Em formação

O estroma lamelo e o grano lamelo são iguais?


Eu tenho uma foto no meu livro que está me confundindo em como eles são diferentes. Eu tentei procurar algumas informações na internet, mas não consegui entender. Por favor, me ajude.


Eu tentarei ajudar. Mas, no futuro, poste uma foto do diagrama confuso para nos ajudar a ajudá-lo.

editar: agora que vejo seu diagrama, não tenho certeza se essa resposta é útil. Irá reconsiderar e possivelmente editar esta resposta. Obrigado por incluí-lo!

As lamelas de grana referem-se às lamelas (membranas) em contato direto com as pilhas fotossintéticas (grana), onde as lamelas do estroma são as que se conectam entre as pilhas individuais (veja aqui). Meu entendimento é que eles são funcionalmente e composicionalmente muito semelhantes, a única diferença sendo a região das lamelas em questão (link para o papel, desculpe pelo acesso pago do JSTOR). Verifique a página da Wikipedia sobre cloroplastos para mais alguns diagramas. Talvez um aqui ajude a fazer mais sentido para você!


Notas da aula, aulas 7 e 8, Tipos de músculos, ossos e cartilagem

1 Consultas e contato com a Escola Médica e Biociências Moleculares Sala CB04.06.66C (SOMENTE com hora marcada) Telefone: 9514 4157 E-mail: [email protected] A linha de assunto DEVE começar com ‘91500 Histologia’

2 Texto prescrito Histologia A Texto e Atlas 6º ed 2011, Ross MH & ampampamp Pawlina W, Lippincott Williams e Wilkins Publ Outros atlas de substituição úteis que podem ser adquiridos em segunda mão, muitos destes não terão informações factuais suficientes, mas são bons para morfologia (tecido estrutura)  Histologia e Biologia Celular: Uma Introdução à Patologia, 3ª ed. 2012 Kierszenbaum A e Tres T, Mosby Publ.  Atlas de Histologia de DeFiore com Correlações Funcionais, Eroshenko VP, 12ª ed. 2012, Point - / Lippincott, Williams and Wilkins Publ.  Atlas of Functional Histology 2ª ed. 2010, Kerr JB, Mosby Publ. (a maioria das imagens vem da 1ª ed)  Atlas of Histology with Functional and Clinical Correlations 2010, Dongmei C, Daley W, Fratkin JD, Haines DE, Lynch JC, Naftel JP e Yang G, Wolters Kluwer / Lippincott, Williams e Wilkins Publ .  Junqueira’s Basic Histology, 12ª ed. 2010, Mescher AL, Lange / McGraw Hill Publ.  Color Atlas of Histology, 5ª ed. 2009, Gartner LP e Hiatt JL, Lippincott, Williams e Wilkins Publ.  Netter’s Essential Histology, 2008, Ovalle WK e Nahirney PC, Saunders- Elsevier Publ.

  1. Conheça as características histológicas básicas dos três tipos de músculos e seja capaz de descrever as principais diferenças.
  2. Relacione as características histológicas dos três tipos de músculos às suas funções principais.
  3. Forneça exemplos das localizações dos três diferentes tipos de músculos.

5 tipos de histologia muscular: - Esquelético - Liso - Cardíaco

Músculo Esquelético  Sarcolema

Organização do músculo esquelético Ross Kaye e ampampamp Pawlina Figura 10.3 - Imagem

Unidade Contrátil Básica - Sarcomere  Miofibrilas

 Miofibrilas ligadas em série

Fibra Muscular Esquelética  Grupo de células musculares esqueléticas

 Núcleos localizados na periferia da fibra  Endomísio  Perimísio

 O epimísio envolve todo o músculo

o Grande número nos músculos posturais do pescoço e, proporcionalmente, nas costas e nas pernas. Fibras Tipo II A (contração rápida ou oxidação rápida)  Contêm grandes quantidades de mioglobina, mitocôndrias e capilares sanguíneos.  As fibras do tipo II A são vermelhas, têm uma capacidade muito alta de gerar ATP por processos metabólicos oxidativos, dividem o ATP em uma taxa muito rápida.  Têm uma velocidade de contração rápida e são resistentes à fadiga. o Essas fibras raramente são encontradas em humanos. Fibras B do tipo II (contração rápida ou glicolítica rápida)  Contêm baixo teor de mioglobina, poucas mitocôndrias, poucos capilares sanguíneos e grandes quantidades de glicogênio  As fibras do tipo II B são brancas, voltadas para gerar ATP por processos metabólicos anaeróbicos, incapazes de fornecer fibras musculares esqueléticas continuamente com ATP suficiente, fadiga facilmente, dividir ATP em uma taxa rápida e ter uma velocidade de contração rápida. o Encontrado em grande número nos músculos dos braços e ombros.

Composição do músculo corporal - NÃO EXAMINÁVEL  A maioria dos músculos esqueléticos do corpo são uma mistura dos três tipos o A proporção varia dependendo da ação normal do músculo  A maioria dos músculos esqueléticos é uma mistura de todos os três tipos de esqueléticos o Todos os esqueléticos as fibras musculares de qualquer unidade motora são todas iguais  Diferentes fibras musculares esqueléticas dependem da necessidade o A ativação de várias unidades motoras é determinada no cérebro e

o Para uma contração fraca, apenas as fibras do tipo I são ativadas por seus

o Contração mais forte do que as unidades motoras de fibras do tipo II A são

o A contração máxima ativa ambas as unidades motoras do tipo IIA e ampampamp II B

Modificação do tipo de fibra do exercício - NÃO EXAMINÁVEL  Exercícios de resistência - corrida ou natação o Causam uma transformação gradual das fibras do tipo II B em fibras do tipo II A o As fibras musculares mostram um ligeiro aumento no diâmetro, mitocôndrias,

o Resultado de alterações cardiovasculares e respiratórias que causam alterações esqueléticas

 Grande resistência por curtos períodos - levantamento de peso o Produz um aumento no tamanho e resistência das fibras B do tipo II o Devido ao aumento da síntese de construção de miofilamentos finos e grossos

 Treinamento de sprint o Constrói o super-rápido (IIb) o Pode liberar o hormônio do crescimento induzido pelo exercício.

