Em formação

12.5: RNAs podem funcionar como enzimas - Biologia


Os exemplos incluem o seguinte:

  • RNase P
  • Ítrons do Grupo I (inclui íntron de pré-rRNA em Tetrahymena)
  • Introns do grupo II
  • RNA: formação de ligação peptídica

Ribozimas Hammerhead

Os viróides e virusóides têm uma atividade de autoclivação localizada em uma estrutura de 58 nucleotídeos ilustrada na Figura 3.3.15. O mecanismo difere em alguns aspectos da transferência de fosfoéster. Um hidróxido de metal divalente liga-se ao sítio ativo e abstrai um próton do 2 'OH do nucleotídeo no sítio de clivagem. Este agora serve como um nucleófilo para atacar o fosfato 3 'e clivar a ligação fosfodiéster, gerando um fosfato cíclico 2', 3 'e um OH 5' nas extremidades do RNA clivado.

Uma aplicação que está sendo explorada atualmente é o uso de tubarões-martelo projetados para clivar um mRNA específico, desligando assim a expressão de um gene específico. Se a superexpressão ou expressão ectópica de um gene definido fosse a causa de alguma patologia (por exemplo, alguma forma de câncer), então, reduzir sua expressão poderia ter valor terapêutico.

Outros RNAs possivelmente envolvidos na catálise, como os snRNAs envolvidos no pré-mRNA de splicing.

Embora os RNAs possam ser suficientes para a catálise, às vezes eles são auxiliados por proteínas para melhorar a eficiência. Por exemplo, os íntrons do grupo I são capazes de unir íntrons por si próprios em uma reação livre de células. Porém, alguns não são muito eficientes nesse processo e, na célula, são auxiliados por proteínas que não são catalíticas, mas potencializam a reação. Exemplos são as maturases, que são proteínas que auxiliam no splicing de alguns íntrons do grupo I encontrados nas mitocôndrias de leveduras.


12.5: RNAs podem funcionar como enzimas - Biologia

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RNA, abreviatura de ácido ribonucleico, composto complexo de alto peso molecular que atua na síntese de proteínas celulares e substitui o DNA (ácido desoxirribonucléico) como portador de códigos genéticos em alguns vírus. O RNA consiste em nucleotídeos ribose (bases nitrogenadas anexadas a um açúcar ribose) ligados por ligações fosfodiéster, formando fitas de comprimentos variados. As bases nitrogenadas do RNA são adenina, guanina, citosina e uracila, que substituem a timina no DNA.

O açúcar ribose do RNA é uma estrutura cíclica que consiste em cinco carbonos e um oxigênio. A presença de um grupo hidroxila quimicamente reativo (−OH) ligado ao segundo grupo de carbono na molécula de açúcar ribose torna o RNA sujeito à hidrólise. Essa labilidade química do RNA, em comparação com o DNA, que não tem um grupo −OH reativo na mesma posição na porção do açúcar (desoxirribose), é considerada uma das razões pelas quais o DNA evoluiu para ser o transportador preferido de informação genética na maioria organismos. A estrutura da molécula de RNA foi descrita por R.W. Holley em 1965.


Um método robusto e versátil para produção e purificação de amostras de RNA em grande escala para biologia estrutural

Descobertas recentes na transcriptômica de todo o genoma revelaram que os RNAs estão envolvidos em quase todos os processos biológicos, em todos os domínios da vida. A caracterização de RNAs nativos de função e estrutura desconhecidas é particularmente desafiadora devido à sua baixa abundância típica na célula e a sensibilidade inerente para enzimas degradantes de RNA ubíquas. Portanto, a síntese in vitro robusta e métodos extensivos de trabalho são frequentemente necessários para obter amostras passíveis de estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Aqui, apresentamos um protocolo que combina os avanços mais recentes na metodologia de transcrição in vitro de T7 com pareamento iônico de fase reversa e purificação por HPLC de troca iônica de RNAs para a produção de amostras em grande escala com rendimento otimizado. O método é fácil de seguir, robusto e adequado para usuários com pouca ou nenhuma experiência no campo da bioquímica ou cromatografia. A execução completa deste método, por exemplo, para a produção de amostras de NMR marcadas isotopicamente, pode ser realizada em menos de uma semana.

Palavras-chave: Biologia estrutural de produção de amostra de transcrição in vitro de RNA de HPLC.

© 2020 Karlsson et al. Publicado pela Cold Spring Harbor Laboratory Press para a RNA Society.


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Ao contrário da polimerase procariótica, que pode se ligar a um molde de DNA por conta própria, os eucariotos requerem várias outras proteínas, chamadas fatores de transcrição, para primeiro se ligarem à região promotora e, em seguida, ajudarem a recrutar a polimerase apropriada.

As três polimerases de RNA eucarióticas

As características da síntese de mRNA eucariótica são marcadamente mais complexas daquelas dos procariotos. Em vez de uma única polimerase compreendendo cinco subunidades, os eucariotos têm três polimerases, cada uma composta por 10 subunidades ou mais. Cada polimerase eucariótica também requer um conjunto distinto de fatores de transcrição para trazê-la para o modelo de DNA.

A RNA polimerase I está localizada no nucléolo, uma subestrutura nuclear especializada na qual o RNA ribossômico (rRNA) é transcrito, processado e montado em ribossomos (Tabela 1). As moléculas de rRNA são consideradas RNAs estruturais porque têm uma função celular, mas não são traduzidas em proteínas. Os rRNAs são componentes do ribossomo e são essenciais para o processo de tradução. A RNA polimerase I sintetiza todos os rRNAs, exceto a molécula de rRNA 5S. A designação & # 8220S & # 8221 se aplica às unidades & # 8220Svedberg & # 8221, um valor não aditivo que caracteriza a velocidade na qual uma partícula sedimenta durante a centrifugação.

