Em formação

Perguntas gerais sobre realçador (padrões de metilação, ect.)


Tenho uma (s) pergunta (s) biológica (s) para vocês envolvendo intensificadores.

1.) Enhancers funcionam sendo os locais de ligação para TFs. Mas como isso aumenta a transcrição? (Especialmente quando os intensificadores podem estar extremamente distantes do gene que controlam.)

2.) Os intensificadores podem se tornar metilados. Quando o fazem, isso geralmente impede a ligação do fator de transcrição? E se impede a ligação, como isso afeta o papel do FT e a expressão do gene.

EDIT: Aqui está o que eu encontrei.

Parece que os intensificadores podem estar longe do gene sobre o qual atuam, mas a ligação do TF por meio de seu domínio de ligação ao DNA pode causar looping do DNA para ajudá-los a alcançar a região promotora do gene de interesse. Assim, aumentando a taxa de expressão do gene.

No reverso, às vezes pode-se ver que a metilação age como silenciador da expressão gênica. Portanto, se nossa região do potenciador for metilada, isso pode impedir a ligação ao TF e o potenciador de aumentar a expressão gênica.

BÔNUS: A metilação em promotores também pode causar silenciamento, impedindo a RNA polimerase II e as proteínas necessárias (ect) de transportar a transcrição.

Se alguém quiser adicionar (ou corrigir alguma coisa, me avise!)


Este assunto é realmente complicado e compreendido de forma incompleta. Por exemplo, há evidências de que alguns realçadores não resultam em loops - em vez disso, sua influência viaja ao longo da cromatina para um promotor próximo.

Você pode pensar nos potenciadores como áreas de preparação onde os complexos de proteínas que promovem a transcrição são montados. Em alguns casos, os intensificadores estão onde o complexo de RNA polimerase é ligado pela primeira vez.

Quando os loops se formam, isso permite que as proteínas em um potenciador interajam diretamente com o local de início da transcrição.

Acho que você achará esta análise de 2015 uma introdução útil.1


Quanto à metilação (que talvez fosse melhor como uma questão separada), geralmente é verdade que a metilação atua para reduzir a ligação do fator de transcrição e, portanto, diminui a transcrição.2

No entanto, essa tendência geral disfarça algumas dinâmicas mais complexas.3


Referências:

1: Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., & Bejerano, G. (2013). Enhancers: cinco questões essenciais. Nature Reviews Genetics, 14(4), 288.

2: Lea, A. J., Vockley, C. M., Johnston, R. A., Del Carpio, C. A., Barreiro, L. B., Reddy, T. E., & Tung, J. (2018). Quantificação do genoma dos efeitos da metilação do DNA na regulação do gene humano. ELife, 7, e37513.

3: Sharifi-Zarchi, A., Gerovska, D., Adachi, K., Totonchi, M., Pezeshk, H., Taft, R. J.,… & Araúzo-Bravo, M. J. (2017). A metilação do DNA regula a discriminação de potenciadores de promotores por meio de um mecanismo de gangorra H3K4me1-H3K4me3. BMC genômica, 18(1), 964.


AP Bio Capítulo 14 Perguntas de estudo

Qual das alternativas a seguir é uma explicação provável para a falta de expressão do transgene na quinta linha celular?

Das falas que expressam o transgene, uma é transcrita, mas não traduzida. Qual das alternativas a seguir é uma explicação provável?

Em um conjunto de experimentos, ela conseguiu diminuir a metilação das caudas das histonas. Qual dos resultados a seguir ela provavelmente veria?

Um de seus colegas sugeriu que ela tentasse aumentar a metilação dos nucleotídeos C em um sistema de mamíferos. Qual dos resultados a seguir ela provavelmente veria?

Em um conjunto de experimentos usando este procedimento em Drosophila, ela foi prontamente bem-sucedida em aumentar a fosforilação dos aminoácidos adjacentes aos aminoácidos metilados nas caudas das histonas. Qual dos resultados a seguir ela provavelmente veria?

Além disso, ela encontra que outras evidências da atividade desse pedaço de RNA de fita simples?


Fundo

A diferenciação bem-sucedida de zigotos em diferentes tipos de células que compõem um organismo multicelular complexo requer flexibilidade para responder às sugestões ambientais, mas também um controle rígido da expressão gênica durante os processos de desenvolvimento. A regulação da expressão gênica, entre outros, depende de uma rede complexa de fatores de transcrição específicos de sequência (TFs), bem como fatores de proteína que podem ler ou escrever modificações de cromatina [1, 2]. Além disso, a regulação da expressão gênica depende da informação genética codificada dentro cis- regiões reguladoras, como promotores e intensificadores da transcrição, que contêm vários locais de ligação ao TF e exibem características particulares de DNA e cromatina [3]. Na última década, as abordagens do genoma em animais identificaram milhares de potenciadores (ver, por exemplo, [4]). Mutações em potenciadores são conhecidos por causar defeitos de desenvolvimento, câncer ou outras doenças [5,6,7,8], enfatizando o papel crucial dos potenciadores na regulação da expressão gênica. A identificação de potenciadores em todo o genoma de alto rendimento em espécies de plantas só começou recentemente e apenas um pequeno número de potenciadores foi completamente estudado em espécies de plantas [9, 10], incluindo potenciadores para booster1 (b1) [11, 12], teosinto ramificado 1 (tb1) [13, 14], cor do pericarpo 1 (p1) [15] em milho, Bloco C para FLOWERING LOCUS T no Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) [16, 17] e os intensificadores para a clorofila a / b- gene de proteína de ligação AB80 e plastocianina de ervilha gene em Pisum sativum [18, 19]. Até agora, poucas abordagens de todo o genoma para identificar cis-sequências regulatórias em plantas foram relatadas, isto é, em Arabidopsis, Oryza sativa (arroz) e milho [20,21,22]. Embora vários estudos em plantas relataram perfis de todo o genoma para diferentes características da cromatina, apenas um, em Arabidopsis, teve como objetivo descobrir realçadores [20].

Os potenciadores podem estar localizados a montante ou a jusante de seus genes-alvo e interagir fisicamente com seus genes-alvo para regular a expressão gênica [23, 24]. Eles são tipicamente sequências curtas de DNA de 50-1000 bps que são ligadas por TFs e caracterizadas por uma estrutura de cromatina acessível, especialmente quando estão ativamente envolvidas na regulação da expressão gênica [25, 26]. Com base em estudos extensivos em animais, os intensificadores ativos estão associados à baixa metilação do DNA e modificações nas histonas, como a acetilação das lisinas 9, 14 e 27 da histona H3 (H3K9ac, H3K14ac e H3K27ac) [27,28,29,30]. A mono-metilação da lisina 4 da histona H3 (H3K4me1) é enriquecida em intensificadores, independentemente de sua atividade [27, 28]. Foi relatado que a metilação do DNA baixa se correlaciona positivamente com a atividade do intensificador e também é usada para prever os intensificadores [29, 31]. Embora dados limitados estejam disponíveis atualmente, características semelhantes de DNA e cromatina foram observadas em intensificadores de plantas conhecidos, indicando que essas marcas podem, pelo menos parcialmente, ser conservadas entre animais e plantas [9].

Outra característica relatada para realçadores de animais é a transcrição bidirecional, produzindo o chamado RNA intensificador (eRNA). Os níveis de expressão de eRNA correlacionam-se positivamente com os níveis de expressão do gene alvo do potenciador [4, 32], o que pode ajudar a ligar os potenciadores aos seus genes alvo. A função dos eRNAs ainda não está clara, mas foi relatado que alguns deles desempenham um papel no recrutamento de FTs para potenciadores ou na formação de interações potenciador-promotor [33, 34].

O objetivo deste estudo foi uma identificação em todo o genoma de intensificadores intergênicos ativos no milho e encontrar seus genes-alvo mais prováveis ​​integrando características de cromatina específicas de tecido e níveis diferenciais de expressão gênica. Para fazer isso, identificamos regiões com baixos níveis de metilação de DNA usando dados de sequenciamento de bissulfito (BS-seq) publicados [35] e medimos a acessibilidade da cromatina usando DNase-seq, acetilação H3K9 usando sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq) e expressão diferencial usando Sequenciamento de RNA (RNA-seq) em tecido de haste interno de estágio V2 (V2-IST) e tecido de casca. Identificamos aproximadamente 1.500 candidatos a intensificadores intergênicos e definimos sua especificidade para o tecido com base na presença ou ausência de hipersensibilidade à DNase I e sinais de enriquecimento de H3K9ac. Nosso pipeline foi validado pela detecção de três potenciadores (putativos) previamente identificados, regulando a expressão de b1, bx1 e tb1.


Desafio 1

Delineamento dos componentes cronológicos e biológicos dos relógios de metilação do DNA

Conhecimento atual

Os relógios epigenéticos derivados da metilação do DNA são atualmente melhores para estimar a idade cronológica real do que os dados transcriptômicos e proteômicos, ou comprimento dos telômeros [7]. No entanto, foi reconhecido que existia alguma variabilidade na estimativa de idade desses relógios iniciais, o que foi identificado como uma medida que captura a variação individual na idade biológica. A aceleração da idade, definida como a diferença entre esta idade medida epigeneticamente e a idade cronológica real, foi associada à mortalidade [26] e outros fenótipos ou doenças relacionadas com a idade [32,33,34,35,36,37,38,39] .

