Em formação

Você pode fazer DNA seq com Microarray?


É possível fazer todo o sequenciamento do DNA com Microarray ou você teria que usar os métodos Sanger ou NGS para isso?


Microarrays geralmente capturam gene produtos, como o mRNA (via cDNA), que foi extensivamente processado. Por causa disso, você perde informações genéticas, como íntrons ou elementos reguladores. Na verdade, você acabaria com o transcriptoma do organismo, e seria impossível sequenciar o DNA a partir dele. Os métodos NGS são superiores para isso, ainda, e há uma boa visão geral das vantagens do RNAseq sobre o microarray aqui, por exemplo. Para sequenciar o DNA, você provavelmente usará o NGS.

Fonte: JCI


A codificação e o transcriptoma não codificante

DNA Microarrays

Microarrays de DNA (ou chips de DNA) têm sido a técnica mais comumente usada durante as últimas duas décadas para monitorar globalmente a abundância celular de espécies transcritas. Um microarray de DNA é uma coleção de pontos microscópicos de DNA presos a uma superfície sólida. Cada mancha de DNA contém muitos milhares de cópias de uma sequência específica de DNA, conhecida como sondas. Geralmente correspondem a uma seção curta de um gene - geralmente na extremidade 3 '. Cada microarray inclui um ou alguns conjuntos de sondas para cada gene interrogado. Estes são usados ​​para hibridizar uma amostra de cDNA (o alvo) em condições de alto rigor. A hibridização sonda-alvo é geralmente detectada e quantificada pela detecção de alvos marcados com fluoróforo, prata ou quimioluminescência para determinar a abundância relativa de transcritos na amostra alvo. Os dados sobre cerca de 700.000 hibridizações de amostra realizadas em microarrays de DNA estão acessíveis através dos bancos de dados Gene Expression Omnibus (GEO) no NCBI e ArrayExpress no EBI.

Como os microarranjos de DNA exigem a localização de sondas de nucleotídeos correspondentes a transcritos conhecidos, apenas a abundância desses transcritos pode ser monitorada. A quantificação de transcritos previamente desconhecidos - muitas vezes específicos para o tipo de célula particular sendo interrogado e, portanto, particularmente relevante para o fenótipo desse tipo de célula - é impossível. Além disso, as sondas são geralmente compartilhadas entre múltiplas formas de splice do mesmo gene e, a menos que projetos de matriz específicos sejam empregados, é impossível deconvoluir as abundâncias de isoformas transcritas alternativas individuais da expressão geral do gene.


Você pode fazer DNA seq com Microarray? - Biologia

Em cada tipo de célula, como uma célula muscular ou uma célula da pele, diferentes genes são expressos (ligados) ou silenciados (desligados). Se as células ativadas sofrerem mutação, elas poderiam & # 8212dependendo do papel que desempenham na célula & # 8212 acionar a célula para se tornar anormal e se dividir incontrolavelmente, causando câncer.

Ao identificar quais genes nas células cancerosas estão funcionando de maneira anormal, os médicos podem diagnosticar e tratar melhor o câncer. Uma maneira de fazer isso é usar um microarray de DNA para determinar os níveis de expressão dos genes. Quando um gene é expresso em uma célula, ele gera RNA mensageiro (mRNA). Genes superexpressos geram mais mRNA do que genes subexpressos. Isso pode ser detectado no microarray.

A primeira etapa no uso de um microarray é coletar amostras de tecido saudável e canceroso do paciente. Dessa forma, os médicos podem observar quais genes são ativados e desativados nas células saudáveis ​​em comparação com as células cancerosas. Uma vez que as amostras de tecidos são obtidas, o RNA mensageiro (mRNA) é isolado das amostras. O mRNA é codificado por cores com marcadores fluorescentes e usado para fazer uma cópia do DNA (o mRNA das células saudáveis ​​é tingido de verde, o mRNA das células anormais é tingido de vermelho).

A cópia de DNA feita, chamada de DNA complementar (cDNA), é então aplicada ao microarray. O cDNA se liga a pares de bases complementares em cada um dos pontos da matriz, um processo conhecido como hibridização. Com base em como o DNA se liga, cada ponto aparecerá vermelho, verde ou amarelo (uma combinação de vermelho e verde) quando escaneado com um laser.

& # 8226 Uma mancha vermelha indica que aquele gene foi fortemente expresso em células cancerosas. (Em sua experiência, esses pontos serão rosa escuro.)

& # 8226 Um ponto verde indica que aquele gene foi fortemente reprimido nas células cancerosas. (Em sua experiência, esses pontos serão rosa claro.)

& # 8226 Se uma mancha ficar amarela, isso significa que aquele gene não foi fortemente expresso nem fortemente reprimido nas células cancerosas. (Em sua experiência, esses pontos ficarão claros.)