  1. Características da fibra muscular esquelética - NÃO EXAMINÁVEL  O número de fibras musculares esqueléticas diferentes não muda o As características das presentes podem ser alteradas.  Os adultos têm ≈ 60% de fibra muscular rápida e ampampamp 40% do tipo de fibra de contração lenta

1 X 5 X

Fibras Fibras Tipo I Fibras Tipo II A Fibras Tipo II B

Tempo de contração Lento Rápido Muito Rápido

Tamanho do neurônio motor Pequeno Grande Muito Grande

Resistência à fadiga Alto Intermediário Baixo

Atividade usada para aeróbio anaeróbio de longo prazo

Força de produção Baixo Alto Muito Alto

Densidade mitocondrial Alto Alto Baixo

Densidade capilar Alto Intermediário Baixo

Capacidade oxidativa alta alta baixa

Capacidade glicolítica Baixo Alto Alto

Principal armazenamento de combustível Triglyceri des CP, Glycogen CP, Glycogen

Músculo liso  Células individuais com núcleos centrais  Tamanho pequeno  Não estriado, mas contém actina e miosina ampampamp que cruzam o citoplasma (não ao redor do núcleo)

 Raramente inervado pelo sistema autônomo o Ambos os componentes parassimpáticos e simpáticos ampampamp

Regeneração do músculo liso  Retém a capacidade regenerativa  Assim pode proliferar e regenerar o músculo liso perdido

Smooth Muscle Cells LP Kerr Figura 5.17a - Imagem

Células musculares lisas HP Kerr Figura 5.17c - Imagem

EM. Células Musculares Lisas Kerr Figura 5.18a - Imagem

EM. Células musculares lisas Corpos densos Kerr Figura 5.18b- Imagem

Diagrama Contração de células musculares lisas - Imagem http://www.cytochemistry.net/microanatomy/muscle/ smooth_muscle_2001.htm

Localização dos músculos lisos  Veias e artérias ampampamp  Pulmões  Intestino  Vesícula biliar e ampampamp Bexiga urinária  Útero  Ureter & ampampamp trompa de Falópio  Estroma fibromuscular da próstata

Músculo liso do intestino Kerr Figura 13.24 - Imagem

Músculo liso do intestino HP seção de plástico Kerr Figura 5.17d - Imagem

Músculo liso da traqueia Kerr Figura 11.4 c- Imagem

Músculo liso da artéria muscular Kerr Figura 7.8b Imagem

Músculo liso do estroma prostático Kerr Figura 18.20b- Imagem

  1. Resumo visual de todos os tipos de músculos - Diagrama - Figura 11.1 Histologia básica 4º Ed Junqueira LC & ampampamp & ampampamp Carneiro J, Lange Publ 1983

Histologia da cartilagem e osso

Descreva a estrutura, composição química e diferenças funcionais do osso compacto e tecido.

Liste as diferenças estruturais dos 3 tipos de cartilagem.

Descrever o desenvolvimento ósseo na placa de crescimento epifisário.

Diferencie a estrutura da matriz e a importância funcional das matrizes ósseas e cartilaginosas.

Cite os 3 tipos de articulações e descreva a estrutura e função da articulação sinovial.

Também conhecido como tecido conjuntivo  osso  cartilagem  articulações

Chefe do Fémur XS Kerr fig 9.10a - imagem

Tipos de osso  Osso lamelar (80% do peso do esqueleto) o Também conhecido como osso cortical, compacto ou denso o Tecido que sustenta o peso dos ossos longos o Osso maduro  tecido o Também conhecido como osso esponjoso, trabecular ou esponjoso o Estrutura de suporte e de suporte do osso interno - Na cura do osso é o precursor imaturo

Esponjoso em comparação com osso compacto Ross, Kaye e Pawlina fig

Composição celular óssea  Célula osteoprogenitora o Conhecidas como células de revestimento ósseo de ósteos periféricos e finais o Mesenquimais de origem, são semelhantes a fibroblastos (fibroblastoide)  Osteoblasto o Células formadoras de osso o Regulam a mineralização óssea  Osteócitos o Células quiescentes que regulam o cálcio sérico & ampampamp fosfato  Osteoclastos o Macrófago / remodelador o Produz colagenases

Periosteum and Bone Spicules Kerr fig 9.4b - imagem

EM da camada de crescimento ósseo de osteócitos Ross, Kaye e Pawlina fig 8.

Osteons remodelando Kerr fig 9.5a - imagem

Sistema Osteon ramificando Kerr fig 9.5c - imagem

Osteão do osso lamelar  Cilindros em camadas de colágeno  Lacunas de osteócitos entre cada camada (ou lamelo)  Canalículos irradiam de cada lacuna e abrigam processos celulares de osteócitos  Central - O canal de Havers contém componentes neurovasculares

Osso moído: ósteons e lacunas Kerr fig 9.3a - imagem

Osso moído Luz polarizada destacando o colágeno Kerr fig 9.2b - imagem

Osteócitos em lacunas com canais de comunicação finos Kerr fig

Canais interlacunares Kerr fig 9.3d - imagem

Osso tecido  Dentro do núcleo dos ossos longos  O colágeno corre em várias direções  Orientado para cargas mecânicas e tensões ampampamp atuando no osso  Revestido por osteoblastos