Dos primeiros relógios relatados, o Hannum et al. clock foi treinado e testado em DNA derivado do sangue [23]. Ele compreende 71 CpG selecionados da matriz Illumina 450k que captura fortemente as mudanças na idade cronológica, que é parcialmente impulsionada por mudanças relacionadas à idade na composição das células sanguíneas [23]. O relógio Horvath foi construído em vários tecidos, incluindo os dados de sangue de Hannum et al., Como um potencial relógio mestre “pan-tecido” de idade cronológica e focado na captura de mudanças compartilhadas, independente do tipo de tecido [24]. Ele incluiu 353 CpGs que estavam presentes no array Illumina 27k da geração anterior. Essas diferenças nos conjuntos de treinamento levaram a alguns resultados conflitantes entre as associações relatadas [7, 29, 40].

O envelhecimento leva a alterações epigenéticas, incluindo mudanças na metilação do DNA, por meio de vários mecanismos distintos e de interseção relacionados à idade [6, 41]. Muitos relógios de envelhecimento por metilação de DNA agora foram derivados e, devido aos seus pontos fortes e fracos individuais, uma referência explícita deve ser feita ao relógio específico empregado (veja mais em “Desafio 2”). A variação epigenética relacionada à idade capturada pode ser primeiramente dividida em aspectos intrínsecos, ou intracelulares, extrínsecos ou amplamente dentro do tecido e externos do processo de envelhecimento [27]. O primeiro é uma leitura substituta de vários processos celulares e genômicos, incluindo a possível deterioração dos mecanismos envolvidos na manutenção do epigenoma, enquanto o último inclui mudanças na proporção de células relacionadas à idade dentro de um tecido. Embora esses primeiros relógios sejam marcadores que capturam esses efeitos em maior ou menor grau [42], ambos podem prever a mortalidade por todas as causas em uma população, mas não em nível individual, mesmo após a correção para fatores de risco conhecidos [27]. Para investigar a idade biológica mais diretamente, os relógios também foram treinados em fenótipos relacionados à idade e doenças em combinação com a idade cronológica, como o relógio de metilação do DNA “PhenoAge” que incorpora nove medidas bioquímicas relacionadas à idade [43]. Observou-se que o tabagismo, um fator significativo relacionado à doença, impulsiona fortemente as alterações preditivas de metilação do DNA associadas à mortalidade [44]. No entanto, essas alterações de metilação relacionadas ao tabaco não influenciam Horvath ou Hannum et al. relógios, mas são capturados em “PhenoAge” [9]. Digno de nota, um relógio de metilação de DNA preditivo de mortalidade recentemente construído, denominado “GrimAge”, incorpora diretamente as mudanças relacionadas ao tabagismo por meio de uma estimativa de tabagismo em “maços de anos”. Este relógio também inclui certos níveis de proteína plasmática estimados pela metilação do DNA, e isso leva a uma previsão ainda mais forte de longevidade e expectativa de saúde [45].

Incerteza atual

Os primeiros relógios de metilação de DNA desenvolvidos foram considerados úteis para estimar a idade real, bem como capturar associações com aspectos biológicos do envelhecimento. Os dados coletados desses primeiros relógios ainda podem ser explorados para essas medidas cronológicas e biológicas. No entanto, agora que essa dualidade foi reconhecida, podemos tentar melhorar nossa avaliação dessas duas características. É provável que relógios especializados sejam mais poderosos para a previsão precisa da idade ou para capturar a deterioração funcional relacionada ao envelhecimento biológico específico ou previsões relacionadas a doenças [45]. Até que ponto esses dois usos distintos podem ser separados em relógios discretos e melhorados para sua função específica é atualmente desconhecido. No entanto, claramente se a medição do relógio de metilação do DNA da idade real foi perfeita, a perda de qualquer variabilidade remove a janela onde as associações de envelhecimento biológico podem ser feitas [46]. Cálculos empíricos estimam que a determinação da idade forense quase perfeita pode ser possível com tamanho de amostra grande o suficiente, mesmo com as atuais plataformas de matriz de metilação de DNA (ver Fig. 1a) [46], embora esta visão estatisticamente derivada de que relógios cronológicos podem se aproximar de extrema precisão não é realizada por todos no campo.

uma Erro de estimativa de idade cronológica. Com o aumento do tamanho da amostra de treinamento, é esperada uma medição aprimorada da idade cronológica, mesmo usando dados de matriz atuais (adaptado de Zhang et al. [46]). y-eixo: raiz quadrada média do erro (RMSE) da idade prevista. b Os relógios de metilação do DNA contêm informações cronológicas e biológicas. As proporções relativas de cada um dependerão das sondas CpG empregadas na construção do relógio. Portanto, existem vários relógios que podem ser deconvoluídos a partir de alterações epigenéticas relacionadas ao envelhecimento. Seguindo em frente, relógios cronológicos (relógio de idade forense) e biológicos mais precisos, específicos para doenças particulares, informativos sobre a saúde ou o estado da doença, precisam ser definidos e separados. c Trajetória da era epigenética. A idade epigenética não é linear ao longo do curso de vida. Idade cronológica em anos (x-eixo) e idade epigenética em anos (y-eixo)

Cada relógio de metilação de DNA que é construído é exclusivo para seu método de calibração [47], indicando a importância do (s) tecido (s) empregado (s), número de amostras e metodologia estatística. Claramente, tamanhos de amostra pequenos são mais suscetíveis a vários fatores de confusão relacionados ao envelhecimento, erros de medição e previsões estatísticas imperfeitas. Mesmo quando os relógios são treinados diretamente na idade cronológica real, a forte influência dos processos biológicos relacionados à idade pode distorcer os CpGs selecionados para o relógio, ressaltando a importância de uma população adequada de doadores de amostra. Além disso, conforme discutido no “Desafio 3”, Zhang et al. destacou recentemente o impacto não apenas do tamanho da amostra, mas também da correção do tipo de célula, em DNA derivado de tipo de célula heterogênea, na melhoria da previsão da idade cronológica [46].

Para relógios “biológicos”, outra área óbvia de incerteza é que não existe uma medida ou “padrão ouro” de envelhecimento biológico [6, 7, 41, 48]. Esse fenômeno abrange uma ampla gama de mudanças associadas à idade, desde as meramente visíveis até as relacionadas ao risco de doenças. Para entender como o envelhecimento pode ser caracterizado por mudanças epigenéticas cronológicas e biológicas relacionadas à idade, precisamos entender mais detalhadamente quais mecanismos podem estar subjacentes a essas observações. Não há evidências de que Horvath ou Hannum et al. Os CpGs de relógio são enriquecidos para funcionalidade além das matrizes focadas no promotor a partir das quais foram construídos. Além disso, os relógios têm mostrado variabilidade em sua capacidade de capturar medidas de idade mitótica, como o comprimento dos telômeros [9, 49], devido aos seus diferentes modelos de treinamento. Em geral, o envelhecimento epigenético é distinto do envelhecimento mediado pela senescência e não é prevenido pela expressão da telomerase [50,51,52]. Um recente relógio de telômero de metilação de DNA identificou que, embora esse relógio fosse treinado no comprimento do telômero, ele refletia mais fortemente a replicação celular e, além disso, estava associado a fenótipos relacionados ao envelhecimento mais fortemente do que o próprio comprimento do telômero [53].

Experimentos e recomendações futuras

Compreender os fatores cronológicos e biológicos desses relógios de metilação do DNA exigirá que eles sejam separados o máximo possível (ver Fig. 1b). A separação clara entre esses dois fatores, até conjuntos específicos de CpGs, levaria a relógios especializados mais poderosos e estudos mecanísticos distintos.

Para obter a estimativa mais precisa da idade real e a quantificação de sua robustez a partir de DNA facilmente avaliável, são necessárias análises de metilação de DNA em grande escala devidamente acionadas. Este é especialmente o caso se esta medida for usada como uma medida legal da idade humana [54,55,56,57]. Serão necessários testes em toda a gama de amostras de DNA coletadas rotineiramente, como aquelas coletadas de sangue periférico ou esfregaços bucais, mas também de outras fontes de DNA, como raiz de cabelo, pele e outros tecidos. No entanto, atualmente é provável que isso só seja tratável em dados derivados de sangue periférico, uma vez que estão disponíveis em grande escala. Para os outros tecidos, é provável que a abordagem seja insuficiente no futuro intermediário. CpGs específicos serão selecionados para construir relógios para estimativa de idade forense de alta precisão, quando a idade cronológica não for conhecida ou contestada. Eles irão empregar aqueles CpGs que são os mais robustos e precisos para tecidos específicos e seus tipos de células constituintes [58]. Precisaremos definir a influência da variação genética e dos fatores ambientais nessas medidas. Acumular esse conhecimento dos vários relógios de metilação do DNA guiará sua futura aplicação legal ou forense [59].