& # 8226 Um ponto preto indica que nenhum cDNA do paciente se ligou ao DNA do gene localizado naquele ponto. Isso indica que o gene está inativo. (Todos os genes em seu experimento estão ativos.)


Implementação

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O que os microarrays fizeram por nós?

A tecnologia de microarray impulsionou a genômica funcional, uma disciplina que se esforça para identificar o papel dos genes nos processos celulares, no centro das atenções porque permitiu a análise funcional da expressão diferencial de RNA em todo o genoma entre diferentes amostras, estados e tipos de células para obter insights sobre os mecanismos moleculares que regular o destino celular, o desenvolvimento e a progressão da doença. Os dados de microarray são usados ​​para gerar um perfil de expressão gênica, que serve como um determinante dos níveis de proteína e, portanto, da função celular entre as amostras biológicas. Um único experimento pode fornecer informações sobre a expressão em milhares de genes, virtualmente todo o genoma humano, para comparar os padrões de expressão entre quaisquer dois estados. Os experimentos de microarray podem indicar quais genes são regulados para cima ou para baixo entre amostras de tecido normal e doente, ou duas amostras na ausência e na presença de um determinado estímulo. É fácil ver por que essa tecnologia pode ser atraente para a compreensão de sistemas biológicos complexos, bem como para a descoberta de medicamentos, o diagnóstico de doenças e a identificação de novos genes.

No próximo artigo desta série de Introdução aos DNA Microarrays, discutirei vários tipos de arranjos de expressão de oligonucleotídeos, como eles são feitos e suas aplicações comuns. Fique ligado…


Genômica e proteômica de plaquetas

Ángel García,. Steve P. Watson, em Platelets (segunda edição), 2007

A DNA Microarrays

Os microarranjos de DNA representam uma maneira relativamente rápida e econômica de estudar a expressão gênica em escala genômica. Os dados de expressão podem ser gerados para milhares de genes em muitos tipos de células e tecidos diferentes expostos a uma variedade de estímulos. A tecnologia de microarray de DNA é baseada no princípio de que cada fita de DNA em uma amostra complexa tem a capacidade de reconhecer e hibridizar com sua sequência complementar imobilizada em uma região específica do microarray de DNA. Esses microarranjos de DNA são geralmente feitos em lâminas de vidro de uma das duas maneiras: imprimindo DNA (geralmente produtos de reação em cadeia da polimerase [PCR] ou oligonucleotídeos) usando um arrayer robótico, desenvolvido no laboratório de Patrick Brown na Universidade de Stanford 2 ou por no local síntese de oligonucleotídeos usando um processo denominado fotolitografia, conforme desenvolvido pela Affymetrix. 3 Esses métodos podem produzir microarrays com milhares de sequências de DNA discretas. Por exemplo, Affymetrix GeneChips contém 600.000 oligonucleotídeos diferentes por centímetro quadrado (www.affymetrix.com).

A principal vantagem da tecnologia de microarray desenvolvida pelo Laboratório Brown é a relativa facilidade com que todo o sistema pode ser configurado em um laboratório acadêmico (para obter instruções, consulte www.cmgm.stanford.edu/pbrown), permitindo que os pesquisadores produzam seus próprios microarrays personalizados de maneira econômica. 9 Para tais microarranjos, cada experimento é geralmente projetado para comparar a abundância relativa de sequências de genes entre duas amostras diferentes de DNA ou RNA (Fig. 5-1A). As duas amostras são inicialmente marcadas com um corante fluorescente diferente, como Cy3 (vermelho) ou Cy5 (verde), e são então misturadas e hibridizadas para o microarray. Um microscópio é usado para medir a fluorescência dos dois corantes para cada ponto, e a proporção vermelho-verde é uma medida da abundância relativa do gene nas duas amostras de ácido nucléico. Múltiplas amostras experimentais podem ser comparadas indiretamente por meio do uso de múltiplos microarranjos, cada um hibridizado com uma amostra de referência comum, para permitir a normalização, e uma amostra experimental. 10

Figura 5-1. Esquema dos dois principais tipos de microarray de DNA. A. O DNA complementar impresso (cDNA) ou microarray de oligonucleotídeo. Neste exemplo, 60 pontos de dados mostram a eficiência de hibridização para 60 cDNAs ou oligonucleotídeos impressos diferentes que representam 60 genes. Um sinal verde indica expressão gênica relativamente alta na amostra 1, um sinal vermelho indica alta expressão gênica na amostra 2, um sinal amarelo indica expressão gênica equivalente em ambas as amostras e cinza indica falta de expressão gênica em ambas. B. O microarray de oligonucleotídeo sintético. Neste exemplo do tipo de microarray Affymetrix, cada gene no microarray é representado por uma linha de 22 oligonucleotídeos 25-mer diferentes, cada um com seu próprio controle de incompatibilidade na linha abaixo. Os dados para quatro genes diferentes são mostrados, com amarelo indicando hibridização detectável e cinza indicando nenhuma hibridização. As análises computacionais determinam se os genes individuais estão "presentes" na amostra de mRNA (por exemplo, o gene no topo do microarray), "ambíguo" ou "ausente" (por exemplo, o gene na parte inferior do microarray).