Tabela 1. Localizações, produtos e sensibilidades das três polimerases de RNA eucarióticas
RNA polimerase Compartimento Celular Produto da Transcrição Sensibilidade de α-Amanitina
eu Nucléolo Todos os rRNAs, exceto 5S rRNA Insensível
II Núcleo Todos os pré-mRNAs nucleares que codificam proteínas Extremamente sensível
III Núcleo 5S rRNA, tRNAs e pequenos RNAs nucleares Moderadamente sensível

A RNA polimerase II está localizada no núcleo e sintetiza todos os pré-mRNAs nucleares codificadores de proteínas. Os pré-mRNAs eucarióticos são submetidos a um extenso processamento após a transcrição, mas antes da tradução (Figura 1). Para maior clareza, a discussão deste módulo sobre a transcrição e tradução em eucariotos usará o termo & # 8220mRNAs & # 8221 para descrever apenas as moléculas maduras processadas que estão prontas para serem traduzidas. A RNA polimerase II é responsável pela transcrição da grande maioria dos genes eucarióticos.

Figura 1. O mRNA eucariótico contém íntrons que devem ser separados. Uma capa 5 & # 8242 e uma cauda poli-A 3 & # 8242 também são adicionadas.

A RNA polimerase III também está localizada no núcleo. Esta polimerase transcreve uma variedade de RNAs estruturais que incluem o pré-rRNA 5S, pré-RNAs de transferência (pré-tRNAs) e pequeno nuclear pré-RNAs. Os tRNAs têm um papel crítico na tradução, pois servem como moléculas adaptadoras entre o molde de mRNA e a cadeia polipeptídica em crescimento. RNAs nucleares pequenos têm uma variedade de funções, incluindo pré-mRNAs & # 8220splicing & # 8221 e fatores de transcrição reguladores.

Um cientista que caracteriza um novo gene pode determinar qual polimerase o transcreve testando se o gene é expresso na presença de um determinado veneno de cogumelo, α-amanitina (Tabela 1). Curiosamente, α-amanitina produzida por Amanita phalloides, o cogumelo Death Cap, afeta as três polimerases de forma muito diferente. A RNA polimerase I é completamente insensível à α-amanitina, o que significa que a polimerase pode transcrever o DNA in vitro na presença desse veneno. Em contraste, a RNA polimerase II é extremamente sensível à α-amanitina e a RNA polimerase III é moderadamente sensível. Saber a transcrição da polimerase pode indicar ao pesquisador a função geral do gene que está sendo estudado. Como a RNA polimerase II transcreve a grande maioria dos genes, vamos nos concentrar nessa polimerase em nossas discussões subsequentes sobre fatores e promotores de transcrição eucarióticos.

Promotores e fatores de transcrição de RNA polimerase II

Os promotores eucarióticos são muito maiores e mais complexos do que os promotores procarióticos. No entanto, ambos têm uma sequência semelhante à sequência -10 dos procariotos. Em eucariotos, essa sequência é chamada de TATA box, e tem a sequência consenso TATAAA na fita codificadora. Ele está localizado em -25 a -35 bases em relação ao local de iniciação (+1) (Figura 2). Esta sequência não é idêntica ao E. coli -10 caixa, mas conserva o elemento A – T rico. A termoestabilidade das ligações A – T é baixa e isso ajuda o molde de DNA a se desenrolar localmente na preparação para a transcrição.

Em vez do fator σ simples que ajuda a ligar a RNA polimerase procariótica ao seu promotor, os eucariotos montam um complexo de fatores de transcrição necessários para recrutar a RNA polimerase II para um gene codificador de proteína. Os fatores de transcrição que se ligam ao promotor são chamados fatores de transcrição basais. Esses fatores basais são todos chamados TFII (para Fator de Transcrição / polimerase II) mais uma letra adicional (A-J). O complexo central é TFIID, que inclui uma proteína de ligação a TATA (TBP). Os outros fatores de transcrição sistematicamente se encaixam no molde de DNA, com cada um estabilizando ainda mais o complexo de pré-iniciação e contribuindo para o recrutamento de RNA polimerase II.

Figura 2. Um promotor generalizado de um gene transcrito pela RNA polimerase II é mostrado. Fatores de transcrição reconhecem o promotor. A RNA polimerase II então se liga e forma o complexo de iniciação da transcrição.

Pergunta Prática

Um cientista une um promotor eucariótico na frente de um gene bacteriano e insere o gene em um cromossomo bacteriano. Você esperaria que a bactéria transcrevesse o gene?

Alguns promotores eucarióticos também têm um conservado Caixa CAAT (GGCCAATCT) em aproximadamente -80. Mais a montante da caixa TATÁ, os promotores eucarióticos também podem conter um ou mais Caixas ricas em GC (GGCG) ou caixas de octâmero (ATTTGCAT). Esses elementos ligam fatores celulares que aumentam a eficiência da iniciação da transcrição e são frequentemente identificados em genes mais “ativos” que estão constantemente sendo expressos pela célula.

Fatores de transcrição básicos são cruciais na formação de um complexo de pré-iniciação no molde de DNA que subsequentemente recruta a RNA polimerase II para o início da transcrição. A complexidade da transcrição eucariótica não termina com as polimerases e promotores. Um exército de outros fatores de transcrição, que se ligam a intensificadores e silenciadores a montante, também ajudam a regular a frequência com que o pré-mRNA é sintetizado a partir de um gene. Intensificadores e silenciadores afetam a eficiência da transcrição, mas não são necessários para que a transcrição prossiga.

