Em formação

12: Transformação de Levedura - Biologia


As técnicas para transformar organismos microbianos com DNA estranho são essenciais na biologia molecular moderna. Neste laboratório,
você vai transformar um S. cerevisiae met cepa com três plasmídeos diferentes e usar ura3complementação para detectar transformados
células. Você usará então o revestimento de réplicas para determinar se S. pombe Met genes são funcionalmente equivalentes aS. cerevisiae MET genes.


Objetivos

No final deste laboratório, os alunos devem ser capazes de:

  • explicar os processos de transformação e complementação a nível molecular.
  • projetar uma estratégia de seleção para isolar cepas transformadas
  • transformar S. cerevisiae com plasmídeos e transformantes isolados em meios seletivos
  • usar replicação de placas para analisar a capacidade de codificação de plasmídeo CONHECEU genes para complementar conheceu deficiências

Neste experimento, você pode receber uma resposta preliminar à pergunta de pesquisa do semestre sobre a conservação funcional das proteínas Met no Ascomycota. Durante a primeira parte do semestre, sua equipe usou o plaqueamento seletivo e PCR de colônia para identificar mutantes de deleção de levedura. Em seguida, você isolou e caracterizou os plasmídeos que podem ser usados ​​para superexpressar as proteínas Met. Esses dois conjuntos de experimentos vêm juntos neste laboratório, quando você transforma o S. cerevisiae de deleção com os plasmídeos de expressão. Por meio de uma série de experimentos de complementação, você vai determinar se os genes carregados nos plasmídeos são capazes de compensar a falta CONHECEU genes nos mutantes. Em complementação, o gene introduzido restaura o fenótipo normal para um mutante com um gene defeituoso.


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