O componente biológico do envelhecimento captado pela aceleração epigenética da idade consiste em uma grande variedade de fatores, incluindo tecido específico, patologia do envelhecimento celular, deterioração estocástica e fatores relacionados à doença. Como mencionado, não há uma medida única da idade biológica, portanto, componentes específicos da biologia do envelhecimento devem ser focalizados e questionados. Isso inclui as vias biológicas relacionadas ao envelhecimento envolvendo, por exemplo, mTOR, IGF-1 e p53 [6], bem como aspectos epigenômicos, incluindo o complexo repressivo polycomb, níveis de TET / DNMT e metilação de H3K36 [60, 61] (ver Tabela 1). Esta análise refinada pode trazer uma nova visão mecanicista molecular para o processo de envelhecimento.

Relógios de tecido específico têm o potencial de ser clinicamente úteis como marcadores de prognóstico e diagnóstico de doenças, conforme discutido no seguinte “Desafio 2”. No entanto, não devemos esquecer os insights potencialmente intrigantes sobre a biologia do envelhecimento que podem ser identificados por modificações que ocorrem em todos os tipos de tecido no corpo, ou mudanças pan-tecido [62]. Candidatos outliers fortes para alterações pan-teciduais identificadas até o momento devem ser avaliados posteriormente, como hipermetilação de DNA em ELOVL2, bem como à procura de novas marcas de cromatina relacionadas ao envelhecimento. Para confirmar qualquer consistência de mudanças entre os tipos de tecido, em última análise, será necessária uma avaliação detalhada e em grande escala de tipos de células individuais ao longo do tempo.Esses pontos, juntamente com a distinção dos efeitos da variação baseada na composição do tipo de célula na metilação do DNA, são discutidos em mais detalhes em "Desafio 3" e "Desafio 5" e todos contribuirão significativamente para melhorar a precisão e compreensão das medidas relacionadas ao relógio.


A metilação de H3K4 associada ao potenciador protege a competência da linha germinativa in vitro

Tore Bleckwehl, Giuliano Crispatzu, Kaitlin Schaaf, Patricia Respuela, Michaela Bartusel, Laura Benson, Stephen J. Clark, Kristel M. Dorighi, Antonio Barral, Magdalena Laugsch, Wilfred FJ van IJcken, Miguel Manzanares, Joanna Rysocka, Wolf Reik, Álvaro -Iglesias

O H3K4me1 mantém as portas do intensificador abertas durante o desenvolvimento dos mamíferos para reativação?

Contexto 1-3

Enhancers são cruciais cis- elementos reguladores que sincronizam a expressão gênica espaço-temporal durante o desenvolvimento, retransmitindo sinais celulares. Os potenciadores são codificados epigeneticamente por H3K4me1 (mono-metilação da histona 3 lisina 4) e H3K27ac (acetilação da histona 3 lisina 27) que estão frequentemente associados à ligação de fatores de transcrição (TF), atividade da RNA polimerase II (RNAPII) e expressão do gene ativo.

No entanto, como qualquer outro processo de vida, a regulação do intensificador não é preto e branco. Por exemplo, a falta de H3K4me1 em potenciadores não parece afetar a ocupação de RNAPII e a expressão gênica, ou os níveis de H3K27ac. Portanto, H3K4me1 e H3K27ac podem ser dispensáveis ​​para a função de intensificador e expressão gênica, embora sejam úteis como marcadores epigenéticos para identificar intensificadores. Além disso, alguns intensificadores desativados (avaliados por níveis subótimos de H3K27ac, TF e RNAPII) em macrófagos diferenciados ainda retêm H3K4me1, possivelmente preparado para reativação no início de sinais específicos. Portanto, a desativação do intensificador pode ser parcial durante o desenvolvimento. Com base nisso, os autores do preprint atual investigaram o papel do H3K4me1 e da regulação mediada por potenciador da expressão gênica durante o desenvolvimento dos mamíferos.

Principais conclusões

  1. Neste trabalho, os autores usaram um modelo bem estabelecido em vitro sistema de diferenciação de células germinativas primordiais (PGC) para desvendar o papel de H3K4me1 e potenciadores durante o desenvolvimento. Usando condições de cultura definidas, eles diferenciaram células-tronco embrionárias (ESCs, naïve) em células germinativas semelhantes a epiblastos (EpiLC), células semelhantes a PGC (PGCLC) e células-tronco epiblásticas incompetentes de linha germinativa (EpiSC) (Fig 1a). Embora o EpiLC possa diferenciar ainda mais o PGCLC em corpos embrionários (EB), o EpiSC não pode. Medindo a expressão gênica (usando uma única célula e pool de células RNA-seq), eles definiram perfis de expressão gênica específicos do estágio corroborando com conjuntos de dados publicados anteriormente. Eles descobriram que ESCs e PGCLCs manifestaram perfis de expressão gênica semelhantes, que eram silenciosos no EpiLC e no EpiSC (Fig. 1b). Assim, em vários estágios de diferenciação de PGCLC, genes que são silenciados no EpiLC poderiam ser reativados no PGCLC.Figura 1: (a) Representação esquemática do sistema de diferenciação in vitro de PGCLC e localização in vivo de PGCs na extremidade posterior proximal de um embrião de camundongo. (b) dados de RNA-seq de célula única coletados em diferentes estágios de diferenciação de PGCLC in vitro. Mapas de calor mostrando a distribuição em todo o genoma de H3K27ac (c), H3K4me1 (d) e mCpG (e) em diferentes estágios de diferenciação de PGCLC in vitro.

Conclusão e perspectiva

Os autores propõem um modelo em que o H3K4me1 pode não ser necessário para a atividade intensificadora, mas fornece uma plataforma de cromatina que facilita a expressão gênica específica do estágio e do tipo de célula. Eles sugerem que o H3K4me1 pode evitar a heterocromatinização em elementos potenciadores e promover (re) ativação da transcrição no início de sinais celulares relevantes (aqui durante o desenvolvimento de PGCLC). Isso poderia explicar a desativação parcial dos potenciadores durante a diferenciação no desenvolvimento embrionário dos mamíferos. Como uma combinação de marcas epigenéticas ativas e inativas no potenciador impacta diferentes estágios de desenvolvimento dos mamíferos permanece aberto para pesquisas futuras.

Figura 3: Modelo proposto neste preprint ilustrando o descomissionamento parcial de intensificadores de PGCLC durante a diferenciação de PGCLC e sua relevância para a competência da linha germinativa.

Agradecimentos

Agradeço a Tore Bleckwehl e Álvaro Rada-Iglesias por seus comentários perspicazes sobre este preLight. Obrigado a todos os autores desta pré-impressão pelo apoio.

Todas as figuras usadas neste preLight foram tiradas diretamente de Bleckwehl T et. al., 2021 sob uma licença internacional CC BY-NC-ND 4.0.

Postado em: 13 de maio de 2021, atualizado em: 17 de maio de 2021

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Leia a pré-impressão (Ainda sem avaliações)

Tore Bleckwehl (TB) e Álvaro Rada-Iglesias (ARI) compartilharam

1. Os autores avaliaram as marcas de realçador em células superexpressas de NANOG e PRDM14. Os autores avaliaram o H3K4me1 e as mudanças na expressão gênica nessas células?

TB e ARI: os intensificadores de PGCLC são fortemente ligados por NANOG e PRDM14 no EpiLC competente da linha germinativa, mas não no EpiSC. Isso indica que os intensificadores de PGCLC são mais acessíveis no EpiLC. Quando realizamos os mesmos experimentos para as modificações de histonas ativas H3K4me2 e H3K27ac, encontramos um aumento em ambas as modificações. Portanto, concluímos que os intensificadores de PGCLC também são mais responsivos no EpiLC. No entanto, não avaliamos o H3K4me1 nos experimentos de superexpressão, em parte porque essa modificação da histona já era maior no EpiLC do que no EpiSC em condições normais.

2. Os autores pretendem usar perfis de RNA Polimerase II ChIP-seq para correlacionar com a atividade do intensificador?

TB e ARI: Analisamos perfis públicos de RNA polimerase II ChIP-seq para a diferenciação e encontramos uma correlação positiva com a atividade do intensificador que se assemelhava à dinâmica de H3K27ac durante a diferenciação de ESC em EpiLC e EpiSC. Porém, considerando a quantidade de dados genômicos já existentes, decidimos não incluí-los no manuscrito.

3. É muito interessante que as células mutantes MLL3 / 4 não manifestem alterações de transcrição, embora os padrões H3K4me1 sejam severamente desafiados. Como os autores enxergam que o H3K4me1 impacta o processo de diferenciação, apesar da falta de mudanças transcricionais? Seria ótimo ouvir a perspectiva dos autores sobre isso.