A Evolução dos Promotores

A evolução dos genes pode ser um conceito familiar. As mutações podem ocorrer nos genes durante a replicação do DNA, e o resultado pode ou não ser benéfico para a célula. Ao alterar uma enzima, proteína estrutural ou algum outro fator, o processo de mutação pode transformar funções ou características físicas. No entanto, os promotores eucarióticos e outras sequências reguladoras de genes também podem evoluir. Por exemplo, considere um gene que, ao longo de muitas gerações, se torna mais valioso para a célula. Talvez o gene codifique uma proteína estrutural de que a célula precisa para sintetizar em abundância para uma determinada função. Se este for o caso, seria benéfico para a célula para aquele promotor do gene & # 8217s recrutar fatores de transcrição de forma mais eficiente e aumentar a expressão do gene.

Os cientistas que examinam a evolução das sequências do promotor relataram resultados variados. Em parte, isso ocorre porque é difícil inferir exatamente onde um promotor eucariótico começa e termina. Alguns promotores ocorrem dentro de genes, outros estão localizados muito a montante, ou mesmo a jusante, dos genes que estão regulando. No entanto, quando os pesquisadores limitaram seu exame às sequências do promotor central humano que foram definidas experimentalmente como sequências que se ligam ao complexo de pré-iniciação, eles descobriram que os promotores evoluem ainda mais rápido do que os genes codificadores de proteínas.

Ainda não está claro como a evolução do promotor pode corresponder à evolução dos humanos ou de outros organismos superiores. No entanto, a evolução de um promotor para efetivamente produzir mais ou menos um determinado produto gênico é uma alternativa intrigante para a evolução dos próprios genes. [1]

Estruturas promotoras para RNA polimerases I e III

Os processos de trazer as RNA polimerases I e III para o molde de DNA envolvem coleções ligeiramente menos complexas de fatores de transcrição, mas o tema geral é o mesmo.

Os elementos promotores conservados para genes transcritos pelas polimerases I e III diferem daqueles transcritos pela RNA polimerase II. A RNA polimerase I transcreve genes que possuem duas sequências promotoras ricas em GC na região -45 a +20. Estas sequências por si só são suficientes para que ocorra a iniciação da transcrição, mas os promotores com sequências adicionais na região de -180 a -105 a montante do local de iniciação irão aumentar ainda mais a iniciação. Os genes que são transcritos pela RNA polimerase III têm promotores a montante ou promotores que ocorrem dentro dos próprios genes.

A transcrição eucariótica é um processo rigidamente regulado que requer uma variedade de proteínas para interagir umas com as outras e com a fita de DNA. Embora o processo de transcrição em eucariotos envolva um maior investimento metabólico do que em procariotos, ele garante que a célula transcreva precisamente os pré-mRNAs de que necessita para a síntese de proteínas.

Alongamento e Rescisão

Após a formação do complexo de pré-iniciação, a polimerase é liberada dos outros fatores de transcrição e o alongamento pode prosseguir como ocorre em procariotos com a polimerase sintetizando pré-mRNA na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Conforme discutido anteriormente, a RNA polimerase II transcreve a maior parte dos genes eucarióticos, portanto, esta seção se concentrará em como essa polimerase realiza o alongamento e a terminação.

Embora o processo enzimático de alongamento seja essencialmente o mesmo em eucariotos e procariontes, o molde de DNA é mais complexo. Quando as células eucarióticas não estão se dividindo, seus genes existem como uma massa difusa de DNA e proteínas chamada cromatina. O DNA é compactado em torno de proteínas histonas carregadas em intervalos repetidos. These DNA–histone complexes, collectively called nucleosomes, are regularly spaced and include 146 nucleotides of DNA wound around eight histones like thread around a spool.

For polynucleotide synthesis to occur, the transcription machinery needs to move histones out of the way every time it encounters a nucleosome. This is accomplished by a special protein complex called FACT, which stands for “facilitates chromatin transcription.” This complex pulls histones away from the DNA template as the polymerase moves along it. Once the pre-mRNA is synthesized, the FACT complex replaces the histones to recreate the nucleosomes.

O término da transcrição é diferente para as diferentes polimerases. Ao contrário dos procariotos, o alongamento pela RNA polimerase II em eucariotos ocorre de 1.000 a 2.000 nucleotídeos além do final do gene que está sendo transcrito. Esta cauda pré-mRNA é subsequentemente removida por clivagem durante o processamento do mRNA. Por outro lado, as RNA polimerases I e III requerem sinais de terminação. Os genes transcritos pela RNA polimerase I contêm uma sequência específica de 18 nucleotídeos que é reconhecida por uma proteína de terminação. O processo de terminação na RNA polimerase III envolve um grampo de mRNA semelhante à terminação independente de rho da transcrição em procariotos.


RNA: Definition, Types, Structure and Functions

Johannes Friedrich Miescher (a Swiss physician and biologist) first discovered the Nucleic acids as ‘nuclein’ from the nucleus in 1869. Severo Ochoa de Albornoz (a Spanish-American physician and biochemist) discovered the RNA synthesis mechanism in 1959. He won the Nobel Prize jointly with Arthur Kornberg in Physiology or Medicine for his discoveries. In 1965, Robert W. Holley sequences 77 nucleotides of yeast tRNA.

Ribonucleic acid or RNA is an essential biological macromolecule. Generally, it helps to exchange the hereditary information encoded by DNA into proteins. The nucleic acid of living cell having ribose sugar in its nucleotides and perform multiple vital roles in the coding, decoding, regulation and expression of genes is called Ribonucleic acid or RNA.

In prokaryotic cell these are found in cytoplasm, chromosome, ribosome, nucleolus, plastid and mitochondria. In eukaryotic cells, 90% RNA present in cytoplasm and 10% in other structures. In some virus, RNA exists as genetic material.

