Em formação

NF-κB ativado, mas IRF bloqueado - Reinstalação da resposta imunológica


O vírus Rubela tem os seguintes PAMPs: ssRNA, que ativará os seguintes PRRs: TLR7, TLR8, RIG-I e possivelmente MDA5. As células dendríticas infectadas com o vírus Rubela são relatadas para produzir níveis muito baixos de IL-12p70 e para produzir ativação fraca de células T virgens. DC-SIGN é um receptor de lectina do tipo C (CLR) relatado como sendo direcionado por glicanos de superfície no vírus Rubela. Explique em algumas linhas, por meio do princípio da reconfiguração do receptor de reconhecimento de padrões, como a supressão imunológica pelo vírus Rubela poderia ser mediada.

Resposta do meu professor: Disparo de DC-SIGN junto com, por exemplo, TLR7 / 8 ativaria NF-κB, mas bloquearia a ativação de IRF. Isso levaria a uma indução fraca de IL-12p70 e, em vez disso, propagaria os níveis de IL-23 e talvez de IL-10 em DC.

Minha pergunta é: como o NF-κB é ativado, mas o IRF é bloqueado? Eu diria que ambos serão ativados, quando os TLRs forem acionados. Além disso, como o IL-23 entra em cena? Eu diria que o TLR7 / 8 daria uma resposta do tipo 1, e o DC-SIGN daria uma resposta das células T regulatórias.


Ativação de NF-κB induzida por receptor de lectina tipo C em respostas imunes e inflamatórias inatas

Os receptores de lectina do tipo C (CLRs) pertencem a uma grande família de proteínas que contêm um domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD) e locais de ligação de cálcio em seus domínios extracelulares. Estudos recentes indicam que muitos CLRs, como Dectin-1, Dectin-2 e Mincle, funcionam como receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que reconhecem ligantes de carboidratos de microrganismos infectados. Após a ligação do ligante, esses CLRs induzem múltiplas cascatas de transdução de sinal através de seus próprios motivos de ativação imunorreceptores baseados em tirosina (ITAMs) ou interagindo com proteínas adaptadoras contendo ITAM, como FcRγ. Evidências recentes indicam que as cascatas de sinalização induzidas por CLR levam à ativação do fator nuclear kappaB (NF-κB) da família de fatores de transcrição por meio de uma (s) via (s) dependente (s) de Syk e CARD9. A ativação de NF-κB desempenha um papel crítico na indução de respostas imunes e inflamatórias inatas após infecção microbiana e danos aos tecidos. Nesta revisão, iremos resumir o progresso recente nas vias de transdução de sinal induzidas por CLRs e como esses CLRs ativam o NF-κB e contribuem para as respostas imunes e inflamatórias inatas.


Artigo ORIGINAL RESEARCH

Xiaolong Yan 1,2, Xueyan Zhao 1, Ruixuan Huo 1 e Tianjun Xu 1,2,3,4,5 *
  • 1 Laboratório de Imunologia Molecular de Peixes, Faculdade de Pesca e Ciências da Vida, Universidade do Oceano de Xangai, Xangai, China
  • 2 Laboratório de Biologia Marinha e Biotecnologia, Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia Marinha de Qingdao, Qingdao, China
  • 3 Centro Nacional de Coleta de Patógenos para Animais Aquáticos, Universidade do Oceano de Xangai, Xangai, China
  • 4 Laboratório Chave de Exploração e Utilização de Recursos Genéticos Aquáticos, Ministério da Educação, Shanghai Ocean University, Shanghai, China
  • 5 Centro Internacional de Pesquisa para Biociências Marinhas, Ministério da Ciência e Tecnologia, Shanghai Ocean University, Shanghai, China