Cabeça de osso longo Kerr fig 9.2a - imagem

Cabeça de osso longo Kerr fig 9.4a - imagem

Osso esponjoso Kerr fig 9.10b - imagem

Cartilagem  Não se regenera  É avascular (sem irrigação sanguínea)  Nutrientes por difusão do pericôndrio e fluido sinovial ampampamp  Forma a placa de crescimento óssea o Conhecida como placa epifisária

Cartilagem do osso em desenvolvimento, primeiro sinal de ossificação é a formação de vasos sanguíneos Kerr fig 9.8d - imagem

Mineralização da cartilagem na placa epifisária Kerr fig 9.11a - imagem

Crescimento ósseo endocondral Kerr fig 9.8e- imagem

Placa de crescimento epifisário Kerr fig 9.10a - imagem

Função de cartilagem  Superfície sem fricção para movimento suave  Absorção de choque  Resiste ao estresse mecânico

Estrutura da Cartilagem - Células  Células o Condroblastos

A interface osso e cartilagem Kerr fig 9.16 - imagem

Crescimento da cartilagem Kerr fig 9.11d - imagem

Estrutura da cartilagem - Matriz de matriz (semelhante a gel)  Glicosaminoglicanos (GAGs)  Ácido hialurônico, condroitina e sulfatos de queratano ampampamp que se agregaram com fibrilas de colágeno  Proteoglicanos  Colágeno  Hidratado (entre 60 a 78% de água) ligado a GAGs carregados negativamente

Chemistry of cartilage Basic Concepts in Cell Biology & ampampamp Histology 2000 JC McKenzie & ampampamp RM Klein, McGraw-Hill Publ. Figura 14.1 - imagem


Resumo

A metástase continua sendo o maior desafio no manejo clínico do câncer. A motilidade celular é um comportamento celular fundamental e antigo que contribui para a metástase e é conservado em organismos simples. Nesta revisão, avaliamos os insights relevantes para o câncer humano que são derivados do estudo da motilidade celular em organismos modelo não mamíferos. Dictyostelium discoideum, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster e Danio rerio permitem a observação direta de células que se movem em ambientes nativos complexos e se prestam a triagens genéticas e farmacológicas em larga escala. Destacamos as percepções derivadas de cada um desses organismos, incluindo a rede de sinalização detalhada que governa a quimiotaxia para quimiocinas um novo mecanismo de invasão da membrana basal o papel positivo da E-caderina na detecção de direção coletiva na identificação e otimização de inibidores de quinase para câncer metastático de tireoide com base no trabalho em moscas e no valor do peixe-zebra para imagens ao vivo, especialmente da remodelação vascular e das interações entre as células tumorais e os tecidos do hospedeiro. Enquanto a motilidade das células tumorais e de certas células hospedeiras promovem a disseminação metastática, a motilidade das células T reativas ao tumor provavelmente aumenta seus efeitos antitumorais. Portanto, é importante elucidar os mecanismos subjacentes a todos os tipos de motilidade celular, com o objetivo final de identificar terapias combinadas que irão aumentar a motilidade de células benéficas e bloquear a propagação de células prejudiciais.


RESULTADOS

Localização dinâmica de miosina

Usando microscopia confocal, observamos a migração de células de fronteira ao vivo e em alta resolução espaço-temporal durante a delaminação (Figura 1 Filme Suplementar S1). As primeiras mudanças morfológicas após a especificação do destino das células limítrofes são que o agrupamento é arredondado e várias células se estendem e retraem as saliências ricas em actina por ∼1 h (Figura 1, D – F). Eventualmente, uma única célula líder com uma protrusão frontal dominante emerge (Figura 1G). À medida que a célula principal avança, células adicionais delaminam do epitélio (Figura 1H), finalmente se destacando das células epiteliais que permanecem para trás (Figura 1I).

Uma vez que a miosina II se reúne cooperativamente nos filamentos contráteis, acumulando-se em seus níveis mais elevados nos locais onde está ativa (Uehara et al., 2010), examinamos sua localização junto com F-actina durante a migração de células de fronteira. Usamos uma forma de cadeia leve de miosina marcada com fluorescência, conhecida em Drosófila como abóbora espaguete (Sqh). A proteína de fusão Sqh-mCherry é expressa sob as sequências regulatórias genômicas endógenas e é totalmente funcional (Martin et al., 2009). Como E-cad (Cai et al., 2014), Sqh-mCherry se acumula em níveis mais elevados nas células somáticas do que na linha germinativa (Figura 2, A – D), embora a linha germinativa contenha altos níveis de F-actina (Figura 2, A e B). A proteína Sqh-mCherry está presente nas células de fronteira ao longo de sua migração e é enriquecida perto das superfícies apicais de todas as células foliculares (Figura 2, A – D), incluindo células polares (Figura 2E). Um padrão semelhante é observado com um Sqh-GFP e Sqh-TS :: GFP (Figura Suplementar S1), embora a marcação de células polares apicais seja mais proeminente com a fusão mCherry. Derrubada de Sqh por RNAi em células polares não resulta em um fenótipo detectável (Majumder et al., 2012), mas o acúmulo de Sqh serve como um marcador útil da posição da célula polar e do lado apical do cluster.

FIGURA 2: Distribuição de espaguete (sqh) durante a migração de células limítrofes. (A – D) Projeções de intensidade máxima de câmaras de ovo fixas nos estágios 9 (A, C) e 10 (B, D) marcadas com faloidina para F-actina (verde), Hoechst (azul) e expressando Sqh-mCherry expressa de seu promotor endógeno e corado com um anticorpo anti-mCherry. A seta indica a posição da célula limítrofe e a ponta da seta indica as superfícies apicais das células foliculares posteriores (C). (E – M) Projeções de intensidade máxima de alta ampliação da localização Sqh-mCherry durante a delaminação (E, H, K), migração média (F, I, L) e na conclusão da migração (G, J, M). As setas brancas indicam o acúmulo de Sqh-mCherry na base das saliências (E), na periferia do cluster (F) e nas superfícies apicais das células polares (p) voltadas para o oócito após o encaixe no estágio 10 (G). As barras de escala em A – D e E-M são iguais. Todas as barras de escala são de 20 µm.