Physical Structure of RNA

Primarily RNA is single-stranded particle with an intra-strand pairing yet in their secondary structure there are a few U shaped loops. It can show a broad twofold helical structure and can also form different tertiary structures.

Chemical Structure of RNA

RNA molecule is a polymer of ribonucleotide. Each ribonucleotide consists of the following molecules:

Each nucleotide in a RNA molecule has one of four nitrogenous bases: adenine, guanine, cytosine and uracil. The first two are purine and the later two are pyrimidine bases.

Types of RNA

RNA is of two main types, such as:

1. Genetic RNA or gRNA: When RNA functions as genetic materials then it is known as genetic RNA, e.g. RNA of some viruses.

2. Non-genetic RNA: When RNA takes part in only protein synthesis, then it is called non-genetic RNA, e.g. RNA of eukaryotic and prokaryotic cells.

Non-genetic RNA is further divided into the following three types:

  1. Ribosomal RNA or rRNA
  2. Messenger RNA or mRNA
  3. Transfer RNA or tRNA

Ribosomal RNA or rRNA: It makes up about 80% of the total RNA in a cell. These are synthesized in nucleolus and occur in ribosome, the protein factories of the cells. Ribosomal RNA is composed of unbranhed, flexible polynucleotide chain. This chain remains coil in low ionic concentration but its nitrogen bases form helical part in high ionic concentration. In such case, adenine bound with uracil and guanine bound with cytosine.

Eukaryotic rRNA is of four types: 28S rRNA, 18S rRNA, 5.8S rRNA, and 5S rRNA.

Image showing Ribosomal RNA (rRNA)

Functions of rRNA

  • Ribosomal RNA gives a procedure for decoding mRNA into amino acids and interrelates with tRNAs during translation.
  • It comprises the predominant material within the ribosome. During protein synthesis.
  • It guarantees the proper alignment of tRNA, mRNA, and ribosome.
  • It catalyzes during peptide bond formation between amino acids.

Messenger RNA or mRNA

French scientists François Jacob and Jacques Monod coined the name mRNA in 1961. mRNA is a single-strand made of up to several thousand nucleotides. It is created as complementary strand of DNA hence it has base sequences as like as in DNA. In its linear structure, mRNA has two non-coding ends and middle coding zone. The two ends of mRNA recognized as 5´ leader and 3´ trailer end. mRNA makes up 3-5% of the total RNA in a cell.

mRNA is a copy of the hereditary information produced by transcription from the cell’s original blueprint, DNA. This hereditary information is brought to the protein factories of the cells, ribosome for using as instruction for the formation of proteins.

Functions of mRNA

  • mRNA is transcribed from the DNA template in the nucleus and carries coding information to the sites of protein synthesis in the ribosomes.

Transfer RNA or tRNA

Transfer RNA is also known as tRNA. It is a small and clover leaf shape RNA which helps transmission a specific amino acid to a new polypeptide chain. During translation, this transmission occurs at the ribosomal site of protein synthesis.

In this case, each of the 20 amino acids which have a specific tRNA that binds with it to form proteins. The tRNA is made up of 70 to 95 nucleotides. It is the essential component of translation and it performs to transfer of amino acids during protein synthesis as a main functions. Hence, it is called transfer RNA or tRNA. tRNA is also called adaptor molecules because it acts as adaptor in the transformation of the genetic sequence of mRNA into proteins. Sometimes tRNA ia also called soluble, or activator RNA.

Robert Willium Holley et al. (1965) proposed the clover leaf model structure of tRNA. He awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 1968 with Har Gobind Khorana and Marshall Warren Nirenberg for describing this model. According to this model the single polynucleotide chain of tRNA is folded upon itself to form five arms. The arms are:

  1. Acceptor arm
  2. Dihydrouridine (DHU) arm or D arm
  3. Anticodon arm
  4. Variable arm and
  5. Thiamine psedocytosine or TΨC arm.

tRNA also have DHU loop, variable loop, anticodon loop, T-loop or TΨC loop and amino acid acceptor end. It has four normal bases A, G, U, C and some unknown bases like isonine (I), dihydouridine, psedouradine, etc. Both end of single chain of tRNA (5´-3´) exist aside.

Image showing Clover Leaf Model Structure of tRNA

Functions of tRNA

  1. It identifies and transports the correct amino acid molecules to the site of protein synthesis in the ribosome.
  2. It primarily is familiar for carrying amino acids.
  3. It also takes part in the process of building proteins.

RNAa can also be broadly divided into the following types:

Non-coding RNAs (ncRNA) are of the following two types, such as:

Non-coding RNA (ncRNA) is further divided into the following two types based on their size such as:

1. IncRNA or Long ncRANS: As a minimum, 200 nucleotides are present in IncRNA.

2. Small ncRNAS: Less than 200 nucleotides are present in ncRNAS.

Small ncRNAs are subdivided into the following five types:

1. miRNA: It is also called micro RNA

2. snoRNA: It is also known as small nucleolar RNA

3. snRNA: It is also known as small nuclear RNA

4. siRNA: It is also called small-interfering RNA

5. piRNA: It is also called PIWI-interacting RNA

The size of t he miRNAs is about twenty two (22) nucleotides long and have particular importance. In most eukaryotic cells, they perform to function in gene regulation. Some miRNAs can regulate target genes which lead to tumour progression and tumorigenesis. The size of piRNA is about 26-31 nucleotide long. They are present in most animals. They can regulate the expression of jumping genes or transposon that move from one location to another on a chromosome. These genes were first identified by Barbara McClintock.