A principal vantagem do método de matriz de oligonucleotídeos sintéticos é a maior confiabilidade dos dados como resultado do uso de vários "oligos" por gene, incluindo controles de incompatibilidade para cada um. 11 A desvantagem é que a fabricação de microarray de alta tecnologia não pode ser prontamente estabelecida no ambiente acadêmico. Em vez disso, os microarrays de DNA são adquiridos de empresas como a Affymetrix. Conforme mencionado, o Affymetrix GeneChips contém tipicamente 22 oligonucleotídeos 25-meros diferentes (denominados sondas) para cada gene. Para cada uma dessas 22 sondas, uma sonda incompatível com uma única substituição de nucleotídeo central também é sintetizada como um controle para hibridização não específica. Os experimentos são projetados para analisar uma única amostra de DNA ou RNA que é marcada por fluorescência, hibridizada com o GeneChip e os sinais detectados por varredura confocal de fluorescência a laser (Fig. 5-1B). A reprodutibilidade e precisão relativamente altas das matrizes de oligonucleotídeos sintéticos permitem a comparação direta de dados entre os experimentos, após a normalização da média geral ou intensidade média de cada GeneChip para um padrão comum. 10


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RESULTADOS

Os dados do transcriptoma foram obtidos das duas zonas da ponta da raiz (Fig. 1) por meio de microarray e RNA-Seq. Um total de aproximadamente 33.500 e 22.700 genes foram detectados como expressos nas zonas de raiz de RNA-Seq e microarray, respectivamente (acesso GSE115555 de expressão de gene [GEO]).

Genes expressos diferencialmente nas duas zonas de raiz

Microarray detectou um total de 6.351 genes significativamente alterados com alteração de 2 ou mais, enquanto o RNA-Seq detectou um total de 6.403 genes que foram diferencialmente expressos entre as duas zonas de raiz. Entre esses dois conjuntos de genes, 4180 genes foram comumente identificados por ambas as técnicas (Fig. 2A). Dos 6.403 genes detectados pelo RNA-Seq, 2.223 genes eram exclusivos do RNA-Seq com uma alteração de 2 ou mais. No entanto, desses 2.223 genes, 771 eram verdadeiramente únicos para RNA-Seq e os 1.452 genes restantes foram detectados por microarray, mas não passaram o valor de corte de mudança de dobra 2 ou superior (log2 FC ≥1 ou ≤1). Os níveis de expressão dos genes estimados por RNA-Seq foram maiores do que os estimados por microarray. Portanto, um número maior de genes passou no critério de corte de alteração de dobra no RNA-Seq do que no microarray. Com o aumento dos requisitos de alteração de dobra, RNA-Seq detectou um maior número de genes em comparação com o microarray (Fig. 2B, C). Em níveis de alteração de dobra de 4 e 8, RNA-Seq identificou 364 e 63 genes únicos em comparação com 41 e seis genes, respectivamente, identificados pelo microarray (círculos internos no diagrama de Venn Fig. 2). No geral, o RNA-Seq foi mais eficiente na detecção de um maior número de genes significativamente alterados em comparação com o microarray.

Genes expressos diferencialmente nas duas zonas de raiz eram funcionalmente distintos

A distribuição dos transcritos nas categorias de GO mais proeminentes está resumida na Tabela 1. Os grupos funcionais regulados positivamente listados na Tabela 1 são aqueles enriquecidos na Zona 2, que incluem localização e transporte de lipídios, morfogênese da raiz, diferenciação da célula epidérmica da raiz, maturação celular, biossintético de polipropenóide processo, diferenciação de células ciliadas da raiz, maturação de tricoblastos e processo metabólico secundário. Os genes regulados para baixo na Zona 2 são aqueles enriquecidos na Zona 1 da raiz (ponta). A análise GO desses genes agrupou-se principalmente em grupos funcionais: regulação do ciclo celular, montagem do complexo de DNA de proteína, montagem da cromatina, embalagem de DNA e processo metabólico, organização do citoesqueleto, divisão celular, biogênese do componente celular e organização (Tabela 1).