Em imagens fixas de células de fronteira migratórias externas, o padrão de Sqh-mCherry se sobrepõe apenas parcialmente à F-actina (Figura 2, H – M). O padrão Sqh-mCherry não é idêntico de um cluster para o outro, sugerindo que é dinâmico. Notamos acúmulo proeminente de Sqh-mCherry na base das saliências (Figura 2, E e K). Além disso, os patches de Sqh-mCherry são evidentes na periferia de alguns clusters durante a migração (Figura 2, F e L), consistentes com um relatório anterior de flashes Sqh dinâmicos durante a migração (Aranjuez et al., 2016). No final da migração, a miosina se acumula apicalmente no cluster na interface célula / oócito da fronteira (Figura 2, G e M).

Para determinar até que ponto a miosina se colocaliza com E-cad em células de fronteira em migração, rotulamos os clusters de expressão de Sqh-mCherry com anticorpo anti-E-cad e os fotografamos usando microscopia confocal. E-cad e Sqh-mCherry colocalizados extensivamente (Figura 3, A – C). Além disso, a imagem Airyscan de amostras fixas com sinais amplificados de GFP e mCherry em alta resolução lateral e axial revelou um alto grau de E-cad e Sqh colocalização em junções célula-célula dentro do agrupamento de células de fronteira e as superfícies apicais de células polares (Figura 3 , D – I Figura Suplementar S2).

FIGURA 3: Colocalização de Sqh e E-cad durante a migração de células limítrofes. Projeções de intensidade máxima da câmara de ovo fixa expressando Sqh-mCherry em níveis endógenos (rotulados por mCherry em magenta) e rotulados para E-cad (verde) (A – C). (D – I) Visualizações de alta ampliação de fatias únicas de Airyscan de aglomerados de células de borda fixa nos planos juncional (D – F) e apical (G – I). Setas brancas marcam junções de células de fronteira entre células. D representa a sobreposição de E e F. G representa a sobreposição de H e I. Projeções de intensidade máxima de imagem de lapso de tempo para (J, K) Sqh-mCherry e (M, N) E-cad-GFP. As junções celulares (setas brancas) e as células polares (p) são representadas. As linhas amarelas indicam a região usada para gerar as quimografias correspondentes para a duração dos filmes mostrados em L e O. As barras de escala em A – C, D – I, J e K, M e N, e L, O são as mesmas. As barras de escala são 20 µm (A – N) e 5 µm (L – O).

Para comparar sua dinâmica, pegamos z-stacks de Sqh e E-cad por 8 min (Filmes Suplementares 2 e 3). Para limitar a fototoxicidade, baixas intensidades de laser foram usadas, de modo que apenas os pools mais brilhantes de miosina e E-cad foram detectados (Figura 3, J, K, M e N). Quimografias de aglomerados representativos mostram pontos juncionais Sqh-mCherry que aparecem e desaparecem com meia-vida de 30 s (Figura 3L), enquanto E-cad é estável por pelo menos 20 min (Figura 3O e dados não publicados). Assim, a imagem ao vivo revelou que a miosina é mais dinâmica do que o E-cad.

Requisito de miosina II na comunicação célula-célula

Uma vez que Sqh e E-cad colocalizam, e E-cad é proposto para acoplar mecanicamente as células de fronteira, testamos se a miosina também contribui para o acoplamento mecânico. Para testar a hipótese de que a atividade da miosina acopla mecanicamente as células a seguidores, inibimos a expressão ou atividade da miosina de três maneiras diferentes (Figura 4, A – E). Primeiro, derrubamos a expressão da cadeia leve usando RNAi (Figura 4B). Em segundo lugar, expressamos uma forma não fosforilável da cadeia leve (Figura 4C), que provavelmente atua como dominante negativa (Jordan e Karess, 1997). Finalmente, bloqueamos a expressão da cadeia pesada da miosina, conhecida como Zipper (Zip), usando RNAi (Figura 4D). Cada uma dessas manipulações resultou em uma fração significativa de clusters exibindo várias saliências ectópicas (Figura 4E). Se a contratilidade mediada por miosina acoplar as células líderes aos seguidores, então esperaríamos que as células seguidoras de tipo selvagem em contato com um líder deficiente em Sqh exibissem saliências em excesso. Para testar isso, geramos agrupamentos de células de fronteira compostos por uma mistura de células de tipo selvagem e Sqh que expressam RNAi (Figura 4, F-L). Células seguidoras de tipo selvagem realmente exibiram protrusões em excesso quando em contato com células líderes depletadas de Sqh (Figura 4, G e L Suplementar Figura S3 Filmes Suplementares S4 e S5). Imagens ao vivo de clusters com Sqh reduzido mostraram uma frequência geral mais alta de protrusões laterais ectópicas que têm vida mais longa do que aquelas observadas em controles de tipo selvagem (Figura Suplementar S4 Filmes Suplementares S6-S8).