MyD88 é um adaptador intracelular conservado, que desempenha um papel importante no sistema imunológico inato. MyD88 transmite sinais para a jusante dos receptores toll-like e IL-1 para ativar a via de sinalização NF - & # x03BAB, que é rigidamente controlada na resposta imune para manter a intensidade e a homeostase imune em diferentes estágios. A via de sinalização NF - & # x03BAB foi extensivamente estudada em mamíferos, mas o mecanismo molecular regulatório ainda não está claro em peixes teleósteos. Determinamos que IRF3 e IRF8 podem regular a via de sinalização NF - & # x03BAB mediada por MyD88 em peixes. Curiosamente, MyD88 é precisamente regulado por IRF3 e IRF8 através do mesmo mecanismo, mas de maneiras completamente opostas. IRF3 promove a via de sinalização NF - & # x03BAB mediada por MyD88, enquanto IRF8 inibe a via de sinalização. MyD88 é regulado via ubiquitina & # x2013proteasome degradation, enquanto IRF3 ou IRF8 inibiu ou promoveu a degradação de MyD88 nesta via. Especificamente, na fase inicial de estimulação de lipopolissacarídeo (LPS) ou Vibrio a infecção, a regulação positiva de IRF3 e a regulação negativa de IRF8 eventualmente aumentaram a expressão de MyD88 para ativar a via de sinalização NF - & # x03BAB para desencadear a resposta imune. No estágio final da estimulação, IRF3 regulado para baixo e IRF8 regulado para cima sinergicamente regulam a expressão de MyD88 para um nível normal, mantendo assim o equilíbrio imunológico da homeostase e evitando danos graves de superimunização persistente. Este estudo apresenta informações sobre a via de sinalização Myd88 & # x2013NF - & # x03BAB em peixes teleósteos e fornece novos insights sobre seu mecanismo regulatório no sistema imunológico de peixes.


MATERIAIS E MÉTODOS

Linhas celulares, vírus e animais.

A linha celular de porquinho da índia CRL 1405 foi subclonada e as células que eram altamente suscetíveis à infecção por BDV foram usadas como uma linha celular de laboratório padrão para infecção por BDV (19). Além disso, células Vero foram usadas ao longo deste estudo. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Iscove (IMDM) suplementado com 5% de soro fetal de vitela (FCS), 2 mM de 1-glutamina e 100 U / ml de gentamicina.

A quarta passagem de rato da cepa He / 80 Giessen BDV foi usada para infecções (40). Em geral, as células aderentes foram infectadas com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 a 1 em placas de 96 ou 6 poços por 1 h em um volume de 25 & # x003bcl (para placas de 96 poços) ou 200 & # x003bcl (para placas de 6 poços) de IMDM-2% FCS. Para infecções simuladas, foi usado homogenato de cérebro de rato normal a 10% em IMDM-2% FCS. Posteriormente, foi adicionado meio de cultura e as células foram cultivadas durante 5 a 7 dias.

Ratos Lewis fêmeas foram obtidos nas instalações de criação de animais do Friedrich Loeffler Institut, Bundesforschungsinstitut f & # x000fcr Tiergesundheit, T & # x000fcbingen, Alemanha. Na idade de 6 semanas, os ratos foram infectados intracerebralmente no hemisfério esquerdo do cérebro com 0,05 ml de BDV, correspondendo a 5 & # x000d7 10 3 unidades formadoras de foco.

Infecção retroviral de células CRL 1405.

Os vetores de expressão retroviral e linhas de células produtoras estáveis ​​usados ​​para este estudo foram descritos anteriormente (12). Dois dias antes da infecção, as células CRL foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 5 & # x000d7 10 4 células / poço. Para infecções, sobrenadantes de cultura de células contendo os vetores retrovirais foram adicionados às células CRL e as placas de cultura foram centrifugadas a 100 & # x000d7 g por 3 h. Posteriormente, os sobrenadantes foram substituídos por meio de cultura. A eficiência da transfecção foi controlada por 2 dias após a infecção, e se a eficiência da transfecção fosse inferior a 20%, o procedimento de infecção era repetido para aumentar a eficiência da infecção / transfecção, que variou entre 20 e 50%. As células foram cultivadas na presença de 1 mg / ml de zeocina (Invitrogen) por 2 semanas ou até que todas as células fossem positivas para proteína fluorescente verde (GFP), que foi monitorada por análise fluorométrica usando um citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson). Antes de cada experimento, as células foram novamente testadas para fluorescência GFP.

Ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA).