Regulado Regulado para baixo
Termo GO Descrição FDR Termo GO Descrição FDR
GO: 0010876 Localização lipídica 4,00E-16 GO: 0051726 Regulação do ciclo celular 3,70E-06
GO: 0006869 Transporte lipídico 1,20E-07 GO: 0007049 Ciclo de célula 3,90E-06
GO: 0042221 Resposta ao estímulo químico 8,80E-07 GO: 0065004 Montagem do complexo proteína-DNA 7.50E-05
GO: 0009698 Processo metabólico fenilpropanóide 1,10E-05 GO: 0031497 Conjunto de cromatina 7.50E-05
GO: 0010054 Diferenciação de tricoblasto 1.80E-05 GO: 0006323 Embalagem de DNA 0.0001
GO: 0006810 Transporte 2,10E-05 GO: 0007166 Via de sinalização ligada ao receptor de superfície celular 0.00021
GO: 0010015 Morfogênese da raiz 2,10E-05 GO: 0006333 Montagem ou desmontagem da cromatina 0.0003
GO: 0051234 Estabelecimento de localização 2,20E-05 GO: 0007167 Via de sinalização de proteína receptora ligada a enzima 0.00046
GO: 0010053 Diferenciação de células epidérmicas da raiz 3,70E-05 GO: 0007169 Via de sinalização da proteína tirosina quinase do receptor transmembrana 0.00046
GO: 0006725 Processo metabólico de composto aromático celular 4.30E-05 GO: 0022402 Processo de ciclo celular 0.00063
GO: 0051179 Localização 4,80E-05 GO: 0051301 Divisão celular 0.00067
GO: 0050896 Resposta ao estímulo 7,20E-05 GO: 0006996 Organização Organelle 0.0015
GO: 0009699 Processo biossintético de fenilpropanoide 8,80E-05 GO: 0022607 Conjunto de componente celular 0.0024
GO: 0019748 Processo metabólico secundário 0.0001 GO: 0007010 Organização do citoesqueleto 0.0034
GO: 0048469 Maturação celular 0.00011 GO: 0048366 Desenvolvimento da folha 0.0055
GO: 0048765 Diferenciação de células ciliadas da raiz 0.00011 GO: 0044085 Biogênese do componente celular 0.0059
GO: 0048764 Maturação de tricoblasto 0.00011 GO: 0016043 Organização de componente celular 0.0067
GO: 0009664 Organização da parede celular tipo planta 0.00015 GO: 0006259 Processo metabólico do DNA 0.0068
GO: 0048468 Desenvolvimento celular 0.00016 GO: 0006325 Organização da cromatina 0.0073
GO: 0022622 Desenvolvimento de sistema raiz 0.00023 GO: 0048827 Desenvolvimento do Phyllome 0.0088
  • FDR = taxa de descoberta falsa.
  • uma Análise de ontologia gênica (GO) dos genes significativamente alterados entre a Zona 2 e a Zona 1 realizada usando agriGO (Du et al., 2010). Grupos funcionais regulados positivamente são aqueles enriquecidos na Zona 2, os grupos regulados negativamente são aqueles enriquecidos na Zona 1.

Alguns dos genes expressos diferencialmente em altos níveis de dobra (Tabela 2) e suas funções, conforme definido no Arabidopsis A base de dados TAIR (Huala et al., 2001) é descrita abaixo.