FIGURA 4: A miosina é necessária para a comunicação celular. (A – D) Imagem fixa de câmaras de ovo coradas para c306-Gal4 tub-GAL80ts dirigindo UAS-Lifeact-GFP junto com o indicado UAS-transgenes. (E) Boxplots de saliências ectópicas em aglomerados de A – D (n) representa o número total de aglomerados contados a partir de pelo menos três cruzamentos independentes. Efeito não autônomo do knockdown Sqh na formação de protrusão no controle (F, H, K) e (G, I, L) sqh-RNAi clones flip-out. A região clonal é marcada por anticorpo anti-GFP (H, I) para mostrar protrusões autônomas. Saliências não autônomas são mostradas por coloração com F-actina faloidina (setas brancas, G, L). (J) Quantificação de saliências ectópicas não autônomas. o y-eixo indica a porcentagem de clusters com saliências em células GFP-negativas n = o número de aglomerados de células limítrofes contados. Estatísticas representam desemparelhados t teste ***p & lt 0,001, **p & lt 0,01, *p & lt 0,05. As barras de escala em A – D e F – L são as mesmas. Todas as barras de escala são de 20 µm.

Normalmente, as protrusões da célula principal (a célula mais próxima do oócito) são mais longas e de vida mais longa do que as protrusões de outras células do cluster (Prasad e Montell, 2007). A pequena GTPase Rac é essencial para a protrusão e migração das células limítrofes (Murphy e Montell, 1996), e sua atividade é maior em células protuberantes (Wang et al., 2010). Além disso, a estimulação focal de uma forma fotoativável de Rac (PA-Rac) em uma célula é suficiente para orientar todo o cluster (Wang et al., 2010). PA-Rac na célula principal acelera o movimento direcionado para a frente, enquanto a ativação Rac na célula traseira inverte a direção do movimento do cluster (Wang et al., 2010) (Figura 5, A e B). Em ambos os casos, a ativação de Rac em uma célula estimula a protrusão na célula ativada e inibe a protrusão de outras células (Wang et al., 2010) (Figura 5, A e B). Assim, a célula protuberante orienta todo o cluster. E-cad é essencial para esta comunicação célula-célula (Cai et al., 2014). Para testar a hipótese de que a miosina é igualmente necessária, expressamos PA-Rac junto com sqh RNAi e Rac fotoativado na célula posterior. As protrusões foram definidas e quantificadas conforme descrito anteriormente (Wang et al., 2018). A inibição de Sqh resultou em múltiplas protrusões, não apenas na célula estimulada, mas também em outras células (Figura 5, C – E). Concluímos que a célula protuberante inibe a protrusão nas células seguintes de maneira dependente da miosina II. Os resultados foram semelhantes para os clusters fotografados perto do início de sua migração (Figura 5, C – E) ou perto do final (Figura Suplementar S5).

FIGURA 5: A miosina é necessária para a distribuição da atividade Rac em agrupamentos de células limítrofes. (A – D) Imagens ao vivo de PA-Rac em slbo-Gal4 controle (A, B) ou UAS-sqh RNAi–Expressando clusters (C, D). (A, C) Círculo branco indica a região iluminada. (B, D) As posições e morfologia do cluster foram marcadas usando sinal mCherry em PA-Rac contendo moscas antes (magenta) e após (verde) 30 min de fotoativação. Setas brancas indicam saliências ectópicas. (E) Número total de protrusões observadas por cluster para cada genótipo. Resultados semelhantes foram observados se os aglomerados foram observados próximo ao início da migração (Anterior) ou próximo ao final (Posterior) (n) indica o número de aglomerados avaliados. (F – L) Imagem raciométrica de slbo-Gal4 dirigindo UAS-Rac FRET. Exemplos de aglomerados protrusivos (F, H, K) ou não protrusivos (G, I, L) são mostrados. Clusters de controle expressos UAS-white RNAi. Células polares (p) não expressam slbo-Gal4. (J) A relação frente / trás dos sinais FRET medidos para os genótipos indicados em clusters protrusivos e não protrusivos (n) indica o número de clusters com imagens. As barras de escala em A – D e F – L são iguais. Todas as barras de escala são de 20 µm. Todos os dados foram analisados ​​por ANOVA de uma via com análise post hoc de Tukey Kramer. ****p & lt 0,0001, ***p & lt 0,001, **p & lt 0,01.

Para investigar o mecanismo dessa restrição de protrusão mediada por miosina, avaliamos os efeitos da alteração da expressão ou atividade da miosina no padrão de ativação de Rac em aglomerados de células limítrofes (Figura 5, F – L). Em clusters de tipo selvagem, a atividade Rac é mais alta nas saliências (Wang et al., 2010), especificamente enquanto eles estão se estendendo. As protrusões da célula principal normalmente mostram a atividade Rac mais alta (Figura 5F), enquanto os aglomerados não protuberantes não exibem atividade Rac mais alta na célula principal (Figura 5G). Para testar o efeito da miosina na distribuição da atividade Rac, expressamos a sonda Rac FRET estabelecida em células de fronteira juntamente com sqh RNAi. Os clusters Sqh RNAi-expressando mostraram redução do enriquecimento frontal da atividade Rac em relação aos clusters de controle (Figura 5, H e J). Assim, a atividade da miosina é essencial para a assimetria na ativação Rac observada em aglomerados protuberantes. Expressão de uma versão fosfomimética de Sqh (SqhE20E21), projetada para causar ativação constitutiva (Hannaford et al., 2018), teve um efeito semelhante (Figura 5, J – L), mostrando que a regulação espacial e / ou temporal da atividade da miosina é essencial para estabelecer a atividade Rac assimétrica.