Para preparações de extratos nucleares, 2 & # x000d7 10 5 células CRL foram semeadas em placas de cultura de células de 60 mm e infectadas com BDV (MOI & # x0003d 1) ou deixadas sem infecção no dia seguinte. Após 6 dias, as células não infectadas foram estimuladas com acetato de tetradecanoil-forbol (TPA 0,3 & # x003bcg / ml) durante 40 min. As células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) e depois colhidas em 400 & # x003bcl de tampão A (KCl 10 mM, HEPES 10 mM [pH 7,9], EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, ditiotreitol 1 mM [DTT ], e fluoreto de fenilmetilsulfonil 1 mM). Após 15 min de agitação a 4 & # x000b0C, 25 & # x003bcl 10% Nonidet P-40 foi adicionado por 2 min, e os núcleos foram sedimentados e ressuspensos em 50 & # x003bcl de tampão B (HEPES 20 mM [pH 7,9], NaCl 0,4 M, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM e DTT 1 mM). Após 20 min de agitação e subsequente centrifugação, as concentrações de proteína dos extratos nucleares foram determinadas (Bio-Rad, Alemanha). Oito microgramas de extrato nuclear foram incubados com 4 & # x003bcg poly (dI-dC) 2 em tampão de ligação (0,1 M KCl, 10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 5 mM MgCl2, DTT 1 mM e glicerol a 10%). Após 20 min, 2 & # x000d7 10 4 a 5 & # x000d7 10 4 cpm de um oligonucleotídeo de fita dupla marcado com 32 P (5 & # x02032-GATCCAGAGGGGACTTTCCGAGTAC-3 & # x02032) foi adicionado à mistura e posteriormente incubado por 10 min à temperatura ambiente. Posteriormente, as amostras foram separadas em géis não desnaturantes de poliacrilamida a 5%. Após secagem, os géis foram submetidos a autorradiografia.

Ensaio do gene repórter de luciferase.

As células (2,5 & # x000d7 10 4) em placas de 24 poços foram transfectadas com 0,05 & # x003bcg 3 & # x000d7 & # x003baB plasmídeo repórter e 0,1 & # x003bcl Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Após 5 h, as células foram estimuladas com 0,3 & # x003bcg / ml TPA. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram colhidas em 100 & # x003bcl de tampão de lise (ácido morfolinotanossulfônico de sódio 50 mM [Na-MES], Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], Triton X-100 a 0,2% e 1 mM DTT). Os lisados ​​foram centrifugados por 5 min a 15.000 & # x000d7 g. Para a determinação da atividade da luciferase, 20 & # x003bcl de lisado limpo foi adicionado a 50 & # x003bcl de tampão de ensaio (125 mM Na-MES, 125 mM Tris-HCl [pH 7,5], 25 mM de acetato de magnésio e 2,5 mg / ml de ATP) e quantificado em um luminômetro (Lumat LB 9501) usando 50 & # x003bcl de solução de substrato (0,5 mM de luciferina, 1 mM de NaOH). Para normalização, as concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford (Bio-Rad).

Ensaio de infectividade.

A infecciosidade do vírus foi determinada pelo uso de células CRL 1405. As células foram cultivadas durante 7 dias na presença de diferentes diluições de lisados ​​de células infectadas com BDV em placas de microtitulação de 96 poços de fundo plano. Posteriormente, as células foram fixadas com paraformaldeído-PBS a 4% e permeabilizadas com Triton X-100-PBS a 1%. A presença de antígenos virais foi demonstrada por uma reação imunohistoquímica utilizando anticorpos monoclonais anti-BDV de camundongo. A ligação não específica de reagentes imunológicos foi bloqueada pela incubação das placas com 10% de soro fetal de vitela-PBS. A reação de anticorpos monoclonais com células foi detectada pelo uso de um anticorpo secundário anti-espécie marcado com biotina (Dianova) e um conjugado de estreptavidina-peroxidase (Dianova). A reação foi visualizada com orto-fenilenodiamina e H2O2 (Sigma).

Tratamento com interferon.

As células CRL foram infectadas com BDV (MOI & # x0003d 0.1) e 3 dias após a infecção (pi) foram tratadas com 100, 10 ou 1 U de IFN universal - & # x003b1 / & # x003b2 (PBL Biomedical Laboratories) para um 3 dias adicionais em 3 ml de meio de cultura. Posteriormente, a infecciosidade viral foi determinada pelo ensaio padrão descrito acima.

Immunohistochemistry.

Amostras de cérebro foram obtidas em diferentes pontos de tempo após a infecção e foram fixadas em paraformaldeído a 4%. Todas as secções de tecido foram coradas com hematoxilina-eosina. A imunohistoquímica foi realizada para a presença de antígenos específicos de BDV, usando um anticorpo monoclonal de camundongo específico de nucleoproteína anti-BDV (38 / 17C1) (55) conforme descrito anteriormente (18), e para a detecção de NF ativado - & # x003baB , usando um anticorpo de coelho específico para fosfo (NEB) pNF - & # x003baB (p65) a uma diluição de 1:50. A reação de coloração foi aumentada pelo uso de um anticorpo secundário biotinilado (1: 200). Para detecção, foi utilizado um kit ABC (Vector).


