Em formação

Qual é o propósito do cruzamento de camundongos por várias gerações?


Ocasionalmente, encontrarei artigos que se referem a camundongos de retrocruzamento de uma cepa em relação a outra cepa de fundo (por exemplo, C57Bl6). Eles não declaram explicitamente o propósito de fazer isso, mas posso inferir que a mudança de cepa é relacionar suas descobertas com o que já é conhecido usando a nova cepa (por exemplo, C57Bl6). Normalmente, os retrocruzamentos são realizados por 5-10 gerações. É para tentar remover (epi) variação genética da cepa original em relação à nova cepa ou é mais para normalizar a expressão de uma variante alélica específica (por exemplo, knocking-in em um transgene)?


Dependendo do objetivo exato do experimento, os pesquisadores podem retrocruzar tanto para suavizar a variação genética entre os indivíduos quanto para normalizar a expressão de um transgene, embora, uma vez que você passe o estágio quimérico, a expressão do gene deva ser razoavelmente estável. Na minha experiência, o retrocruzamento permite gerar um camundongo geneticamente alterado que difere o menos possível de uma cepa parental (geralmente bem caracterizada), exceto no locus da manipulação genética. Dessa forma, quaisquer diferenças no fenótipo podem ser explicadas mais facilmente pelo nocaute / nocaute / transgene / o que você quer, e não por quaisquer variações na genética de fundo.

Por exemplo, os camundongos C57BL / 6, sendo consanguíneos, têm uma série de mutações, deficiências, resistências bem conhecidas, etc. e, por uma razão ou outra, tornaram-se uma das cepas de camundongos mais populares e caracterizadas na biologia, portanto, há um grande interesse em continuar a pesquisa usando um modelo histórico bem conhecido com tantos dados experimentais existentes. Esses camundongos são bastante diferentes da cepa 129, que é frequentemente usada para fazer cepas geneticamente modificadas iniciais devido ao grande número de linhas de células-tronco embrionárias disponíveis e outras razões técnicas que permitem a geração relativamente fácil de transgênicos, etc. por vários outros motivos, os 129s não são usados ​​com tanta frequência nos tipos de estudos que os BL / 6s, então é preferível criar a mutação em um 129 e, em seguida, cruzá-lo de volta para um fundo BL / 6. Ambas as cepas são bastante homogêneas de um indivíduo para outro (cada irmão é praticamente um gêmeo do próximo), mas uma vez que você começa a cruzar 129s com BL / 6s, você pode gerar todos os tipos de heterogeneidade genética devido a cruzamentos aleatórios e tudo as outras coisas sobre as quais gostamos tanto de falar por aqui quando se trata de mutações e meiose. Como qualquer pessoa que já trabalhou com doenças genéticas em humanos irá prontamente dizer a você, pode ser extraordinariamente difícil identificar genótipos específicos que levam a fenótipos específicos quando há tantos outros fatores de confusão presentes. Retrocruzar um mutante de 5, 10, ou mesmo 20 ou mais gerações de volta em uma cepa de referência é uma das melhores maneiras que temos no momento de controlar todas as variações genéticas que são introduzidas quando duas cepas "ferramenta" consanguíneas são cruzadas.

E agora, fotos fofas :)

129 mouse

Mouse C57BL / 6

ambas as imagens de Charles River


Qual é o propósito do cruzamento de camundongos por várias gerações? - Biologia

O rato é um sistema modelo popular porque é um mamífero com ferramentas genéticas sofisticadas e recursos genéticos significativos.

Posição entre mamíferos

As ordens de mamíferos surgiram de 50 a 65 milhões de anos atrás, em uma rápida diversificação. A ramificação das diferentes ordens de mamíferos era difícil de resolver com base em evidências morfológicas e fósseis. A comparação das sequências do genoma completo sugere que os carnívoros (cães) estão mais relacionados aos primatas (humanos) do que aos roedores (camundongos).

Os camundongos têm 20 cromossomos em seu genoma haplóide (portanto, 40 cromossomos no total). O genoma haplóide tem cerca de 3 picogramas, semelhante ao dos humanos. A ordem dos genes dos genomas de camundongos e humanos é conservada (sintenia), embora haja rearranjos, vários por cromossomo. Ao contrário da maioria dos cromossomos metacêntricos de humanos, todos os cromossomos de camundongos são acrocêntricos.

Camundongos adultos pesam 30-40 gramas (50.000 a 70.000 gramas para um humano adulto jovem) têm um volume de sangue de 2 ml (4.800 ml para humanos) e uma frequência cardíaca em repouso de 500-700 bpm (60-80 bpm para humanos) .

Os ratos de laboratório são únicos, pois há um grande número (centenas) de linhagens consanguíneas. As linhagens consanguíneas são uma linhagem de camundongos em que cada indivíduo é essencialmente geneticamente idêntico e homozigoto em todos os loci.

Cepas consanguíneas de camundongos são geradas por 20 gerações ou mais de acasalamento irmão-irmã. Embora seja freqüentemente declarado que linhagens consanguíneas de camundongos são homozigotas em todos os loci, variações menores dentro de uma linhagem consanguínea foram encontradas, e diferenças claras existem entre a mesma linhagem mantida em diferentes fornecedores ou laboratórios.

As cepas puras mais comuns de camundongos surgiram de um número limitado de camundongos geneticamente distintos e, portanto, o genoma de muitas das cepas puras comuns são um mosaico de pequenos (vários genes) trechos contíguos de um de um pequeno número de variantes genéticas. Assim, para um intervalo de vários genes contíguos (300-600 kb), duas cepas podem ser essencialmente idênticas na sequência de DNA (1 mudança de nucleotídeo por 21.000 pares de bases), ou podem ser divergentes (1 mudança de nucleotídeo por 440 pares de bases). (Frazer et al., Nature 448: 1050)

As vantagens de cepas consanguíneas de camundongos incluem a fixação de fundo genético e a reprodutibilidade desse fundo em diferentes laboratórios e ao longo do tempo (para algumas cepas, como o C57BL / 6J comum do Laboratório Jackson, a cepa foi arquivada como embriões congelados e o estoque é substituído de embriões congelados periodicamente). Dada a taxa de mutação (1 x 10 ^ -5 por locus por gameta), a deriva genética é baixa e todos os camundongos de uma determinada linhagem são essencialmente geneticamente idênticos (exceto machos / fêmeas)

Quando camundongos de duas linhagens consanguíneas diferentes são acasalados, seus descendentes são considerados camundongos F1 (geração filial um). Camundongos F1 são geneticamente idênticos um ao outro, já que cada um herdou o mesmo conjunto paterno de cromossomos e o mesmo conjunto materno de cromossomos. Camundongos F1 são mais robustos do que seus pais devido ao vigor híbrido. (Obviamente, com a exceção de que machos e fêmeas são cromossomicamente, geneticamente e fenotipicamente distintos. Além disso, pode haver efeitos epigenéticos de origem parental, de modo que a cepa feminina 1 gerada por F1 x cepa masculina 2 pode ser diferente de F1 gerada a partir da cepa feminina 2 x linhagem masculina 1 - os dois cruzamentos neste exemplo são chamados de cruzamentos recíprocos.)

Camundongos F1 acasalados irmão-irmã produzem uma geração F2. Todos os camundongos F2 são geneticamente distintos uns dos outros, uma vez que os cromossomos derivados da mãe e da mãe se recombinam antes de segregar em gametas.

Um mouse F1 acoplado a seu pai produz a primeira geração de retrocruzamento, a geração N1. Retrocruzamentos contínuos para esta cepa geram gerações subsequentes de retrocruzamento (N2, N3 etc).

Os termos isogênico, coisogênico, congênico e consômico são usados ​​para descrever tipos específicos de parentesco. Camundongos isogênicos são geneticamente idênticos, portanto, camundongos individuais diferentes de uma linhagem consanguínea são isogênicos. Os camundongos coisogênicos têm uma variante (mutação, transgene, alelo direcionado) que surgiu diretamente nessa cepa. Camundongos congênicos têm uma variante maior do que um gene, mas são isogênicos. Os camundongos congênicos normalmente eram mutantes que surgiram em uma cepa, mas que foram retrocruzados por 9 gerações ou mais em uma segunda cepa, selecionando a variante desejada em cada geração. As gerações são denotadas como um retrocruzamento com N1, N2, etc. Em um congênico, a variante, bem como os genes contíguos (da primeira cepa) perto da variante, são colocados em segundo plano, uma vez que a recombinação não removerá com eficiência o DNA intimamente ligado. Camundongos consômicos têm um cromossomo completo de uma linhagem de camundongos no fundo de uma segunda linhagem. Um conjunto de 21 linhas consômicas pode ser usado para representar cada cromossomo (nuclear) de uma cepa em um segundo.