A distribuição da miosina depende do E-cad

Como a miosina e o E-cad se colocalizam e funcionam na comunicação célula-célula, perguntamos se a miosina é recrutada de maneira dependente do E-cad. Comparamos a distribuição de Sqh-mCherry em grupos de controle com aqueles com expressão de E-cad reduzida (Figura 6, A – H). Várias linhas de RNAi validadas que têm potências variáveis ​​estão disponíveis para E-cad (Tabela Suplementar S1). Uma vez que as células de fronteira com knockdown E-cad completo raramente migram (Niewiadomska et al., 1999 Cai et al., 2014), realizamos experimentos em baixa temperatura (18 ° C) que produz um leve defeito de migração para analisar o efeito na miosina. Embora essa abordagem arrisque subestimar o efeito fenotípico, pensamos que era importante comparar o controle migratório e os clusters de knockdown, em vez de comparar os clusters de controle migratório com os clusters de knockdown de E-cad imóveis. Após o knockdown parcial de E-cad, observamos aglomerados protrusivos e aglomerados arredondados, como nos controles (Figura 6, Filmes Suplementares A – H S9 – S14). Os agrupamentos de ambas as morfologias exibiram miosina cortical significativamente reduzida em comparação com os controles (Figura 6I). Para quantificar o efeito, usamos imagem confocal de varredura a laser para capturar filmes de lapso de tempo de células de fronteira em migração marcadas com Lifeact-GFP e Sqh-mCherry. Usando o software de análise de imagem Imaris, segmentamos o cluster de células de fronteira com base no canal Lifeact-GFP e, em seguida, isolamos o perímetro do cluster (Supplemental Movie S15). Usamos o canal Sqh-mCherry para medir os níveis de miosina cortical normalizados para o sinal Sqh-mCherry nas células de enfermagem adjacentes ao agrupamento de células de fronteira, para corrigir o fotobranqueamento. Devido às flutuações dinâmicas normais da miosina cortical, há uma grande variação na intensidade da miosina cortical em aglomerados de tipo selvagem (Figura 6I). O knockdown de E-cad reduziu os níveis gerais e as flutuações de miosina cortical (Figura 6I). A Figura 6J ilustra esquematicamente os efeitos da miosina cortical baixa versus alta, tanto no controle quanto nos agrupamentos de knockdown de E-cad. Juntos, esses resultados mostram que o recrutamento de miosina requer adesão mediada por E-cad entre as células limítrofes.

FIGURA 6: Requisito mútuo para E-cad e Sqh. (A – H) Fotos instantâneas de imagens de lapso de tempo de clusters que coexpressam Lifeact-GFP sob o controle do slbo potenciador e Sqh-mCherry de seu promotor endógeno. (A – D) Clusters de controle expressando UAS-white RNAi em aglomerados protrusivos (A, B) e redondos (C, D). (E – H) Células limítrofes expressando RNAi UAS-E-cad em aglomerados protrusivos (E, F) e redondos (G, H). Todos os genótipos incluem c306-Gal4 e foram incubados a 18 ° C. (B, D, F, H) Canal somente de miosina. (I) Box plot comparando a intensidade média da miosina cortical no controle vs. E-cad RNAi–Expressando clusters. n refere-se ao número total de frames medidos a partir de seis controles e nove E-cad RNAi filmes de lapso de tempo. (J) Representação esquemática dos efeitos da variação do nível de miosina em aglomerados protrusivos e redondos. (K – N) células expressando Flipout-Gal4 (marcadas pelo anticorpo GFP em verde) em clusters que expressam controle, UAS-white RNAi (K, L), ou UAS-sqh RNAi (M, N) corado para E-cad (magenta). A seta indica uma descontinuidade na junção observada na fração indicada de aglomerados clonais. As barras de escala em A – H e K – N são iguais. Todas as barras de escala são de 20 µm. Os dados foram analisados ​​usando não emparelhados t teste. ****p & lt 0,0001.

Para avaliar se a miosina também exerce um efeito sobre os contatos E-cad e / ou célula-célula, comparamos a localização do E-cad no controle e sqh Células de fronteira que expressam RNAi (Figura 6, K-N). Usamos a técnica FLPout (ver Materiais e métodos), portanto, os clusters eram compostos por uma mistura de células GFP-positivas e GFP-negativas. Em grupos de controle em que as células GFP + e GFP– expressam níveis normais de Sqh, a marcação E-cad do domínio da célula polar apical e os contatos de células de fronteira / células de fronteira são evidentes (Figura 6, K e L). Em clusters em que as células GFP + também expressam sqh RNAi, contatos de células de fronteira / células de fronteira pareceram irregulares em 8/36 amostras examinadas (Figura 6, M e N) em comparação com os contatos relativamente suaves entre células de controle em agrupamentos 29/29 (Figura 6, K e L). Os 28 restantes sqh As amostras de RNAi não eram claramente distinguíveis do tipo selvagem. Esses resultados sugerem que normalmente há tensão mediada por actomiosina mantendo os contatos entre células da fronteira, como em monocamadas epiteliais in vitro (Warner e Longmore, 2009 Acharya et al., 2018 Charras e Yap, 2018).

A miosina atua na retração de protrusões de chumbo

Observamos o acúmulo proeminente, mas transitório, de Sqh-mCherry na base das saliências (Figuras 2E e 7A, Filmes Suplementares S16 e S17), que não foi descrito anteriormente. Realizamos imagens ao vivo e descobrimos que, conforme as protrusões se aproximam de sua extensão máxima, Sqh-mCherry se acumula e é seguido por retração da protrusão. Para quantificar esse efeito, medimos a mudança no comprimento de protrusão (ΔL) por unidade de tempo (Figura 7B). ΔL positivo indica protrusão, enquanto valores negativos de ΔL representam retração. A representação gráfica da intensidade da miosina como uma função da taxa de alteração do comprimento da protrusão demonstra uma correlação positiva entre o acúmulo e a retração da miosina e uma correlação negativa com a protrusão (Figura 7C).

