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Sabemos se os cães são transmissores assintomáticos de sars-cov-2?


Os cães não usam máscara para passear nem observam a distância de segurança. Pelo contrário, eles freqüentemente juntam seus narizes e colocam seus narizes onde outros cães os colocaram antes ou urinaram. Portanto, como são nossos animais de estimação, é importante saber se podem ser transmissores assintomáticos de sars-cov-2. Nós sabemos disso? Pelo menos, nós testamos animais de estimação assintomáticos de pessoas infectadas com sars-cov-2?


Pode ser muito cedo para saber.

Testes de cães em Wuhan não encontraram cães infectados "487 cães, incluindo 90 cães beagle, 147 cães de estimação e 250 cães de rua durante o surto de SARS ‐ CoV ‐ 2 também foram testados com sorologia negativa." de https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tbed.13577

"O coronavírus pode infectar gatos - cães, nem tanto." https://www.nature.com/articles/d41586-020-00984-8

encontrado ao pesquisar "dog" no LitCovid em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/coronavirus/


Animais de estimação podem receber a vacina? 5 perguntas da Covid-19 respondidas por especialistas

Covid-19 pode infectar nossos amigos peludos - aqui está o 101 na Covid-19 e animais de estimação.

Quando a Organização Mundial da Saúde declarou pela primeira vez Covid-19, uma pandemia em março de 2020, não demorou muito para que os humanos começassem a pirar com seus animais de estimação.

Relatórios assustadores começaram a surgir, como o primeiro cão com teste positivo para Covid-19 morrendo - embora não esteja claro se Covid-19 foi a causa da morte - ou relatos de surtos em massa em fazendas de vison, levando muitos donos de animais a se perguntarem se seus peludos amigos podem ser seriamente infectados com a Covid-19.

Mas agora que estamos há mais de um ano no Covid-19, como mudou nossa compreensão da infecção por Covid-19 em animais de estimação?

Para começar: agora podemos responder a várias perguntas sobre Covid-19 e animais de estimação, incluindo:

  • Se os humanos podem infectar animais (e vice-versa)
  • Transmissão entre humanos e animais
  • Como os animais de estimação são infectados e se são portadores de anticorpos Covid-19
  • Se os animais de estimação podem ficar gravemente doentes
  • Quais animais são mais suscetíveis ao Covid-19
  • Como proteger nossos amigos peludos da Covid-19

E um estudo recente publicado no mês passado na revista PLOS One pode ser capaz de lançar ainda mais luz, revelando novas informações sobre a infecção por Covid-19 em cães e gatos no Brasil.


O que fazer se você tiver animais de estimação

Se você tem animais de estimação, trate-os como faria com outros membros da família humana para protegê-los de uma possível infecção por COVID-19.

Como existe o risco de que pessoas com COVID-19 espalhem o vírus para animais, os donos de animais de estimação devem limitar a interação de seus animais de estimação com pessoas fora de casa.

  • Sempre que possível, mantenha os gatos dentro de casa e não os deixe vagar livremente do lado de fora.
  • Passear os cães com uma coleira a pelo menos 6 pés de distância de outras pessoas para protegê-los de interagir com pessoas fora da casa.
  • Evite locais públicos onde muitas pessoas se reúnem.
  • Não coloque máscara em animais de estimação. As máscaras podem prejudicar seu animal de estimação.

Não há evidências de que o vírus possa se espalhar para as pessoas a partir da pele, pêlo ou cabelo de animais de estimação. Não limpe ou dê banho em seu animal de estimação com desinfetantes químicos, álcool, peróxido de hidrogênio ou outros produtos, como desinfetante para as mãos, toalhetes de limpeza ou outros produtos de limpeza industriais ou de superfície. Converse com seu veterinário & # 8203 se tiver dúvidas sobre produtos apropriados para o banho ou limpeza de seu animal de estimação & # 8203 & # 8203.

Animais infectados com este vírus podem ou não adoecer. Os animais de estimação que apresentam sintomas geralmente apresentam uma doença leve, que pode ser tratada em casa. Se você acha que seu animal de estimação está doente com o vírus ou se você tem dúvidas sobre a saúde do seu animal de estimação, converse com seu veterinário. A maioria dos animais de estimação que ficaram doentes com o vírus que causa COVID-19 foram infectados após contato próximo com uma pessoa com COVID-19.


Resultados de pandemia em potencial

René F. Najera, Dr.PH., epidemiologista e editor do History of Vaccines Project do College of Physicians of Philadelphia, explica que uma grande população imune é o que normalmente acabou com outras pandemias históricas. “Ou um número substancial de pessoas contraiu a doença e se tornou imune, um número significativo morreu ou uma vacina bem-sucedida foi desenvolvida e implantada com sucesso”, disse o Dr. Najera a SELF. A pandemia de influenza de 1918 diminuiu por causa do primeiro cenário, mas somente depois de infectar aproximadamente um terço da população mundial e matar pelo menos 50 milhões de pessoas. As vacinas funcionaram para acabar com o flagelo da varíola, enquanto as vacinas contra a poliomielite reduziram os casos para menos de 100 por ano.

Agora, quando um patógeno se torna uma pandemia, existem três trajetórias possíveis que ele pode seguir. As autoridades de saúde podem ter como objetivo a eliminação em um país ou área geográfica maior (os EUA ou a América do Norte), como fizemos nos EUA com o sarampo, caxumba e rubéola. Eliminação significa que o vírus geralmente não está presente no país, mas pode ser importado ocasionalmente e causar epidemias locais devido a pessoas que viajam após serem expostas durante surtos em andamento em outras áreas do globo.

Uma segunda possibilidade é que o patógeno possa ser erradicado, como foi feito para a varíola e está em andamento para a poliomielite: o extermínio completo do organismo da natureza na terra. Isso é muito desafiador e provavelmente impossível para o SARS-CoV-2, explica o Dr. Najera, devido à natureza zoonótica do vírus e seu potencial para saltar espécies. “Se for encontrado em outras espécies, então simplesmente vai de uma para a outra, escondendo-se e retornando conforme as condições mudam.” Charles Kenny, Ph.D., pesquisador sênior do Center for Global Development e autor de O ciclo da peste: a guerra sem fim entre a humanidade e as doenças infecciosas, concorda sobre a questão da erradicação: “Eu ficaria um pouco surpreso se conseguíssemos com SARS-Cov-2, que encontramos em gatos, cães, visons, gorilas e tigres, por exemplo, e que podem originaram-se em morcegos. ”

Além disso, não temos certeza se as vacinas COVID-19 em uso fornecerão imunidade duradoura, como fazem as vacinas contra a varíola e a poliomielite. Do contrário, isso pode deixar os indivíduos desprotegidos, à medida que sua imunidade à vacina diminui. Além disso, para tentar a erradicação, a vacina deve estar disponível para todos, o que não é viável agora, embora a produção deva aumentar no restante de 2021 e 2022. Casos assintomáticos de infecção também impediriam uma campanha de erradicação, como aconteceu para a poliomielite, permitindo a disseminação não detectada. Ter sintomas muito distintos, como a erupção da varíola, facilitou a identificação de casos e o controle da transmissão da varíola durante a campanha de erradicação.

Portanto, a erradicação acabou, e a eliminação seria muito difícil, pelo menos neste momento. Isso nos deixa com a terceira possibilidade: um vírus endêmico. Isso significa que estará presente em um nível baixo da população em um futuro próximo. O Dr. Najera sugere que o SARS-CoV-2 se tornará mais semelhante aos quatro coronavírus humanos endêmicos que geralmente causam resfriados: “outro vírus incômodo para alguns e grave o suficiente para matar outros”. No entanto, com uma porção considerável da população vacinada, veremos muito menos infecções e mortes do que experimentamos nos últimos 16 meses e, mesmo quando ocorrerem surtos, haverá menos probabilidade de sobrecarregar os hospitais.

Esta conclusão endêmica é consistente com o resultado da pandemia de “gripe suína” de 2009, H1N1. Em 10 de agosto de 2010, aproximadamente 16 meses após seu início, a Organização Mundial da Saúde (OMS) declarou a pandemia “acabada”, mas advertiu: “À medida que entramos no período pós-pandêmico, isso não significa que o vírus H1N1 tenha desaparecido longe. Com base na experiência com pandemias anteriores, esperamos que o vírus H1N1 assuma o comportamento de um vírus da gripe sazonal e continue a circular por alguns anos ”. Isso se tornou realidade. Mais de uma década depois, descendentes do vírus da pandemia de 2009 ainda estão circulando, como os vírus da pandemia de influenza fizeram após as pandemias de influenza de 1918, 1957 e 1968. Em algum momento, a OMS emitirá uma declaração semelhante para COVID-19, quando os níveis de novos casos forem suficientemente baixos na maioria dos países ao redor do mundo. Mas este não será o fim do vírus.


Os cães poderiam espalhar o vírus ainda mais?

Em estudos experimentais, os cães não demonstraram ser capazes de replicar o vírus (dentro do corpo). Simplesmente, eles próprios não são uma fonte de infecção.

Atualmente, existem dois relatos de casos no mundo de cães potencialmente contaminados com o vírus COVID-19 por seus proprietários. Esses cães não ficaram doentes.

Para reduzir ainda mais qualquer risco potencial de transmissão para pessoas e cães, o aparelho usado para treinar os cães não permite qualquer contato direto entre o nariz do cão e a amostra de suor.

O nariz do cão vai para um cone de aço inoxidável, com a amostra de suor em um recipiente atrás. Isso permite livre acesso aos compostos olfativos voláteis, mas nenhum contato físico.

Além disso, todos os cães treinados para detectar COVID-19 são verificados regularmente por testes de esfregaço nasal, testes de esfregaço retal e exames de sangue para identificar anticorpos. Até agora, nenhum dos cães detectores foi encontrado infectado.


Colocando em perspectiva

Para verificar sua hipótese de computador, Xia precisaria encontrar uma concessão ou outros recursos para testar cães vadios na natureza.

"Isso sugere a importância de monitorar coronavírus semelhantes ao SARS em cães selvagens na luta contra o SARS-CoV-2", disse Xia.

Embora essa seja uma hipótese razoável com base no estudo de vírus, levará tempo para fazer, e os resultados podem ou não apoiar a teoria, assim como outras hipóteses foram deixadas de lado.

"Estou confiante de que as respostas sobre a origem do SARS-CoV-2 ainda estão por aí, em algum lugar do mundo natural, mas ainda não as encontramos", disse Neuman.

Para colocar as conclusões do estudo em perspectiva para donos de animais de estimação em todo o mundo, Schaffner aponta o que ele chama de linha-chave no artigo: "a transmissão zoonótica deve ser um evento muito raro."

“Há quase 100% de probabilidade de haver apenas uma transmissão”, disse Schaffner. “Esta é uma declaração poderosa - uma transmissão de alguma origem animal para um humano que provavelmente ocorreu em um mercado úmido na China.

"Aconteceu apenas uma vez, e todas as outras infecções em humanos que ocorreram vieram dessa única instância de transmissão."