Existem também camundongos que são mantidos como populações de camundongos geneticamente heterogêneos que são criados em rotação para manter um alto grau de heterozigosidade. Essas cepas são chamadas de cepas exangues. Algumas linhagens exangues foram colocadas sob pressão seletiva por alta reprodução em seu passado. A robustez e alta reprodução das cepas exangues tornam-nas úteis em estudos reprodutivos, tecnologias reprodutivas e em embriologia, onde um grande número de embriões mutantes (que podem ser apenas 1/4, 1/8 ou 1/16 dos embriões) são necessários . As linhagens de camundongos não-consanguíneos não devem ser consideradas mais representativas de camundongos selvagens do que camundongos consanguíneos: ambos são artefatos de laboratório, embora gerados por diferentes estratégias de reprodução e pressões seletivas.

A viabilidade de cepas consanguíneas de camundongos demonstra que essas cepas não carregam nenhuma mutação letal recessiva. Mutações letais recessivas e outras mutações deletérias estão presentes em todas as populações de animais selvagens (estima-se que cada indivíduo carregue 6 mutações recessivas), portanto, a endogamia resulta em aptidão reduzida e letalidade. Deve-se presumir que mutações letais e deletérias estavam presentes nos progenitores de camundongos de laboratório, mas as letais não foram propagadas e mutações deletérias foram selecionadas contra em um ambiente de laboratório. As cepas consanguíneas têm defeitos genéticos característicos da cepa, incluindo agenesia do corpo caloso (cepa 129), cegueira (C3H, FVB, SJL) e perda auditiva progressiva (A / J, Balb / c, C57BL / 6).

Mutações que afetaram a cor da pelagem de camundongos estavam entre os primeiros alelos mutantes estudados em camundongos, e ainda são importantes hoje. Muitas linhagens puras e consanguíneas de camundongos carregam um alelo mutante recessivo de um gene da cor da pelagem (ou combinações de alelos recessivos). Essas mutações recessivas foram úteis para detectar a contaminação de uma cepa consanguínea com camundongos selvagens ou outra cepa consanguínea.

É útil entender a genética de dois dos genes de cor de pelagem mais comuns, albino e nonagouti. Esses genes são nomes de seus fenótipos mutantes recessivos, então camundongos homozigotos mutantes no locus albino não têm pigmentação (pelos brancos e olhos rosa) e heterozigotos e tipo selvagem para albinos têm pigmentação (pelos e olhos escuros). O produto do gene albino, a tirosinase, é necessário para a síntese de todos os pigmentos. Os ratos têm dois pigmentos diferentes em cada cabelo, amarelo na ponta e preto no resto do cabelo. Em mutantes albinos, nenhum pigmento é produzido. O produto do gene nonagouti é necessário para a produção do pigmento amarelo, então camundongos mutantes nonagouti têm cabelo preto. Em heterozigotos não-agouti e tipos selvagens, o pelo parece marrom devido à combinação de pigmentos amarelos e pretos. Os camundongos mutantes para albino e não-agouti são brancos.

Ciclo de vida e reprodução

A reprodução humana (e de outros primatas superiores) difere da reprodução da maioria dos mamíferos, pois a reprodução humana não é sazonal e o ciclo ovulatório é críptico. A reprodução do camundongo na natureza varia sazonalmente, e o ciclo ovulatório é evidente e coordena o acasalamento. Longos períodos de luz diários no ciclo diário permitem uma reprodução robusta. Assim, os ratos de laboratório são mantidos em um longo ciclo de luz (12 horas de luz e 12 horas de escuridão).

O ciclo ovulatório ou estral de camundongos fêmeas tem duração de 4 a 6 dias. O ciclo estral pode se tornar sincronizado em camundongos fêmeas alojados continuamente, e pode ser suspenso na ausência de exposição a feromônios masculinos. Os ciclos suspensos podem ser reiniciados pela exposição a feromônios masculinos. Camundongos fêmeas são receptivos ao acasalamento apenas quando ovulam. Mulheres receptivas podem ser identificadas pela inspeção da genitália. A estimulação física do colo do útero no acasalamento é necessária para tornar o útero receptivo à implantação do embrião. O macho produz um tampão copulador de secreções das glândulas vesiculares e coagulantes que bloqueia a vulva por 8 a 10 horas após o acasalamento. O acasalamento de uma fêmea pode ser determinado pelo plugue, por inspeção ou com uma sonda romba.

O estro e a ovulação podem ser manipulados por injeções de hormônio para sincronizar e maximizar a ovulação (superovulação). O embrião inicial (embrião pré-implantação) está livre no oviduto e útero da fêmea do camundongo durante os primeiros 4 dias. Os embriões pré-implantados podem ser recuperados do oviduto e do útero, irrigando o meio de cultura através dos ovidutos e dos cornos uterinos (o útero dos camundongos é bicorno, tendo dois tratos anexados ao colo do útero). Os embriões pré-implantação podem ser manipulados em cultura por injeção, infecção e pela adição ou remoção de células. Eles podem ser cultivados e transferidos cirurgicamente para uma fêmea receptora (transferência de embrião). Se o útero da fêmea receptora estiver receptivo, os filhotes podem nascer. As fêmeas receptoras são acasaladas com machos vasectomizados antes da cirurgia de transferência de embriões para garantir que o útero esteja receptivo. Essas fêmeas pseudo-gestantes são acasaladas de acordo com um cronograma de acordo com a idade dos embriões transferidos.

A gestação no mouse leva de 18 a 20 dias, dependendo da cepa. Dentro de uma ninhada de embriões, há alguma variação no tempo de desenvolvimento, que é particularmente evidente nos estágios iniciais, quando o desenvolvimento morfológico é rápido.

Os estágios de embriões e fetos são designados por uma nomenclatura padronizada. Este sistema expressa o estágio de um embrião como o dia da gestação. A meia-noite anterior à tomada é designada como 0,0 dias ou E0.0. No entanto, como embriões individuais dentro de uma ninhada e embriões de diferentes linhagens se desenvolvem em taxas diferentes, o estágio de um embrião, designado em dias, é definido morfologicamente, de fato. Por exemplo, aos oito dias (meia-noite ao final do oitavo dia), alguns embriões terão formado o primeiro somito e serão E8.0, e outros em uma ninhada podem ser mais jovens com dobras de cabeça bem desenvolvidas e ter E7,75 e outro pode ser mais velho com 3 somitos e ser E8.25. Sim, é realmente tão confuso quanto você pensa que é.

A maioria das ninhadas que nascem podem ser criadas com sucesso por suas mães. Filhotes que não são viáveis ​​podem ser parcialmente ou totalmente consumidos por ratos na gaiola. Quando a mãe não está feliz, entretanto, ela pode comer toda a ninhada. Um componente chave para manter os ratos felizes é mantê-los em grupos sociais estáveis. Assim, pares de machos e fêmeas, pares de fêmeas grávidas conhecidas ou fêmeas grávidas e não grávidas têm mais probabilidade de criar filhos com sucesso do que fêmeas alojadas individualmente.

Os ratos nascem sem pelos e com os olhos fechados. Por volta das três semanas de idade, eles têm seus cabelos adultos, olhos abertos, dentes e podem pular para o topo da gaiola para se alimentar e beber. Nesse momento, eles podem ser removidos de suas mães e normalmente são alojados juntos por sexo.

Para cepas direcionadas e transgênicas, os camundongos portadores da alteração no DNA são geralmente identificados por meio de um punção de tecido da orelha em um padrão para marcar o animal e fornecer DNA para um ensaio de PCR (genotipagem). A genotipagem é mais frequentemente realizada no desmame.

A maturidade sexual pode ocorrer tão cedo quanto 6 semanas nas mulheres e 8 semanas nos homens, dependendo da estirpe.

A expectativa de vida reprodutiva varia amplamente com a linhagem, mas as fêmeas normalmente têm uma vida reprodutiva de 6 a 8 meses, enquanto os machos têm uma vida reprodutiva de cerca de um ano. Na prática, é importante não superestimar a expectativa de vida reprodutiva para não perder a capacidade de propagação da cepa.