FIGURA 7: O acúmulo de miosina precede as retrações de protrusão. (A) Imagens instantâneas de lapso de tempo de um cluster representativo expressando Lifeact-GFP (verde) e Sqh-mCherry (magenta) durante uma extensão de protrusão e ciclo de retração. As células polares são marcadas com p. (B) Esquema mostrando como as mudanças nos comprimentos de protrusão da célula principal (ΔL) foram medidas. (C) Gráfico de ΔL vs. intensidade de miosina em 29 ciclos de protrusão / retração de três filmes de lapso de tempo independentes. Todas as barras de escala são de 20 µm. O valor de R2 da linha de tendência é 0,64. (D) Gráfico de caixa de velocidade instantânea de (77) ciclos de protrusão e (72) retrações.

Esta observação força uma reavaliação das funções das saliências. Com base apenas na imagem do tecido fixo, Fulga e Rørth (2002) sugeriram que as saliências funcionam como uma garra para puxar o cluster para frente (Schober e Perrimon, 2002). No entanto, tal modelo implica que a ponta da saliência adere fortemente ao substrato e não retrairá, mas será incluída no agrupamento de avanço. Observamos que 130/162 protuberâncias retraíram, sugerindo que a maioria das protuberâncias não são garras eficazes. O modelo de agarrar e puxar prevê ainda que os aglomerados avançarão mais rapidamente quando as saliências forem estendidas ao máximo e que os aglomerados não protuberantes não avançarão. We quantified cluster migration speed in relation to protrusion extension and retraction. Importantly, we measured migration speed by following the displacement of the polar cells, rather than following the geometric center of the cluster. This approach is key because the mere extension of a forward-directed protrusion creates an illusion of forward cluster movement when measuring the geometric center, whereas following polar cells does not suffer from this artifact. We found that protruding and retracting clusters move with similar velocities (Figure 7D). Therefore we conclude that protrusions are dynamic and serve some function other than pulling the cluster forward (see Discussão).

Phosphomimetic myosin is sufficient to cause a mesenchymal to amoeboid transition in vivo

Tumor cell lines can undergo a transition from mesenchymal to amoeboid migration both in vitro and when xenografted in mice (Pinner and Sahai, 2008 Friedl and Wolf, 2010 Sanz-Moreno et al., 2011). The mesenchymal mode of motility is characterized by high Rac activity and pseudopod-driven movements, similar to normal border cell migration. In contrast, cells that migrate in an amoeboid manner are round and exhibit blebs due to high Rho and Rho kinase activity. Hyperactivation of Rho is sufficient to drive the mesenchymal to amoeboid transition in some cell lines (Panková et al., 2010 Yilmaz and Christofori, 2010). Amoeboid movement is likely dependent on high actomyosin contractility downstream of Rho, however it is unknown whether hyperactivating myosin is sufficient to trigger a mesenchymal to amoeboid transition. Moreover, to our knowledge such transitions have not been reported in untransformed cells.

To test whether constitutive activation of myosin would cause a similar effect, we expressed the phosphomimetic form of Sqh, SqhE20E21. The substitution of glutamate for serine or threonine at these residues mimics the activation by phosphorylation by myosin light chain kinase. We found that SqhE20E2, like active Rho, is sufficient to cause a transition from collective, pseudopod-dependent border cell migration to amoeboid, blebbing motility (Figure 8 Supplemental Movies S6 and S18–S20). Live imaging of SqhE20E21-­expressing clusters revealed that in some frames, some cells exhibited small protrusions (Figure 8E and Supplemental Movie S19). This resulted in migration that was slower than control clusters (Figure 8, D and I). Notably, blebbing-based amoeboid motion in SqhE20E21 clusters is faster than protrusive motility (Figure 8, F and I). Even after reaching the oocyte border, cells expressing SqhE20E21 maintain a rounded, blebbing morphology compared with the epithelial morphology of control clusters (Figure 8, G and H). The transition to amoeboid morphology and migration also caused clusters to break into single cells and cell pairs. This suggests that hyperactive actomyosin contractility is sufficient to break the cell–cell adhesions that normally hold the cluster together. Although sqhE20E21 surprisingly displays reduced motor activity in vitro (Vasquez et al., 2016), we observed similar cluster morphology and blebs when we expressed a constitutively active (CA) version of Rho (Rho1V14) in border cells. Thus SqhE20E21 phenocopies hyperactivation of Rho, suggesting that in vivo SqhE20E21 is constitutively active, as expected (Supplemental Movies S21–S22). We conclude that regulation of the level of myosin activity is important because either reducing or increasing activity impaired border cell migration.

FIGURE 8: Myosin activation causes hypercontractility and membrane blebs. (A–C) Fixed imaging of clusters expressing c306-Gal4 tub-GAL80ts dirigindo UAS-Lifeact-GFP e UAS-white RNAi in control (A), or clusters expressing constitutively active Sqh (B, C). Egg chambers are stained with anti-GFP antibody (green), F-actin (magenta), and Hoechst (blue). Clusters can split and migrate as blebbing amoeboid cells (B) or split into blebbing amoeboid cells that fail to migrate (C). (D–H) High-magnification views of the indicated genotypes in protrusive or blebbing states. Arrows indicate protrusions or membrane blebs in E, F, and H. (I) Box plot of border cell cluster migration speed measured in 10 time-lapses for control and SqhE20E21 expressing clusters in protrusive or bleb phases. Scale bars in A–C and D–H are the same. All scale bars are 20 µm. All data were analyzed by one-way ANOVA with Tukey Kramer post hoc analysis. ***p < 0.001, *p & lt 0,05.


tissue that makes up stems:

Epiderme the outer layer of the stem - role is protection of cells beneath it , secretes cutin a waxy substance which helps prevent water loss some contain hairs which can be stiff for protection or loaded with irritant chemicals

Parênquima - packing tissue, parenchyma is most common, unspecialised cells which can be modified e.g into collenchyma and sclerenchyma.

collenchyma gives the tissue its strength found around the outside of the stem just under the epidermis give support but remain living ( not lignin)

sclerenchyma develops as plant gets bigger and needs more support makes strong secondary cell walls lignin is depsited on the cell walls making it no longer permiable the cell dies and becomes hollow forming wood. when it becomes compleatly impregnated it forms a sclereids.

in order from inside nucleus, vacuole, cytoplasm, middle lamellum, parenchyma (primary cell wall) collenchyma (extra cellulose), sclerenchyma (secondary cell wall, with lignin), epidermis.