Novo estudo se propõe a elevar as práticas de vigilância COVID-19 assintomáticas

ST. PAUL, MINN. --- O corpo docente da Faculdade de Medicina Veterinária (CVM) da Universidade de Minnesota está colaborando com pesquisadores da Escola de Saúde Pública (SPH) para lançar um estudo de vigilância de COVID-19 entre populações assintomáticas. O estudo irá comparar a incidência de infecção em indivíduos que participam da vigilância COVID-19 assintomática com indivíduos com incidência autorreferida de doença COVID-19, ao mesmo tempo que investigará o desempenho e a eficiência de um sistema de vigilância que usa testes agrupados em vez de testes individuais.

“O CDC estimou que 40-50 por cento dos indivíduos infectados com o vírus COVID-19 são infecções assintomáticas e, sem testes, esses indivíduos provavelmente desempenham um papel importante na disseminação da doença”, diz Scott Wells, DVM, PhD, professor no Departamento de Medicina Veterinária da População (VPM) da CVM, que lidera o estudo. “Esperamos que o uso duas vezes por semana de testes agrupados de custo relativamente baixo identifique esses indivíduos infectados, o que permitirá que eles se isolem e reduzam o risco de disseminação da infecção”. Wells acumulou décadas de experiência no uso da epidemiologia para realizar vigilância, prevenção e medidas de controle de doenças infecciosas em bovinos e outros ambientes de agricultura animal para alimentação.

Os resultados deste estudo devem ajudar a esclarecer quando o teste de amostra agrupada deve ser usado em vez de teste de amostra individual. Também ajudará a avançar a compreensão científica dos riscos de transmissão de doenças de portadores de COVID-19 infecciosos assintomáticos. O Laboratório de Genômica da Universidade de Minnesota testará pools de cinco amostras e espera reverter os resultados em 24 horas. Se um pool de amostras obtiver um resultado positivo, os indivíduos cujas amostras foram usadas no pool serão testados cada um para identificar o indivíduo infectado.

O estudo contará com voluntários da comunidade CVM. Os participantes elegíveis incluem alunos do quarto ano de veterinária, bem como os técnicos veterinários, professores, residentes, alunos de pós-graduação e estagiários que instruem esses alunos em rotações clínicas. Os participantes serão testados duas vezes por semana para SARS-CoV-2 por 13 semanas consecutivas. “Este projeto se torna um exercício de 'momento de ensino' da vida real, por meio do qual os alunos podem obter uma compreensão pessoal dessas mesmas ferramentas e conceitos que usamos na medicina veterinária - vigilância de doenças, capacidades de teste e limitações - todos os elementos que usarão na prática . ” diz Jerry Torrison, DVM, PhD, DACVPM, diretor do Laboratório de Diagnóstico Veterinário de Minnesota (VDL). “Claro, a parte da vida real de ajudar a manter nossa comunidade segura é fundamental.”

Este projeto reúne especialistas em diagnóstico do VDL e do UMN Genomics Center, em epidemiologia e modelagem de doenças da CVM, e em saúde pública do Programa de Residência em Saúde Pública Veterinária e Medicina Preventiva da CVM e da Escola de Saúde Pública. “Estamos entusiasmados em poder usar nossas experiências e conhecimentos coletivos para proteger a saúde de nossos alunos e instrutores de veterinária na CVM e apoiar o treinamento seguro de alunos de veterinária durante esta pandemia”, disse Wells.

“Este estudo é um excelente exemplo de como os modelos matemáticos de propagação de doenças podem orientar a vigilância”, diz Kim VanderWaal, PhD, professor assistente do VPM. Vanderwaal, cuja posição é financiada em parte pelo programa de Transferência de Tecnologia de Pesquisa, Educação e Extensão do Legislativo de Minnesota, tem ampla experiência na integração de dados epidemiológicos diversos e complexos para melhor compreender e prever a disseminação de patógenos em grandes sistemas de produção agrícola. “Nosso modelo de transmissão assintomática de COVID em ambientes de trabalho quantifica o quão mais importante é o teste frequente à medida que os casos aumentam em nosso município”.

As rotações clínicas são uma parte vital da educação veterinária, enfermagem, odontológica e médica, e a pandemia tornou o treinamento clínico pessoal cada vez mais difícil. O CVM tem trabalhado muito para garantir que os alunos do quarto ano do programa DVM tenham acesso seguro a esse treinamento clínico. As informações recolhidas a partir deste estudo podem ajudar outros programas profissionais de saúde em todo o país a navegar com mais segurança nas águas desconhecidas desta pandemia global.

Os participantes voluntários do estudo simplesmente limparão o interior de suas narinas e devolverão o teste aos locais de coleta no campus da UofM duas vezes por semana durante o período do estudo. Os investigadores do estudo também estão trabalhando para adicionar locais de coleta de teste adicionais nos locais de treinamento adicionais da CVM, como a New Sweden Dairy Facility e a West Metro Equine Clinic. Os resultados dos testes deste estudo serão compartilhados com o Departamento de Saúde de Minnesota para fins de rastreamento de contato para proteger a saúde pública.

Este estudo foi financiado pelo Gabinete do Vice-Reitor de Pesquisa da Escola de Medicina da Universidade de Minnesota. Além de Wells, Torrison e Vanderwal, a equipe da CVM e do corpo docente da SPH inclui Michael Mahero, DVM, PhD Tim Goldsmith, DVM Sandra Godden, DVM Maxim Cheeran, MVSc, PhD Scott Madill, DVcs, DACT Perle Zhitnitsky, DVM, MSpVM Jeff Bender, DVM, MS e Craig Hedberg, PhD.

A equipe de estudo está começando o recrutamento agora. Se você estiver qualificado e interessado, entre em contato com Jan Mladonicky em [email & # 160protected].

CONTATO DA MÍDIA
Scott Wells - [e-mail & # 160 protegido]


Probabilidade de COVID grave e 'longo' pode ser estabelecida muito cedo após a infecção

Partículas do vírus SARS-CoV-2 são mostradas emergindo da superfície de células cultivadas em laboratório. Crédito: NIH Image Gallery

Novas pesquisas fornecem informações importantes sobre o papel desempenhado pelo sistema imunológico na prevenção - e em alguns casos no aumento da gravidade dos - sintomas de COVID-19 em pacientes. Ele também encontra pistas de por que algumas pessoas experimentam "COVID longo".

Entre as principais descobertas, que ainda não foram revisadas por pares, estão:

  • Indivíduos com doença assintomática ou leve mostram uma resposta imune robusta no início da infecção.
  • Os pacientes que precisam de internação hospitalar apresentam comprometimento das respostas imunológicas e inflamação sistêmica (ou seja, inflamação crônica que pode afetar vários órgãos) desde o início dos sintomas.
  • Anormalidades persistentes nas células imunológicas e uma mudança na resposta inflamatória do corpo podem contribuir para 'longo COVID. "

A resposta imune associada ao COVID-19 é complexa. A maioria das pessoas que é infectada pelo SARS-CoV-2 apresenta uma resposta antiviral bem-sucedida, resultando em poucos ou nenhum sintoma. Em uma minoria de pacientes, no entanto, há evidências de que o sistema imunológico reage exageradamente, levando a uma inundação de células imunológicas (uma 'tempestade de citocinas') e à inflamação crônica e danos a múltiplos órgãos, frequentemente resultando em morte.

Para entender melhor a relação entre a resposta imune e os sintomas do COVID-19, cientistas da University of Cambridge e do Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, têm recrutado indivíduos com teste positivo para SARS-CoV-2 para o COVID-19 coorte do NIHR BioResource. Esses indivíduos variam desde profissionais de saúde assintomáticos, nos quais o vírus foi detectado em exames de rotina, até pacientes que necessitam de ventilação assistida. A equipe coleta amostras de sangue de pacientes ao longo de vários meses, além de continuar medindo seus sintomas.

Na pesquisa publicada hoje, a equipe analisou amostras de 207 pacientes do COVID-19 com uma variedade de gravidades da doença obtidas em entrevistas regulares ao longo de três meses após o início dos sintomas. Eles compararam as amostras com as retiradas de 45 controles saudáveis.

Devido à necessidade urgente de compartilhar informações relacionadas à pandemia, os pesquisadores publicaram seu relatório sobre o MedRXiv. Ainda não foi revisado por pares.

O professor Ken Smith, co-autor sênior e diretor do Instituto Cambridge de Imunologia Terapêutica e Doenças Infecciosas (CITIID), disse: "O NIHR BioResource nos permitiu abordar duas questões importantes relacionadas à SARS-CoV-2.Em primeiro lugar, como a resposta imunológica precoce em pacientes que se recuperaram de uma doença com poucos ou nenhum sintoma se compara com aqueles que experimentaram doença grave? E, em segundo lugar, para os pacientes que apresentam doença grave, com que rapidez o sistema imunológico se recupera e como isso pode se relacionar com 'COVID longo'? "

A equipe encontrou evidências de uma resposta imune adaptativa robusta e precoce nos indivíduos infectados cuja doença era assintomática ou levemente sintomática. Uma resposta imune adaptativa ocorre quando o sistema imune identifica uma infecção e, em seguida, produz células T, células B e anticorpos específicos para o vírus para lutar contra ela. Esses indivíduos produziram os componentes imunológicos em maior número do que os pacientes com COVID-19 mais grave administrados e na primeira semana de infecção - após o que esses números voltaram rapidamente ao normal. Não houve evidência nesses indivíduos de inflamação sistêmica que pudesse causar danos em múltiplos órgãos.

Em pacientes que requerem internação hospitalar, a resposta imune adaptativa inicial foi retardada e anormalidades profundas em vários subconjuntos de leucócitos estavam presentes. Também estava presente na primeira amostra de sangue coletada desses pacientes a evidência de aumento da inflamação, algo não observado em pessoas com doença assintomática ou leve. Isso sugere que um componente inflamatório anormal da resposta imune está presente mesmo no momento do diagnóstico em indivíduos que progridem para doença grave.

A equipe descobriu que as principais assinaturas moleculares produzidas em resposta à inflamação estavam presentes em pacientes internados no hospital. Eles dizem que essas assinaturas poderiam ser usadas para prever a gravidade da doença de um paciente, bem como correlacionar com o risco de morte associada a COVID-19.

Dr. Paul Lyons, co-autor sênior, também do CITIID, disse: "Nossas evidências sugerem que a jornada para COVID-19 grave pode ser estabelecida imediatamente após a infecção, ou o mais tardar na época em que eles começam a mostrar os sintomas. A descoberta pode ter implicações importantes sobre como a doença precisa ser controlada, pois sugere que precisamos começar o tratamento para interromper o sistema imunológico, causando danos muito cedo, e talvez até preventivamente em grupos de alto risco rastreados e diagnosticados antes que os sintomas se desenvolvam . "

Os pesquisadores não encontraram evidências de uma relação entre a carga viral e a progressão para doença inflamatória. No entanto, uma vez que a doença inflamatória foi estabelecida, a carga viral foi associada ao resultado subsequente.

O estudo também fornece pistas para a biologia subjacente aos casos de 'COVID longo' - onde os pacientes relatam os sintomas da doença, incluindo fadiga, por vários meses após a infecção, mesmo quando já não apresentam teste positivo para SARS-CoV-2.

A equipe descobriu que alterações profundas em muitos tipos de células imunológicas frequentemente persistiam por semanas ou até meses após a infecção por SARS-CoV-2, e esses problemas se resolviam de maneira muito diferente, dependendo do tipo de célula imunológica. Alguns se recuperam à medida que a inflamação sistêmica se resolve, enquanto outros se recuperam mesmo diante de uma inflamação sistêmica persistente. No entanto, algumas populações de células permanecem marcadamente anormais ou mostram apenas uma recuperação limitada, mesmo depois que a inflamação sistêmica foi resolvida e os pacientes receberam alta do hospital.