Observações Finais

Definitively, the RNA is as significant as DNA into molecular investigations as the evaluation of the gene expression is relies upon the complete mRNA present into the specific tissue. mRNA is fundamental to the procedure of transcription, while tRNA is essential to the procedure of translation, and rRNA makes up the ribosomes in which translation occurs. The amount of expression of gene can be estimated by utilizing the Reverse transcription polymerase chain reaction technique or RT-PCR technique through the evaluation of RNA.


Drug development

In the various jobs that AARSs have taken on above and beyond their traditional role, Schimmel and colleagues see a theme: they keep cells and bodies stable. “They seem to be something that’s playing a modulatory role, restoring more of a homeostasis,” says Leslie Nangle, a former Schimmel lab grad student who is now senior director for research at aTyr Pharma. Many researchers think it’s risky to mess with such essential enzymes, says Kim, but he and Schimmel see potential in targeting AARSs for treating disease. Schimmel’s company aTyr, of which Kim and Yang are also cofounders, hopes to turn the enzymes themselves into biologic therapeutics. In addition, in Seoul, Kim directs the nonprofit drug discovery organization Biocon, where researchers are developing several small molecules that interact with AARSs, as well as biologics based on natural AARS variants.

Biocon is currently testing molecules to treat cardiac fibrosis, alopecia areata (an autoimmune disease that causes hair loss), and inflammation. A fibrosis treatment now under Phase 1 study targets the site on the proline synthetase that links the amino acid to its tRNA. Fibrosis results from an accumulation of collagen, which is two-thirds proline. Biocon researchers have found that a drug can go after that active site, knocking down the canonical function by more than 90 percent in healthy cultured cells without greatly affecting the synthesis of other proteins or cell proliferation, says Kim. At first, he and his colleagues didn’t believe their results, but he’s come to see sense in them. “A normal cell is not necessarily doing high level protein synthesis all the time,” he says. “As long as it has a certain degree of residual activity going on, then a normal cell can be perfectly happy.”

For cancer and other conditions, Biocon is developing small molecule candidates that avoid the tRNA–amino acid linking site or target the extracellular activities of secreted AARSs, meaning that protein synthesis should not be affected. Similarly, aTyr researchers expect that the firm’s therapeutics, based on AARS derivatives themselves, to be relatively safe. “Coming from a world of natural physiology, you start to feel better about it,” says aTyr CEO Sanjay Shukla.

Nangle and colleagues, alongside aTyr’s subsidiary Pangu Biopharma in Hong Kong, began by cataloging natural AARS splice variants and then screening them for interesting biological activities in a variety of human cell–based assays. They looked for effects on cell proliferation and protection, immunomodulation and inflammation, cell differentiation, transcriptional regulation, and cholesterol transport. “We figured there’s got to be some therapeutic benefit there,” says Schimmel.

Currently, aTyr is pursuing an immuno-modulator based on the WHEP domain of the histidine enzyme HisRS. In human T cell cultures, full-length HisRS quieted activated cells and reduced cytokine production. In further experiments, aTyr researchers found that the WHEP domain hooks up with receptors on those immune cells to dampen activity. The company hopes that its modified version of the HisRS WHEP peptide, attached to a bit of antibody to help it last longer in the bloodstream, will have the same quieting effect in an inflammatory disease called sarcoidosis. This disease affects a variety of organs, most often the lungs, and can sometimes require lifelong treatment with immune-suppressing steroids. Those medications come with a list of misery-inducing and dangerous side effects ranging from insomnia to glaucoma to infection.

aTyr presented results from several animal models of inflammatory lung disease at the American Thoracic Society meeting in 2017, 2018, and 2019, and those findings suggest the company’s candidate 1923 looks promising. For example, the cancer drug bleomycin can cause lung damage, but HisRS or its WHEP domain reduced inflammation and fibrosis. 19 Rats treated with bleomycin breathe quickly to compensate for their damaged lungs, but those treated with 1923 recovered normal respiratory rates.

aTyr’s 1923 has already been through a Phase 1 trial for safety in healthy people without any red flags. Now, the company is running a Phase 1/2 study in people with sarcoidosis, looking to confirm safety, find the right dosage, and perhaps even see signs of efficacy. Patients enter the trial while taking steroids, and the aim is to taper down the steroid dosage during the study. Those receiving 1923, it’s hoped, will see their symptoms stay the same or improve, while those on placebo should see them worsen as the steroid doses are lowered.

It’s a testament to the need for a new treatment that volunteers are willing to risk having their symptoms intensify if they end up in the placebo arm, says participating physician Daniel Culver, a pulmonologist at the Cleveland Clinic. “[Steroids are] very toxic,” says Culver, who notes that one of his patients calls his steroid prescription “the Devil’s drug” because it does almost as much harm as good. “People are very, very motivated to find something different.”

The study plans to enroll 36 participants, but has been delayed by the COVID-19 crisis. With such a small sample size, Culver doesn’t expect a “home run,” but he says he hopes the data will be good enough to embark on a larger, Phase 3 study. aTyr is also planning a Phase 2, 30-person trial of 1923 for respiratory complications associated with COVID-19.

If aTyr succeeds, it will be the first instance of a therapeutic built from an AARS—but probably not the last. As Kim sees it, AARSs are ready and waiting to respond to anything that challenges homeostasis, from cancer to the novel coronavirus. “I rename the synthetases ‘Molecular 911.’”

Correction (June 2, 2020): The original version of a table in this story stated that during HIV infection, the synthetase for lysine (LysRS) is packaged into new viral particles that use its UUU sequence to prime reverse transcription in newly infected cells. Rather, the viral particles use LysRS to deliver its cognate tRNA, which is used as a promoter for reverse transcription. O cientista lamenta o erro.


Role of RNA Polymerase in Gene Transcription | Genética

In this article we will discuss about the role of RNA polymerase in transcription.