Discussão

Aspectos mecanísticos.

Nosso modelo de trabalho de como U-STAT2, IRF9 e p65 colaboram no IL6 promotor para aumentar a expressão é mostrado na Fig. 3 G e H. Propomos que STAT2 faça uma ponte entre os elementos ISRE e κB ligando-se simultaneamente a IRF9 e p65, trazendo o domínio de transativação potente de STAT2 em jogo para ajudar a ativar a maquinaria transcricional. Como um componente de U-ISGF3, STAT1 pode participar na ativação dependente de ISRE da expressão de IL6, mas não é necessário, uma vez que o complexo U-STAT2 – IRF9 funciona bem mesmo sem STAT1. No entanto, STAT1 pode ajudar induzindo a expressão de U-STAT2 e IRF9 como genes alvo de ISGF3 fosforilado. Uma vez que os elementos ISRE e κB não estão próximos um do outro na sequência linear de DNA do promotor, é provável que um loop seja formado para facilitar sua interação. As altas concentrações de U-STAT2 e IRF9 que ajudam a conduzir a expressão de IL6 são alcançadas tardiamente em resposta aos IFNs tipo I, uma vez que o STAT1, STAT2, e IRF9 os genes são todos ISGs ativados fortemente por ISGF3 fosforilado em tirosina durante a resposta inicial a esses IFNs. Em muitos cânceres, essas três proteínas, que compreendem U-ISGF3, são expressas em um alto nível constitutivamente, como resultado da exposição dos tumores a IFNs tipo I ou III, ou como consequência de outros mecanismos indutores, como aglomeração celular (35). Embora U-STAT2 desempenhe um papel predominante na condução da expressão de IL6, ainda é possível que STAT2 fosforilado em tirosina também contribua. Conforme mostrado na Fig. 1UMA, IL6 foi induzida 4 h após o tratamento com IFNβ, quando a fosforilação da tirosina de STAT2 era aparente, mas o aumento da expressão de STAT2 não.

A expressão de IL6 em resposta ao IFN tipo I requer que NF-κB p65 livre já esteja presente, mas IFNβ não libera NF-κB de IκB nas células que estudamos. IL6 não é o único gene que é regulado por IFNs tipo I de uma maneira dependente de NF-κB, pois tanto ISGF3 quanto NF-κB são necessários para induzir a expressão do gene βR1 em resposta ao IFNβ (36). Os sinais gerados em resposta ao IFN tipo I interagem com os sinais dependentes de NF-κB em células derivadas da medula óssea. Em linfoblastos, a ativação de NF-κB induzida por IFNα é devida à degradação de IκBα, catalisada pela ativação dependente de IFN de PI3K e AKT (37). Mostramos que IFNβ induz a expressão de um pequeno subconjunto de genes dependentes de NF-κB, incluindo IL6, sem ativar a liberação de NF-κB de IκB ou aumentar a fosforilação de p65. No entanto, p65 é necessário para U-STAT2 mais IRF9 ou IFNβ para induzir a expressão de IL6.

Nós mostramos que a indução aumentada de IL6 por U-ISGF3 em combinação com estimuladores NF-κB depende da presença de um ISRE no IL6 promotor. Em outro estudo, Listeria monocytogenes e IFNβ mostraram induzir a expressão dos genes NOS2 e IL6 sinergicamente (38). ISGF3 fosforilado em tirosina e NF-κB regulam cooperativamente NOS2 transcrição recrutando STAT1 e p65 para um potenciador distante que é ∼30 kb a montante do local de início da transcrição (TSS), mas não para ISREs putativos localizados em -940 a -952 e -911 a -924. A cooperação de ISGF3 fosforilado e NF-κB foi considerada como ocorrendo no início da resposta a IFNs tipo I, de acordo com nossa descoberta de que a iniciação por ISGF3 fosforilado aumenta a indução de IL6 em resposta a IL1 (Fig. 2B) Além disso, a indução sinérgica do IL6 O gene em resposta à sinalização dependente de IFNγ e TLR está associado à ocupação de STAT1 em um potenciador que é ∼25 kb a montante do TSS, seguido pela iniciação de acetilação de histona (39). Ambos os estudos mostram que STAT1 é recrutado para o IL6 potenciador distal, aumentando assim a formação de complexos de iniciação que incluem RNA polimerase II no SST. No entanto, em nosso estudo, a ativação aumentada da expressão de IL6 é muito mais forte em células com altos níveis de U-ISGF3 do que em tempos iniciais em células com ISGF3 fosforilado (Fig. 2B) Um ISRE em -1.513 a -1.526 no IL6 O promotor, em vez de um intensificador muito mais distal, é responsável pela indução intensificada da expressão de IL6 em resposta ao U-ISGF3 que é formado tardiamente na resposta a IFNβ, em combinação com ativadores de NF-κB.