A Dra. Laura Bergamaschi, a primeira autora do estudo, disse: "São essas populações de células imunológicas que ainda mostram anormalidades, mesmo quando tudo o mais parece ter se resolvido, que pode ser importante no COVID longo. Para alguns tipos de células, pode ser que eles são apenas lentos para se regenerar, mas para outros, incluindo alguns tipos de células T e B, parece que algo continua a impulsionar sua atividade. Quanto mais entendermos sobre isso, mais provavelmente seremos capazes de tratar melhor os pacientes cujas vidas continuam a ser afetados pelos efeitos colaterais do COVID-19. "

O professor John Bradley, investigador-chefe do NIHR BioResource, disse: "O NIHR BioResource é um recurso único que se tornou possível pelas fortes ligações que existem no Reino Unido entre médicos e cientistas no NHS e em nossas universidades. É por causa de colaborações como é isso que aprendemos tanto em tão pouco tempo sobre a SARS-CoV-2. "


Resultados

Características demográficas

Em 6 de fevereiro de 2020, a Comissão Nacional de Saúde da China atualizou o Plano de Prevenção e Controle COVID-19 (4ª edição) para o gerenciamento de contatos próximos, com ênfase na identificação e quarentena de indivíduos assintomáticos 1. Para identificar indivíduos assintomáticos, os Centros Distritais de Wanzhou para Controle e Prevenção de Doenças (CDC) realizaram uma extensa triagem de RT-PCR para 2.088 contatos próximos em quarentena. Os indivíduos com resultados positivos de RT ‐ PCR foram então selecionados por pesquisas de prevalência pontual realizadas pelo CDC local e avaliações de sintomas relatadas por médicos. Destes, 60 indivíduos não alegaram nenhum sintoma nos 14 dias anteriores, de acordo com os registros locais do CDC, e foram transferidos para um hospital designado pelo governo para isolamento centralizado. Na admissão, 17 indivíduos foram excluídos por sintomas leves ou atípicos com base em avaliações de sintomas relatados por médicos seis indivíduos que desenvolveram sintomas 4-17 dias após a admissão também foram excluídos. Finalmente, 37 casos assintomáticos, definidos como indivíduos com um resultado de teste de ácido nucleico positivo, mas sem quaisquer sintomas clínicos relevantes nos 14 dias anteriores e durante a hospitalização, foram incluídos neste estudo. Um total de 178 pacientes com infecções confirmadas de SARS-CoV-2 foram identificados no distrito de Wanzhou antes de 10 de abril de 2020, conforme rastreado pelos sistemas de vigilância do CDC. Neste estudo, a proporção de pacientes com infecções assintomáticas foi de 20,8% (37/178).

Para a detecção de anticorpos e medidas de citocinas, 37 pacientes sintomáticos leves pareados por sexo, idade e comorbidade foram selecionados para comparação com os indivíduos assintomáticos (Tabela Suplementar 1). Trinta e sete indivíduos controle pareados por sexo e idade do distrito de Wanzhou com resultados de RT-PCR negativos para SARS-CoV-2 também foram selecionados para comparação de citocinas.

Dos 37 indivíduos assintomáticos, a idade mediana foi de 41 anos (variação, 8–75 anos) e 22 eram do sexo feminino. Vinte e oito indivíduos tinham uma história confirmada de contato com um paciente confirmado por RT-PCR com COVID-19, e nove eram residentes de Wuhan ou tinham um histórico de viagens para Wuhan antes do início da infecção (Tabela Suplementar 2).

Achados radiológicos e laboratoriais

Um hemograma completo, bioquímica do sangue, função de coagulação, função hepática e renal e biomarcadores de infecção foram medidos na admissão (Tabela suplementar 2) para monitorar a progressão potencial da doença, de acordo com as Diretrizes de Tratamento COVID-19 (5ª edição) do National Health Comissão da China 7. Dos 37 indivíduos assintomáticos, três apresentaram linfopenia e um apresentou trombocitopenia. Seis indivíduos tinham níveis elevados de alanina aminotransferase e 11 tinham níveis aumentados de proteína C reativa.

Na admissão, a tomografia computadorizada (TC) de tórax mostrou opacidades em vidro fosco focais em 11 indivíduos assintomáticos (11/37, 29,7%) e sombras de listras e / ou consolidação difusa em dez indivíduos (10/37, 27,0%), enquanto 16 indivíduos (16/37, 43,2%) não apresentavam anormalidades (fig. 1). Cinco indivíduos desenvolveram opacidades em vidro fosco focais ou sombras listradas na TC de tórax dentro de 5 dias da admissão hospitalar. Não ocorreram derrames pleurais, sinais de broncograma aéreo ou linfonodos aumentados, alterações típicas de pacientes criticamente sintomáticos 8,9,10. Achados radiológicos anormais confinados a um pulmão foram identificados em 66,7% (14/21) dos indivíduos assintomáticos, enquanto 33,3% (7/21) apresentavam alterações em ambos os pulmões.

uma, Tomografia computadorizada de uma mulher de 45 anos mostrando opacidades em vidro fosco focais no lobo inferior do pulmão esquerdo (seta). b, Tomografia computadorizada de uma mulher de 50 anos mostrando opacidades em vidro fosco e listras coexistindo no lobo inferior do pulmão direito (setas).

Resultados virológicos

Comparamos os valores do limiar do ciclo RT ‐ PCR (Ct) dos primeiros esfregaços nasofaríngeos positivos para todos os 37 indivíduos assintomáticos e 37 pacientes sintomáticos. Os valores iniciais de Ct para 37 indivíduos assintomáticos e 37 pacientes sintomáticos pareceram semelhantes (ORF1b 32,8 (IQR, 30,9-35,8) versus 31,7 (IQR, 30,3-35,1), P = 0.336 N 32,6 (IQR, 29,5-34,6) versus 33,5 (IQR, 31,3-37,2), P = 0,126) (Fig. 2a). A duração mediana da eliminação viral, definida como o intervalo do primeiro ao último esfregaço nasofaríngeo positivo, nos indivíduos assintomáticos foi de 19 d (IQR, 15–26 d). A menor duração observada de eliminação viral foi de 6 dias, enquanto a mais longa foi de 45 dias. A duração média da eliminação viral foi de 14 d (IQR, 9–22 d) em pacientes com sintomas leves. O grupo assintomático teve uma duração significativamente maior de eliminação viral do que o grupo sintomático (log-rank P = 0,028) (Fig. 2b). No entanto, a eliminação mensurável do vírus não equivale à infecciosidade viral, e avaliação adicional é necessária para determinar a carga viral respiratória do SARS-CoV-2 que está correlacionada com o vírus cultivável 11.

uma, Os valores Ct de ORF1b e N obtidos com RT-PCR que foram detectados em swabs nasofaríngeos de assintomáticos (n = 37) e sintomático (n = 37) grupos. Os gráficos de caixa mostram as medianas (linha do meio) e o primeiro e o terceiro quartis (caixas), enquanto os bigodes mostram 1,5 × o IQR acima e abaixo da caixa. Teste U de Mann-Whitney bilateral não pareado P os valores são representados nos gráficos, e os P o valor de corte foi fixado em 0,05. b, O método Kaplan-Meier foi usado para estimar a taxa positiva de RNA viral e o teste de log-rank bilateral foi aplicado para avaliar a diferença significativa da duração da eliminação viral nos grupos sintomático e assintomático.

IgG e IgM específicos para vírus em indivíduos assintomáticos

Para investigar a resposta aguda de anticorpos à infecção por SARS-CoV-2, IgG e IgM vírus-específicos foram medidos em amostras de soro de indivíduos assintomáticos e sintomáticos. No grupo assintomático, 81,1% (30/37) testaram positivo para IgG e 83,8% (31/37) do grupo sintomático testaram positivo para IgG aproximadamente 3–4 semanas após a exposição. Além disso, 62,2% (23/37) do grupo assintomático eram positivos para IgM, enquanto 78,4% (29/37) do grupo sintomático eram IgM positivos. Curiosamente, os níveis de IgG no grupo sintomático (mediana S / CO, 20,5 IQR, 5,8-38,2) foram significativamente maiores do que aqueles no grupo assintomático (mediana S / CO, 3,4 IQR, 1,6-10,7) na fase aguda (o período quando o RNA viral pode ser encontrado em uma amostra respiratória) (P = 0,005) (Fig. 3a).

uma, A comparação dos níveis de anticorpos específicos do vírus em pacientes assintomáticos (n = 37) e pacientes sintomáticos (n = 37) com infecções agudas. b, Níveis de IgG em pacientes com COVID-19 em fase de convalescença que receberam alta do hospital. c, Alterações dinâmicas nos níveis de IgG específico do vírus nas fases aguda e de convalescença. d, Alterações dinâmicas nos anticorpos neutralizantes do soro nas fases aguda e de convalescença. Os resultados são expressos como a média de duas experiências independentes. e, Proporções IgG-positivas de pacientes com COVID-19 nas fases aguda e convalescente. A caixa plota em uma e b mostram as medianas (linha do meio) e o primeiro e o terceiro quartis (caixas), e os bigodes mostram 1,5 × o IQR acima e abaixo da caixa. Teste U de Mann-Whitney bilateral não pareado P os valores são representados nos gráficos, e os valores P o valor de corte foi estabelecido em 0,05.

Também acompanhamos 37 indivíduos assintomáticos e 37 pacientes sintomáticos até a fase inicial de convalescença (8 semanas após a alta hospitalar). Os níveis de IgG no grupo sintomático ainda eram significativamente mais elevados do que aqueles no grupo assintomático na fase inicial de convalescença (P = 0,002) (Fig. 3b). Surpreendentemente, os níveis de IgG em 93,3% (28/30) do grupo assintomático e 96,8% (30/31) do grupo sintomático diminuíram durante a fase inicial de convalescença (Fig. 3c). A porcentagem média de diminuição foi de 71,1% (variação, 32,8–88,8%) para os níveis de IgG no grupo assintomático, enquanto a porcentagem média de diminuição foi de 76,2% (variação, 10,9–96,2%) no grupo sintomático. Usando um ensaio de neutralização baseado em pseudovírus (Métodos), também observamos uma diminuição nos níveis de anticorpos neutralizantes no soro em 81,1% (30/37) do grupo assintomático e em 62,2% (23/37) do grupo sintomático. A porcentagem média de diminuição foi de 8,3% (variação, 0,5–22,8%) para anticorpos séricos neutralizantes no grupo assintomático, enquanto a porcentagem média de diminuição foi de 11,7% (variação, 2,3–41,1%) no grupo sintomático (Fig. 3d ) Além disso, 40,0% (12/30) dos indivíduos assintomáticos, mas apenas 12,9% (4/31) dos sintomáticos, tornaram-se soronegativos para IgG (fig. 3e).