RNA polymerase enzymes are complex enzyme which in E. coli is made up of 5 subunits or polypeptide chains designated β, β’, α, σ and ω with respective molecular weights of 160,000, 150,000, 90,000, 40,000 and 10,000. The α chain is present twice, others only once. The active form of the enzyme is called holoenzyme and has a total molecular weight of 500,000.

The polypeptide chains are held together by secondary non-covalent bonds. Chains β, β’, α and ω form the core enzyme σ (sigma factor) is weakly attached to the other chains and can easily become detached. The core enzyme catalyses the linkage of ribose nucleotides by phosphodiester bonds.

The sigma factor recognises start sequences in the promoter region of DNA where transcription begins. In the presence of the sigma factor the holoenzyme binds to those nucleotides in promoter region which initiate transcription. Soon thereafter, the double helix unwinds and one strand serves as the template for transcription.

The eukaryotic RNA polymerases I, II and III consist of 8 to 14 different subunits in each. They recognise different promoters and recognise different classes of genes.

The two largest subunits of all three eukaryotic RNA polymerases are related to the β and β’ subunits of the E. coli polymerase. Five subunits of the eukaryotic RNA polymerases are common to all the three enzymes. These structural similarities allow eukaryotic polymerases to share several common functional properties.

Site of Transcription, Promoter Recognition:

The DNA sequence to which RNA polymerase binds to initiate transcription of a gene is called the promoter. The promoter is a specific site at the beginning of genes where transcription is initiated.

The initiation process is important because this is the primary step at which transcription is regulated. Typical promoters are from 20 to 200 bases long. The base sequence among different promoters shows variation, and that relates with the strength in binding with the RNA polymerase.

Transcription raised the question as to whether one or both strands of DNA duplex are transcribed. In virus φ X 174 which has only single-stranded DNA (unlike most other DNA viruses), only one strand of DNA is transcribed into a complementary RNA sequence. In other viruses with duplex DNA, when we consider the entire genome, both strands of DNA duplex are transcribed, one strand serving as template for some genes, the other strand for remaining genes.

Transcription in Prokaryotes:

Promoters in bacteria are located in the region of a DNA strand just preceding the initiation site of RNA transcription. The nucleotide at which transcription is initiated is denoted as + 1 and the preceding nucleotide as -1. The portions of the DNA preceding the initiation site, toward the 3′ end of the template are said to be upstream of that site.

Those portions of the DNA succeeding it, toward the 5′ end of the template are said to be downstream of that site. Comparisons of promoter sequences of a series of different genes isolated from E. coli revealed that the region upstream of the transcription initiation site contains two sets of sequences that are similar in a variety of genes.

These two common sequences, referred to as consensus sequences, contain 6 nucleotides each. Each base in the consensus sequence is the base most often observed at that position among any number of observed sequences.

Consensus sequences are located approximately 10 and 35 base pairs upstream of the transcription start site. They are called the -10 and -35 elements, denoting their position in relation to the transcription initiation site, which is at + 1 position. (Fig. 15.6).

The consensus sequence in position 35 in E. coli has TTGACA and that in position 10 has TATAAT. The sequences at the – 10 and – 35 positions are not identical in different promoters, but similar enough to establish consensus sequences. The – 10 sequence which is called the TATA box or Pribnow box (after the name of its discoverer) is similar to sequences found at corresponding positions in many eukaryotic promoters.

The positions of the promoter sequences determine where and on which strand the RNA polymerase begins synthesis. Experimental evidence supports the functional importance of the – 10 and – 35 promoter elements.

First, genes with promoter elements that differ from the consensus sequences are transcribed less efficiently than genes whose promoters match the consensus sequence more closely.

Second, mutations induced in either the – 35 or – 10 consensus sequences have strong effects on promoter function.

Third, the sites at which RNA polymerase binds to promoters have been directly identified by foot-printing experiments, widely used to determine the sites at which proteins bind to DNA (Fig. 15.7).

In these experiments, a DNA fragment is radiolabeled at one end. The labelled DNA is incubated with the protein, for example RNA polymerase, and then subjected to partial digestion with DNase. The method is based on the principle that the regions of DNA to which the protein binds are protected from DNase digestion. A parallel sample of DNA that was not incubated with protein is digested with DNase.

The regions of DNA with bound protein can be identified by comparison of the digestion products from protein-bound DNA and DNA without protein. Such foot-printing analysis has shown that RNA polymerase generally binds to promoters over approximately a 60 base pair region, extending from – 40 to + 20, that is, from 40 nucleotides upstream to 20 nucleotides downstream of the transcription start site. The sigma (σ factor) subunit of RNA polymerase binds specifically to sequences in both the – 35 and – 10 promoter regions, indicating the importance of these regions in promoter function.

Iniciação da Transcrição:

In absence of sigma subunit, RNA polymerase can bind non-specifically to DNA with low affinity. Sigma plays a crucial role in directing the polymerase to promoters by binding specifically to both the – 35 and – 10 sequences, leading to initiation of transcription at the beginning of a gene. The initial binding between the polymerase and promoter is referred to as closed-promoter complex because the DNA is not unwound.

The polymerase then unwinds about 15 bases of DNA around the initiation site to form an open-promoter complex and single stranded DNA is made available for transcription. The first nucleoside triphosphate is placed at the site. The next nucleotide in line is joined to the 3′ carbon of the ribose, and so forth. Transcription is initiated by the joining of two free NTPs at the + 1 site.

Chain Elongation:

After addition of about the first ten nucleotides, sigma is released from the polymerase shown in Fig. 15.6. The polymerase then moves along the DNA template strand, adding nucleotides to the 3′ end of the growing RNA chain. Thus RNA chains grow in the 5′ to 3′ direction similar to what is observed in DNA synthesis.