Como um importante coordenador das respostas imunes, o NF-κB interage com muitos outros fatores de transcrição. STAT3 e STAT1 interagem com p65 fisicamente. Por exemplo, STAT1α se liga a p65, diminuindo a localização nuclear de NF-κB e inibindo a ativação do gene alvo (40). Confirmamos a interação entre U-STAT1 e p65 (Fig. 3 C e D), mas não está claro se essa interação é direta. No entanto, não detectamos a ligação de p65 a IRF9, embora IRF9 seja necessário para a expressão do gene dependente de NF-κB induzida por STAT2 (Fig. 1eu) U-STAT2 se liga a IRF9 por meio de seu domínio bobina-bobina (41), mas ainda não sabemos qual domínio de U-STAT2 é responsável por sua interação com p65. No entanto, sabemos que o domínio SH2 de STAT3 é essencial para sua interação com NF-κB (38), sugerindo que este domínio de STAT2 pode se ligar a p65 de forma semelhante.

Os complexos STAT1 – NF-κB e STAT3 – NF-κB provavelmente se formam no citosol, e sabemos que U-STAT2 é necessário para a translocação de p65 para o núcleo em macrófagos derivados da medula óssea (19). O EGF que está presente no meio de cultura para células HME ativa o NF-κB (42, 43). No entanto, não encontramos uma diferença significativa na quantidade de IκBα ligado a p65 quando comparamos as células HME com e sem a expressão de U-STAT2 exógeno (Apêndice SI, Fig. S5C) Concluímos que U-STAT2 e IRF9 não afetam a translocação de p65 para o núcleo em células HME, ao contrário da situação em macrófagos. IRF9 e STAT2 são necessários para expressão aumentada de IL6, mas não aumentam a expressão de IL1 ou IL8 em resposta a LPS (Apêndice SI, Fig. S4 E e F), apoiando ainda mais nossa conclusão de que a capacidade de U-STAT2 e IRF9 para aumentar a expressão do gene dependente de NF-κB é específica do promotor e provavelmente dependente da presença de um elemento ISRE nos promotores dos genes que mostram esta cooperação.

Agora descobrimos que IRF9 ocupa um elemento κB que está muito próximo ao local de início da transcrição do IL6 gene, e que p65 ocupa um ISRE putativo no promotor em células que expressam altos níveis de U-STAT2 e IRF9, mas não em células que expressam um alto nível de IRF9 apenas. Combinado com nossa descoberta de que p65 interage com U-STAT2, mas não IRF9, os dados apoiam fortemente nossa hipótese de que STAT2 funciona como uma ponte conectando p65 e IRF9 no IL6 promotor. Por outro lado, um estudo recente descobriu que o TNF induziu a ligação de NF-κB a um ISRE, direcionando a expressão de alguns ISGs em hepatócitos (44). Estas descobertas sugerem que o complexo U-STAT2 – IRF9 – p65 pode ser montado independentemente dos elementos κB, e que a ativação da sinalização dependente de NF-κB pode aumentar a formação deste complexo, que pode ocupar ISREs em promotores ISG para conduzir um modesto nível de transcrição. Em resumo, o complexo U-STAT2 – IRF9 – p65 conduz a transcrição de um subconjunto de genes dependentes de NF-κB em resposta a IFNs tipo I e tipo III e um subconjunto de ISGs em resposta a ativadores de NF-κB.

The Role of Synergistic Activation of IL6 Expression in Cancer.