A expectativa de vida dos camundongos também varia com a cepa, mas normalmente é de 1,5 a 2 anos.

Agentes infecciosos e bactérias comensais

Além da base genética padronizada, muito esforço é feito para padronizar o status do patógeno em camundongos. Parece óbvio que os patógenos e os ciclos de infecção podem impactar os resultados da pesquisa, mas o padrão de prática vai além dos patógenos com efeitos clínicos para incluir alguns agentes sem efeitos clínicos em camundongos normais. A justificativa para a eliminação de agentes subpatogênicos é que eles podem ter efeitos imunomoduladores, uma vez que camundongos são amplamente utilizados para pesquisas imunológicas. Esse padrão de atendimento é denominado Specific Pathogen-Free. Este padrão mudou conforme novos patógenos são descobertos ou seus efeitos são melhor compreendidos. Por exemplo, norovírus e Helicobacter sp foram adicionados à lista de patógenos excluídos recentemente.

Camundongos que possuem patógenos são tornados Livres de Patógenos Específicos por rederivação. A rederivação é uma transferência de embrião em que a mãe doadora do embrião é mantida em quarentena, os embriões são recuperados esterilmente e transportados para fora da quarentena e transferidos para uma fêmea receptora pseudogravura sem patógenos específicos, alojada em uma instalação livre de patógenos específicos.

Bactérias comensais podem afetar a fisiologia e interagir com variantes genéticas no hospedeiro. A fim de controlar os comensais, ratos livres de bactérias (ratos axênicos) podem ser gerados por cesariana. Camundongos axênicos podem então ser inoculados com populações bacterianas definidas para gerar camundongos gnotobióticos.

Culturas primárias de embriões ou fetos de camundongos (Fibroblastos Embrionários Primários de Camundongos ou MEFs) podem ser usadas para observar os fenótipos celulares. MEFs podem ser imortalizados por cultura estendida até que se tornem transformados, ou linhas de células de tecidos específicos podem ser geradas pela expressão do antígeno T de SV40 no camundongo no tecido de interesse.

Linhas celulares de embriões pré-implantação podem ser geradas. Essas linhas de células-tronco embrionárias (células ES) podem ser usadas para introduzir DNA exógeno e alterar o DNA endógeno por direcionamento de genes. Essas células ES podem ser estudadas diretamente em cultura ou podem ser usadas para gerar camundongos contendo as alterações genéticas. As cepas de camundongos existentes também podem ser usadas para gerar novas linhas de células ES, também usadas para estudar fenótipos celulares in vitro. As células ES têm muitas vantagens sobre os MEFs, incluindo proliferação mais rápida e a formação de colônias clonais.

Embriões de pré-implantação podem ser manipulados para incorporar outras células e, se as células adicionadas forem semelhantes a embriões (por exemplo, células ES), elas participarão da formação de um embrião, feto e animal nascido vivo. As células ES podem participar da formação de todos os tecidos adultos, incluindo a linha germinativa, as células que produzem gametas. Esses embriões, fetos e adultos, que são misturas de duas células geneticamente distintas, são chamados de quimeras.

Como os genomas dos diferentes componentes de uma quimera estão em células separadas, os genomas não se recombinam. Assim, se o embrião hospedeiro for a / ae a célula ES for A / A, então os espermatozóides 'a' e 'A' podem ser produzidos. Mas o espermatozóide 'a' deve vir do hospedeiro e o espermatozóide 'A' deve vir da célula ES. Se esta quimera for acasalada com um camundongo que é a / a, então a / a descendência virá das células hospedeiras, e A / a descendência virá da célula ES.

No exemplo anterior, oa e A são símbolos usados ​​para o locus nonagouti, onde os ratos a / a são pretos e os ratos A / a (e os ratos A / A) são castanhos. Este esquema é a estratégia mais frequentemente usada para determinar se as células ES são transmitidas através da linhagem germinativa para a prole.

Em um experimento de direcionamento típico, apenas uma das duas cópias do gene é direcionada, de modo que apenas 50% da prole marrom carregará a mutação desejada.

As células ES são normalmente feitas de machos. Os embriões hospedeiros não são selecionados pelo sexo, então quimeras podem ser feitas com um embrião hospedeiro macho ou fêmea. Devido à natureza dominante da testosterona e ao fato de que ela age sistemicamente, as quimeras macho / fêmea serão camundongos machos.

As quimeras também podem ser usadas experimentalmente para examinar o efeito de um gene mutante em células no contexto de tecido de tipo selvagem. Essa estratégia pode ser usada para determinar se o efeito do gene mutante atua na própria célula (autônomo) ou em seus vizinhos adjacentes ou distantes (não autônomo).

Os camundongos podem ser modificados para ter um gene introduzido, os chamados camundongos transgênicos. Normalmente, os ovos fertilizados (zigotos) são coletados e microinjetados com DNA. O DNA é injetado no núcleo do espermatozóide após a fertilização, mas antes de se fundir com o núcleo do óvulo - antes da fusão, os núcleos haplóides são chamados de pronúcleos, portanto, a injeção às vezes é chamada de injeção pronuclear. Cerca de 20% dos óvulos injetados sobreviventes terão o DNA inserido em um local de um cromossomo. O DNA injetado normalmente se insere como várias cópias de ponta a ponta (10 a 100 cópias) neste único local.

A inserção de DNA por microinjeção frequentemente (

10% das vezes) resulta em mutação. Essa alta taxa de mutagênese ocorre não porque 10% do genoma seja funcional, mas porque a inserção do DNA costuma ser acompanhada por deleção e rearranjo no local da inserção.

Os genes introduzidos na maioria das vezes são minigenes que consistem em elementos potenciadores para expressão específica de tecido, um promotor transcricional, as sequências de codificação (cDNA) e um conjunto completo de sinais de poliadenilação.

Surpreendentemente, o nível de expressão de um transgene de minigene não se correlaciona com o número de cópias.

A expressão dos transgenes pode ser perdida nas gerações subsequentes por meio do silenciamento epigenético, portanto, um meio de monitorar se o transgene continua a ser expresso é importante, e monitorar a transmissão do DNA para a prole por si só não é suficiente.

A expressão dos transgenes pode ser alterada pelo ambiente cromossômico ao seu redor. Esses efeitos incluem nível de expressão, tecidos expressos e propensão a serem silenciados.

Como nem todos os transgenes são expressos conforme desejado e porque a inserção pode ter interrompido um gene endógeno, múltiplos (

3) camundongos ou linhagens fundadores transgênicos independentes devem ser analisados ​​para garantir que os fenótipos gerados são devidos ao transgene. Para facilitar isso, cada camundongo fundador positivo para DNA da injeção é tipicamente cruzado com camundongos do tipo selvagem para estabelecer uma linha de camundongos descendentes daquele fundador, e então as diferentes linhagens fundadoras são tratadas como experimentos independentes.

Sistemas para controle temporal da expressão do transgene também existem. Um dos sistemas mais prevalentes é o sistema doxiciclina / tetraciclina. A estratégia envolve o controle da expressão gênica por meio da administração de um medicamento. Normalmente, estes sistemas envolvem dois transgenes, um que expressa um fator de transcrição que se liga ao fármaco que ativa ou inibe o fator de transcrição, o segundo tem sequências de DNA para ligação do fator de transcrição que regulam a expressão das sequências alvo em cis.

A clonagem e agrupamento do genoma com grandes (

Fragmentos genômicos de 200 kb em bibliotecas de cromossomos artificiais bacterianos (BAC) tornaram possível o uso desses fragmentos como transgenes. Ao contrário dos transgênicos de minigene, esses grandes fragmentos direcionam a expressão proporcional ao seu número de cópias no genoma, frequentemente no padrão de expressão do gene endógeno e são muito menos suscetíveis ao silenciamento epigenético. Além disso, as tecnologias estão disponíveis (por exemplo, recombineering) para modificar o DNA de maneiras sofisticadas.

Os genes das células ES em cultura podem ser manipulados por recombinação homóloga. A capacidade de crescer um grande número de células permite a seleção de células com raros eventos de recombinação homóloga, e a capacidade das células ES em contribuir com camundongos possibilita a introdução dessas alterações genéticas em camundongos, uma vez identificadas as células com eventos raros. O crescimento clonal das células ES é importante aqui novamente, por permitir o estabelecimento fácil de muitas linhas individuais de células.