UP Reg Gene ID Registro2 FC RNA-Seq Registro2 Microarray FC Número de adesão e breve descrição
AT4G40090 10.14 6.17 NM_120175. Arabidopsis thaliana AGP3 (arabinogalactan-proteína 3) (AGP3) mRNA, cds.
AT1G48750 9.01 5.21 NM_103770. Inibidor de protease de Arabidopsis thaliana / armazenamento de sementes / proteína de transferência de lipídios (LTP) mRNA da família da proteína (AT1G48750), cds.
AT5G05960 8.93 5.76 NM_120678. Inibidor da protease de Arabidopsis thaliana / armazenamento de sementes / proteína de transferência de lipídios (LTP) mRNA da família da proteína (AT5G05960), cds.
AT3G18280 8.82 4.93 NM_112712. Inibidor da protease de Arabidopsis thaliana / armazenamento de sementes / proteína de transferência de lipídios (LTP) mRNA da família da proteína (AT3G18280), cds.
AT1G12040 8.53 7.29 NM_101076. Arabidopsis thaliana LRX1 (REPETIÇÃO RICA EM LEUCINA / EXTENSINA 1) histidina fosfotransfer quinase / ligação de proteína / constituinte estrutural da parede celular (LRX1) mRNA, cds.
AT5G67400 8.46 7.98 NM_126140. Peroxidase 73 de Arabidopsis thaliana (PER73) (P73) (PRXR11) (AT5G67400) mRNA, cds.
AT1G10380 8.31 5.16 NM_100912. Arabidopsis thaliana mRNA de lipoproteína de membrana putativa, cds.
AT3G54590 8.21 5.49 NM_115316. Arabidopsis thaliana ATHRGP1 (HYDROXYPROLINE-RICH GLYCOPROTEIN) constituinte estrutural do mRNA da parede celular (ATHRGP1), cds.
AT3G25930 8.08 5.96 NM_113497. ARNm da família da proteína do estresse universal (USP) de Arabidopsis thaliana (AT3G25930), cds.
AT5G65530 8.01 6.86 NM_125951. Proteína quinase de Arabidopsis thaliana, mRNA putativo (AT5G65530), cds.
AT1G02900 7.84 6.83 NM_100171. Arabidopsis thaliana RALF1 (FATOR DE ALCALINIZAÇÃO RÁPIDA 1) mRNA do transdutor de sinal (RALF1), cds.
AT1G30870 7.76 6.18 NM_102824. Peroxidase catiônica de Arabidopsis thaliana, mRNA putativo (AT1G30870), cds.
AT1G48930 7.68 7.19 NM_103786. Arabidopsis thaliana AtGH9C1 (Arabidopsis thaliana glicosil hidrolase 9C1) catalítico / hidrolase, hidrolisando compostos de O-glicosil (AtGH9C1) mRNA, cds.
AT5G58010 7.68 5.77 NM_125186. ARNm da família de proteína (AT5G58010) de Arabidopsis thaliana básica hélice-ansa-hélice (bHLH), cds.
AT1G75750 7.64 7.02 NM_106225. Arabidopsis thaliana GASA1 (GAST1 PROTEIN HOMOLOG 1) (GASA1) mRNA, cds.
AT5G66815 7.54 5.29 NM_126080. Arabidopsis thaliana C-PÉPTIDO 5 TERMINALMENTE CODIFICADO, ARNm da proteína transmembranar CEP5 (AT5G66815), cds.
AT3G21550 7.51 3.09 NM_113050. Arabidopsis thaliana DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 2, ATDMP2, DMP2, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 2 (AT3G21550) mRNA, cds.
AT3G10340 7.40 5.17 NM_111869. Arabidopsis thaliana PAL4 (fenilalanina amônia-liase 4) amônia ligase / amônia-liase / mRNA catalítico (PAL4), cds.
AT4G02270 7.39 6.70 NM_116460. Arabidopsis thaliana pólen Ole e 1 alérgeno e proteína da família da extensina mRNA (AT4G02270), cds.
AT5G44130 7.37 5.33 NM_123780. Arabidopsis thaliana FLA13 (PRECURSOR DA PROTEÍNA 13 ARABINOGALACTAN SEMELHANTE A FASCICLINA) (FLA13) mRNA, cds.
AT5G19520 −5.59 −4.39 NM_121957. Arabidopsis thaliana MSL9 (CANAL MECANOSSENSÍVEL DE PEQUENA CONDUTÂNCIA-LIKE 9) mRNA do canal iônico mecanicamente fechado (MSL9), cds.
AT3G13175 −5.61 −3.43 NM_112157. ARNm da proteína desconhecida de Arabidopsis thaliana (AT3G13175), cds.
AT2G38810 −5.72 −5.54 NM_129438. Arabidopsis thaliana HTA8 (HISTONE H2A 8) mRNA de ligação ao DNA (HTA8), cds.
AT5G13870 −5.78 −4.06 NM_121390. Arabidopsis thaliana EXGT-A4 (ENDOXYLOGLUCAN TRANSFERASE A4) hidrolase, atuando em ligações glicosil / hidrolase, hidrolisando compostos O-glicosil / x & gt (EXGT-A4) mRNA, cds completos.
AT1G57590 −5.79 −4.63 NM_104556. ARNm de Arabidopsis thaliana carboxilesterase (AT1G57590), cds.
AT3G51280 −5.99 −3.91 NM_114987. Arabidopsis thaliana esterilidade masculina MS5, mRNA putativo (AT3G51280), cds.
AT2G23050 −6.26 −5.40 NM_127869. Arabidopsis thaliana NPY4 (NAKED PINS IN YUC MUTANTS 4) mRNA de ligação de proteína / transdutor de sinal (NPY4) mRNA, cds.
AT2G22610 −6.30 −2.95 NM_127826. ARNm relacionado com a proteína motora de cinesina de Arabidopsis thaliana (AT2G22610), cds.
AT2G34020 −6.35 −3.11 NM_128953. ARNm de ligação do ião cálcio de Arabidopsis thaliana (AT2G34020), cds.
AT5G48940 −6.38 −4.74 NM_124271. Arabidopsis thaliana proteína quinase transmembranar de repetição rica em leucina, mRNA putativo (AT5G48940), cds.
AT2G20515 −6.48 −3.32 NM_127611. ARNm da proteína alérgica da família Ole e I do pólen de Arabidopsis thaliana (AT2G20515), cds.
AT2G25060 −6.51 −4.12 NM_128063. ARNm da proteína contendo o domínio do tipo plastocianina de Arabidopsis thaliana (AT2G25060), cds.
AT3G52910 −6.52 −2.97 At3g52910. 68416.t05420 expressou proteína quase idêntica ao ativador de transcrição GRL4 [Arabidopsis thaliana] GI: 21539886 (não publicado)
AT2G45050 −6.81 −5.12 NM_130069. ARNm da família da proteína de dedo de zinco de Arabidopsis thaliana (tipo GATA) (AT2G45050), cds.
AT5G60530 −6.88 −4.32 NM_125446. Arabidopsis thaliana embriogênese tardia abundante relacionada à proteína / LEA (AT5G60530) mRNA, cds completo.
AT5G10130 −7.22 −5.16 NM_121051. Arabidopsis thaliana pólen Ole e 1 alérgeno e proteína da família da extensina mRNA (AT5G10130), cds.
AT1G18250 −7.39 −5.43 NM_001035987. ARNm de Arabidopsis thaliana ATLP-1 (ATLP-1), cds.
AT5G28640 −7.86 −5.71 NM_122747. Arabidopsis thaliana AN3 (ANGUSTIFOLIA 3) coativador de proteína de ligação / transcrição (AN3) mRNA, cds.
AT2G28790 −7.93 −5.44 NM_128438. Proteína semelhante a osmotina de Arabidopsis thaliana, mRNA putativo (AT2G28790), cds.
AT1G52070 −9.15 −5.77 NM_104088. ARNm da proteína da família de lectinas de Arabidopsis thaliana jacalin (AT1G52070), cds.