Citocinas em indivíduos assintomáticos

Para elucidar ainda mais as respostas imunes associadas à infecção por SARS-CoV-2, os níveis séricos de citocinas e quimiocinas foram comparados entre os grupos assintomáticos e sintomáticos. Concentrações elevadas de 18 citocinas pró e antiinflamatórias foram observadas no grupo sintomático em comparação ao grupo assintomático. Destes, o ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral (TRAIL) (P = 3,39 × 10 -14), fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF) (P = 5,08 × 10 −13), oncogene-α regulado pelo crescimento (GRO-α) (P = 1,5 × 10 −10), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) (P = 2,05 × 10 −9) e interleucina 6 (IL-6) (P = 6,33 × 10 −9) mostrou as mudanças mais significativas (Fig. 4 e Dados Estendidos Fig. 1). Além disso, as citocinas foram analisadas posteriormente no grupo assintomático e nos 37 controles saudáveis. Os níveis plasmáticos de 32 citocinas foram semelhantes entre os controles saudáveis ​​e os indivíduos assintomáticos. Níveis significativamente mais elevados de fator de células-tronco (SCF) (P = 1,48 × 10 -9), IL-13 (P = 3,75 × 10 -7), IL-12 p40 (P = 7,08 × 10 -6) e fator inibidor de leucemia (LIF) (P = 1,33 × 10 −3) foram encontrados no grupo assintomático (Dados Estendidos Fig. 2). Coletivamente, nossos dados mostram que os indivíduos assintomáticos tiveram uma resposta inflamatória reduzida caracterizada por baixas concentrações circulantes de citocinas e quimiocinas.

Amostras de assintomáticos (n = 37) e sintomático (n = 37) pacientes com COVID-19 foram coletados na fase aguda durante a hospitalização, e foram realizados ensaios para medir as concentrações de 48 citocinas e quimiocinas. Os gráficos de caixa mostram as medianas (linha do meio) e o primeiro e o terceiro quartis (caixas), e os bigodes mostram 1,5 × o IQR acima e abaixo da caixa. Teste U de Mann-Whitney bilateral não pareado P os valores são representados nos gráficos, e os valores P o valor de corte foi definido em 0,001.


Reconhecimento

A iniciativa do Plano de Emergência para Animais de Estimação é financiada pelo Programa de Resiliência a Desastres Naturais e foi desenvolvida pela RSPCA South Australia em parceria com a Comunidade e o Governo Estadual da Austrália Meridional.

Se você estiver enfrentando desafios ao cuidar de seus animais, entre em contato com a RSPCA local para discutir as opções que estamos aqui para oferecer suporte e ajuda, se possível.

Observe que existem muitas coisas que são atualmente desconhecidas sobre este vírus e o risco que ele representa para animais de estimação e de animais de estimação para humanos. Estas informações foram preparadas com as melhores e mais atuais informações disponíveis no momento, mas as coisas estão mudando rapidamente conforme a situação evolui. Nossas informações são atualizadas com a maior freqüência possível.


Materiais e métodos suplementares

Coortes Clínicas

Coorte de biópsia intestinal

Os participantes incluíram pacientes hospitalizados em MSH, bem como aqueles atendidos em práticas gastrointestinais ambulatoriais que foram submetidos à endoscopia entre 17 de abril de 2020 e 2 de junho de 2020. Pacientes casos e controles COVID-19 foram definidos com base em SARS-CoV- nasofaríngeo 2 testes de PCR com esfregaço. Os critérios de inclusão incluíram (1) um resultado de teste de PCR NP SARS-CoV-2 positivo, sintomas clínicos relevantes e evidência sorológica de anticorpos anti & # x02013SARS-CoV-2 (para pacientes caso) e um teste NP SARS-CoV-2 negativo E ausência de febre, tosse, falta de ar e histórico de contato relevante (para indivíduos de controle) (2) indicação clínica para procedimento endoscópico e (3) capacidade do paciente e / ou de seu representante de saúde em fornecer consentimento informado. Os critérios de exclusão incluíram (1) condições comórbidas incluindo coagulopatia grave, (2) uso de anticoagulação concomitante, (3) doença crítica e qualquer outro parâmetro clínico que pudesse aumentar o risco de biópsias de pesquisa adicionais e (4) falha em obter consentimento. A gravidade do COVID-19 foi definida com base em um sistema de pontuação interno desenvolvido pelo Departamento de Doenças Infecciosas da MSH. Este sistema de pontuação foi desenvolvido de acordo com a Organização Mundial da Saúde e # x000a0 Escala de Progressão / Melhoria Clínica Ordinária (https://www.who.int/publications/i/item/covid-19-therapeutic-trial-synopsis) e com base no status de oxigenação e lesão de órgão, com as seguintes definições:

  • & # x02022 suave: SpO2 de & # x0003e94% no ar ambiente E sem pneumonia na imagem
  • & # x02022 moderado: SpO2 de & # x0003c94% no ar ambiente OU pneumonia na imagem
  • & # x02022 grave: cânula nasal de alto fluxo, máscara sem rebreather, pressão positiva de dois níveis nas vias aéreas (ventilação positiva não invasiva das vias aéreas) ou ventilação mecânica E sem medicamentos pressores E depuração de creatinina de & # x0003e30 mL / min E alanina aminotransferase de & # x0003c5 vezes o limite superior do normal
  • & # x02022 Grave com evidência de EOD: cânula nasal de alto fluxo, máscara sem rebreather, pressão positiva de dois níveis nas vias aéreas (ventilação positiva não invasiva das vias aéreas) ou ventilação mecânica E medicamentos pressores OU depuração de creatinina de & # x0003c30 mL / min OU nova terapia de substituição renal OU alanina aminotransferase de & # x0003e5 vezes o limite superior do normal (Tabela Suplementar & # x000a03).

Coorte de descoberta

Os pacientes admitidos no MSH entre 1º de abril de 2020 e 15 de abril de 2020 foram recrutados para a coorte de descoberta se fossem SARS-CoV-2 PCR positivos, se tivessem mais de 18 anos e se o painel ELLA de citocinas (IL6 , IL8, IL1 & # x003b2 e TNF - & # x003b1) foi realizado como parte do atendimento clínico. Detalhes clínicos de pacientes elegíveis foram extraídos do Mount Sinai Data Warehouse sob um protocolo aprovado pelo IRB (IRB-20-03297A registro norte-americano das manifestações digestivas de COVID-19).Os critérios de inclusão incluíram (1) um resultado de teste de PCR NP SARS-CoV-2 positivo no Mount Sinai Health System entre 1 e 15 de abril de 2020 e admissão em MSH (2) idade & # x0003e18 anos e (3) pacientes que tiveram um painel de citocinas ELLA realizado durante a hospitalização. Os critérios de exclusão incluíram (1) teste em um local fora do MSH em um ambiente ambulatorial ou aqueles que foram testados no departamento de emergência, mas não admitidos (2) idade & # x0003c18 anos e (3) pacientes sem um painel de citocinas ELLA.

Um total de 634 participantes foi incluído na coorte de descoberta (Figura Suplementar & # x000a011). Além de informações demográficas (incluindo raça e etnia, idade e sexo), características clínicas, dados laboratoriais e dados de desfechos foram extraídos dos prontuários médicos. As covariáveis ​​que foram estudadas incluíram IMC (obesidade definida como IMC de & # x0003e30 kg / m 2) e condições comórbidas, incluindo hipertensão, diabetes, doença pulmonar crônica (incluindo asma e doença pulmonar obstrutiva crônica [DPOC]), doença cardíaca (incluindo artéria coronária doença, fibrilação atrial e insuficiência cardíaca), doença renal crônica, câncer, HIV e doença inflamatória intestinal.

Os sintomas gastrointestinais foram definidos como mais de 1 episódio de diarreia, náusea e / ou vômito no momento da admissão. Se apenas 1 episódio de diarreia, náusea e / ou vômito fosse especificamente documentado, os pacientes não eram considerados como apresentando sintomas gastrointestinais. Além disso, não consideramos os sintomas gastrointestinais que se desenvolveram durante o curso da hospitalização, porque eles podem refletir efeitos nosocomiais ou relacionados ao tratamento, e consideramos apenas os sintomas gastrointestinais que estavam presentes no momento da admissão hospitalar, a fim de evitar a inclusão de fatores de confusão iatrogênicos ( tratamentos ou doenças adquiridas em hospitais que podem resultar em diarreia, náuseas e vômitos).

A gravidade da doença (conforme descrito) e a mortalidade foram consideradas como variáveis ​​de desfecho. A mortalidade foi calculada como o estado do paciente (vivo ou morto) 25 dias após a admissão. Se nenhuma informação estivesse disponível após a alta, os pacientes eram censurados no momento da alta hospitalar.

Coorte de validação externa

Esta coorte consistiu de 287 pacientes internados em um centro de atendimento terciário em Milão, Itália, entre 22 de fevereiro de 2020 e 30 de março de 2020, com resultado de PCR de SARS-CoV-2 positivo confirmado e que não morreram ou não foram transferidos para a UTI dentro de 24 horas da admissão foram estudados conforme detalhado em Aghemo et & # x000a0al. 1 Foi registrada a presença de vômito e diarreia (definida como pelo menos 3 movimentos intestinais soltos por dia) antes ou na admissão. Os resultados foram analisados ​​usando admissão na UTI, óbito ou o desfecho do estudo composto de admissão na UTI ou óbito dentro de 20 dias de hospitalização.

Coorte de validação interna

A coorte de validação interna é uma coorte distinta de pacientes admitidos no MSH entre 16 de abril de 2020 e 30 de abril de 2020, usada para testar um modelo preditivo de gravidade e mortalidade de COVID-19. Os mesmos critérios de inclusão e exclusão da coorte de descoberta foram usados ​​com as seguintes diferenças: (1) um resultado positivo do teste de PCR de SARS-CoV-2 entre 16 de abril de 2020 e 30 de abril de 2020 (2) uma exclusão adicional de pacientes que já estavam incluídos na coorte de descoberta. De um total de 408 pacientes, 242 preencheram os critérios de inclusão e foram incluídos na coorte de validação interna. Dados demográficos, clínicos e relacionados aos resultados foram extraídos dos registros médicos dos pacientes e # x02019, conforme descrito para a coorte de descoberta.

Teste SARS-CoV-2

O PCR SARS-CoV-2 foi executado no laboratório de Microbiologia Clínica como parte dos cuidados de rotina na plataforma Roche cobas, que realiza a amplificação seletiva de 2 alvos, o gene ORF-1 (alvo 1) e o gene E para pan- sarbecovírus (alvo 2) (detecta SARS-CoV-2, bem como síndrome respiratória aguda grave ou vírus da síndrome respiratória do Oriente Médio, mas não o coronavírus sazonal de rotina). Um resultado positivo indicou que o alvo 1 e o alvo 2 foram detectados (a maioria dos casos) ou que o alvo 1 sozinho foi detectado. Um resultado positivo presumido indica um resultado negativo no alvo 1 e um resultado positivo no alvo 2, que, de acordo com o fabricante, pode ser o resultado do seguinte: & # x0201c (1) uma amostra em concentrações próximas ou abaixo do limite de detecção de o teste, (2) uma mutação na região alvo do alvo 1 nos locais de ligação do oligo, ou (3) infecção com algum outro sarbecovírus (por exemplo, SARS-CoV ou algum outro sarbecovírus previamente desconhecido para infectar humanos), ou (4) outros fatores. & # x0201d Pacientes com PCR para SARS-CoV-2 presumivelmente positiva foram incluídos na análise se eles foram tratados clinicamente como tendo COVID-19.