Na maioria das vezes, o direcionamento do gene é usado para gerar uma mutação de forma que o gene não produza mais um produto funcional (um alelo nulo do gene). Um alelo nulo é a ferramenta genética mais importante para determinar a função normal de um gene. Essas mutações são coloquialmente chamadas de nocautes.

O direcionamento de genes pode ser usado para introduzir mutações pontuais ou outras alterações sutis de sequência ou para colocar uma nova sequência de codificação completa em um gene. Essas mutações são coloquialmente chamadas de knockins.

Como um gene pode ter funções múltiplas em momentos diferentes e em tecidos diferentes, é útil ser capaz de eliminar a função do gene em momentos específicos ou em tecidos específicos. Esses alelos são denominados alelos condicionais ou, coloquialmente, alelos flanqueados (para flanqueados por loxP). Alelos condicionais gerados por recombinação homóloga têm função de tipo selvagem até serem expostos à Cre recombinase, que deleta uma porção do gene que foi flanqueada pelas sequências de DNA que se ligam a Cre, a sequência loxP. Nos casos em que as sequências de codificação Cre são fundidas a uma forma mutante do domínio de ligação ao ligante do receptor de estrogênio (Cre-ER), o medicamento tamoxifeno pode ser administrado a camundongos para ativar Cre-ER, iniciando uma rodada de recombinação.

Bibliotecas de armadilhas gênicas de genes mutantes em células ES são um importante recurso genético. Bibliotecas de armadilhas de genes são geradas pela inserção aleatória de DNA de vetores de armadilhas de genes nos genes, com subsequente identificação molecular do gene. Os vetores de armadilhas de genes são tipicamente um de dois tipos, armadilhas aceitadoras de splice ou armadilhas poli-A. Em uma armadilha de aceitador de splice, quando a armadilha de gene se insere em um íntron na orientação correta, o padrão de splicing do gene endógeno é interrompido por splicing no aceitador de splice da armadilha de gene. O splicing na armadilha de genes também resulta na expressão de um gene de resistência a drogas e na sobrevivência dessas células na presença da droga. Em uma armadilha poli-A, o vetor armadilha de gene tem um promotor e sequências de codificação para um gene de resistência a drogas, mas nenhum sinal de poliadenilação. Na ausência de um sinal de poliadenilação, não é produzida proteína de resistência ao fármaco em quantidade suficiente para permitir a sobrevivência. Se um vetor armadilha poli-A insere a montante dos sinais de poliadenilação de um gene na orientação correta, então transcritos adequadamente terminados e adenilados para o gene de resistência a drogas serão feitos, juntamente com a proteína de resistência a drogas. Para interromper a função do gene, as armadilhas poli-A também têm um aceitador de splice para interromper o splicing do gene endógeno. Os genes que foram capturados são identificados por sequenciação de cDNAs unidos em sequências de captura de genes. As coleções de armadilhas de genes agora são grandes o suficiente para que genes com íntrons tenham sido capturados várias vezes. As armadilhas gênicas com inserções nos íntrons em direção à extremidade 5 'do gene têm maior probabilidade de resultar em perda completa da função (nula).

Recursos e repositórios mutantes

Agências científicas em todo o mundo reconheceram que seu apoio é necessário para a preservação e distribuição de camundongos variantes. Mouse Genome Informatics (MGI) no Laboratório Jackson mantém um banco de dados de camundongos mutantes, transgênicos e outras variantes que foram publicados. Este é o lugar para começar a determinar quais alelos de um gene foram publicados. O MGI está vinculado ao International Mouse Strain Resource (IMSR), que é um banco de dados de mutantes em repositórios públicos como camundongos ou gametas criopreservados, embriões ou células ES. Alelos de genes em bibliotecas de armadilhas de genes não são atualmente acessíveis por meio de MGI e IMSR. Os dois lugares para começar sua busca por alelos de armadilhas de genes são o International Genetrap Consortium e o Texas Institute for Genomic Medicine. Também existem armadilhas genéticas condicionais e podem ser pesquisadas com mais facilidade no Programa Europeu de Mutagênese Condicional em Rato (EUCOMM). Links para consórcios trabalhando a partir de fenótipos de variantes e mutantes induzidos de volta ao gene mutado - genética progressiva ou clássica - estão disponíveis na página de recursos da comunidade de fenótipos e mutantes do MGI.

O Laboratório Jackson fornece DNA genômico de muitas de suas cepas.

Bibliotecas BAC de DNA genômico foram feitas a partir de várias linhagens de camundongos consanguíneos. Duas dessas bibliotecas, de 129 e C57BL / 6J, foram sequenciadas no final e colocadas lado a lado no genoma montado, de modo que o conteúdo dos clones seja conhecido. Para 129 clones genômicos, BACs contendo seu gene podem ser identificados usando o navegador do genoma ensembl, selecionando a fonte DAS "clones 129S7 / AB2.2". Se você deseja obter um clone específico, clicar no BAC abrirá um menu e, ao selecionar o link na parte inferior da lista, será levado ao formulário de pedido de compra no Sanger Institute. Os clones C57BL6J BAC podem ser identificados com o navegador do genoma UC Santa Cruz e adquiridos no BACPAC Resources Center CHORI. As localizações dos polimorfismos de nucleotídeo único entre essas cepas podem ser verificadas aqui no site da Jax.


O gerenciamento de colônias de ratos MBP inclui os seguintes serviços.

  • Configurando pares reprodutores.
  • Monitoramento da gaiola para gravidez e filhotes recém-nascidos
  • Manutenção de registros de todos os dados essenciais. Os dados da colônia do cliente podem ser visualizados ao vivo pelo acesso ao sistema de gerenciamento de dados da colônia “MOSAIC”.
  • Filhotes com corte de cauda e orelha para genotipagem, conforme necessário.
  • Envio de tecido de camundongo para genotipagem interna ou transferência para o cliente para teste.
  • Desmamar filhotes em gaiolas.
  • Comunicar relatórios mensais da colônia ao cliente.
  • Faturamento mensal da conta UC ou pedido de compra do cliente para todos os serviços de biotério e genotipagem.

Todas as gaiolas atribuídas a um projeto de criação de um cliente específico serão cobradas na conta do cliente como uma diária (custo / gaiola / dia). Isso inclui gaiolas de reprodução e gaiolas de filhotes desmamados.

Quando a genotipagem é necessária, os filhotes serão identificados por corte do dedo do pé (ou orelha e cauda). Os filhotes serão identificados pelo número da gaiola, número do clipe do dedo do pé (ou entalhe da orelha) e data de nascimento.

Os camundongos importados de fornecedores como JAX, Harlan e CRL podem ser importados diretamente em nossas instalações MBP convencionais para projetos de reprodução personalizados.

Os camundongos importados das próprias instalações do cliente podem exigir a derivação por transferência de embriões para entrar nas instalações de alojamento convencional MBP e sempre exigirão a re-derivação para entrar em nosso alojamento de barreira SPF. As descrições de nosso invólucro de barreira limpa MBP (convencional) e instalações de invólucro de barreira SPF podem ser encontradas aqui Caixa do mouse .

Para saber mais sobre o manejo de colônias, entre em contato com nosso serviço de concierge em mbp Este endereço de e-mail está protegido contra spambots. Você deve habilitar o JavaScript para visualizá-lo. ou ligue para nós 530-754-MOUSE.


Filhos problemáticos

Para explorar como o trauma afeta gerações de ratos, os pesquisadores enfatizaram os ratos-mãe. Seus filhotes então exibiram mudanças moleculares e comportamentais, como correr mais riscos em um labirinto elevado. Essas mudanças persistiram por até cinco gerações.

Mãe separada dos filhotes e traumatizada. A mãe freqüentemente ignora os filhotes.

Filhos de machos de três meses acasalados com fêmeas não traumatizadas.

A prole apresenta alterações epigenéticas e comportamentais sem ter sofrido traumas.

Reprodução realizada por seis gerações.

Mudanças epigenéticas, como metilação do DNA e alteração do RNA

Estudos epidemiológicos de pessoas revelaram padrões semelhantes. Um dos casos mais conhecidos é o da fome no inverno holandês, uma fome que se abateu sobre a Holanda nos meses finais da Segunda Guerra Mundial. The children of women pregnant during the food shortages died earlier than peers born just before, and had higher rates of obesity, diabetes, and schizophrenia. Studies of other groups suggested the children of parents who had starved early in life—even in the womb—had more heart disease. And a look last year at historical records showed the sons of Civil War soldiers who had spent time as prisoners of war (POWs) were more likely to die early than the sons of their fellow veterans. (The researchers controlled for socioeconomic status and maternal health.)