TB e ARI: Isso é realmente muito interessante. Mostramos que em ESC e após a diferenciação para EpiLC e EpiSC, a ausência de H3K4me1 parece ter um efeito bastante menor na expressão gênica. Por outro lado, mostramos que a perda de H3K4me1 prejudicou a indução adequada de PGCLC medida por FACS e RNA-seq de célula única e também reduziu a indução de genes associados a intensificadores de PGCLC. Com base em nossos dados atuais, propomos que H3K4me1 pode facilitar a reativação de intensificadores anteriormente ativos, tornando-os mais acessíveis e responsivos a ativadores transcricionais durante o estado competente da linha germinativa. Mais pesquisas são necessárias para investigar a importância de H3K4me1 em diferentes contextos celulares e para explorar se H3K4me1 pode contribuir para a função intensificadora por meio de mecanismos adicionais (por exemplo, arquitetura de cromatina 3D).

4. O que os autores pensam sobre o descomissionamento do intensificador heterogêneo no na Vivo dados? Os autores prevêem se isso é devido a uma infinidade de sinais celulares presentes na Vivo?

TB e ARI: Essa é outra questão interessante. Trabalhos de outros laboratórios mostraram que a diferenciação assíncrona de células pluripotentes e / ou oscilações em todo o genoma nos níveis de metilação CpG podem contribuir para a heterogeneidade na metilação CpG, que pode estar relacionada aos sinais múltiplos e opostos que o embrião enfrenta após a implantação. Assumindo que a metilação de CpG dentro dos intensificadores está negativamente correlacionada com a competência da linha germinativa, poderíamos imaginar que a heterogeneidade epigenética dentro dos intensificadores pode facilitar a diversidade das transições celulares. Por exemplo, essa heterogeneidade pode garantir que, durante a fase de competência da linha germinativa, algumas células epiblásticas possam exibir metilação CpG mais baixa dentro dos intensificadores de PGCLC e podem ser particularmente responsivas aos sinais indutivos da linha germinativa. Assim, essa heterogeneidade pode garantir que apenas um número limitado de células epiblásticas dê origem a PGCs.


Conclusões

Neste trabalho, realizamos uma análise sistemática da dinâmica de metilação do DNA associada ao câncer e ao envelhecimento no tecido cerebral em humanos e camundongos. Nós empregamos RRBS como uma plataforma que nos permitiu traçar o perfil de localizações genômicas comparáveis ​​em ambas as espécies. Com esta estratégia, primeiro confirmamos, em nosso sistema de estudo, os paralelismos nos padrões de metilação do DNA de linha de base entre humanos e camundongos. Posteriormente, exploramos as alterações associadas ao câncer e ao envelhecimento em ambas as espécies. Nossas análises revelaram que existem diferenças consideráveis ​​nas características genômicas e epigenômicas das alterações de metilação do DNA no câncer e no envelhecimento, e que as características particulares das alterações encontradas para cada processo são globalmente conservadas em humanos e em camundongos (ver fig. S17 suplementar, Material Suplementar online, para um esboço gráfico das principais conclusões). Encontramos paralelismos específicos ao nível de suas localizações genômicas e da magnitude das mudanças, as vias genéticas envolvidas, o contexto da cromatina das alterações, as famílias de elementos repetitivos do DNA afetados e a alteração dos locais de regulação do FT, entre outros. Curiosamente, observamos que as mudanças associadas ao envelhecimento em geral parecem impactar as vias de genes funcionais mais específicas em camundongos do que em humanos. No entanto, descobrimos que a hipermetilação clássica das vias gênicas do desenvolvimento é mais compartilhada entre o câncer e o envelhecimento em humanos do que em camundongos. Curiosamente, a alteração epigenética das repetições dos satélites parecia ser uma característica tanto do envelhecimento quanto do câncer em humanos, mas não em camundongos. Significativamente, encontramos semelhanças interespécies muito claras nas alterações associadas ao envelhecimento que ocorrem nos locais de ligação ao TF de famílias específicas, sugerindo que o impacto funcional das alterações de metilação do envelhecimento poderia ocorrer indiretamente por meio da desregulação do FT em vez do direcionamento direto de genes específicos. Finalmente, derivamos um grande conjunto de sítios CpG ortólogos com medições interespécies, o que nos permitiu observar que sítios de variabilidade epigenética são conservados entre as espécies, que diferenças interespécies entre humanos e camundongos podem ser parcialmente explicadas por mudanças no contexto genômico local associado com os locais CpG e que existem loci interespécies comuns que são alterados durante o envelhecimento e o câncer.

Os resultados apresentados neste manuscrito cobrem vários aspectos da dinâmica epigenética em humanos e camundongos, mas também devemos chamar a atenção para as limitações de nosso estudo. Em primeiro lugar, reconhecemos que o tamanho da amostra usado em nosso desenho de estudo é limitado (n = 3 por grupo), o que se deve principalmente ao número substancial de grupos em análise (quatro fenótipos em duas espécies). No entanto, a corroboração interespécies dos resultados indica que os padrões observados são robustos. Em segundo lugar, nos concentramos em um único tecido (cérebro). Embora isso nos tenha permitido realizar um estudo comparativo em maior profundidade, e é sabido que as alterações epigenéticas que surgem no câncer ou no envelhecimento são semelhantes entre os tecidos (Michalak et al. 2019), será de valor explorar a conservação interespécie de assinaturas epigenéticas em outros tecidos (Maegawa et al. 2017 Wang et al. 2017), e também outras espécies, como porco ou rhesus. Terceiro, usamos RRBS para traçar o perfil de localizações genômicas análogas em humanos e camundongos, uma tecnologia que se concentra em localizações densas de CpG e é mais limitada ao estudar regiões intergênicas. Dito isso, o uso de RRBS nos permitiu definir um grande subconjunto de medições interespécies (59.100 locais CpG) com cobertura adequada em todas as amostras.

De uma perspectiva evolutiva, as comparações multiespécies sistemáticas são de grande valor na compreensão da etiologia da doença. A descoberta de caminhos comuns entre espécies fornece explicações moleculares robustas para os mecanismos em jogo, enquanto as diferenças entre espécies podem ajudar a explicar as divergências fenotípicas observadas entre as espécies. Por exemplo, nossa observação da desregulação epigenética específica de humanos de genes de dedo de zinco no câncer pode estar relacionada à importância desta família em primatas, que experimentaram considerável expansão específica de linhagem em comparação com roedores (Huntley et al. 2006 Emerson e Thomas 2009). A ênfase nas vias específicas da espécie, embora relevante para a biologia evolutiva, é, por outro lado, de menos valor na biologia clínica, que busca a tradução de mecanismos para os humanos. A esse respeito, estudos integrativos multiespécies sistemáticos, abrangendo todo o genoma, como o apresentado aqui, têm o potencial de responder a questões relacionadas a ambas as extremidades.

Do ponto de vista mais clínico, podemos prever que nossos resultados podem despertar o interesse em diversas áreas. O camundongo é um dos principais modelos pré-clínicos para doenças humanas e, como tal, é essencial ter marcadores para a previsão do sucesso do tratamento em humanos (Day et al. 2015). Nesse sentido, neste trabalho, descobrimos que as mudanças epigenéticas comuns entre as espécies em doenças foram prontamente associadas a genes que mostram alterações de expressão em glioma em humanos. Assim, o foco em alterações epigenéticas conservadas, como as descritas aqui, pode ajudar a estreitar a busca por alvos funcionalmente relevantes que são alterados na doença. Nesse sentido, os avanços atuais no desenvolvimento de ferramentas de edição epigenética direcionada (Liu et al. 2016), combinados com o conhecimento da conservação epigenética em camundongos e humanos, podem servir como uma ferramenta poderosa para explorar o impacto geral da epigenética e da via alterações em múltiplos cenários biológicos.

Por outro lado, o conjunto de locais de metilação de DNA epigeneticamente conservados pode abrir caminho para o projeto e desenvolvimento de novas plataformas personalizadas de alto rendimento, seja no contexto de tecnologia de microarray econômica ou por meio do uso de sequenciamento de bissulfito direcionado mais sofisticado abordagens. Isso pode ser de particular interesse no âmbito do perfil epigenético durante a triagem de drogas em modelos pré-clínicos, uma vez que as alterações de tais loci associados à doença conservados podem ajudar a prever o sucesso futuro do tratamento em humanos. Por exemplo, o glioma é um tipo de câncer com alta prevalência de mutações da isocitrato desidrogenase que levam a alterações epigenéticas importantes (Han et al. 2020). O principal tratamento quimioterápico no glioma envolve temozolomida (Hirst et al. 2013), e sua eficácia também está associada a várias características de metilação do DNA além das bem conhecidas MGMT metilação do promotor (Cheng et al. 2019). Assim, a integração do conhecimento de conservação epigenética poderia ajudar na identificação de vias sensíveis a drogas em modelos animais, o que por sua vez melhoraria os atuais tratamentos padrão de cuidado, bem como também lançaria luz sobre os insights mecanísticos de novos compostos ou aqueles resgatados de abordagens atuais de reposicionamento de drogas.