Considerando o importante papel de IL6 no microambiente tumoral, investigamos a capacidade de U-STAT2 e IRF9 de regular a secreção de IL6 em células cancerosas, descobrindo que a diminuição da expressão de IRF9 e U-STAT2 inibiu a produção de IL6 e a ativação de STAT3 no câncer de pulmão HCC827 células (Fig. 4 D e E), onde a ativação de STAT3 é dependente de IL6 autócrina (45). Como consequência, a redução do nível de IRF9 reprimiu o crescimento dessas células (Fig. 4F), que contrasta com a função do ISGF3 como ativador da expressão gênica antiproliferativa. Digno de nota, a diminuição da expressão de IRF9 não inibiu a ativação de STAT3 e o crescimento celular em fibroblastos normais (Apêndice SI, Fig. S7). Esta não é a primeira vez que se descobriu que ISGF3 promove a sobrevivência do câncer e metástase. Nosso trabalho anterior mostrou que U-ISGF3 regula cerca de um quarto dos ISGs induzidos por IFNβ (5), e que este subconjunto é virtualmente idêntico ao conjunto de genes induzidos por IFN na assinatura de resistência a danos no DNA relacionado ao interferon (IRDS) (46 ) Em células de câncer de mama triplo-negativas, mas não em células ER-positivas, o subconjunto IRDS de ISGs é induzido por uma via antiviral dependente de RIG-1 (DDX58) quando as células cancerosas entram em contato com fibroblastos estromais (47). Funções adicionais de ISGF3 na sobrevivência de células cancerosas ainda não estão claras. Considerando a instabilidade do genoma do câncer, ISGF3 também pode desempenhar um papel importante na superação da morte celular induzida pela instabilidade genômica no processo de tumorigênese. Não observamos fosforilação de tirosina STAT2 basal nas células cancerosas que estudamos. Portanto, U-STAT2 – IRF9 e U-ISGF3 podem ser os principais mediadores da colaboração com ativadores de NF-κB em células cancerosas, e observamos que níveis elevados de U-STAT2 e IRF9 se correlacionam com prognósticos ruins no adenocarcinoma de pulmão. O complexo U-STAT2 – IRF9, U-ISGF3 ou ambos, também podem interagir com outros fatores de transcrição além de NF-κB para induzir a expressão de genes que facilitam o crescimento de células cancerosas.


Materiais e métodos

O Comitê de Revisão Institucional (IRB) da Ohio State University aprovou os experimentos in vitro envolvendo células sanguíneas humanas de doadores saudáveis ​​não identificados. Os requisitos de consentimento para as amostras de sangue não identificadas foram dispensados ​​pelo IRB. Monócitos primários foram isolados a partir de leucócitos adquiridos do American Red Cross Blood Service. MDMs foram diferenciados de monócitos conforme descrito (50). O controle THP-1 e as linhas de células THP-1 / KO foram descritas anteriormente (29). Os ensaios de infecção por SeV e HIV-1 foram realizados conforme descrito anteriormente (32, 39). Materiais e métodos detalhados podem ser encontrados em Apêndice SI.


IRFs em mecanismos de co-ligação de regulação transcricional

Outra camada de regulação transcricional na qual IRFs desempenham um papel pode ser encontrada em mecanismos de aumento e co-ligação. Fatores de transcrição incluindo IRF3 / IRF7, ATF-2 / c-Jun, NF - & # x003baB e proteína arquitetônica HMGI (Y) se reúnem para formar um enhanosome (62, 77). A ligação cooperativa de fatores de transcrição à região intensificadora de IFN & # x003b2 estimula a transcrição do IFNgene & # x003b2. Foi observado que mudanças induzidas por ligação na conformação do DNA, e não na superfície das interações proteína-proteína, são cruciais para a ligação cooperativa e a ativação transcricional. A análise detalhada desta montagem de enhanosome foi conduzida em estruturas cristalinas dos domínios de ligação de DNA de IRF3, IRF7 e NF - & # x003baB humanos ligados ao IFN& # x003b2 enhancer (PDB IDs & # x020131T2K, 2O61, 2O6G) (62, 125). Além disso, foi demonstrado que o IRF3 interage com as proteínas adaptadoras CBP, STING, MAVS e TRIF. Estudos sobre a estrutura do mutante fosfomimético IRF3 S386 / 396E ligado a CBP (5JEM) sugeriram que um conservado peuxO IS motif é responsável por esta cooperação.

Uma ampla gama de estudos identificou uma pletora de genes que são regulados positivamente pelos efeitos coativadores de NF - & # x003baB e IRFs. A primeira sugestão de tais efeitos coativadores foi de IRF1 e NF - & # x003baB, presente no elemento regulador IFN (IRE) do IFN& # x003b2 promotor. NF - & # x003baB regula positivamente a expressão do gene IFN & # x003b2 ligando-se a dois locais de reconhecimento em seu promotor. Estes locais de reconhecimento flanqueiam o motivo PRD-I ao qual IRF1 se liga (1, 126, 127). IRF1 / NF - & # x003baB co-ativação, portanto, depende tanto da ligação ISRE quanto & # x003baB, em que IRFs e Nf & # x003baB sentam-se lado a lado no DNA (Figuras 1C, & # x200B, 3). 3). O IRF1 por si só é suficiente para regular positivamente o IFN & # x003b2 após a infecção viral da doença de Newcastle, enquanto que o NF - & # x003baB sozinho não induziu a regulação positiva. No entanto, como mencionado antes, a regulação positiva de IFN & # x003b2 foi muito mais potente quando IRF1 e NF - & # x003baB se ligaram simultaneamente à sua região promotora (1).