Microscopia Imunofluorescente

Seções (5 & # x003bcm) de tecido fixado em formalina e embebido em parafina foram desparafinadas em xileno e reidratadas em álcool graduado e então lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A recuperação do epítopo induzida pelo calor foi realizada incubando as lâminas em uma panela de pressão por 15 minutos em alta solução de recuperação do alvo (Dako, S1699). Uma vez que as lâminas resfriadas à temperatura ambiente, elas foram lavadas duas vezes em PBS e então permeabilizadas por 30 minutos em 0,1% de tritonX-100 em PBS. A ligação não específica foi bloqueada com soro de cabra a 10% durante 1 hora à temperatura ambiente. As seções foram então incubadas em anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio durante a noite a 4 & # x000b0C. Os anticorpos primários e secundários estão resumidos na Tabela Suplementar & # x000a016. As lâminas foram lavadas em Tween 20 0,1% mais PBS três vezes e, em seguida, incubadas em anticorpo secundário e 4 & # x02032,6-diamidino-2-fenilindol (1 & # x003bcg / mL) durante 1 hora à temperatura ambiente. As secções foram lavadas duas vezes em Tween 20 a 0,1% mais PBS e uma vez em PBS e depois montadas com Fluoromount-G (Electron Microscopy Sciences, 1798425). Os controles incluíram omitir o anticorpo primário (sem controle primário) ou substituir os anticorpos primários por anticorpos não reativos do mesmo isotipo (controle de isotipo). O tecido foi visualizado e fotografado usando um microscópio Nikon Eclipse Ni e uma câmera SLR digital (Nikon, DS-Qi2).

Quantificação de linfócitos intraepiteliais

Três imagens IF 10 & # x000d7 não sobrepostas foram tiradas para cada amostra de biópsia. Doze amostras de biópsia (10 duodeno, 2 íleo) de 11 pacientes com COVID-19 na coorte de biópsia foram analisadas junto com 9 indivíduos controle não infectados (5 duodeno, 4 íleo). IELs CD3 + e IELs CD3 + CD8 + foram quantificados para cada imagem. O comprimento do epitélio em cada imagem foi medido no ImageJ (National Institutes of Heath). 2 Amostras de biópsia de pacientes com COVID-19 e indivíduos controle foram comparadas por meio de t teste.

Microscopia Eletrônica Clínica de Rotina

Após a pós-fixação em tetróxido de ósmio a 1%, os tecidos foram desidratados em série e incluídos em resina epóxi de maneira padrão. Seções scout coradas com toluidina de um mícron foram preparadas para orientação microscópica de luz. Cortes ultrafinos de 80 nm para microscopia eletrônica foram coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinadas em um microscópio eletrônico de transmissão Hitachi 7650 a 80 kV.

Infecção de células cultivadas para análises de microscopia eletrônica e tomografia eletrônica

As infecções virais de células em cultura foram conduzidas nas instalações da UVM BSL-3 sob um protocolo de biossegurança institucional aprovado. SARS-CoV-2 cepa 2019-nCoV / USA_USA-WA1 / 2020 (WA1) foi generosamente fornecido por Kenneth Plante e o Centro de Referência Mundial para Vírus Emergentes e Arbovírus da University of Texas Medical Branch e propagado em células renais de macaco verde africano ( Vero E6), que foram gentilmente cedidos por JL Whitton. As células Vero E6 foram mantidas em meio Eagle modificado Dulbecco & # x02019s completo (Thermo Fisher Scientific, catálogo no. 11965 & # x02013092) contendo 10% de soro fetal bovino (Gibco, Thermo Fisher Scientific, catálogo no. 16140 & # x02013071), tampão HEPES a 1% solução (15630 & # x02013130) e 1% de penicilina-estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, catálogo no. 15140 & # x02013122). As células foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37 & # x000b0C com 5% de CO2. Células Vero E6 semeadas em placas de 6 poços e infectadas com SARS-CoV-2 em uma multiplicidade de infecção de 0,01 por 48 horas antes de serem fixadas e preparadas para microscopia eletrônica. As células foram prefixadas com 3% de glutaraldeído, 1% de paraformaldeído, 5% de sacarose em 0,1 mol / L de cacodilato de sódio tri-hidratado, removidas das placas e posteriormente preparadas por congelamento de alta pressão e substituição por congelamento, como será descrito.

Microscopia Eletrônica e Tomografia de Eixo Duplo do Tecido de Biópsia Intestinal

As amostras de tecido foram fixadas com glutaraldeído a 3% para atender aos requisitos de biossegurança. Os tecidos foram enxaguados com cacodilato de sódio 0,1 mol / L tri-hidratado mais 5% de sacarose e posteriormente dissecados para tamanhos de blocos suficientes para congelamento a alta pressão. Tecidos ou células cultivadas foram enxaguados com tampão cacodilato 0,1 mol / L contendo 10% de Ficoll (crioprotetor externo), colocados em pranchetas de latão (Ted Pella, Inc) e ultrarapidamente congelados com uma máquina de congelamento de alta pressão HPM-010 (Bal-Tec / UM SUTIÃ). Amostras congeladas vítreamente foram transferidas sob nitrogênio líquido para frascos criogênicos Nalgene (Thermo Fisher Scientific) contendo uma mistura congelada de 2% OsO4, 0,05% de acetato de uranila em acetona. Os frascos foram colocados em uma máquina de substituição por congelamento AFS-2 (Leica Microsystems), e as amostras foram substituídas por congelamento por 72 horas a & # x0201390 & # x000b0C. As amostras foram então aquecidas a & # x0201320 & # x000b0C ao longo de 24 horas e mantidas nessa temperatura por mais 12 horas antes de serem aquecidas à temperatura ambiente, enxaguadas 3 vezes com acetona e, em seguida, infiltradas na resina Epon-Araldite (Ciências de Microscopia Eletrônica). As amostras foram embebidas em plano entre 2 lâminas de microscópio de vidro revestidas com Teflon e a resina foi polimerizada a 60 & # x000b0C durante 24 horas. Blocos de tecido embutidos foram observados por microscopia de luz para verificar a qualidade de preservação e selecionar regiões de interesse (ou seja, epitélio apical). Os blocos foram extraídos com um bisturi e colados em tocos de corte de plástico antes do corte. Seções seriais de Semithin (150 nm) foram cortadas com um ultramicrótomo UC6 (Leica Microsystems) usando uma faca de diamante (Diatome, Ltd). As seções foram colocadas em grades de fenda de cobre-ródio revestidas com formvar (Ciências de Microscopia Eletrônica) e coradas com acetato de uranila a 3% e citrato de chumbo. Partículas de ouro coloidal (10 nm) foram colocadas em ambas as superfícies das grades para servir como marcadores fiduciais para o alinhamento da imagem tomográfica. As grades foram colocadas em um suporte de tomografia de eixo duplo (Model 2010, E.A. Fischione Instruments) e fotografadas com um microscópio eletrônico de transmissão Tecnai G2 T12 (120 KeV, Thermo Fisher Scientific). As imagens foram gravadas com uma câmera CCD 2k & # x000a0 & # x000d7 2k (XP1000, Gatan). Série de inclinação tomográfica e montagens de grande área foram adquiridas automaticamente usando o pacote de software SerialEM. 3 Para tomografia de eixo duplo, as imagens foram coletadas em intervalos de 1 & # x000b0 conforme as amostras eram inclinadas & # x000b162 & # x000b0. A grade foi então girada 90 & # x000b0, e uma segunda série de inclinação foi adquirida em torno do eixo ortogonal. Tomogramas foram calculados, analisados ​​e modelados usando o pacote de software IMOD 4, 5 em computadores MacPro e iMac Pro (Apple, Inc).

Vírions presuntivos de SARS-CoV-2 foram identificados a partir de reconstruções tomográficas de amostras de tecido por meio da observação de estruturas semelhantes a vírions descritos em estudos de tomografia de elétrons crio & # x02013 de SARS-CoV-2 purificado e SARS-CoV-2 em células infectadas 6, 7, 8, 9 e comparação com vírions identificados em células em cultura infectadas com SARS-CoV-2 & # x02013 (Figura Suplementar & # x000a06). Usamos os seguintes critérios para identificação do vírion SARS-CoV-2 em tecidos: (1) estruturas esféricas em 3 dimensões e não contínuas com outras estruturas adjacentes, com diâmetros de aproximadamente 60 & # x02013120 nmol / L e (2) estruturas esféricas com densidades correspondendo a uma bicamada de membrana distinta, pontos internos consistentes com ribonucleoproteínas 6 e densidades correspondendo a pontos superficiais nas periferias externas das esferas. Partículas semelhantes a vírions foram examinadas em 3 dimensões por tomografia antes das atribuições (Filmes Suplementares 1 e 2). Notamos que as vesículas internas de corpos multivesiculares (MVBs) foram erroneamente identificadas como SARS-CoV-2 por microscopia eletrônica. 10 Portanto, comparamos as medidas de vesículas internas de MVB e vírions de coronavírus presuntivos do que identificamos como compartimentos de saída intracelular dentro do mesmo tomograma (resultados não publicados) com nossas reconstruções tomográficas anteriores de MVBs. 11, 12 Nós distinguimos os vírions dentro de um compartimento de saída citoplasmático das vesículas internas de um MVB com base nas diferenças de tamanho (os vesículas internas do MVB são geralmente menores em diâmetro do que os coronavírus) e a presença de pontas superficiais e pontuações internas (as vesículas internas do MVB não apresentar pontas superficiais ou pontos internos).

Experimentos de cultura celular e isolamento de vírus

As células epiteliais de rim de macaco verde africano (Vero E6) foram originalmente adquiridas na American Type Culture Collection. As células foram mantidas em meio Eagle & # x02019s modificado por Dulbecco & # x02019s com l-glutamato, piruvato de sódio (Corning) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U de penicilina / mL e 100 mg de estreptomicina / mL. Para todos os experimentos, as células foram sempre mantidas em monocamadas.

Várias tentativas foram feitas para isolar partículas infecciosas vivas dessas amostras de biópsia. Resumidamente, as amostras de biópsia foram coletadas e armazenadas em PBS até a homogeneização. Após homogeneização e centrifugação (10.000g, 20 minutos, 4 & # x000b0C), o sobrenadante resultante foi inoculado em uma monocamada Vero E6 mantida em meio de crescimento de vírus ideal para o vírus SARS-CoV-2 (meio Eagle modificado por Dulbecco & # x02019s com l-glutamato, piruvato de sódio, 2% de FBS , 100 U de penicilina / mL e 100 mg de estreptomicina / mL 10 mmol / L de aminoácidos não essenciais, 1 mmol / L de piruvato de sódio e 10 mmol / L de HEPES). As células Vero E6 foram incubadas a 37 & # x000b0C e 5% de CO2 por uma semana e monitorado diariamente para efeito citopático potencial.