Em suma, este trabalho pode constituir uma linha de base para outros estudos futuros com foco na avaliação sistemática de padrões epigenéticos associados a doenças em vários tecidos e espécies de uma perspectiva multiômica, a fim de informar a busca por padrões inter e intraespécies de regulação epigenética.


Resumo

As modificações covalentes das caudas das histonas têm papéis fundamentais na estrutura e função da cromatina. Uma dessas modificações, a metilação da lisina, tem funções importantes em muitos processos biológicos que incluem a formação de heterocromatina, inativação do cromossomo X e regulação da transcrição. Aqui, resumimos os avanços recentes em nossa compreensão de como a metilação da lisina funciona nesses diversos processos biológicos e levantamos questões que precisam ser abordadas no futuro.


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2. Construindo uma hipótese global de acessibilidade à cromatina

2.1. O problema de acessibilidade: a dificuldade de ler o DNA genômico

Em última análise, a distinção entre um bit de cromatina e outro depende da sequência local do DNA. Envolver o DNA em nucleossomos torna a sequência de DNA difícil de acessar e, se ela não pode ser acessada, um nucleossomo não pode ser distinguido de outro. As modificações das histonas ajudam a restaurar a diferenciação funcional. A presença de nucleossomos e a natureza das modificações nas histonas que eles carregam produzem estados de cromatina que determinam se, quando ou como a sequência é lida pelas proteínas de ligação ao DNA. A menos que as proteínas de ligação ao DNA tenham acesso à sequência de DNA, o aparato que se liga à cromatina e age sobre ela não saberia para onde ir e, o mais importante, os genes e outras informações da sequência não poderiam ser lidos.

Na segunda parte deste ensaio, quero considerar a questão da acessibilidade do DNA genômico, além da ligação cooperativa ou da remodelação que segue a ligação de fatores pioneiros (elaborado na Seção 2.3), este é um problema que está subjacente a muitos dos as questões relativas às modificações das histonas & # x02014suas multiplicidades e dinâmicas. Proponho um argumento que começa a integrar a massa de informações sobre as modificações das histonas do ponto de vista da acessibilidade ao DNA.

Relatos de livros explicam o envolvimento do DNA em nucleossomos como um meio de empacotar genomas eucarióticos no núcleo. O envolvimento de 147 bp de DNA em um nucleossomo claramente reduz o volume ocupado, embora mais por reduzir os graus de liberdade do que realmente diminuir o espaço ocupado pela dupla hélice. O DNA pode ser compactado muito mais do que geralmente é em um núcleo eucariótico, como mostrado pelo empacotamento de um genoma de bacteriófago em um capsídeo ou do genoma humano em um núcleo de esperma. A diferença é que o DNA do bacteriófago não está disponível, exceto pela liberação de todo o conteúdo do capsídeo, e nem está muito ou todo o genoma do esperma. O genoma eucariótico em uma célula somática, em vez disso, está disponível ou especificamente endereçável em parte (isto é, eucromatina), e o complemento heterocromático pode ser considerado acessível pelo menos parte do tempo. O que faz a diferença, é claro, é que o genoma eucariótico é dividido em miríades de pequenos pacotes (ou seja, nucleossomos). Eles podem ser posteriormente empacotados hierarquicamente em estruturas de ordem superior que, potencialmente, podem ser dobradas ou desdobradas localmente. Em outras palavras, uma fração arbitrária do genoma até um único nucleossomo pode, em princípio, ser aberta individualmente, permitindo acesso ao seu conteúdo de DNA. Para fazer isso, no entanto, um nucleossomo deve ser diferenciado de seus vizinhos ou seu conteúdo de DNA deve ser pesquisável pelo menos intermitentemente.

2.2. Cromatina como uma resposta à concentração de DNA no núcleo

Embora o espaço seja limitante no núcleo e compactação de pelo menos parte do DNA genômico, existe uma tensão imperativa, muito mais importante: uma tensão entre a necessidade de acessibilidade genômica controlada para transcrição e a necessidade de reduzir a acessibilidade à maior parte do genômico DNA. O empacotamento de um grande genoma no núcleo é uma necessidade, mas talvez muito mais importante seja o imperativo de ocultar a maior parte do DNA para que não seja facilmente acessível à maquinaria da proteína que precisa agir sobre ele.Todos os mecanismos que distinguem um sítio genômico de outro, exceto aqueles baseados em propriedades físicas ou topológicas em massa, devem ser capazes de reconhecer motivos de sequência de nucleotídeos específicos, curtos o suficiente para serem legíveis e ligáveis ​​por uma única proteína com discriminação suficiente para minimizar o ruído resultante de ligação inadequada. A razão entre sinal e ruído (isto é, ligação específica versus não específica) é crítica para a realização de qualquer tipo de regulação gênica. Essa discriminação é perdida se a concentração de DNA não específico for tão grande que qualquer proteína de ligação ao DNA gastaria seu tempo ligada inadequadamente às sequências erradas. A chave para a especificidade no núcleo está, portanto, intrinsecamente ligada à necessidade de mascarar a maior parte do DNA genômico de modo a torná-lo indisponível para ligação à maquinaria regulatória e transcricional. No entanto, a diferenciação da cromatina e as atividades específicas da informação genética dependem, em última instância, da sequência local do DNA. O empacotamento em nucleossomos não apenas impede o acesso à sequência de DNA, mas, por si só, reduziria o genoma a uma coleção indiferenciada de nucleossomos estruturalmente idênticos. Visto sob esta luz, é claro, então, que uma grande parte da regulação do gene eucariótico deve consistir em maneiras de (1) remover ou remodelar nucleossomos de modo a tornar o DNA subjacente disponível para proteínas de ligação ao DNA (2) fazer isso em uma sequência - forma específica ou pelo menos produzir resultados específicos de sequência e (3) desenvolver uma maneira de marcar nucleossomos ou domínios nucleossômicos de modo a restaurar alguma especificidade para a ação de proteínas reguladoras (por exemplo, acetilar caudas de histonas para tornar certos nucleossomos mais fáceis de deslocar ou remodelar).

2.3. Densidade do Nucleossomo

É bem conhecido que a densidade dos nucleossomos é importante para reter a especificidade regulatória. Se forem produzidas histonas insuficientes, a densidade nucleossômica é reduzida. No Drosófila, isso causa perda de silenciamento heterocromático e supressão de variegação de efeito de posição (Moore et al. 1983). Em células de leveduras e mamíferos, a insuficiência de histonas causa desrepressão de muitos genes expressos condicionalmente (Han e Grunstein 1988 Lenfant et al. 1996 Wyrick et al. 1999 Celona et al. 2011 Gossett e Lieb 2012). Curiosamente, uma densidade de nucleossomos reduzida muda a ocupação (a frequência com que uma posição é ocupada) em vez da distribuição dos nucleossomos. Isso ocorre porque certas sequências de DNA favorecem a formação de nucleossomos, envolvendo mais facilmente o núcleo da histona do que outras. Além disso, quanto mais DNA se torna acessível, mais proteínas de ligação ao DNA podem se ligar às suas sequências preferidas e competir com a formação de nucleossomos.

Como mostrado há muito tempo, inicialmente por Drosófila Em experimentos de deleção de genes de histonas, a densidade de nucleossomos é uma pré-condição necessária para o silenciamento heterocromático. Se a densidade do nucleossomo for muito baixa, o DNA se torna muito acessível às proteínas de ligação ao DNA, em particular, a RNA polimerase, e evidências crescentes mostram que o acesso indiscriminado resulta em transcrição indiscriminada. A atividade transcricional está associada a muitas outras atividades modificadoras de nucleossomos, particularmente a acetilação de histonas, que impede o estabelecimento do estado heterocromático e promove maior acessibilidade. Um efeito semelhante é obtido na presença de um complemento normal do gene da histona se a concentração de um ativador do gene for aumentada (Ahmad e Henikoff 2001). Esses efeitos mostram que, sem os nucleossomos, a capacidade de reprimir a transcrição é perdida e a capacidade dos nucleossomos de prevenir o acesso está em competição com a ligação dependente da concentração da maquinaria transcricional. O que se perde não é apenas a capacidade de reprimir, mas também o controle da ativação transcricional em que a necessidade de ativadores para produzir a transcrição é pelo menos parcialmente absolvido se a RNA polimerase não precisar mais da ajuda de várias atividades de remodelação para acessar a sequência de DNA. Além disso, embora o controle de acesso seja um componente importante das atividades repressivas da heterocromatina, em células normais há janelas de oportunidade para acessar até mesmo a sequência de DNA heterocromática, e uma concentração suficientemente alta de um ativador de ligação de DNA pode explorar estes para se ligar à sua sequência e produzir desrepressão local. Em muitos casos, então, o principal fator limitante no controle da transcrição é o acesso da RNA polimerase ao DNA. Muitos genes, particularmente em eucariotos superiores, desenvolveram maneiras de garantir que a RNA polimerase seja pré-carregada, freqüentemente iniciada pela transcrição, mas interrompida (polimerase em pausa) e pronta para responder aos sinais de transcrição que permitem seu alongamento. Na maioria dos casos, isso requer o acesso de proteínas de ligação ao DNA que configuram os nucleossomos ao redor do sítio do promotor. Também aqui, no entanto, a pausa depende da necessidade de fatores adicionais para superar os obstáculos nucleossômicos ao alongamento.