But the human studies faced an obvious objection: The trauma could have been transmitted through parenting rather than epigenetics. Something about the POW experience, for example, might have made those veterans poor fathers, to the detriment of their sons' lives. The psychological impact of growing up with a parent who starved as a child or survived the Holocaust could itself be enough to shape a child's behavior. Answering that objection is where mouse models come in.

Mansuy began in 2001 by designing a mouse intervention that re-creates some aspects of childhood trauma. She separates mouse mothers from their pups at unpredictable intervals and further disrupts parenting by confining the mothers in tubes or dropping them in water, both stressful experiences for mice. When the mothers return to the cage and their pups, they're frantic and distracted. They often ignore the pups, compounding the stress of the separation on their offspring.

Mansuy says the mice's suffering has a purpose. "We're applying a paradigm that is inspired by human conditions," she says. "We're doing it to gain understanding for better child health."

Unsurprisingly, the pups of stressed mothers displayed altered behavior as adults. But to Mansuy's surprise, the behavioral changes persisted in the offspring's offspring. Initially, she thought this could be a result of the offspring's own behavior: Mice traumatized as pups could have been bad parents, replicating the neglect they experienced in childhood. Thus they might simply be passing on a behavioral legacy—the same lasting psychological effect that might explain such findings in humans.

To rule out that possibility, Mansuy studied only the male line, breeding untraumatized, "naïve" female mice with traumatized males, and then removing males from the mother's cage so that their behavior did not impact their offspring. After weaning, she raised the mice in mixed groups to prevent litter mates from reinforcing each other's behaviors.

Her lab repeated the procedure, sometimes going out six generations. "It worked immediately," she says of the protocol. "We could see that there were symptoms [in descendants] that were similar to the animals that were themselves separated." Descendants of stressed fathers displayed more risk-taking behavior, like exploring exposed areas of a platform suspended off the ground. When dropped in water, they "gave up" and stopped swimming sooner than control mice, an indicator of depressivelike behavior in mice.

Mansuy is "definitely a pioneer," says Romain Barrès, a molecular biologist at the University of Copenhagen. Other researchers have developed conceptually similar models, for example giving male mice altered diets or exposing them to nicotine and tracing metabolic and behavioral changes out for generations.

"If you're asking, ‘Does the experience of the parent influence the process of development?’ the answer is yes," says epigenetics researcher Michael Meaney at McGill University in Montreal, Canada, whose own studies have shown that differences in maternal care can have epigenetic effects on brain development. "Isabelle and others have documented the degree to which the experience of the parent can be passed on. The question [is] how."

Three massive freezers down the hall from Mansuy's office are filled with samples of mouse blood, liver, milk, microbiome, and other tissues. These serve as a −80°C archive of more than 10 years of data. Mansuy estimates she's collected behavioral data and tissue samples from thousands of mice altogether.

Isabelle Mansuy is searching for molecular changes that could explain how trauma in mice affects their offspring.

She hopes the biological markers of trauma are hidden in those freezers, waiting to be revealed. Many of the early mammalian epigenetics studies focused on DNA methylation, which "tags" DNA with methyl groups that switch genes off. But those changes seemed unlikely to be directly inherited: In mammals, methylation is mostly erased when egg and sperm come together to form an embryo.

Mansuy and others still think methylation could have some role. But they are also zeroing in on tiny information-rich molecules called small noncoding RNAs (sncRNAs). Most RNA is copied from DNA, and then acts as a messenger to instruct the cell's ribosomes to produce specific proteins. But cells also contain short strands of RNA that don't produce proteins. Instead, these noncoding RNAs piggyback on the messenger RNAs, interfering with or amplifying their function, thus causing more or less of certain proteins to be produced.

Mansuy and others think stress may influence sncRNAs, along with the many other biochemical changes it causes, from higher levels of hormones like cortisol to inflammation. They have focused on the sncRNAs in sperm, which may be especially vulnerable to stress during the weeks that newly formed sperm spend maturing in a twisting tube on top of the testes. Later, when sperm and egg come together, altered sncRNAs could modify the production of proteins at the very beginning of development in a way that ripples through the millions and millions of cell divisions that follow. "Hosts of signals happen as those cells become a zygote," says epigeneticist Tracy Bale at the University of Maryland in Baltimore. "If dad brings small noncoding RNAs that have an effect on mom's RNAs, that can change the trajectory of embryo development."

Bale found evidence that trauma can affect sncRNAs in sperm—and that the effects might be transmitted to offspring. She stressed mice during adolescence by barraging them for weeks at unpredictable intervals, with things like fox odors, loud noises, and bright light. Then, she examined the sncRNAs in their sperm and offspring. She found differences in nine types of sncRNAs, including one that regulates SIRT1, a gene that affects metabolism and cell growth.

She then created RNA molecules with similar alterations and injected them into early-stage embryos. When those embryos grew to adults, they carried RNA alterations like those seen in the sperm. This second generation also had lower levels of corticosterone, the mouse equivalent of cortisol, after a stressful spell inside a tight tube. "If you do the same RNA changes, you produce offspring with the same phenotype," Bale says.

Mansuy found similar RNA changes in her male mice traumatized as pups. They had higher levels of specific sncRNAs, including miR-375, which plays a role in stress response. Mansuy is convinced those molecular changes account for some of the inherited behavioral traits she documented. In one experiment, her team injected RNA from traumatized male sperm into the fertilized eggs of untraumatized parents and saw the same behavioral changes in the resulting mice.

But although the cause, in the form of altered RNA, and the effect, in the form of altered behavior and physiology, are identifiable in mouse experiments, everything else remains maddeningly difficult to untangle, especially in people. "The field has come a long way in the last 5 years," Bale says. "But we don't know what's going on in humans because we don't have a controlled environment."

Trauma to a mother mouse can alter the behavior of her descendants over multiple generations, like this father, son, and grandson.

Still, mouse data in hand, Mansuy has been looking for similar epigenetic changes in people. She analyzed blood samples from Dutch soldiers, collected before and after deployment to Afghanistan between 2005 and 2008. And she's working with clinicians in Nice, France, to examine blood samples from survivors of a horrific 2015 terror attack.

Other researchers had found altered sncRNAs in the blood of the soldiers. In 2017, for example, Dutch researchers showed soldiers exposed to combat trauma had recognizable differences in dozens of sncRNA groups, some of them correlated with PTSD. But Mansuy couldn't find the same kinds of RNA changes that appeared in her lab's mice. That could be because the soldiers' samples were years old, or simply because mice and people are different, showing the limits of mouse models. But Mansuy hopes it means epigenetic changes are sensitive to the type of trauma and when it occurs in the life course. Mice can never perfectly replicate human suffering, but, she says, "the best approach" for research "is to select a population of humans who have gone through conditions which are as similar as possible to our model."

That's where the Pakistani orphans come in. The children's chaotic early years may have some similarities to what the mice in Mansuy's lab experience, she says, including unpredictable separation from their mothers.

Early results are promising. "We have overlapping findings with the mouse model," Jawaid says. In a preprint uploaded last month to bioRxiv, Mansuy and Jawaid documented changes in the levels of fatty acids in the orphans' blood and saliva that mimicked changes in the traumatized mice—as well as similar sncRNA alterations. The presence of similar biomarkers "suggests that comparable pathways are operating after trauma in mice and children," Mansuy says.

In a conceptually similar effort to go from mice to people, biologist Larry Feig at Tufts University in Boston exposed male mice to social stress by routinely changing their cage mates. Their sperm had altered levels of specific sncRNA groups—albeit different ones from those altered in Mansuy's mice—and their offspring were more anxious and less sociable than the offspring of unstressed parents.

Working with a sperm bank, Feig then looked for the same sncRNAs in human sperm. He also asked donors to fill out the Adverse Childhood Experience (ACE) questionnaire, which asks about abusive or dysfunctional family history. The higher the men's ACE score, the more likely they were to have sperm sncRNA profiles matching what Feig had seen in mice.

But this body of research hasn't convinced everyone. Geneticist John Greally at the Albert Einstein College of Medicine in New York City has been a vocal critic of the evidence for epigenetic inheritance of trauma, pointing at small sample sizes and an overreliance on epidemiological studies. For now, he says, "Mouse models are the way to go." He's not yet seen definitive experiments even in mice, he says. "I'd like to see us be more bold and brave and move from preliminary association studies to definitive studies—and be open to the idea that there may be nothing there."