Os sobrenadantes da cultura celular também foram coletados e avaliados quanto à presença de partículas infecciosas por ensaio de placa. Resumidamente, diluições em série de 10 vezes foram realizadas em meio de infecção para SARS-CoV-2 e inoculadas em uma monocamada de células Vero E6 confluente em uma placa de 6 poços. Após 1 hora de adsorção, os sobrenadantes foram removidos e as monocamadas de células foram cobertas com meio essencial mínimo contendo 2% de FBS e ágar purificado (Thermo Scientific Oxoid) a uma concentração final de 0,7%. As células foram então incubadas durante 3 dias a 37 & # x000b0C. As células foram fixadas durante a noite com formaldeído a 10% para a inativação do potencial vírus SARS-CoV-2. A sobreposição foi removida e as células foram lavadas uma vez com PBS. Uma solução de violeta de cristal a 2% foi usada para visualização e contagem da placa. Os experimentos foram realizados sob condições BSL 3.

Detecção viral SARS-CoV-2 RNA em tecido de biópsia intestinal

Para detectar o RNA SARS-CoV-2 de amostras de biópsia intestinal, foi usada uma versão modificada do Centro de Controle e Prevenção de Doenças 2019-nCoV RT-qPCR em tempo real. Primers e sondas estavam disponíveis comercialmente (Integrated DNA Technologies, catálogo no. 10006713, RUO Kit). Os conjuntos de primer e sonda SARS-CoV-2 consistiam em 2 conjuntos específicos de nCoV 2019 (N1 e N2). Um terceiro conjunto de iniciadores foi usado para detectar RNaseP celular hospedeiro. As reações foram realizadas usando o QuantiFast Pathogen RT-PCR & # x000a0 + IC Kit (Qiagen, catálogo no. 211454). Os ensaios foram executados usando USA / WA-1/2020 SARS-CoV-2 RNA como um controle positivo e água livre de nuclease como um controle não-modelo em um formato de 384 poços. Um plasmídeo contendo a sequência do genoma da proteína N (Integrated DNA Technologies, catálogo nº 10006625, RUO Kit) foi usado para calcular o número de cópias do genoma de seus respectivos limites de ciclo usando a equação linear das respectivas curvas padrão de plasmídeo. O limite de detecção foi estabelecido como 1 & # x0201310 cópias / & # x003bcL. As reações foram realizadas em duplicado usando as seguintes condições de ciclagem no Roche LightCycler 480 Instrument II (Roche Molecular Systems, 05015243001): 50 & # x000b0C por 20 minutos, 95 & # x000b0C por 1 segundo e 95 & # x000b0C por 5 minutos, seguido por 45 ciclos de 95 & # x000b0C por 15 segundos e 60 & # x000b0C por 45 segundos. O limite de detecção para SARS-CoV-2 foi determinado usando um controle de plasmídeo disponível comercialmente (Integrated DNA Technologies, catálogo no. 10006625).

Coleta e processamento de biópsia para citometria de massa

As amostras de biópsia foram transferidas para 10 mL de tampão de dissociação (HEPES 1 mol / L [Lonza], EDTA 5 mmoles / L [Invitrogen], FBS 10% em tampão HBSS [Gibco]). Os tubos foram mantidos em um agitador (180 rotações / minuto, 37 & # x000b0C) por 20 minutos e então agitados suavemente em vórtex. As suspensões de células foram coletadas após a passagem das amostras de biópsia por filtros de células 100 & # x003bcm. Uma segunda rodada de dissociação do EDTA foi realizada conforme detalhado anteriormente. A suspensão de células foi centrifugada a 1800 rotações / minuto para sedimentar a CE e mantida em gelo. O tecido restante foi transferido para tubos frescos contendo um tampão de digestão (2% de FBS, 0,005 g de colagenase tipo IV por amostra [Sigma] e 100 & # x003bcl DNase I [Sigma] em RPMI). Os tubos foram colocados no agitador (180 rotações / minuto, 37 & # x000b0C) durante 40 minutos e depois agitados suavemente com vórtex. Os tecidos digeridos foram filtrados através de filtros de células 100 & # x003bcm, seguido por outra rodada de filtração através de filtros de células 40 & # x003bcm. As suspensões de células foram centrifugadas a 1800 rotações / minuto para obter células mononucleares LP. Ambos os pellets EC e LP foram então ressuspensos em 500 & # x003bcL de RPMI (Gibco) contendo 10% de FBS + 1 & # x003bcl Rh103 & # x000a0 + 1 & # x003bcl 5-Iodo-2 & # x02019-desoxiuridina e incubados a 37 & # x000b0C por 20 minutos. Em seguida, 5 mL de RPMI (+ FBS a 10%) foram adicionados a cada tubo e centrifugados a 1.800 rotações / minuto para as células do sedimento. Em seguida, 700 & # x003bcL de estabilizador Prot1 (SmartTube Inc) foi adicionado a cada tubo e transferido para criotubos e incubado em temperatura ambiente por 10 minutos. Os criotubos foram imediatamente transferidos para & # x0201380 & # x000b0C até que a amostra fosse adquirida para citometria de massa, conforme detalhado na próxima seção.

Coleta e processamento de sangue para citometria de massa

Resumidamente, 15 mL de meio de separação de linfócitos LymphoSep (MP Bio) foram adicionados a cada tubo de centrifugação de 50 mL. O sangue foi diluído com PBS para elevar o volume até 30 mL e o sangue diluído foi colocado em camadas suavemente sobre o LymphoSep. Os tubos foram então centrifugados a 2.000 rotações / minuto por 20 minutos com os freios e a aceleração desligados. Após centrifugação, a camada leucocitária contendo células mononucleares de sangue periférico foi transferida para outro tubo e centrifugada a 1800 rotações / minuto para sedimentar as células. Os peletes foram ressuspensos em PBS e os tubos foram centrifugados a 1800 rotações / minuto.Finalmente, os pellets foram ressuspensos no meio de congelamento (10% dimetilsulfóxido + 44% FBS em RPMI) e criopreservados a & # x0201380 & # x000b0C.

Processamento de citometria de massa e aquisição de dados

As células foram processadas conforme descrito anteriormente por Geanon et & # x000a0al. 13 Resumidamente, as amostras estabilizadas proteômica EC e LP SmartTube foram descongeladas em banho-maria 10 & # x000b0C e lavadas com Cell Staining Buffer (Fluidigm). Para facilitar a aquisição de dados e a remoção do dupleto, várias amostras também foram codificadas com códigos de barras usando kits de códigos de barras Fluidigm Pd e, em seguida, lavadas e agrupadas para aquisição de dados. Imediatamente antes da aquisição de dados, as amostras foram lavadas com Tampão de Coloração Celular e Solução de Aquisição de Células (Fluidigm) e ressuspensas a uma concentração de 1 milhão de células / mL em Solução de Aquisição de Células contendo uma diluição de 1:20 de grânulos de Normalização EQ (Fluidigm). As amostras foram então adquiridas em um Helios Mass Cytometer equipado com um injetor de amostra de boca larga a uma taxa de eventos de & # x0003c400 eventos por segundo. Após a aquisição, as aquisições repetidas da mesma amostra foram concatenadas e normalizadas usando o software Fluidigm, e as amostras com código de barras foram desmultiplexadas usando o desbarcoder de célula única Zunder.

Análise de dados de citometria de massa

Arquivos decodificados foram enviados ao Cytobank para análise. As células imunes foram identificadas com base na intensidade de DNA Ir-193 e expressão de CD45 Ce140 + grânulos de normalização, resíduos de CD45-low / Ir-193-low e amostra cruzada e multipletos de nuvem de íons Gaussianos foram excluídos da análise a jusante subsequente. A citometria por painel de anticorpos por tempo de voo é detalhada no Arquivo de Dados Suplementares 1. Os principais tipos de células imunológicas foram identificados usando a abordagem Astrolábio automatizada, cujo resultado se correlacionou amplamente com nossas abordagens de passagem manual. O impacto de cada condição testada na qualidade de coloração relativa foi avaliado de 2 maneiras: (1) as correlações gerais foram determinadas calculando os coeficientes de correlação de Pearson para a expressão mediana de cada marcador em cada subconjunto imune definido e (2) um índice de coloração (SI ) foi calculado usando populações definidas que mostram os níveis de expressão mais altos e mais baixos de cada marcador: SI & # x000a0 = (Medianpos & # x02013 Medianneg) / 2 & # x000a0 & # x000d7 Std.Devneg. Já foi descrito que os protocolos de fixação baseados em SmartTube levam em consideração artefatos de citometria de massa descritos anteriormente, como multipletos célula-célula, transbordamento isotópico ou oxidação ou configuração de instrumento de citômetro de massa. 13

Análise estatística para citometria de massa

Células CD45 + viáveis ​​predefinidas foram primeiro agrupadas e anotadas usando a Plataforma de Citometria Astrolabe (Astrolabe Diagnostics, Inc), que envolve o uso de um algoritmo de Mapas Auto-Organizáveis ​​de Fluxo (SOMs) baseado em hierarquia para rotular populações de células em amostras individuais. Esses clusters Astrolabe Profiling de cada tipo de tecido foram então meta-agrupados em todas as amostras usando o mapa de calor interativo Clustergrammer2 & # x02019s como um método para interrogar a expressão de anticorpos em cada cluster e curar e atribuir categorias de população de células. Clusters de amostra única também foram visualizados usando UMAP. As comparações de pares foram realizadas nas frequências de cada população de células identificada entre as coortes de pacientes (COVID-19 vs controle, COVID-19 grave vs controle e COVID19-assintomático / leve / moderado vs controle) para determinar a alteração de dobra (FC), P valores e FDR ajustados P valores usando o método de Benjamini-Hochberg 14 para contabilizar comparações múltiplas.

Sequenciamento de RNA

Preparação e sequenciamento da biblioteca

Bibliotecas direcionais de RNA-seq foram preparadas a partir de 50 ng de RNA total de amostras de EC e LP com a preparação TruSeq Stranded Total RNA com kit Ribo-Zero (catálogo no. 20020599). O sequenciamento de extremidades emparelhadas (100 & # x02013 pares de base) foi realizado para bibliotecas de DNA em um instrumento Illumina NovaSeq em um NovaSeq S1 Flowcell, com um rendimento médio de 39 milhões de leituras de extremidades emparelhadas / amostra.

Análise de sequenciamento de RNA

A chamada de base e a pontuação de qualidade dos dados de sequenciamento foram feitas por meio do software Real-Time Analysis da Illumina & # x02019s. O processamento de dados de RNA-seq e o mapeamento de referência foram feitos com scripts de análise personalizados combinando ferramentas disponíveis publicamente conforme descrito anteriormente 15 com as modificações a seguir, e as leituras foram mapeadas para uma referência personalizada que combinou o genoma de referência hg38 humano (versão 34, GRCh38.p13) e o genoma SARS-CoV-2 (RefSeq NC_045512) para quantificação simultânea de transcritos do hospedeiro e do vírus.

A análise de expressão diferencial de genes foi realizada com o Bioconductor edgeR package 16 usando, como entrada, uma matriz combinada de contagens brutas de leitura emparelhadas mapeadas, com genes em linhas e amostras em colunas. Antes da análise de expressão diferencial de genes, as contagens de genes foram convertidas em fragmentos por quilobase por milhão de leituras (FPKM) com o pacote RSEM com configurações padrão no modo específico de fita. 17

Genes com menos de 1 FPKM em pelo menos 50% das amostras foram removidos. As contagens de genes restantes foram então normalizadas em amostras usando a média aparada ponderada de M método dos valores. 18 A dispersão foi estimada ajustando um modelo linear generalizado conforme implementado em edgeR, e sexo foi ajustado como uma covariável em um desenho pareado por paciente. Comparações pareadas foram realizadas entre grupos de amostra (isto é, entre seções de tecido, bem como entre pacientes casos e indivíduos de controle). Diferenças de expressão significativas foram selecionadas com base em Bayes-ajustada empírica P valores corrigidos para testes múltiplos usando o método Benjamini-Hochberg (q & # x02264 .05).