Quando o DNA está totalmente ocupado por nucleossomos, ou pelo menos quando os níveis de histonas não limitam a densidade de nucleossomos, a maior parte da sequência de DNA não é diretamente acessível às proteínas de ligação ao DNA. Foi demonstrado que alguns fatores de transcrição são mais capazes do que outros de se ligar a sequências de DNA nucleossômico, pelo menos quando os locais de ligação estão próximos a uma borda do nucleossomo (Zaret e Carroll 2011). Esses fatores & # x0201cpioneer & # x0201d podem ganhar uma sustentação ao se ligar ao DNA que entra no nucleossomo, mesmo em uma estrutura de cromatina compactada, expelir a histona ligante H1 e invocar máquinas de remodelação de nucleossomo para desvendar o DNA e expô-lo para a ligação de outro intensificador de ligação fatores em um processo de múltiplos estágios (Li et al. 2010).

2.4. Atividades de roaming

Características especiais podem permitir que certas proteínas de ligação específicas de sequência encontrem seus locais de ligação, possivelmente lucrando oportunisticamente com a abertura transitória da estrutura da cromatina. Em geral, porém, o acesso ao DNA requer a ajuda de máquinas remodeladoras. Assim, para permitir o acesso ao DNA nucleossômico sem informações de sequência anterior, precisaríamos criar a hipótese de atividades de roaming que pesquisam a cromatina genômica e a reviram periodicamente, por assim dizer, abrindo temporariamente o acesso à sequência subjacente. Ao mesmo tempo, para impedir esse acesso e garantir a abertura regulamentada, podemos esperar uma atividade oposta. Existem marcas de cromatina conhecidas ou atividades da cromatina que possam apoiar essa hipótese?

Duas características foram identificadas que são características de locais nos quais o DNA deve ser mantido em um estado acessível: Um é a ligação da histona acetilase CBP ou seu parente próximo p300, acompanhado ou não por enriquecimento em estado estacionário na acetilação de histona H3K27 . A outra é a marca da cromatina H3K4me1, cujo papel na acessibilidade não é bem compreendido. Essas características são caracteristicamente encontradas em locais de intensificadores, nos quais o CBP é considerado recrutado pela maioria dos fatores de ligação de intensificadores (Heintzman et al. 2007 Xi et al. 2007 Visel et al. 2009). Eles também são encontrados em promotores e onde quer que as proteínas de ligação ao DNA encontrem acesso ao DNA genômico. Também se descobriu que esses locais são pontos quentes de renovação de nucleossomos ativos, detectáveis ​​pela deposição de nucleossomos contendo a variante de histona H3.3, freqüentemente junto com a variante de histona H2A.Z. Esta combinação de variantes é menos estável do que o normal e mais fácil de remodelar ou virar (Jin et al. 2009). O fato de que a acetilação nem sempre é detectada em locais do intensificador, apesar da presença de CBP, sugere que os nucleossomos acetilados são aqueles que foram deslocados para criar a região livre de nucleossomos, que é ocupada por proteínas de ligação ao DNA.

CBP é frequentemente associado a uma atividade de remodelação de histonas (por exemplo, Drosophila Brahma, ortólogo de SNF2L2 humano) e UTX, uma das duas histonas H3K27 demetilases conhecidas, mas a única encontrada em Drosófila (Tie et al. 2012). UTX é um componente essencial da metiltransferase H3K4 relacionada ao tritórax (TRR) (ou MLL3 e MLL4 em mamíferos), que é a fonte de H3K4me1 e às vezes H3K4me2, encontrada em potencializadores, promotores e outros locais de ligação ao DNA ligado a proteínas ( Herz et al. 2012). Podemos nos perguntar o que uma desmetilase H3K27 pode estar fazendo nesses locais, mas há uma forte conexão que CBP é responsável pela acetilação de H3K27 e essa atividade é bloqueada pela simples presença de metilação de H3K27 preexistente, sem a necessidade de recrutar complexos repressivos de qualquer tipo.

2,5. Metilação ubíqua de H3K27

A metilação de H3K27 é, de fato, onipresente no genoma. É produzida pelo complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2), cuja subunidade de metiltransferase em Drosófila é E (z) (ortólogo de mamífero Ezh1 e Ezh2). PRC2 é responsável por H3K27 mono-, di-, trimetilado. O estado trimetilado é o que mais chama a atenção por ser aquele associado aos genes reprimidos por Polycomb. No entanto, seu produto mais abundante não é H3K27me3, que em células somáticas constitui cerca de 5% & # x0201310% da histona H3 total, mas H3K27me2, que é encontrado em 50% & # x0201360% de todo H3 (Peters et al. 2003 Ebert et al. 2004 Jung et al. 2010 Voigt et al. 2012). A dimetilação é, portanto, a principal atividade do PRC2 tanto nas moscas quanto no homem. Estudos cinéticos (McCabe et al. 2012) mostram, de fato, que embora os monometilatos e dimetilatos de PRC2 sejam rápidos, a trimetilação é enzimaticamente mais difícil e provavelmente ocorre in vivo principalmente onde PRC2 está ligado de forma estável. H3K27me2 também é o tipo de modificação de histona mais abundante e amplamente distribuído, encontrado em todos os lugares, exceto em regiões que são enriquecidas em H3K27me3 ou em atividade transcricional. A razão para o primeiro é óbvia. A razão para o último (ou seja, seu esgotamento nas regiões transcritas) é provavelmente dupla: (1) os nucleossomos são menos densamente distribuídos em tais regiões por causa do aumento da instabilidade e do turnover, e (2) as regiões transcricionalmente ativas são direcionadas pelo UTX H3K27 desmetilase, produzindo H3K27me1 e H3K27me0. Resultados muito semelhantes foram relatados recentemente para células-tronco embrionárias de camundongo (Ferrari et al. 2014). Nessas células, H3K27me3, me2 e me1 constituem, respectivamente, 7%, 70% e 4% do H3 total, enquanto H3K27ac é 2% e H3K27 não modificado é 16%. H3K27me2 está confinado a regiões transcricionalmente inativas, exceto aquelas que têm PRC2 ligado de forma estável, enquanto H3K27me1 é encontrado apenas em regiões transcricionalmente ativas. Muito provavelmente, então, H3K27me2 é removido ativamente por desmetilação, com H3K27me1 como um intermediário para a desmetilação completa. Não surpreendentemente, as regiões transcricionalmente ativas também são enriquecidas em UTX, a única desmetilase H3K27 conhecida em Drosófila. A remoção da metilação de H3K27 em regiões ativas é necessária para a acetilação de H3K27, que é geralmente encontrada na região 5 & # x02032 de unidades de transcrição ativas e intensificadores. Mas isso deixa as duas questões: por que há metilação de H3K27 em primeiro lugar? E por que a acetilação do H3K27 é especificamente necessária?

Ao contrário do H3K27me3, que é encontrado principalmente em locais genômicos que podem recrutar de forma estável o complexo PRC2, a atividade que produz o H3K27me2 deve ter como alvo todo o genoma. Embora possa estar associado à bifurcação de replicação, é mais provavelmente explicado pela interação transitória de PRC2 livre com nucleossomos por um mecanismo hit-and-run. No entanto, não é um mecanismo completamente aleatório. A atividade de metilação do PRC2 é modulada por várias entradas da cromatina circundante. Um deles é dependente de uma bolsa hidrofóbica nos pentes sexuais extras da subunidade PRC2 (ESC) / Eed, que se liga ao H3K27 metilado (Margueron et al. 2009). Quando essa ligação ocorre, ela efetua uma mudança conformacional na subunidade catalítica E (z) que estimula fortemente sua atividade de metilação. Embora o H3K27me3 se ligue mais fortemente, o H3K27me2 também se liga à bolsa aromática. Portanto, a presença de H3K27me2 ou H3K27me3 em nucleossomos circundantes promove a metilação de nucleossomos recém-depositados. Mutações na bolsa hidrofóbica ESC reduzem drasticamente o nível global de H3K27me3 e H3K27me2. Outros mecanismos que modulam a atividade de PRC2 provavelmente contribuem, embora não tenham sido testados in vivo. Assim, a densidade de nucleossomos em torno de um nucleossomo alvo também parece estimular a atividade de metilação (Yuan et al. 2012), enquanto a presença de H3K4me3 ou H3K36me2 / me3 no nucleossomo alvo reduz a atividade de metilação de PRC2 (Schmitges et al. 2011 Yuan et al. 2011). Como consequência, as regiões que já contêm metilação de H3K27 são alvos melhores para PRC2, ao passo que as regiões que têm uma densidade de nucleossomo mais baixa ou nucleossomos que carregam H3K4me3 ou H3K36me2 / me3, todas as marcas de atividade transcricional, são alvos fracos. A descoberta desses vários dispositivos em PRC2 e outras metiltransferases deixou claro que mecanismos de feedback e feed-forward podem ser incorporados em máquinas de modificação da cromatina para auto-renovar uma marca de cromatina e evitar regiões marcadas com certas outras modificações de histonas. Vale ressaltar aqui que esses mecanismos não apenas ajudam a manter a repressão Polycomb de um ciclo celular para o próximo por meio da manutenção de H3K27me3, mas, ao modular a deposição de H3K27me2, também fornecem uma memória da atividade transcricional. As regiões que foram recentemente transcritas têm menor densidade de nucleossomos e são enriquecidas nas marcas H3K4me3 e H3K36me2 / me3 que favorecem a atividade transcricional renovada e, ao mesmo tempo, inibem a metilação de H3K27. Em outras palavras, no caso de uma marca de histona distribuída globalmente, como H3K27me2, a ausência da marca é em si uma marca que carrega informações de atividade transcricional anterior (Fig. 1). & # x200B).