As it moves, the polymerase unwinds the template DNA over about 17 base pairs (less than two turns of the double helix) in the region of transcription. After RNA polymerase has passed, the DNA strands reform the duplex.

Chain Termination:

The RNA chain continues to grow until the RNA polymerase encounters a termination signal. Then transcription stops, the RNA chain is released from the polymerase, and the enzyme dissociates from its DNA template. The most common type of termination signal in E. coli consists of a symmetrical inverted repeat of a GC-rich sequence followed by 4 or more A residues.

Transcription of the GC-rich inverted repeat produces a segment in the growing RNA chain that can form a stem loop structure by complementary base pairing (Fig. 15.8).

The formation of a self-complementary structure dissociates the chain from the DNA template and terminates transcription. There are other types of transcription termination signals in prokaryotes as well as eukaryotes that involve binding of proteins to specific DNA sequences for chain termination, instead of formation of the stem-loop structure in RNA.

Transcription in Eucariótica:

There are two major differences between prokaryotic and eukaryotic transcription systems.

First, a single RNA polymerase is able to transcribe all genes in bacteria, whereas eukaryotic cells have multiple different RNA polymerases that transcribe distinct classes of genes.

Second, eukaryotic RNA polymerases do not bind directly to promoter sequences, but interact with a number of proteins to specifically initiate transcription. The complexity of the transcription process in eukaryotes is presumed to be related with the regulation of gene expression required to control activities of many different cell types in multicellular forms.

Three distinct nuclear RNA polymerases transcribe different classes of genes in eukaryotic cells (Table).

RNA polymerase II transcribes protein coding genes in nucleus to yield mRNAs RNA polymerases I and III transcribe ribosomal RNAs (rRNAs) and transfer RNAs (tRNAs). The three largest species of tRNAs are transcribed by RNA polymerase I.

The genes for transfer RNA and the smallest species of ribosomal RNA (5S rRNA), as well as some small nuclear (snRNAs) and cytoplasmic RNAs (scRNAs) involved in splicing and protein transport are transcribed by RNA polymerase III. In addition, mitochondria and chloroplasts contain separate RNA polymerases similar to bacterial RNA polymerases that specifically transcribe DNA in these organelles.

Transcription by RNA Polymerase II:

The different mode of action of transcription in eukaryotic cells was noted in 1979 when it was found that RNA polymerase II is able to initiate transcription only if additional proteins are added to the reaction. In contrast with the bacterial sigma factors, transcription in eukaryotic cells requires distinct initiation factors that were not associated with the polymerase.

Specific proteins acting as transcription factors have now been identified that are required by RNA polymerase II to initiate transcription. Two types of transcription factors have been defined: general transcription factors involved in transcription from all polymerase II promoters additional transcription factors involved in control of expression of individual genes.

Experiments using in vitro systems have indicated that five general transcription factors are required for initiation of transcription by RNA polymerase II. The promoters of many genes transcribed by polymerase II contain a sequence similar to TATAA 25 to 30 nucleotides upstream of the transcription start site.

This sequence referred to as the TATA box is similar to the -10 sequence of bacterial promoters and is involved in initiation of transcription as follows: first, a general transcription factor called TFIID (TF indicates transcription factor, II denotes polymerase II) binds to the TATA box. TFIID has multiple subunits including the TATA-binding protein (TBP).

The TBP binds specifically to the TATAA consensus sequence and 10-12 other polypeptides called TBP-associated factors (TAFs). Second, TBP binds to a second general transcription factor (TFIIB) forming a TBP-TFIIB complex at the promoter. Following recruitment of RNA polymerase II to the promoter, two additional factors (TFIIE and TFIIH) are required for initiation of transcription.

Two subunits of TFIIH are helicase that unwind DNA around initiation site, while another subunit is a protein kinase that phosphorylates repeated sequences in the largest subunit of RNA polymerase II. In spite of the development of in vitro systems, much remains to be elucidated about polymerase II transcription in eukaryotic cells.

Transcription by RNA Polymerases I and III:

Like RNA polymerase II, the other two polymerases I and III also require additional transcription factors to associate with appropriate promoter sequences. Although the three eukaryotic polymerases recognise distinct types of promoters, a common transcription factor, the TATA- binding protein (TBP) seems to be required for initiation of transcription by all 3 polymerases.

RNA polymerase I transcribes ribosomal RNA genes which are present in tandem repeats, to yield a large 45S pre-rRNA, which is then processed to derive the 28S, 18S and 5.8S rRNAs (Fig. 15.9).

The promoter of rRNA genes consists of 150 base pairs just upstream of the transcription initiation site. These promoter sequences are recognised by two transcription factors, UBF (upstream binding factor) and SL1 (selectivity factor 1) which bind to the promoter and then recruit polymerase I to form an initiation complex.

One of the four protein subunits of the SL1 transcription factor is TBP. Thus, TBP is a common transcription factor required by all 3 types of eukaryotic RNA polymerases. The promoter of ribosomal RNA genes does not contain TATA box, therefore, TBP does not bind to specific promoter sequences. Thus TBP associates with ribosomal RNA genes through the binding of other proteins in the SL1 complex to the promoter.

The genes for tRNAs, 5S rRNA and some of the small RNAs involved in splicing and protein transport are transcribed by Polymerase III. These genes are characterised by promoters that lie within, and not upstream of the transcribed sequence.

The process of termination of transcription was found out from experiments in prokaryotes in which nucleus is not bound by a membrane. Therefore, synthesis of proteins on ribosomes occurs simultaneously with synthesis of mRNA on DNA.