Ontologia de genes e análise de enriquecimento de vias

A via KEGG e o processo biológico da Ontologia Genética, a função molecular e / ou as análises de enriquecimento do componente celular foram realizadas usando o pacote gProfileR R versão 0.6.8. 19 O conjunto de genes de fundo foi restrito a genes com expressão detectada (definidos como genes com níveis de expressão acima de 1 FPKM em pelo menos 50% das amostras). Os genes com expressão diferencial foram classificados por log2 mudança de dobra e usada como uma consulta ordenada. P os valores foram corrigidos usando o algoritmo g: SCS para levar em conta as comparações múltiplas.

Análise de Deconvolução de Tipo Celular e Enriquecimento de Assinatura Genética

Para a deconvolução do tipo de célula dos dados de RNA-seq em massa, a Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) de DEGs de caso paciente versus comparações individuais de controle foi realizada contra assinaturas de célula única de expressão de gene de tipo de célula da mucosa intestinal 20 e expressão de gene assinaturas de subconjuntos ileal DC. 21 Da mesma forma, DEGs foram testados para enriquecimento de assinaturas gênicas associadas a uma resposta antiviral, inflamação e sinalização de citocinas em tecido post mortem com infecção aguda de SARS-CoV-2 22 foram testados para significância (P & # x02264 .05) enriquecimento usando testes exatos de Fisher e usando correção de Bonferroni para comparações múltiplas.

Além disso, GSEA 23 foi realizado em uma lista de classificação de EC infectado vs análise molecular de controle. A métrica de classificação usada foi log (FC) & # x000a0 & # x000d7 & # x02013log (P valor) no entanto, os resultados foram semelhantes quando a métrica de log (FC) também foi usada (dados não mostrados). Para os conjuntos de dados associados a COVID-19 & # x02013, selecionamos 2 assinaturas de organóides infectados, 24 hSIOs-COVID-19: organóides do intestino delgado humano (hSIOs) cultivados em (1) meio de alta expansão Wnt (no ajustado P & # x0003c .05) ou (2) meio de diferenciação (no ajustado P & # x0003c .1). As configurações padrão do GSEA foram usadas, ou seja, meandiv para o modo de normalização, estatística de enriquecimento ponderado e 1000 permutações. GSEA usando o banco de dados Hallmark (versão 7.1 25) também foi executado com as mesmas configurações.

Análises Computacionais

Modelo multivariado baseado em coorte de descoberta

Para esta análise, consideramos 570 pacientes com descritores clínicos incluindo idade, sexo, raça / etnia, IMC, comorbidades (incluindo hipertensão, diabetes, doença pulmonar crônica (incluindo asma e DPOC), doença cardíaca (incluindo doença arterial coronariana, fibrilação atrial e insuficiência cardíaca) e sintomas GI. Uma regressão logística multivariada foi usada para modelar a gravidade e mortalidade como uma função de cada um dos sintomas GI e variáveis ​​clínicas, incluindo raça, idade, sexo, IMC, doenças cardíacas e pulmonares e hipertensão.

Em particular, a raça foi estratificada como branca, negra (afro-americana), hispânica e outras doenças pulmonares foi definida como 1 se o paciente fosse afetado por DPOC ou asma e como 0, caso contrário, a doença cardíaca foi definida como 1 se o paciente foi afetado por doença arterial coronariana, fibrilação atrial ou insuficiência cardíaca e a 0 caso contrário. O indicador de gravidade foi definido como igual a 1 para pacientes com doença grave e grave com EOD e a 0 para pacientes com COVID-19 leve e moderada. A mortalidade foi definida como igual a 1 para pacientes falecidos e a 0 caso contrário.

As associações significativas foram determinadas com base em intervalos de confiança de 95% (ICs) com base em 1000 iterações de bootstrap. A cada iteração de bootstrap, os pacientes foram amostrados com substituições, e as regressões logísticas foram estimadas considerando como desfecho a gravidade e a mortalidade. Em seguida, ICs de 95% dos coeficientes e ORs foram estimados entre as iterações de bootstrap.

Coorte de validação externa

Para esta análise, foram considerados 228 pacientes com dados clínicos como idade, sexo e sintomas gastrointestinais, conforme descrito por Aghemo et & # x000a0al. 1 Uma regressão logística multivariada foi usada para modelar mortalidade, admissão na UTI e o resultado composto de admissão na UTI ou mortalidade em função da presença ou ausência de diarreia e variáveis ​​clínicas, incluindo idade, sexo, IMC, doença cardíaca, DPOC, diabetes, e hipertensão. A doença cardíaca foi definida como igual a 1 se o paciente fosse afetado por doença arterial coronariana ou fibrilação atrial e como 0 caso contrário. O IC de 95% de ORs foram calculados com base em 1000 iterações de bootstrap, conforme descrito.

Em 270 pacientes desta coorte, os dados do tratamento estavam disponíveis. Os tratamentos incluíram tratamentos antivirais com hidroxicloroquina, incluindo lopinavir-ritonavir e darunavir-cobicistate tocilizumabe, esteróides, antibióticos incluindo ceftriaxona, azitromicina e piperacilina-tazobactam, inibidores da ECA das estatinas e bloqueadores do receptor da angiotensina II. Usando esses dados, realizamos o teste exato de Fisher para determinar se algum tratamento estava associado à diarreia. Além disso, calculamos ICs de 95% de ORs com base em 1000 iterações de bootstrap.

Desempenho preditivo com base na coorte de validação interna

Para esta análise, foram considerados 233 pacientes com dados clínicos incluindo idade, IMC e sintomas gastrointestinais. Para avaliar o desempenho preditivo de cada modelo, foi realizado bootstrapping. Especificamente, em cada iteração de bootstrap, amostramos aleatoriamente os pacientes na coorte de descoberta com substituição e estimamos uma regressão logística para modelar cada resultado como função de um sintoma GI específico, idade e IMC. Nesta análise, apenas a idade e o IMC foram ajustados porque eram as únicas variáveis ​​significativamente associadas a ambos os resultados em diferentes modelos de sintomas GI na coorte de descoberta (Figura & # x000a05 B e Tabela Suplementar & # x000a09). Em seguida, o modelo estimado foi usado para prever o desfecho dos pacientes na coorte de validação interna. Este procedimento foi repetido para 1000 iterações de bootstrap. Para cada iteração, a curva de característica operacional receptora (ROC) e a AUC foram calculadas. Para fins de comparação, a distribuição da AUC em 1000 iterações de bootstrap do modelo preditivo com base na idade e apenas no IMC foi considerada. Figura & # x000a05 Dmostra o boxplot de valores de AUC em 1000 iterações de bootstrap. Então, considerando o seguinte modelo,

avaliamos o efeito de cada variável no resultado calculando a redução na AUC obtida após a remoção de 1 variável de cada vez. Para este efeito, a AUC do modelo 1 foi comparada com os seguintes 3 modelos:

resultado & # x000a0 = f(idade & # x000a0 + qualquer sintoma GI) modelo 3

resultado & # x000a0 = f(IMC & # x000a0 + qualquer sintoma GI) modelo 4

para 1000 iterações de bootstrap. Seguindo essa estratégia, em & # x000a0cada iteração de bootstrap, os pacientes foram amostrados com substituição. Figura & # x000a05 E mostra os ICs de 95% de diferença em & # x000a0 as AUCs entre o modelo 1 e os modelos 2, 3 e 4 (ou seja, & # x000a0AUCModel1 & # x02013 AUCModel2, AUCModel1 & # x02013 AUCModel3, e AUCModel1 & # x02013 AUCModel4) em 1000 iterações de bootstrap. A diferença na AUC foi calculada considerando a mortalidade e a gravidade como resultado.

Efeito médio do tratamento

O ATE para a Coorte do Monte Sinai (MSH), combinando as coortes de descoberta e validação interna, e para a coorte de validação externa foram calculados por meio do pacote TMLE em R. 26 Para a coorte MSH, o ATE foi calculado para cada sintoma GI usando como resultados gravidade da doença e mortalidade. O efeito marginal foi calculado após o ajuste para covariáveis ​​como idade, raça, IMC, sexo, diabetes, doença pulmonar, doença cardíaca e hipertensão. Para a coorte de validação externa, o ATE foi calculado para diarreia na admissão na UTI, mortalidade e o composto de admissão na UTI e mortalidade. O efeito marginal foi calculado após o ajuste para covariáveis, como idade, IMC, sexo, diabetes, doença pulmonar, doença cardíaca e hipertensão.

Quantificação de cargas virais nasofaríngeas SARS-CoV-2

As cargas virais de SARS-CoV-2 foram determinadas conforme detalhado em Pujadas et & # x000a0al. 27 Resumidamente, o RNA viral foi extraído da amostra de swab de NP, seguido por RT-PCR em tempo real usando primers N2. Apenas amostras com N2Cpt de & # x0003c38 foram incluídos. O RNA viral SARS-CoV-2 foi calculado com o método delta CT e uma curva padrão. Cargas virais são apresentadas como log base 10 & # x02013 valor N2 não corrigido transformado & # x000a0 + 1000 (constante adicionada antes da transformação). 27 Para pacientes com vários esfregaços NP disponíveis, o primeiro esfregaço foi usado para análise.

Painel de citocinas ELLA

A plataforma ELLA é um método para medição rápida de citocinas usando ensaios de imunoabsorção enzimática microfluídica. O ensaio mediu TNF - & # x003b1, IL6, IL8 e IL1 & # x003b2, previamente validado pelo Mount Sinai Human Immune Monitoring Center usando plasma de pacientes com mieloma múltiplo e recentemente relatado para grande coorte de pacientes com COVID-19 admitidos no MSH .

Ensaio Proteômico Multiplexado (Olink)

Para a análise de citocinas circulantes, usamos um painel de inflamação proteômica multiplexado (Olink), que consiste em 92 proteínas relacionadas à inflamação quantificadas por uma extensão de proximidade mediada por anticorpos & # x02013 ensaio baseado. As amostras com valores de expressão de proteína normalizados abaixo do limite de detecção em & # x0003e75% das amostras foram excluídas de análises posteriores. Para o restante dos analitos, a qualquer amostra abaixo do limite de detecção foi atribuído um valor do limite de detecção dividido pela raiz quadrada de 2. O log2(FC) sobre a mediana da expressão da proteína de controle saudável foi calculada, e o procedimento de Benjamini-Hochberg foi usado para ajustar P valores para testes múltiplos.

Agrupamento de consenso de dados Olink

Para esta análise, consideramos 238 amostras com anotação de sintomas GI. O agrupamento de consenso foi realizado com base na abundância de 92 citocinas em todas as 238 amostras. O agrupamento de consenso foi realizado usando os pacotes R ConsensusClusterPlus com base em z-score & # x02013 dados normalizados. Especificamente, os marcadores foram particionados em 6 clusters usando o K-Significa algoritmo, que foi repetido 1000 vezes. Em seguida, os marcadores em cada cluster foram considerados para derivar cluster z-score assinaturas através do pacote GSVA. Com base nessas assinaturas, as associações entre diferentes grupos e sintomas GI foram derivadas por meio de regressão logística com resultado correspondente a cada sintoma GI. Figura & # x000a06 C mostra o FDR assinado (& # x02013log10 escala). P os valores foram ajustados via Benjamini-Hochberg. A análise da via para os clusters descritos foi realizada considerando todas as bases de dados KEGG e Hallmark.