A Zona Raiz 2 foi enriquecida com genes envolvidos em processos metabólicos de crescimento secundário, como resposta a estímulos, alongamento celular, diferenciação e desenvolvimento e maturação de cabelo de raiz (Tabela 1). Os genes nessas categorias incluem proteínas arabinogalactana (AT4G40090, AT5G44130), proteína básica hélice-alça-hélice (bHLH) (AT5G58010) e as repetições ricas em leucina (LRX) / proteínas da família da extensina (AT1G12040, AT4G02270). Outro conjunto de genes altamente enriquecidos na Zona 2 são as proteínas do metabolismo lipídico: as proteínas da família das proteínas de armazenamento de sementes / proteínas de transferência de lipídios (AT1G48750, AT5G05960, AT3G18280). Também foram induzidas peroxidases que são específicas da raiz do cabelo (AT5G67400, AT1G30870) e o gene de sinalização celular (AT1G02900).

A zona raiz 1 foi enriquecida com genes envolvidos no metabolismo do crescimento primário, como componentes celulares, ciclo celular e metabolismo do DNA. Os genes enriquecidos na zona 1 da ponta da raiz incluíram: biogênese da parede celular e genes de organização (AT5G13870, AT1G57590), regulação da expressão gênica (AT3G52910, AT2G45050) ligação de ATP / microtúbulo (AT2G22610, AT5G48940) divisão celular / ciclo celular (AT3G51290, AT2G45050) e resposta de ATP / microtúbulo (AT2G22610, AT5G48940) para estímulo mecânico, luminoso e de organismo (AT2G23050 [gravitropismo], AT2G45050 [luz], AT5G19520 [mecânico], AT1G18250 e AT2G28790 [patógeno]). Outros genes enriquecidos na Zona 1 incluíram aqueles com função prevista de ligação e transporte de íons (AT5G19520, AT2G34020, AT2G25060), juntamente com a proteína abundante da embriogênese tardia (LEA) (AT5G60530).

Genes únicos / novos identificados por RNA-Seq não identificados por microarray

O RNA-Seq detectou 771 genes que não foram detectados pelo microarray (Apêndice S1). Trezentos e trinta e nove genes foram enriquecidos na Zona 2 da ponta da raiz (regulação positiva na Zona 2) e 432 genes foram enriquecidos na Zona 1 da ponta da raiz (regulação negativa na Zona 2) (Apêndice S1). A análise GO desses genes agrupou os genes nos seguintes grupos: constituinte estrutural do ribossomo, atividade molecular estrutural e atividade do fator de alongamento da tradução. Os 20 principais genes com maior alteração estão listados na Tabela 3. Estes incluem proteína da família da extensina (AT3G09925), transportador de fosfato 1 (AT5G43350), proteína da família ovate 17 (AT2G30395), proteína da superfamília semelhante à pectina liase (AT4G23500), resposta da citocinina fator 4 (AT4G27950), proteína da família da proteína quinase (AT5G07140), proteína da família da transducina (AT4G33270) e proteína semelhante à defensina (AT4G22235).