Visualisation of Transcription:

The idea of visualizing gene transcription originally arose from light microscopic studies of lampbrush chromosomes in amphibian oocytes performed by Callan and Lloyd, and Gall in the 1960’s similar studies were done on the puffed polytene chromosomes of insects by Beermann and his colleagues. Oocyte-chromosomes are highly extended in the lampbrush state and contain thousands of chromosomal loci active in RNA synthesis.

Another favourable attribute of oocytes is that there is amplification (manifold increase) of rRNA genes during early oogenesis giving rise to hundreds of extra nucleoli in a nucleolus. In this system, transcription of ribosomal cistrons has been visualised.

During transcription on oocyte lampbrush chromosomes, the DNA in the condensed, bead­like chromomere unravels and is spun out into a loop and transcribed. The loop axis becomes covered by the transcribed RNA fibrils embedded in a protein matrix (Fig. 15.12). At the base of each RNP (ribonucleoprotein) fibril, an RNA polymerase molecule is attached. In male meiosis and somatic cells transcription produces fine hair-like outgrowths from the chromosomes (Fig. 15.13).

Puffing in the giant polytene chromosomes in the salivary glands of insects represents a direct way of correlating chromosome structure with gene transcription. Puff formation indicates genes that are actively transcribing RNA which would be translated into salivary proteins. Further work of Grossbach (1969) and others made it possible to relate the syn thesis of a specific protein with a specific puff.

In 1969 Miller and Beatty developed a spreading technique for chromatin by which nascent RNP transcripts could be visualised in the electron microscope. The technique has since been applied to various materials. It allows us to visualize the spatial relationships between DNA, RNA polymerase and the RNA transcripts in situ.

EM studies have confirmed that most of the DNP (de-oxy-ribonucleoprotein) fibrils are entangled in the chromomeric mass and only a small proportion is extended into lateral loops. The initiation and termination sites for transcription are located at the two ends of the loop i.e., the thick and thin insertion sites of the loop.

The lateral RNP fibrils which contain the nascent RNA transcripts are of increasing length. One loop is said to represent one transcriptional unit. Many times an active loop shows tandemly arranged transcription units separated by spacer regions (Fig. 15.14). The spacers represent non-transcribed regions. Up to 5 transcriptional units may be present on a loop the loop is therefore a multi-gene structure.

These authors also found initiation sites of two transcriptional units overlapping each other. The drug actinomycin-D which inhibits transcription removes RNP fibrils from the template and causes loops to collapse.

The initial products of transcription observed in EM are longer than the average hnRNA molecules isolated by biochemical techniques. Similar studies on transcription have also been conducted on interphase nuclei of somatic cells in some organisms.

Inhibitors of Transcription:

Several compounds can inhibit transcription of DNA by RNA polymerase. One group of compounds acts by binding non-covalently to the DNA template and modifying its structure the other group binds to the RNA polymerase and inhibits its catalytic function. The most important inhibitor is actinomycin-D (AMD), an antibiotic produced by streptomyces.

Its phenoxazene ring intercalates between two GC pairs, while its two peptide side chains form H-bonds with guanine bases and project into minor groove of the double helix.

AMD does not interfere with the binding of RNA polymerase to DNA but inhibits chain elongation by preventing movement of core enzyme along the template. AMD does not interfere with replication of DNA. Aflatoxin, ethidium bromide and 2- acetyl-amino-fluorine also inhibit transcription by binding to DNA.

A group of bacterial antibiotics called rifamycins act by inhibiting bacterial RNA polymerases. One such compound known as rifampicin binds non-covalently to the β subunit of RNA polymerase so that chain initiation is inhibited, but does not affect chain elongation, α- amanitin blocks one of the RNA polymerase enzymes present in eukaryotic cells but bacterial mitochondrial or chloroplast RNA polymerases are not affected by it.


Comprehensive analysis of translation from overexpressed circular RNAs reveals pervasive translation from linear transcripts

Circular RNAs (circRNAs) encompass a widespread and conserved class of RNAs, which are generated by back-splicing of downstream 5' to upstream 3' splice sites. CircRNAs are tissue-specific and have been implicated in diseases including cancer. They can function as sponges for microRNAs (miRNAs) or RNA binding proteins (RBPs), for example. Moreover, some contain open reading frames (ORFs) and might be translated. The functional relevance of such peptides, however, remains largely elusive. Here, we report that the ORF of circZNF609 is efficiently translated when expressed from a circZNF609 overexpression construct. However, endogenous proteins could not be detected. Moreover, initiation of circZNF609 translation is independent of m6A-generating enzyme METTL3 or RNA sequence elements such as internal ribosome entry sites (IRESs). Surprisingly, a comprehensive mutational analysis revealed that deletion constructs, which are deficient in producing circZNF609, still generate the observed protein products. This suggests that the apparent circZNF609 translation originates from trans-splicing by-products of the overexpression plasmids and underline that circRNA overexpression constructs need to be evaluated carefully, particularly when functional studies are performed.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.

Bonecos

Overexpressed circZNF609 is translated. (…

Overexpressed circZNF609 is translated. ( UMA ) circZNF609 contains an ORF upon circularization.…

circZNF609 is translated independently of…

circZNF609 is translated independently of METTL3 activity. ( UMA ) Western blot of…

circZNF609 is not translated from…

circZNF609 is not translated from linear cis -splicing RNA products. ( UMA )…

Analysis of circZNF609 UTR and…

Analysis of circZNF609 UTR and ORF sequences. ( UMA ) Schematic overview of…

No evidence for exogenous in…

No evidence for exogenous em vitro transcribed (IVT) circZNF609 translation. ( UMA )…

circZNF609 protein products are most…

circZNF609 protein products are most likely generated from splicing by-products. ( UMA )…


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