In a darkened room down the hall from Mansuy's office, just outside the mouse breeding area, two cages stand side by side on a table. One is a standard lab mouse enclosure, not much bigger than a shoebox. Wood chip–strewn cages like this are where most lab mice, including most of Mansuy's animals, spend their lives.

Next to it, black-furred, pink-tailed mice scurry up and down in a luxury two-story mouse house, equipped with three running wheels and a miniature maze. Their environment is designed to stimulate their senses and engage more of their brains in play and exploration.

In 2016, Mansuy published evidence that traumatized mice raised in this enriched environment didn't pass the symptoms of trauma to their offspring. The limited data—Mansuy says her lab is now working on an expanded study—suggest life experience can be healing as well as hurtful at the molecular level. "Environmental enrichment at the right time could eventually help correct some of the alterations which are induced by trauma," Mansuy says.

This and a few other studies suggesting epigenetic change is reversible have the potential to change the narrative of doom around the topic, researchers say. "If it's epigenetic, it's responsive to the environment," says Feig, who more than a decade ago found similar effects on brain function across generations by giving mice play tubes, running wheels, toys, and larger cages. "That means negative environmental effects are likely reversible."

In public talks and interviews, Mansuy says she's careful not to promise too much. As confident as she is in her mouse model, she says, there's lots more work to be done. "I don't think the field is moving too fast," Mansuy says. "I think it's moving too slow."


Mouse

UMA mouse, plural camundongos, is a small rodent. Characteristically, mice are known to have a pointed snout, small rounded ears, a body-length scaly tail, and a high breeding rate. The best known mouse species is the common house mouse (Mus musculus) Mice are also popular as pets. In some places, certain kinds of field mice are locally common. They are known to invade homes for food and shelter.

Mice are classified under the order Rodentia. Typical mice are classified in the genus Mus.

Mice are typically distinguished from rats by their size. Generally, when a muroid rodent is discovered, its common name includes the term mouse if it is smaller, or rat if it is larger. The common terms rat e mouse are not taxonomically specific. Scientifically, the term mouse is not confined to members of Mus for example, but also applies to species from other genera such as the deer mouse, Peromyscus.

Domestic mice sold as pets often differ substantially in size from the common house mouse. This is attributable to breeding and different conditions in the wild. The best-known strain of mouse is the white lab mouse. It has more uniform traits that are appropriate to its use in research.

Cats, wild dogs, foxes, birds of prey, snakes and even certain kinds of arthropods have been known to prey heavily upon mice. Despite this, mice populations remain plentiful. Due to its remarkable adaptability to almost any environment, the mouse is one of the most successful mammalian genera living on Earth today.

In certain contexts, mice can be considered vermin. Vermin are a major source of crop damage, [1] as they are known to cause structural damage and spread disease. Mice spread disease through their feces and are often carriers of parasites. [2] In North America, breathing dust that has come in contact with mouse excrement has been linked to hantavirus, which may lead to hantavirus pulmonary syndrome (HPS).

Primarily nocturnal [3] animals, mice compensate for their poor eyesight with a keen sense of hearing. They depend on their sense of smell to locate food and avoid predators. [4]

In the wild, mice are known to build intricate burrows. These burrows have long entrances and are equipped with escape tunnels. In at least one species, the architectural design of a burrow is a genetic trait. [5]


Ratos Knockout Específicos de Tecido

Embora os genes de "manutenção" sejam expressos em todos os tipos de células em todos os estágios de desenvolvimento, outros genes são normalmente expressos apenas em certos tipos de células quando ativados pelos sinais apropriados (por exemplo, a chegada de um hormônio).

Para estudar esses genes, pode-se esperar que os métodos descritos acima funcionem. No entanto, descobriu-se que genes que são expressos apenas em certos tecidos adultos podem ser vitais durante o desenvolvimento embrionário. Nesses casos, os animais não sobrevivem o suficiente para que seu gene knockout seja estudado.

Felizmente, agora existem técnicas com as quais camundongos transgênicos podem ser feitos, onde um determinado gene é eliminado em apenas um tipo de célula.

The Cre /loxP Sistema

One of the bacteriophages that infects E. coli, called P1, produces an enzyme &mdash designated Cre &mdash that cuts its DNA into lengths suitable for packaging into fresh virus particles. Cre corta o DNA viral sempre que encontra um par de sequências designadas loxP. Todo o DNA entre os dois loxP os locais são removidos e o DNA remanescente ligado novamente (de forma que a enzima é uma recombinase).

  • the gene encoding Cre attached to a promoter that will be activated only when it is bound by the same transcription factors that turn on the other genes required for the unique function(s) of that type of cell
  • um gene "alvo", aquele cuja função será estudada, flanqueado por loxP sequências.
  • aquelas células que
    • receber sinais (por exemplo, a chegada de um hormônio ou citocina)
    • para ligar a produção dos fatores de transcrição necessários
    • para ativar os promotores dos genes cujos produtos são necessários para aquele tipo particular de célula

    O resultado: um camundongo com um determinado gene eliminado apenas em algumas células.


    5 Coisogenic, Congenic, and Segregating Inbred Strains

    There are several ways in which inbred strains may differ at only a small part of the genome.

    5.1 Coisogenic Strains

    Coisogenic strains are inbred strains that differ at only a single locus through mutation occurring in that strain. Strains containing targeted mutations in ES cells that are then crossed to, and maintained, on the same inbred substrain from which the ES cells were derived can be regarded as coisogenic, but the possibility of mutations elsewhere should be considered. Similarly, chemically or radiation induced mutants on an inbred background can be considered coisogenic, although other genomic alterations could be present. A coisogenic strain may accumulate genetic differences over time by genetic drift unless periodically backcrossed to the parental strain.

    Coisogenic strains should be designated by the strain symbol (and where appropriate the substrain symbol) followed by a hyphen and the gene symbol of the differential allele, in italics.

    129S7/SvEvBrd-Fyn tm1SorA targeted mutation of the Fyn gene was produced using the AB1 ES cell line derived from 129S7/SvEvBrd. Chimeric animals were mated to 129S7/SvEvBrd and the allele subsequently maintained on this coisogenic strain.

    In some cases, such mutations will be maintained in heterozygous condition. It should be noted that this means that the strain designation does not reflect the breeding system, nor indicate the specific genotype of a given mouse or rat.

    C57BL/6J-Aqp2 cphThe congenital progressive hydronephrosis mutation in the aquaporin 2 gene arose on the C57BL/6J strain. It is a coisogenic strain, but because homozygotes are generally juvenile lethal, the strain is maintained by breeding heterozygotes Aqp2 cph /+ x Aqp2 cph /+.

    If the number of generations of inbreeding since the mutation arose in a coisogenic strain is to be shown, it can be indicated by adding the number of generations since the mutation to the number before:

    F110 + F23 indicates 23 generations of brother x sister matings since the occurrence of a mutation at F110 in an inbred strain.

    5.2 Congenic Strains

    Congenic strains are produced by repeated backcrosses to an inbred (background) strain, with selection for a particular marker from the donor strain (Snell 1978, Flaherty 1981). Congenic lines that differ at a histocompatibility locus and therefore resist each other's grafts are called congenic resistant (CR) lines.

    A strain developed by this method is regarded as congenic when a minimum of 10 backcross generations to the background strain have been made, counting the first hybrid or F1 generation as generation 1. At this point the residual amount of unlinked donor genome in the strain is likely to be less than 0.01. (Note that the amount of donor genome linked to the selected gene or marker is reduced at a much slower rate, approximately equivalent to 200/N, where N is the number of backcross generations for N>5 (Flaherty 1981 Silver 1995).

    Marker assisted breeding or marker assisted selection breeding, also known as "speed congenics" permits the production of congenic strains equivalent to 10 backcross generations in as few as 5 generations. (Markel et al. , 1997 Wakeland et al ., 1997). Provided that the appropriate marker selection has been used, these are termed congenic strains if the donor strain contribution unlinked to the selected locus or chromosomal region is less than 0.01. Ideally, descriptions of speed congenic strains in first publications thereof should include the number and genomic spacing of markers used to define the congenicity of the strain. Because speed congenics depend upon thorough marker analysis and can vary by particular experimental protocol, the inbred status of speed congenics should be regarded with caution.

    Congenic strains are designated by a symbol consisting of three parts. The full or abbreviated symbol of the recipient strain is separated by a period from an abbreviated symbol of the donor strain, this being the strain in which the allele or mutation originated, which may or may not be its immediate source in constructing the congenic strain. A hyphen then separates the strain name from the symbol (in italics) of the differential allele(s) introgressed from the donor strain.