Alocação de amostras para diferentes ensaios em pacientes com COVID-19 e indivíduos controle. Diagramas de Venn mostrando amostras de sangue e biópsia usadas para citometria de massa (#) e sequenciamento de RNA (& # x00394) em pacientes com COVID-19 (vermelho) e controlar indivíduos (azul) Os números nos diagramas de Venn referem-se aos respectivos pacientes e casos de controle detalhados na Tabela Suplementar & # x000a02. A tabela resume o número total de amostras de sangue e biópsia alocadas para citometria de massa e RNA-seq. N / A, não aplicável.

Coloração H & # x00026E representativa de espécimes de biópsia do intestino delgado de pacientes com COVID-19. O número do paciente no canto superior esquerdo corresponde ao número do paciente na Tabela complementar & # x000a02. Todas as amostras de biópsia são duodenais, com exceção do paciente 12, que é do íleo terminal. Barra de escala: 100 e # x003bcm.

Os IELs não estão aumentados em amostras de biópsia do intestino delgado de pacientes com COVID-19 em comparação com indivíduos de controle. (UMA) IELs CD3 + e CD8 + por milímetro de epitélio em pacientes com COVID-19 e indivíduos controle não infectados no duodeno (Preto) e íleo (cinzento). P valores gerados a partir do desemparelhado t testes. (B) Imagens representativas de IF de amostras de biópsia do intestino delgado mostrando CD3 (verde), CD8 (vermelho), e DAPI (azul) IELs CD8 + representativos (ponta de flecha) e IELs CD8 & # x02013 representativos (seta) são indicados. Barra de escala: 100 e # x003bcm. ns, não significativo.

Imagens representativas de IF de espécimes de biópsia do intestino delgado de pacientes com COVID-19. Nucleocapsídeo SARS-CoV-2 (verde), EPCAM (vermelho), e DAPI (azul) em todos os pacientes com COVID-19 em que havia tecido disponível para IF. O número do paciente no canto superior direito corresponde ao número do paciente na Tabela complementar & # x000a02. Todas as amostras de biópsia são duodenais, com exceção do paciente 12, que é do íleo terminal. O paciente 8 está faltando devido a dificuldades técnicas durante a coloração IF. Barra de escala: 100 e # x003bcm.

Imagens representativas de imunofluorescência de espécimes de biópsia do intestino delgado de indivíduos controle. Nucleocapsídeo SARS-CoV-2 (verde), EPCAM (vermelho), e DAPI (azul) em espécimes de biópsia duodenal (superior) e espécimes de biópsia ileal (diminuir) Barra de escala: 100 e # x003bcm.

Microscopia eletrônica por congelamento de alta pressão / fixação de substituição por congelamento de infecção presuntiva por SARS-CoV-2 em cultura de células Vero. (UMA) Visão geral montada de uma célula infectada (seção de 150 nm) (apresentada para comparação com estruturas análogas encontradas em amostras de tecido (Figura & # x000a02 e Filme Suplementar 1), que não pôde ser preservada em condições ideais semelhantes para microscopia eletrônica). A célula exibe um grande número de vacúolos citoplasmáticos, bolhas de superfície e citopatogenicidade geral. (B) Reconstrução tomográfica montada da porção central da célula mostrada em UMA. Um grande número de presumíveis vírions SARS-CoV-2 está contido em compartimentos citoplasmáticos, a maioria bem adjacente às periferias do compartimento & # x02019s. (C) Galeria de 30 vírions individuais presumíveis de SARS-CoV-2 retirados do tomograma mostrado em B. Cada exemplo é exibido como uma vista equatorial com uma espessura tomográfica de 4,7 nm.

Populações imunes alteradas na CE de pacientes com COVID-19 em comparação com indivíduos controle. (UMA) O mapa de calor mostra o agrupamento e a distribuição de diferentes tipos de células na CE. Frequências relativas de (B) IELs e (C) células plasmáticas na CE de indivíduos controle e pacientes com COVID-19. Círculos vermelhos abertos denotam pacientes com doença assintomática / leve / moderada, e círculos vermelhos preenchidos denotam pacientes com COVID-19 grave. Os gráficos de barra mostram as frequências médias. NK, natural killer NKT, natural killer T.

Populações imunes alteradas no sangue de pacientes com COVID-19 em comparação com indivíduos controle. (UMA) O mapa de calor mostra o agrupamento e a distribuição de diferentes tipos de células do sistema imunológico no sangue. Frequências relativas de (B) clássico (barras pontilhadas) e monócitos não clássicos (bares abertos), (C) Células T reguladoras CD4 +, e (D) Plasmócitos IgG + no sangue de indivíduos controle e pacientes com COVID-19. Círculos vermelhos abertos denotam pacientes com doença assintomática / leve / moderada, e círculos vermelhos preenchidos denotam pacientes com COVID-19 grave. Os gráficos de barra mostram as frequências médias. CM, EM de memória central, PBMC de memória efetora, célula mononuclear de sangue periférico.

Populações imunes alteradas no LP de pacientes com COVID-19 em comparação com indivíduos controle. (UMA) Frequências relativas de células imunes LP em indivíduos controle e pacientes com COVID-19. Círculos vermelhos abertos denotam pacientes com doença assintomática / leve / moderada, e círculos vermelhos preenchidos denotam pacientes com COVID-19 grave. Os gráficos de barra mostram as frequências médias. (B) Os gráficos de barras empilhados mostram a distribuição das frequências médias de células T CD4 + e CD8 + ingênuas e de memória no LP de pacientes com COVID-19 e indivíduos controle. EMRA, células T efetoras de memória que re-expressam CD45RA Freq., Frequência TREG, T regulatório.

Populações de células T alteradas em amostras de sangue e biópsia intestinal de pacientes com COVID-19 em comparação com indivíduos de controle com base em análise supervisionada. Gráficos CyTOF representativos e gráficos de barra comparando as frequências de células T CD29 + CD38 + CD4 + e CD29 + CD38 + CD8 + em (UMA) o sangue e (B) LP de indivíduos de controle (azul) e pacientes com COVID-19 (vermelho) Círculos vermelhos abertos denotam pacientes com doença assintomática / leve / moderada, e círculos vermelhos preenchidos denotam pacientes com COVID-19 grave. Os gráficos de barra mostram as frequências médias. CyTOF, citometria por tempo de vôo.

Perfis de expressão distintos no EC e LP intestinal. (UMA) Análise de componentes principais das frações CE e LP de pacientes com COVID-19 e indivíduos controle. As 2 frações de tecido se separam no componente principal 1 (x-eixo). (B) Agrupamento hierárquico das mudanças de expressão média para 6.636 genes (filas) caracterizando a CE (vermelho) ou LP (azul) frações (FDR, & # x022640.05) nas amostras de biópsia intestinal de pacientes com COVID-19 e indivíduos controle. O painel esquerdo indica genes significativos em amarelo para cada compartimento de tecido. A barra de cores (direito) indica o log médio2(FC).

Assinaturas imunológicas na CE de pacientes com COVID-19. GSEA foi realizada usando uma lista ordenada de genes diferencialmente expressos no EC infectado vs EC controle. A métrica para classificação foi log (FC) & # x000a0 & # x000d7 & # x02013log (P valor). (UMA) GSEA foi realizado no conjunto de genes EC ordenados por classificação usando conjuntos de dados organoides infectados com SARS-CoV-2 & # x02013. Os conjuntos de genes testados foram assinaturas moleculares com curadoria de conjuntos de dados experimentais de organoides infectados com SARS-CoV-2 & # x02013 usando hSIOs cultivados em meio (1) Wnt de alta expansão (EXP) (em adjP & # x0003c .05) ou (2) meio de diferenciação (DIF) (em adjP & # x0003c .1). Apenas conjuntos de genes significativamente enriquecidos (em FDR de & # x0003c0.05) são exibidos. (B) GSEA foi realizado para o mesmo conjunto de genes EC ordenados por classificação usando os conjuntos de dados da via Hallmark. Duas vias significativamente enriquecidas foram encontradas associadas a genes regulados positivamente em EC infectados em relação a indivíduos controle (em FDR de & # x0003c0,05). A pontuação de enriquecimento normalizado (NES) e os valores de FDR são os indicados.

Diagrama de fluxo da coorte de descoberta. O diagrama mostra o número total de pacientes admitidos no Sistema de Saúde Mount Sinai entre 1º e 15 de abril de 2020 e o processo de seleção que foi adotado para selecionar os pacientes na coorte de descoberta. DE, departamento de emergência.

Náuseas e vômitos foram associados à redução da mortalidade e gravidade. Curvas de Kaplan-Meier para mortalidade estratificada por (UMA) náusea e (B) vômito para pacientes na coorte de descoberta. P os valores do teste de log rank e IC de 95% das curvas de Kaplan-Meier são mostrados. Abaixo de cada curva de Kaplan-Meier, o número de pacientes em risco para diferentes pontos de tempo é relatado.

Pacientes com COVID-19 com sintomas GI apresentaram níveis reduzidos de IL6 e IL8 circulantes. (UMA) IL6, (B) IL8, (C) TNF - & # x003b1, e (D) IL1 & # x003b2 no momento da admissão em pacientes com e sem sintomas gastrointestinais. Os boxplots representam a mediana e o intervalo interquartil. P os valores foram calculados usando o 2-tailed desemparelhado t teste.

Matriz de correlação (Pearson) para 92 marcadores contidos na plataforma Olink. (UMA) Matriz de correlação entre pacientes com náuseas (deixou) em comparação com pacientes sem náuseas (direito) e (B) pacientes com vômitos (deixou) em comparação com pacientes sem vômito (direito) A atribuição de cluster derivada do uso de clustering de consenso não supervisionado é relatada na parte superior do mapa de calor.

Tabela complementar & # x000a03

Critérios para pontuação da gravidade da doença em pacientes com COVID-19

Pontuação de gravidadeCritério
SuaveSp o 2 de & # x0003e94% no ar ambiente E sem pneumonia na imagem
ModeradoSp o 2 de & # x0003c94% no ar ambiente OU pneumonia na imagem
ForteCânula nasal de alto fluxo, máscara sem rebreather, pressão positiva de dois níveis nas vias aéreas (ventilação positiva não invasiva das vias aéreas) ou ventilação mecânica E sem medicamentos pressores E depuração de creatinina & # x0003e30 mL / min E alanina aminotransferase de & # x0003c5 vezes o limite superior de normal
Grave com EODCânula nasal de alto fluxo, máscara sem rebreather, pressão positiva de dois níveis nas vias aéreas (ventilação positiva não invasiva das vias aéreas) ou ventilação mecânica E medicamentos pressores OU depuração de creatinina de & # x0003c30 OU nova terapia de substituição renal OU alanina aminotransferase de & # x0003e5 vezes o superior limite do normal

Tabela complementar & # x000a06

Dados demográficos básicos da coorte de descoberta, características clínicas e resultados


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