Memória transcricional do estado da cromatina. O desenho esquemático ilustra algumas mudanças importantes nas marcas da cromatina associadas a uma região da cromatina que foi recentemente transcrita ou se torna estavelmente reprimida por mecanismos Polycomb. Uma região que não foi transcrita recentemente é marcada por H3K27me2 pesado. Uma região recentemente transcrita perdeu H3K27me2, mas em vez disso ganhou marcas H3K27ac e H3K4me3 na parte proximal do promotor e H3K36me3 (que, por sua vez, recruta complexos desacetilantes) para controlar o acesso excessivo permitido pela perda de H3K27me2. As regiões que podem recrutar ligação estável de complexos Polycomb PRC1 e PRC2 adquirem H3K27me3. Para simplificar, outras marcas de histonas não são mostradas.

Um modelo para o controle da acessibilidade ao DNA na cromatina. (UMA) O modelo propõe que as atividades de roaming antagônicas interajam transitoriamente com a cromatina genômica: uma, causada por PRC2, deposita a marca H3K27me2. Outro remove essa marca de metilação e remodela os nucleossomos, permitindo o acesso transitório à sequência de DNA. Essas atividades são atribuídas a UTX, CBP e BRAHMA. (B) Um fator A de ligação ao DNA se liga ao seu motivo de ligação cognato no DNA, temporariamente tornado acessível, e recruta a ligação estável do CBP junto com uma atividade de remodelação (BRAHMA) e o complexo TRR / MLL3,4 contendo UTX. Essas atividades removem a metilação do H3K27, depositando em seu lugar as marcas H3K27ac e H3K4me1. (C) A atividade de remodelação fornece acesso estável ao DNA, levando à ligação de fatores adicionais B e C a uma região intensificadora (ou outro elemento regulador no DNA). A região do DNA tornada acessível também pode ser oportunisticamente direcionada pela RNA polimerase, que pode produzir transcritos curtos de ambas as fitas de DNA.

PRC2, portanto, fornece um mecanismo global para marcar a cromatina de acordo com seu uso recente. Mas o que a marca H3K27me2 faz e como ela é interpretada? Nós nos acostumamos a pensar nas modificações das histonas como marcas que são & # x0201cread & # x0201d por proteínas da cromatina que possuem domínios de ligação apropriados. Isso é possível, mas improvável para H3K27me2. A abordagem & # x0201creader & # x0201d é adequada para marcas que distinguem uma região do resto da cromatina. Uma marca global como H3K27me2 ligaria o & # x0201creader & # x0201d virtualmente em todos os lugares. Uma interpretação mais econômica é que, em vez de ser & # x0201cread, & # x0201d, a presença da marca fornece a leitura e a resposta ao mesmo tempo que a metilação de H3K27 impede a lisina de modo que ela não pode ser acetilada. H3K27ac é uma marca associada à região 5 'dos ​​genes ativos. Como vimos, ele também está potencialmente presente em todos os locais que contêm CBP & # x02014, ou seja, locais como os intensificadores que envolvem o acesso de proteínas de ligação ao DNA ao DNA. Em princípio, a monometilação de H3K27 teria o mesmo propósito. O H3K27me1 tem sido frequentemente considerado associado, não à repressão, mas à atividade transcricional. O H3K27me1 é encontrado em genes transcricionalmente ativos, provavelmente porque esses são os locais nos quais o H3K27me2 é desmetilado por UTX. O estado monometilado é provavelmente um estágio de desmetilação ou remetilação.

2.6. A Hipótese de Acessibilidade

Uma hipótese que integraria essas várias descobertas é que o acesso ao conteúdo de DNA dos nucleossomos é o principal fator limitante no controle de todas as atividades específicas da sequência no genoma. O controle do acesso à DNA é, portanto, um princípio regulatório fundamental. De acordo com a hipótese (Fig. 2), o acesso é fornecido de forma intermitente por uma atividade de remodelação de nucleossomos móveis que & # x0201cvira & # x0201d nucleossomos, tornando temporariamente seu DNA acessível. Por alguma razão que não está clara neste estágio, essa atividade envolve a acetilação do H3K27, talvez transitoriamente, e é bloqueada pela prevenção da acetilação do H3K27. Em geral, esta acetilação é constantemente removida por histonas desacetilases de roaming, como foi mostrado em leveduras (Vogelauer et al. 2000). A remodelação que fornece acessibilidade é contrariada por uma atividade de PRC2 de roaming que dimetila o genoma de H3K27 em todo o genoma, esta dimetilação de H3K27 mediada por PRC2, portanto, impede esta posição e bloqueia sua acetilação. A dimetilação do H3K27 pode ser removida pela UTX desmetilase, cuja principal atividade é, portanto, remover o bloqueio à acetilação e permitir um acesso mais estável ao DNA. Isso é necessário em locais como intensificadores, promotores, PREs e outros em que várias proteínas de ligação ao DNA precisam ver a sequência de nucleotídeos. A ligação desses fatores recruta CBP estável e está associada à atividade de remodelação, cuja presença de longo prazo desloca os nucleossomos, produzindo uma região depletada de nucleossomos. Essas regiões são tipicamente hipersensíveis ao tratamento com DNaseI e encontradas associadas a intensificadores, promotores, PREs, locais cujas bordas também são enriquecidas para histona H3.3 em relação aos seus arredores. Este, conforme analisado por Mito et al. (2007), é causada pela substituição de nucleossomos, o que significa que os nucleossomos ali encontrados não são formados como parte do processo replicativo, mas devido a uma renovação contínua.

2.7. Transcrição de regiões livres de nucleossomos e a resposta de RNAi

A hipótese da acessibilidade requer que os locais de depleção ou remodelação nucleossômica, ou qualquer região que não seja densamente povoada por nucleossomos, tenham uma alta probabilidade de se ligar à RNA polimerase de forma oportunista e produzir alguns produtos transcricionais.A quantidade e o comprimento de tais transcrições são provavelmente muito variáveis ​​e dependentes da sequência, da vizinhança de alguma atividade semelhante a intensificador e provavelmente de muitos outros fatores. Deve haver pouca especificidade de fita para esses inícios de transcrição, que, portanto, provavelmente resultariam na produção de RNA de ambas as fitas e, portanto, seriam direcionados por mecanismos de RNAi.

Os promotores, que têm uma região reduzida de nucleossomo curta, são bem conhecidos por produzir transcritos curtos de ambas as fitas dentro de uma região de algumas centenas de nucleotídeos em torno do início da transcrição chamados TSSa-RNAs (Seila et al. 2008 Affymetrix / Cold Spring Harbor Laboratory ENCODE Projeto Transcriptome 2009 Taft et al. 2009). As regiões promotoras desenvolveram maneiras de minimizar a produção de RNA de ambas as fitas, selecionando uma alta frequência de sinais de poliadenilação de modo que o alongamento produtivo ocorra predominantemente na direção a jusante do gene TSS (Almada et al. 2013 Ntini et al. 2013). Os potenciadores também são a fonte de transcrições, os chamados RNAs potenciadores ou eRNAs, de ambas as fitas (De Santa et al. 2010 Kim et al. 2010 & # x000d8rom e Shiekhattar 2013). Os sítios de dano ao DNA, onde os nucleossomos são removidos por um comprimento considerável em torno de uma quebra de fita dupla, também produzem transcritos de ambas as fitas. Esses RNAs são agora conhecidos por serem processados ​​por Dicer e Drosha e necessários para a ligação de ATM, uma quinase que fosforila a histona variante H2AX para iniciar a formação de focos de reparo de danos ao DNA (Francia et al. 2012). Os RNAs produzidos a partir de todas essas regiões depletadas de nucleossomos são subprodutos dos processos de remodelação de nucleossomos que ocorrem nesses locais. Eles não precisam ter uma função específica, mas não deve ser surpreendente descobrir que adquiriram uma função em certos locais.