A regulação cruzada entre as vias de sinalização ativadas por NF - & # x003baB e IRF3 também é evidenciada pela presença de múltiplos & # x003baB e sítios de ligação ISRE em regiões reguladoras de genes (42). O mecanismo de IRF3 / NF - & # x003baB é o mesmo descrito para IRF1 / NF - & # x003baB. A ação combinada de NF - & # x003baB e IRF3 é obrigatória para a ativação transcricional de vários genes, incluindo quimiocinas Cxcl10 e Ccl5, ativador do inflamassoma Gbp5, Gene Imune-responsivo 1, e IFN& # x003b21. A análise detalhada da cinética de ativação sugeriu que genes individuais dentro deste pequeno agrupamento usam mecanismos regulatórios distintos (128, 129). Além disso, a ocupação de todo o genoma induzida por vírus de sítios de ligação de IRF3 e p65 / RelA correlacionada com a co-ligação de outros fatores de transcrição antivirais (130). Mecanicamente, NF - & # x003baB foi encontrado em um estudo de todo o genoma de Wienerroither et al. para recrutar o módulo de quinase mediador do complexo de transcrição, enquanto STATs em ISGF3 contatam o módulo mediador central do complexo de transcrição, ambos necessários para a transcrição do gene com sucesso (131). De fato, outros estudos de todo o genoma estabeleceram que também em genes ativados pela ligação de IRF3 e RelA, a ligação de MED1 e Polimerase II ocorreu em posições sobrepostas nos promotores, sugerindo seus papéis no recrutamento do complexo de transcrição (130).

Mais recentemente, a interação entre IRF5 e NF - & # x003baB também foi revelada. A indução da via TLR7 pelo Imiquimod leva à regulação positiva de IRF5 por meio da ativação de NF - & # x003baB e PU.1, que se ligam aos dois primeiros exons do gene IRF5 (132). Além disso, NF - & # x003baB desempenha um papel no recrutamento de IRF5 para os sítios de ligação PU.1-ISRE não canônicos compostos em promotores de genes inflamatórios em macrófagos após estimulação de LPS (133).

Juntos, esses estudos sugerem que os IRFs colaboram globalmente com NF - & # x003baB e outros coativadores utilizando diversos mecanismos regulatórios para induzir com precisão redes regulatórias de transcrição distintas.


Macrófagos como barreira à quimioterapia e imunoterapia

Enquanto a heterogeneidade das populações de TAM ainda está sendo desconvoluída, a evidência clínica sugere que os macrófagos podem contribuir para as deficiências da quimioterapia e da imunoterapia com hifenato. A alta densidade de TAM tem se mostrado um marcador independente de mau prognóstico em pacientes com câncer de mama, especialmente para câncer de mama HR-positivo (170). É importante notar que os macrófagos demonstraram contribuir para a redução da eficácia da quimioterapia. Shree et al. descobriu que em vitro BMDMs que expressam catepsina protegem as células de câncer mamário da morte celular induzida por paclitaxel. Eles demonstraram ainda que os tumores de camundongos MMTV-PyMT tratados com paclitaxel aumentaram a infiltração de TAM, e a inibição da catepsina em combinação com paclitaxel aumentou a sobrevida a longo prazo (176). Da mesma forma, as amostras clínicas ER-positivas e HER2-negativas resistentes ao tamoxifeno tiveram uma densidade maior de populações de macrófagos CD163 + e aumentou a expressão de EGFR do que as amostras sensíveis a tamoxifeno, que se correlacionaram positivamente com o tamanho do tumor e metástase (177). Além disso, os macrófagos podem interromper a infiltração de células T, nas quais as imunoterapias dependem para mediar a eficácia. Por exemplo, em pacientes com câncer de pulmão, a exclusão de macrófagos de células T CD8 + de ninhos de tumor se correlacionou com uma resposta fraca à terapia anti-PD-1. Quando os macrófagos foram depletados com terapia anti-CSF-1R, as células T CD8 se infiltraram com sucesso no tumor para interagir com as células malignas e retardar a progressão do tumor (178). Além disso, de maneira importante, em modelos pré-clínicos de câncer de mama, quando os macrófagos são esgotados usando terapia anti-CSF-1R (145, 178) ou seu fenótipo foi convertido em um fenótipo antitumoral (179), terapia anti-PD-1 induzida por terapia anti-potente - imunidade tumoral. Isso destaca os efeitos deletérios dos TAMs em tumores e a importância de direcionar as células imunes inatas e adaptativas para atingir o potencial total da imunoterapia e uma resposta imune anticâncer durável.