    In cases where the chromosome on which the mutation arose is unknown, e.g. , the donor is not inbred or is complex or an F1 hybrid, the symbol Cg should be used to denote this complex genetic origin. The use of the donor strain symbol or Cg is essential to distinguish congenic from coisogenic strains. Cg also is used to designate a strain constructed by crossing together two congenic strains that have been backcrossed separately to the same host background, but where their respective donor strains differ. Cg also is applied where alleles originate from a single donor strain, but the congenic strain also carries other coisogenic alleles. The use of Cg after the period as the donor strain indicates that multiple alleles in the strain name came from more than one source or that the genetic origin of at least one allele in the strain name is uncertain.

    B6.AKR-H2 kA mouse strain with the genetic background of C57BL/6 but which differs from that strain by the introduction of a differential allele (H2 k ) derived from strain AKR/J.
    SHR.BN-RT1 nA rat strain with the genetic background of SHR but which differs from that strain by the introduction of a differential segment (RT1 n ) derived from strain BN.
    ACI.BUF-Pur1/MnaA rat strain with the genetic background of ACI onto which a segment from the BUF strain containing the Pur1 QTL has been transferred.
    B6.Cg- Kit W-44J Gpi1 aA mouse strain with the genetic background of C57BL/6, but where the donor strain is mixed, the Kit allele originating from C3H/HeJ and the Gpi1 allele originating from CAST/Ei.

    If several lines derived from the same host background and donor strains and carrying the same differential allele(s) are available, the individual lines should be distinguished by adding a forward slash followed by serial numbers and Laboratory codes.

    Parentheses may be used to show that an inbred, incipient congenic or congenic inbred strain may have a minor contribution from other than the defined host background and donor strain. A single additional strain contribution is indicated by the strain abbreviation in parentheses following the inbred or congenic designation. Multiple, mixed or unknown additional contributions are indicated by the symbol Cg in parentheses. If the donor is designated by Cg, parenthetical information may not be included.

    B6(C)-mutA mutation originates on an inbred ( e.g. , C57BL/6J), is crossed out to or onto another background (por exemplo., BALB/c) and then is crossed back onto the original background.
    B6(Cg)-mutA mutation arose in C57BL/6, was crossed onto a mixed or undefined background, and then was backcrossed back onto the original C57BL/6 background.
    C.129P(B6)-Il2 tm1HorA targeted mutation created in a 129 ES cell line and transferred from a B6129P mixed background to BALB/c.
    B6(C)-mutA mutation arises on a congenic strain carrying another mutation (por exemplo., B6.C-m) and the original mutation is bred out of the new strain. The new mutation is known to have occurred in a host strain-derived segment of the genome.
    B6(C)-mutA mutation arises on a hybrid or mixed background stock (por exemplo., B6CF1) and is backcrossed onto one of the original inbred strains (por exemplo., C57BL/6J). The new mutation is known to have occurred in a host strain-derived segment of the genome.
    B6.C(Cg)-mutA mutation arose on an inbred strain (por exemplo., BALB/c) and was maintained on a mixed or undefined background (por exemplo., a linkage-testing stock) before being backcrossed onto a second inbred strain (por exemplo., C57BL/6).

    If the chromosomal segment that has been transferred is defined by several genes or multiple DNA loci, the segment can be defined in the symbol by listing the most proximal and the most distal markers demonstrated to be in the segment in parentheses, separated by a hyphen.

    B6.Cg-(D4Mit25-D4Mit80)/Lt A congenic strain made by introducing into C57BL/6J a segment of chromosome 4 from an outbred or mixed strain (=Cg), extending between the two defined markers.
    B6.CBA-(D4Mit25-D4Mit80)/Lt A similar congenic strain in which the donor chromosomal segment comes from the CBA/J strain.

    Note that the markers defining the segment only describe the most proximal and distal markers tested, and this does not imply that there are not other untested markers further proximal or distal. If several lines are made, in the same or different labs that contain the same segment and would be otherwise indistinguishable, then a forward slash, serial number and Laboratory code should be appended.

    If necessary, the number of backcross generations should be indicated by N and the number in parentheses following the strain name generations should not be incorporated into the strain name. Incipient congenics may be given congenic nomenclature at N5, as long as the number of generations of backcrossing is clearly documented in information accompanying the strain. In cases where it is necessary to use more complex mating systems, the generations should be expressed as N equivalents (NE) and the strain regarded as congenic at a minimum of NE10. For example, when backcrossing a recessive gene onto an inbred background, after 10 rounds of backcrossing and intercrossing to recover a homozygote for the next backcross (20 generations), the strain would be at NE10. When a congenic strain is maintained by brother x sister matings after backcrossing, the number of brother x sister generations follows the number of backcross generations, e.g. , (N10F6), 10 generations of backcrossing followed by 6 generations of brother x sister inbreeding (NE12F17), a complex system of backcrosses and intercrosses genetically equivalent to 12 backcrosses, followed by 17 generations of brother x sister matings.

    When generating speed congenics N will be less than 10 initially, nevertheless the actual number should be given in parentheses following the N, e.g. , N(6), and the details of breeding system and markers used detailed elsewhere in a publication or database.

    5.3 Chromosome Substitution or Consomic Strains

    Chromosome substitution or consomic strains (Nadeau et al ., 2000) are produced by repeated backcrossing of a whole chromosome or its parts onto an inbred strain. O termo chromosome substitution strain is a common designation for consomic, subconsomic, and conplastic strains. To create a chromosome substitution strain, transfer of a whole chromosome or a large chromosomal region is carried out, while in congenic strains, the transferred entity is a gene, marker or genomic segment including a specific marker or interval.

    5.3.1 Consomic Strains

    Consomic strains are produced by repeated backcrossing of a whole chromosome onto an inbred strain. As with congenic strains, a minimum of 10 backcross generations is required, counting the F1 generation as generation 1. For autosomes it is necessary to genotype progeny to ensure that the selected donor chromosome has not recombined with the corresponding recipient chromosome. The generic designation for consomic strains is HOST STRAIN-Chr # DONOR STRAIN .

    SHR-Chr Y BN In this consomic rat strain, the Y chromosome from BN has been backcrossed onto SHR.
    C57BL/6J-Chr 19 SPR In this consomic mouse strain, a M.spretus Chromosome 19 has been backcrossed onto C57BL/6J.
    C57BL/6J-Chr 1 A/J Chr 3 DBA/2J In this consomic mouse strain, Chromosome 1 from the A/J strain and Chromosome 3 from the DBA/2J strain have been backcrossed onto C57BL/6J.

    Experience shows that on occasion it is impossible to transfer an entire chromosome from one strain to another due to lethal effects on a particular chromosome. For example, a consomic set on which PWD/Ph individual chromosomes were transferred to C57BL/6J revealed that Chr 11 and Chr X cannot be transferred intact. To designate "sections" of transferred chromosomes that contribute to a consomic set, regions can be indicated as a decimal 1, 2, 3, etc.

    Thus, a part of Chr 11 of this consomic set would be: C57BL/6J-Chr 11.1 PWD/Ph /ForeJ.

    Although consomic strains are similar in concept and development to congenic strains, in consomic nomenclature the name of the host strain is not abbreviated, and no period followed by the donor strain is required because the strain of origin is shown in the superscript. Capitalization of all letters in the superscript and non-italicization of the chromosome letter/number and of the superscript distinguish a chromosome identifier from an allele symbol.

    5.4 Segregating Inbred Strains

    Segregating inbred strains are inbred stains in which a particular allele or mutation is maintained in heterozygous state. They are developed by inbreeding (usually brother x sister mating) but with heterozygosity selected at each generation. They are designated like other inbred strains since the segregating locus is part of the standard genotype of the strain (see Section 5.1 Coisogenic Strains). When segregating coat color alleles are part of the inbred strain's normal phenotype, they need not be included in the strain name (see examples below). Details of inbred strain genotypes are available in publications and databases.

    129P3/J This mouse strain segregates for the tyrosinase alleles albino (Tyr c ) and chinchilla (Tyr c-ch ).
    WB/ReThis mouse strain segregates for the dominant white spotting allele of the kit oncogene (Kit W ).

    Strains that carry linked alleles in coupling or repulsion should be designated so that it is clear that the alleles are linked and the phase of the linked genes is specified.