As regiões que estão parcialmente esgotadas de nucleossomos ou se tornam facilmente acessíveis à RNA polimerase são propensas a iniciar a transcrição, que não é específica para o filamento. No caso geral, portanto, a maioria dessas regiões acessíveis produziria transcritos de RNA de ambas as fitas. Uma possível consequência da transcrição bidirecional é o recrutamento da maquinaria de RNAi. As transcrições bidirecionais produzidas a partir de sítios de dano ao DNA recrutam claramente componentes da maquinaria de RNAi (Francia et al. 2012). Proteínas RNAi, como Dicer2 e AGO2, estão associadas a promotores ativos que produzem pequenos RNAs bidirecionais (Cernilogar et al. 2011). Foi afirmado que a proteína RNAi, AGO2, se associa a uma variedade de locais que se espera sejam depletados de nucleossomos, incluindo locais de ligação a CTCF, promotores e PREs (Moshkovich et al. 2011). Não está claro qual seria a função do AGO2 nesses casos, mas sua perda leva a uma diminuição da atividade do isolador ou à repressão Polycomb (Grimaud et al. 2006 Lei e Corces 2006).

Os mecanismos de RNAi são freqüentemente considerados protetores da integridade do genoma contra ataques de vírus ou transposons em proliferação. No núcleo, eles resultam no recrutamento da metilação da histona H3K9, na ligação de proteínas heterocromatinas, como HP1 e histona desacetilases, e na estabilização dos nucleossomos, em essência, o oposto do processo que abriu a cromatina e produziu os transcritos bidirecionais em intensificadores, promotores, etc. A conexão entre a acessibilidade do DNA e a resposta do RNAi, eu sugiro, não é acidental. As regiões que estão parcialmente esgotadas de nucleossomos ou se tornam facilmente acessíveis à RNA polimerase são propensas a iniciar a transcrição, que não é específica para o filamento. No caso geral, portanto, a maioria dessas regiões acessíveis produziria transcritos de RNA de ambas as fitas. Se esses RNAs recrutam a resposta de RNAi, essa resposta é endêmica e inseparável da necessidade fundamental de obter acesso ao DNA genômico. Pode-se argumentar, portanto, que a resposta de RNAi pode ser, em sua forma básica, uma forma de recrutar proteínas que estabilizam nucleossomos (HP1, histona ligante, histona desacetilases), restauram a ocupação nucleossômica ou restauram a estabilidade nucleossômica em locais que, por qualquer motivo, pode ter se tornado temporariamente aberto. O fato de a resposta do RNAi ter se tornado uma proteção valiosa contra elementos genéticos invasores não seria incompatível com a função ainda mais básica de manter o DNA genômico coberto e garantir que regiões abertas transitoriamente não saiam do controle.

2.8. PRC2 e heterocromatina

Os mecanismos de RNAi são considerados importantes para o estabelecimento da heterocromatina. Isso foi elaborado em detalhes para o fermento de fissão Schizosaccharomyces pombe, mas muitos aspectos dessa relação se aplicam a Drosófila e formação de heterocromatina em mamíferos. Os argumentos apresentados acima ajudam a entender por que E (z) foi encontrado para desempenhar um papel no estabelecimento eficiente de heterocromatina e, de fato, é conhecido como um supressor de variegação de efeito de posição em Drosófila (Laible et al. 1997). Esse papel tem sido um quebra-cabeça por muitos anos, porque não há presença específica de E (z) ou H3K27me3 na heterocromatina. Este papel é melhor compreendido em termos de acessibilidade. No Drosófila, os estágios embrionários iniciais são uma época de divisões nucleares extremamente rápidas e sincronizadas. Estes diminuem até o 14º ciclo (3 h após a fertilização), mas a cromatina produzida deve agora ser o alvo de um grande esforço de metilação do H3K27. Isso é conseguido graças a quantidades correspondentemente massivas de componentes PRC2 que são depositados no ovo durante a oogênese. No momento em que a proliferação nuclear diminui e a heterocromatina se torna detectável pela primeira vez, a dimetilação global do H3K27 deve estar no lugar. Nesse estágio, é importante suprimir a acetilação, remodelação e atividade de transcrição adventícia do H3K27 para permitir que o RNAi e outros mecanismos iniciem e mantenham a heterocromatina. O acesso ao DNA nunca é completamente impedido, mesmo em heterocromatina, como mostrado pelo fato de que ativadores fortes podem prevenir o silenciamento heterocromático de um gene repórter (Ahmad e Henikoff 2001), mas a ausência de H3K27me2 certamente resultaria em um nível de acesso a ativadores e RNA polimerase que interferiria no estabelecimento do silenciamento heterocromático.

2.9. Efeitos da perda de PRC2

Se a metilação de H3K27 desempenha um papel genômico global, a perda da função PRC2 certamente teria consequências importantes e aumento da transcrição generalizada, entre outras. Infelizmente, ainda não foi possível separar a função de dimetilação H3K27 global da trimetilação H3K27 mais específica relacionada a Polycomb. A perda de PRC2 é uma letal embrionária precoce tanto em mamíferos quanto Drosófilae produz embriões com fenótipos de desrepressão homeóticos clássicos (Struhl e Brower 1982). Perda de repressão Polycomb de Hox genes e muitos outros genes importantes para o desenvolvimento certamente seriam suficientes para explicar a letalidade. Além disso, seria difícil determinar se quaisquer outros efeitos deveriam ser atribuídos às consequências indiretas da desrepressão ou perda da dimetilação do H3K27. No entanto, a perda da atividade de PRC2 não é letal para as células. As células-tronco embrionárias de mamíferos com nocautes de Ezh2 ou Eed são viáveis, embora incapazes de se diferenciar. Em células-tronco embrionárias de camundongo sem função PRC2, a acetilação de H3K27 aparece em novos locais junto com H3K4me1, formando uma assinatura típica de regiões potenciadoras posicionadas (Ferrari et al. 2014). Isso sugere que muitas regiões normalmente silenciosas se tornam acessíveis e transcricionalmente ativas. A ativação de novos locais de transcrição normalmente não associados com H3K27me3 também foi observada. Um aumento na acessibilidade da cromatina à RNA polimerase também foi observado em Drosófila embriões sem ESC materno e zigótico, um componente essencial do PRC2 (Chopra et al. 2011). Promotores de milhares de genes foram ocupados pela RNA polimerase II, fossem ou não ativados transcricionalmente.

Mutações que afetam a atividade de EZH2 e PRC2 estão associadas a uma variedade de cânceres agressivos, mas, estranhamente, tanto a hiperatividade quanto a perda de atividade parecem ser oncogênicas. A interpretação geralmente tem sido que esses efeitos são mediados pela hiperrepressão ou desrepressão de genes-alvo Polycomb, e isso é sem dúvida verdade, pelo menos em parte. Por exemplo, genes que bloqueiam a progressão do ciclo celular, como INK4A / B, são regulados por mecanismos Polycomb e a hiperrepressão removeria os freios à proliferação celular. Como muitas evidências apóiam um papel promotor de câncer da atividade de PRC2, a descoberta de que a perda da função de PRC2 também pode promover cânceres, como a leucemia mieloide, tem sido intrigante (Hock 2012 Simon et al. 2012 Tamagawa et al. 2013).

Um caso particularmente interessante é o das mutações recentemente caracterizadas que convertem K27 em metionina nos genes da histona H3 ou H3.3. Esta mutação foi encontrada associada a um glioblastoma particularmente maligno, no qual tem um efeito dominante totalmente desproporcional com a fração relativamente pequena da histona H3 total que é produzida pela cópia do gene H3 da histona mutada (Chan et al. 2013 Lewis et al . 2013). A metionina na posição 27 imita, em parte, a metilação do K27, mas carece da carga positiva moderadora que o nitrogênio da amina retém mesmo quando trimetilado. Como consequência, o domínio catalítico EZH2 se liga, mas não libera prontamente, o peptídeo H3K27M. Embora isso não tenha sido demonstrado diretamente, uma consequência pode ser que o complexo PRC2 se torna efetivamente sequestrado e indisponível, fazendo com que o H3K27 se torne submetilado em todo o genoma. A atenção tem sido focada na perda parcial de H3K27me3 e conseqüente desrepressão de genes alvo de Polycomb. Eu sugiro uma interpretação um pouco diferente. A dimetilação de H3K27 em todo o genoma seria ainda mais afetada porque é fortemente dependente de um mecanismo de acerto e execução e, portanto, do pool de PRC2 livre. Seria de se esperar que a perda de metilação do H3K27 desreprimisse um grande número de genes cujo silenciamento depende da incapacidade dos ativadores e da RNA polimerase II de acessar o promotor. Mais importante, talvez, é que a transcrição pode começar em qualquer lugar, incluindo dentro dos corpos dos genes, produzindo proteínas parciais que teriam efeitos neomórficos inesperados.

Essas observações apoiam a hipótese da acessibilidade global, pelo menos em parte, mas estão longe de fornecer provas substanciais. Eles sugerem, no entanto, que a abundância e onipresença da dimetilação do H3K27 têm um significado que poderia ajudar a entender a maneira como as diferentes modificações da cromatina se chocam, a interação que forneceu a matéria-prima a partir da qual a evolução deu forma à cromatina paisagem e suas funções.


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