Gene Registro2 FC Símbolo Pequena descrição
AT5G07322 7.72 N / D Outro RNA [Fonte: TAIRAcc: AT5G07322]
AT3G09925 7.35 N / D Pólen Ole e 1 alérgeno e proteína da família da extensina [Fonte: TAIRAcc: AT3G09925]
AT1G28815 7.15 N / D Proteína desconhecida tem cinco acertos BLAST para cinco proteínas em duas espécies: Arqueiros - 0 Bactérias - 0 Metazoa - 0 Fungos - 0 Plantas - 5 Vírus - 0 Outros Eucariotos - 0 (fonte: NCBI BLink). [Fonte: TAIRAcc: AT1G28815]
AT5G48920 7.06 TED7 Relacionado à diferenciação do elemento traquear 7 [Fonte: TAIRAcc: AT5G48920]
AT5G43350 6.94 ATPT1 Transportador de fosfato 11 [Fonte: TAIRAcc: AT5G43350]
AT2G30395 6.92 ATOFP17 Proteína 17 da família Ovate [Fonte: TAIRAcc: AT2G30395]
AT3G24460 6.81 N / D Domínio da serina contendo proteína de biossíntese de serina e esfingolipídeo [Fonte: TAIRAcc: AT3G24460]
AT5G57887 6.63 N / D Proteína desconhecida FUNÇÕES EM: função molecular desconhecida ENVOLVIDA EM: processo biológico desconhecido LOCALIZADO EM: sistema de endomembrana Possui 30201 Blast acertos em 17322 proteínas em 780 espécies: Archae - 12 Bactérias - 1396 Metazoa - 17338 Fungos - 3422 /… / - 5037 Vírus - 0 Outros Eukaryotes - 2996 (fonte: NCBI BLink). [Fonte: TAIRAcc: AT5G57887]
AT2G28671 6.50 N / D Unknown protein FUNCTIONS IN: molecular_function unknown INVOLVED IN: biological_process unknown LOCATED IN: cellular_component unknown Has 30201 Blast hits to 17322 proteins in 780 species: Archae - 12 Bacteria - 1396 Metazoa - 17338 Fungi - /…/ Plants - 5037 Viruses - 0 Other Eukaryotes - 2996 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT2G28671]
AT1G77885 6.45 N / D Unknown protein BEST Arabidopsis thaliana protein match is: unknown protein (TAIR:AT1G22065.1) Has 35333 Blast hits to 34131 proteins in 2444 species: Archae - 798 Bacteria - 22429 Metazoa - 974 Fungi - 991 Plants - 531 Viruses - 0 Other Euk /…/s - 9610 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT1G77885]
AT5G19230 6.17 N / D Glycoprotein membrane precursor GPI-anchored [Source:TAIRAcc:AT5G19230]
AT4G23500 5.85 N / D Pectin lyase-like superfamily protein [Source:TAIRAcc:AT4G23500]
AT4G27950 −4.04 CRF4 Cytokinin response factor 4 [Source:TAIRAcc:AT4G27950]
AT3G63430 −4.10 TRM5 TON1 RECRUITING MOTIF 5, TRM5 zinc finger CCCH domain protein(source:Araport11)
AT5G01445 −4.13 N / D Unknown protein FUNCTIONS IN: molecular_function unknown INVOLVED IN: biological_process unknown LOCATED IN: mitochondrion Has 5 Blast hits to 5 proteins in 2 species: Archae - 0 Bacteria - 0 Metazoa - 0 Fungi - 0 Plants - 5 Viruses - 0 Ot /…/karyotes - 0 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT5G01445]
AT5G41071 −4.20 N / D Unknown protein Has 30201 Blast hits to 17322 proteins in 780 species: Archae - 12 Bacteria - 1396 Metazoa - 17338 Fungi - 3422 Plants - 5037 Viruses - 0 Other Eukaryotes - 2996 (source: NCBI BLink). [Source:TAIRAcc:AT5G41071]
AT5G07140 −4.50 N / D Protein kinase superfamily protein [Source:TAIRAcc:AT5G07140]
AT4G33270 −4.74 CDC20.1 Transducin family protein / WD-40 repeat family protein [Source:TAIRAcc:AT4G33270]
AT4G22235 −5.24 N / D Arabidopsis defensin-like protein [Source:TAIRAcc:AT4G22235]
AT2G22496 −5.56 MIR779A MIR779a miRNA [Source:TAIRAcc:AT2G22496]

Furthermore, a total of 107 novel transcripts were identified that were mapped to the genome but did not have any gene annotation in the reference genome database. Out of these 107 transcripts, 19 were found to be significantly changed between the zones at FDR < 0.01 (Appendix S2).