    B6.Cg-m Lepr db /+ + In this strain the m eLepr db alleles are carried on one chromosome (in coupling) and the wild type alleles on the other.
    B6.Cg-m +/+ Lepr dbIn this strain the m e Lepr db alleles are carried on different homologs of the chromosome (in repulsion) this is also called a balanced strain.

    5.5 Conplastic Strains

    Conplastic strains are strains in which the nuclear genome from one strain has been introduced into the cytoplasm of another, either by backcrossing (in which the mitochondrial donor is always the female parent) or by direct nuclear transfer into an enucleated zygote. The designation is NUCLEAR GENOME-mt CYTOPLASMIC GENOME .

    C57BL/6J-mt BALB/c A strain with the nuclear genome of C57BL/6J and the cytoplasmic (mitochondrial) genome of BALB/c.

    Such a strain is developed by crossing male C57BL/6J mice with BALB/c females, followed by repeated backcrossing of female offspring to male C57BL/6J. As with congenic strains, a minimum of 10 backcross generations is required, counting the F1 generation as generation 1.


    Researchers succeed in making generations of mouse clones

    Mouse clones from the 24th and 25th generations. Credit: RIKEN

    Using the technique that created Dolly the sheep, researchers from the RIKEN Center for Developmental Biology in Kobe, Japan have identified a way to produce healthy mouse clones that live a normal lifespan and can be sequentially cloned indefinitely.

    Their study is published today in the journal Célula-tronco celular.

    In an experiment that started in 2005, the team led by Dr. Teruhiko Wakayama has used a technique called somatic cell nuclear transfer (SNCT) to produce 581 clones of one original 'donor' mouse, through 25 consecutive rounds of cloning.

    SNCT is a widely used cloning technique whereby a cell nucleus containing the genetic information of the individual to be cloned is inserted into a living egg that has had its own nucleus removed. It has been used successfully in laboratory animals as well as farm animals.

    However, until now, scientists hadn't been able to overcome the limitations of SNCT that resulted in low success rates and restricted the number of times mammals could be recloned. Attempts at recloning cats, pigs and mice more than two to six times had failed.

    "One possible explanation for this limit on the number of recloning attempts is an accumulation of genetic or epigenetic abnormalities over successive generations" explains Dr. Wakayama.

    To prevent possible epigenetic changes, or modifications to DNA function that do not involve a change in the DNA itself, Wakayama and his team added trichostatin, a histone deacetylase inhibitor, to the cell culture medium. Using this technique, they increased cloning efficiency by up to 6-fold.

    By improving each step of the SCNT procedure, they were able to clone the mice repeatedly 25 times without seeing a reduction in the success rate. The 581 healthy mice obtained in this way were all fertile, they gave birth to healthy pups and lived a normal lifespan of about two years, similar to normally conceived mice.

    "Our results show that there were no accumulations of epigenetic or genetic abnormalities in the mice, even after repeated cloning," conclude the authors.

    Dr. Wakayama adds, "This technique could be very useful for the large-scale production of superior-quality animals, for farming or conservation purposes."

    Dr. Wakayama's work made the news in 2008 when his team created clones from the bodies of mice that had been frozen for 16 years, using SNCT.


    Sharing Laboratory Resources: Genetically Altered Mice: Summary of a Workshop Held at the National Academy of Sciences, March 23-24, 1993.

    “Important as transgenic mice are, they are really the tip of the iceberg when compared with what we are going to see in the next few years.”–Janet Rossant

    Several hundred mouse stocks containing mutations have been used for a long time as models of human disease and for the study of metabolic processes. Traditionally, the mutations have been spontaneous or induced by chemicals or radiation. Recently, scientists have gained the ability to create mutant strains by integrating foreign DNA, with increasing specificity, into the genome of mouse cells. Such transgenes can be added at random to the genome. Offspring of the resulting mouse express the trait coded for by the foreign DNA. Alternatively, mutations can be targeted at specific loci to produce “knockout mice” which do not express the gene, or otherwise to alter gene expression. Those approaches are now revolutionizing genetic research.


    C57BL/6J is the most widely used inbred strain. It is commonly used as a general purpose strain and background strain for the generation of congenics carrying both spontaneous and induced mutations. Although this strain is refractory to many tumors, it is a permissive background for maximal expression of most mutations. C57BL/6J mice are used in a wide variety of research areas including cardiovascular biology, developmental biology, diabetes and obesity, genetics, immunology, neurobiology, and sensorineural research. C57BL/6J mice are also commonly used in the production of transgenic mice. Overall, C57BL/6J mice breed well, are long-lived, and have a low susceptibility to tumors. Primitive hematopoietic stem cells from C57BL/6J mice show greatly delayed senescence relative to BALB/c and DBA/2J. This is a dominant trait. Other characteristics include: 1) a high susceptibility to diet-induced obesity, type 2 diabetes, and atherosclerosis 2) a high incidence of microphthalmia and other associated eye abnormalities 3) resistance to audiogenic seizures 4) low bone density 5) hereditary hydrocephalus (early reports indicate 1 - 4 %) 6) portosystemic shunts (

    5%) 7) hairloss associated with overgrooming 8) a preference for alcohol and morphine 9) late-onset hearing loss 10) increased incidence of hydrocephalus and malocclusion and 11) spontaneous calcaneal luxation in 1% of aged males beginning at 6-8 months of age, resulting in ankylosing enthesopathy of that tarsal joint.

    C57BL/6J mice fed a high-fat diet develop obesity, mild to moderate hyperglycemia, and hyperinsulinemia (see JAX® Diet-induced Obesity (DIO) Models). C57BL/6J mice fed an atherogenic diet (1.25% cholesterol, 0.5% cholic acid and 15% fat) for 14 weeks develop lesions in the range of 4500 to 8000 um 2 atherosclerotic aortic lesions/aortic cross-section. The variation in aortic lesions found among various inbred strains has led to the identification of the existence of eight genes affecting atherosclerosis, Ath1 para Ath8. C57BL/6J mice also develop severe and progressive hearing loss later in life, with the disruption of both outer and inner hair cells, due to the Cdh23 Ahl alelo. Cheers and McKenzie found C57BL/6J resistant to listeriosis. A naturally occurring deletion in nicotinamide nucleotide transhydrogenase (Nnt) exons 7-11 occurred in C57BL/6J sometime prior to 1984. This deletion results in the absence of the NNT protein, and is associated with impaired glucose homeostasis control and reduced insulin secretion. This mutation is not found in C57BL/6JEi, C57BL/6N, C57BL/6NJ, C57BL/6ByJ, C57BL/10J, C57L/J, or C58/J (Toye AA, et al, Diabetologia, 2005). Since C57BL/6JEi separated from C57BL/6J in 1976, the Nnt deletion arose sometime between 1976 and 1984. The spontaneous n-Tr20 m1J C50T point mutation, which is also present in C57BL/6JEiJ but not C57BL/6NJ or C57BL/6ByJ, causes increased ribosomal pausing at AGA codons compared with that of other inbred strains (Ishimura et al., 2014). n-Tr20 has been found to be restricted in expression to the nervous system and n-Tr20 m1J causes changes in synaptic transmission and raises the electroconvulsive seizure threshold, making C57BL/6J comparatively seizure resistant (Kapur et al., 2020). Additionally, an intronic point deletion in Gabra2, which arose sometime between the early 1970's and 1990's, results in decreased transcript and protein expression of this chloride channel component in the brain.

    C57BL/6J was the DNA source for the international collaboration that generated the first high quality draft sequence of the mouse genome. 5 SNP differences have been identified that distinguish C57BL/6J from C57BL/6ByJ and C57BL/6NJ. Both C57BL/6ByJ and C57BL/6NJ type as follows: 08-015199792-M (rs3709624) is C 11-004367508-M (rs3659787) is A 13-041017317-M (rs3722313) is C 15-057561875-M (rs3702158) is G 19-049914266-M (rs3724876) is T. C57BL/6J types as follows: 08-015199792-M (rs3709624) is T 11-004367508-M (rs3659787) is G 13-041017317-M (rs3722313) is T 15-057561875-M (rs3702158) is A 19-049914266-M (rs3724876) is G (Petkov and Wiles, 2004.) Others have subsequently identified further SNP differences between sublines of C57BL/6 (Mekada et al., 2009, Zurita et al., 2010).


    Assista o vídeo: Jeśli wpłyniesz między fale krzyżowe, będziesz w niebezpieczeństwie! (Janeiro 2022).