Introdução

The physical properties of the extracellular matrix (ECM) milieu are widely acknowledged as fundamental determinants of cell fate, tissue homeostasis, immune response, wound healing, and cancer progression [[1], [2], [3], [4]]. Within a given tissue, the ECM not only provides structural support but regulates cell signaling via reciprocal biochemical and biophysical cues [5]. On one hand, the ECM contributes to overall tissue mechanics, and the effects of mechanical properties on cell fate and phenotype have been extensively studied using in vitro and in vivo assays [[6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]]. For example, tissues become progressively stiffer as a function of malignant transformation from normal to tumors [9]. In addition, the architecture of the ECM provides structural feedback, such as topographical cues [[13], [14], [15], [16]]. Topography, simply described, refers to the shape and profile of a given material's surface [[17], [18], [19]]. Cells respond to topographical and stiffness-mediated cues through biochemical signaling via cellular adhesions and cytoskeletal attachments to the ECM [20]. Cell sensing of architectural and mechanical cues is a complex phenomenon where ECM adhesion molecules act concomitantly with intracellular machinery to drive cellular responses [21]. In vivo, tissue topographical cues are heterogeneous, with hybrid structures comprised of aligned ridges and pores that span lengths from nanoscale to microscale [[17], [18], [19]]. On the nanoscale level, ECM proteins can adopt different morphologies, such as globular and fibrillar architectures [17,18]. One such example is fibronectin (FN), which presents different cell binding sites and is alternatively spliced to generate conformation which initiate distinct signaling cascades [22,23]. On the other hand, the chemical specificity of these building blocks in turn also regulate unique signaling cascades. For example, cells that interact with fibronectin fibrils receive distinct chemical cues from those received when exposed to cues derived from collagen type I fibrils. Yet, in some cases, physical cues may dominate cellular response in the presence of a chemical cue. Simulations of stretching of a module of a FN fibril, FN III, is sufficient to override beta one-dependent modulation of increased ligand binding and associated down-stream signaling. Thus, understanding how cells “sense” these interconnected cues and how they influence eventual cell fate remains a perplexing issue.

These concepts are often difficult to discern using naturally derived 3D tissue mimetics, as precise control of ligand density and architecture are often intertwined. Moreover, dissecting differential physical cues such as mechanics from architecture is also challenging. While studies using patterned two-dimensional substrates [24,25] and microfabricated environments [26] have revealed aspects of cell response to topography, reactions to topographic cues in more physiologically relevant three-dimensional environments are not as well understood. Importantly, three-dimensional cues are likely vital to recapitulate some aspects of physiological mechanosensing. Also, cell attachments to matrices in 3D environments often differ with respect to that observed for cells cultured in 2D substrates, which in turn may impact mechanosensing in specific 3D ECMs. In tissue, 3D topographies consist of highly oriented structures that are not well-recapitulated by in vitro hydrogel models. For example, commonly used collagen hydrogels form fibers that are randomly oriented unless some external micropatterning is imposed during their polymerization [27]. Similarly, laminin-rich ECMs (Matrigel) form amorphous gels devoid of cell-scale structures [28]. To address the need for reproducible 3D culture systems with well-defined matrix architecture and ECM protein composition, we recently developed a method whereby functionalized paramagnetic colloidal particles are magnetically aligned in 3D hydrogels to create fibrils that span microns in length and 10s of nms in widths [17,29]. Fiber alignment, diameter, spacing, and extracellular matrix conjugation to the colloidal particles can be controlled to create defined topography independently of the ligand used to coat the particles. In 3D Matrigel matrices containing aligned particles, mouse fibroblasts and neural cell lines send out protrusions that are longer than those seen in matrices lacking particle alignment, independently of the ECM ligand conjugated to the colloidal particles. When the particles are coated in fibronectin, these cells preferentially extend protrusions either parallel or perpendicular to the fibers. This system allows us to test if cells cultured in matrices where fibrils of the same size and arranged in similar geometries will show similar behavior for different types of ECM proteins. In this system, the bulk mechanical properties were similar regardless of the presence of aligned or unaligned colloidal particles. However, lack of understanding of mechanical cues at the cellular scale, of how ECM nanoparticle conjugation affects cell response, and of mechanistic factors driving cell response to topography limited the use of this system.

Here, we used our system to discern the role of aligned topographical cues, presented across a range of human ECM proteins, on human cell response in Matrigel (laminin-rich) matrices with well-characterized physical properties. Using optical trap-based active microrheology, we measured the 3D microscale viscoelasticity. We then asked how topographical and micromechanical cues influence human normal (human foreskin fibroblast, HFF) and cancer (U87 glioblastoma) cells on this length scale. Using genetic manipulation and small molecule inhibitors, we determined that β1integrin knockdown and fascin inhibition reduced the length of cell protrusions in response to physical cues resulting from fiber alignment in these engineered Matrigel matrices. However, protrusions were still aligned with the fibrils. In contrast, reduced myosin II activity did not affect protrusion length, but protrusions were randomly oriented. We confirmed that myosin II is also required by cells to sense topographical alignment in vivo using the zebrafish brain vasculature as our model system. Our results suggest that normal and cancer cells use similar machinery to respond to the topographical and micromechanical cues in this system, where myosin II may regulate how cells sense topographical cues.


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