Additional information from RNA-Seq on differentially expressed genes

In addition to the differential gene expression data, RNA-Seq provided information on isoforms, coding DNA sequences, and transcription start sites. Figure 3 provides examples of isoform information from four different genes in Zone 2 that were significantly altered between the two root zones to study their isoform information—two upregulated genes: AT5G05960 (protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein [LTP] family protein) and AT4G02270 (pollen Ole e 1 allergen and extensin family protein) and two downregulated genes: AT2G23050 (NPY4 [NAKED PINS IN YUC MUTANTS 4]) and protein binding/signal transducer (NPY4) and AT1G18250 (Arabidopsis thaumatin-like protein [ATLP-1]). The differential expression of these four genes in the two root zones from microarray and RNA-Seq are shown in Fig. 3A. Log2 FC values for these genes in RNA-Seq and microarray were comparable, and RNA-Seq estimated a higher level of fold change for all four genes (Fig. 3A). Expression levels of these genes (Fig. 3B) and isoforms (Fig. 3C) in root Zone 1 and 2 were plotted using FPKM values measured by RNA-Seq. Although all of these genes were significantly changed between Zone 1 and Zone 2 (Fig. 3B), the different FPKM values measured can be attributed to changes in alternative isoforms (Fig. 3C). For instance, the FPKM values of two isoforms of genes AT5G05960 and AT2G23050 are not significantly changed individually (Fig. 3C), but when the expression values are added up there is a significant change in gene expression (Fig. 3B). On the contrary, in genes AT4G02270 and AT1G18250, one isoform in each gene (TCONS_00025944 and TCONS_00005036, respectively) was significantly altered in expression, leading to a change in the total FPKM values (Fig. 3C).


Types of Microarrays

Depending upon the kind of immobilized sample used construct arrays and the information fetched, the Microarray experiments can be categorized in three ways:

1. Microarray Expression Analysis: In this experimental setup, the cDNA derived from the mRNA of known genes is immobilized. The sample has genes from both the normal as well as the diseased tissues. Spots with more intensity are obtained for diseased tissue gene if the gene is over expressed in the diseased condition. This expression pattern is then compared to the expression pattern of a gene responsible for a disease.

2. Microarray for Mutation Analysis: For this analysis, the researchers use gDNA. The genes might differ from each other by as less as a single nucleotide base.

A single base difference between two sequences is known as Single Nucleotide Polymorphism (SNP) and detecting them is known as SNP detection.

3. Comparative Genomic Hybridization: It is used for the identification in the increase or decrease of the important chromosomal fragments harboring genes involved in a disease.


Genomic and microarray approaches to coral reef conservation biology

New technologies based on DNA microarrays and comparative genomics hold great promise for providing the background biological information necessary for effective coral reef conservation and management. Microarray analysis has been used in a wide range of applications across the biological sciences, most frequently to examine simultaneous changes in the expression of large numbers of genes in response to experimental manipulation or environmental variation. Other applications of microarray methods include the assessment of divergence in gene sequences between species and the identification of fast-evolving genes. Arrays are presently available for only a limited range of species, but with appropriate controls they can be used for related species, thus avoiding the considerable costs associated with development of a system de novo. Arrays are in use or preparation to study stress responses, early development, and symbiosis in Acropora e Montastraea. Ongoing projects on several corals are making available large numbers of expressed gene sequences, enabling the identification of candidate genes for studies on gamete specificity, allorecognition and symbiont interactions. Over the next few years, microarray and comparative genomic approaches are likely to assume increasingly important and widespread use to study many aspects of the biology of coral reef organisms. Application of these genomic approaches to enhance our understanding of genetic and physiological correlates during stress, environmental disturbance and disease bears direct relevance to the conservation of coral reef ecosystems.

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CONCLUSIONS

We have shown proof-of-principle of a hybrid SBS/SBL biochemistry called CycLiC. Gel experiments show that the ligation and cleavage mechanism is effective and can lead to high reaction completion. Notably, we have also shown that a microarray probe can be used to capture a template which can then be subjected to CycLiC to read up to three contiguous bases. A range of further optimization studies should be conducted, including how to retain the template-primer duplex in place after capture in order to extend the sequence read further. CycLiC on microarrrays uses ‘generic’ commercially available enzymes, common oligonucleotide modifications and standard microarrays and because the read will be from a targeted genomic location, sequence re-assembly algorithms will not be necessary. The method will therefore be amenable to adaptation and improvement by a community of users for sequencing as much or as little as desired from any genome for which a reference sequence is available.


Assista o vídeo: Aprenda os fundamentos do Microarray (Dezembro 2021).