated that AAV is the first virus to be shown to enter the cell through the so-called CLIC/GEEC (Clathrin eundependent Carrier/GPI-Anchored-Protein-Enriched Endosomal Compartment) pathway (Nonnenmacher and Weber, 2011). The CLIC/GEEC pathway is an as yet poorly understood endocytic entry mechanism that is used by several bacterial toxins, including cholera toxin, to enter the cell.

    Interestingly, however, AAV can also enter the cells through a second pathway that is dependent on the GTPase dynamin, which is known to play a role in several endocytic mechanisms, including clathrin mediated endocytosis. Intriguingly, when the dynamin-dependent endocytosis of AAV is blocked by pharmacologically inhibiting dynamin activity with dynasore, AAV still can accumulate in the perinuclear region, where it accumulates in the absence of any drugs. On the other hand, when CLIC/GEEC mediated endocytosis is blocked with the amiloride analog EIPA, AAV remains in vesicles dispersed throughout the cytoplasm (Nonnenmacher and Weber, 2011).

    These results and other data indicate that to be able to transduce a cell, AAV must reach the perinuclear region and, more specifically, the Golgi to transduce successfully a cells (Nonnenmacher and Weber, 2011).

    Trafficking from the Cell Periphery to the Golgi

    It has been proposed that AAV travels from the cell periphery to the perinuclear area through either the late endosomes (LE) or the recycling endosomes (RE). Our recent investigations, using a combination of siRNAs and small molecule inhibitors that target canonical LE and RE dependent pathways, showed that AAV uses a non-canonical endosome to Golgi pathway that depends on the tSNARE syntaxin 5 (Nonnenmacher et al., 2015)

    Strikingly, siRNA-mediated knock-down of syntaxin 5 reduces transduction by most serotypes. Moreover, remarkably, Retro 2, an inhibitor of syntaxin 5 function, drastically reduces transduction of most cell types by most AAV serotypes (Nonnenmacher et al., 2015).

    The fact that most, if not all, serotypes use the same endocytic mechanism and share the same trafficking pathway to the Golgi raises an obvious question: If receptor distribution does not fully explain tissue and cell type tropism and the endocytic and trafficking patterns are the same what, then, determines the tropism of the AAV serotypes?

    We believe that a better understanding of the endocytic pathways and intracellular trafficking patterns used by AAVs will ultimately help us and others in designing novel AAV variants with specific cell and tissue tropism.


    Assista o vídeo: Wirusy i priony 1 - Wirusy - czym są i jak działają? budowa i funkcjonowanie biologia matura (Dezembro 2021).