Direcionando TAMs para terapia anticâncer

Ambas as estratégias pré-clínicas e clínicas para direcionar as funções promotoras de tumor de TAMs no câncer estão sendo desenvolvidas. Essas abordagens foram revisadas em grande detalhe e incluem a inibição do recrutamento de macrófagos para tumores, bloqueando os eixos CCL2 & # x02013CCR2 ou CCR5 & # x02013CCL5, esgotando TAMs bloqueando o macrófago bloqueador de CSF-1 ou CSF-1R & # x0201d e # x0201d CD47 / SIRP1 & # x003b1, PD-1 / PD-L1, MHCI / LILRB1 e CD24 / Siglec-10 e suprimindo a atividade pró-tumor dos macrófagos (inibição de TGF - & # x003b2 ou VEGF) (36, 180 e # x02013184) . A depleção ou inibição de macrófagos usando inibidores de CCL2, CSF-1 e CSF-1R demonstrou ser eficaz contra tumores de camundongo e humanos (16, 36, 145, 185). É importante ressaltar que um estudo recente mostrou que a inibição de CCL2 como monoterapia levou a mais metástases quando a terapia foi descontinuada, o que foi conduzido de forma dependente de IL-6 e VEGF (186). Este estudo desafia o uso de CCL2 como monoterapia e destaca a necessidade de entender a composição do microambiente tumoral para uma terapia antimetastática bem-sucedida.

CSF-1R é um alvo promissor para abordar TAMs terapeuticamente, uma vez que a alta expressão de CSF-1 ou CSF-1R prediz a progressão do câncer e mortalidade (187). Foi demonstrado que o bloqueio de CSF-1R diminui a infiltração de TAM, que subsequentemente resulta no aumento de células T CD8 + e melhora a resposta à quimioterapia (95, 145). Em um estudo de fase Ib com tumores sólidos avançados, a combinação de pexidartinibe, um inibidor de CSF-1R e paclitaxel foi bem tolerada, e a combinação mostrou infiltração de macrófagos reduzida no microambiente tumoral (188). No entanto, em outro estudo a / b de fase I, emactuzumabe, um anticorpo monoclonal contra CSF-1R, mostrou redução em TAMs imunossupressores, mas não demonstrou benefício clínico sozinho ou em combinação com paclitaxel (189). Esses estudos sugerem que uma avaliação cuidadosa do TME é importante antes de decidir quais pacientes se beneficiariam melhor com a terapia com CSF-1R. Outras advertências às terapias anti-CSF-1R incluem relatórios que mostram que a inibição da sinalização de CSF-1R pode promover metástase de câncer de mama (190).

Para melhorar as terapias anti-CSF-1R, a combinação de anti-CSF-1R com quimioterapia complementar e agentes que aumentam a função das células T pode melhorar significativamente os resultados. A esse respeito, um estudo recente mostrou que a adição de um agonista de CD40 antes da terapia anti-CSF-1R induziu um estado de macrófago hiperativado de curta duração que foi suficiente para gerar uma resposta de células T eficaz em tumores resistentes a ICB (191). Além disso, mostramos recentemente que a inibição de CSF-1R leva a uma redução significativa em TAMs e, quando combinada com a terapia com inibidor de PARP, resulta em um aumento na sobrevida global, com alguns camundongos experimentando sobrevida livre de tumor por pelo menos 1 ano (159). Estudos com antagonistas de sinalização do CSF-1R, combinados com o medicamento paclitaxel ou carboplatina, mostraram maior controle do tumor e redução da metástase em modelos pré-clínicos de câncer de mama. É importante ressaltar que o bloqueio da sinalização de CSF-1 também aumentou a imunidade antitumoral e a infiltração de células T citotóxicas à quimioterapia (145). O bloqueio do eixo CCR5 & # x02013CCL5, que diminuiu a infiltração de macrófagos em tumores, é outro alvo terapêutico estimulante com ensaios clínicos em andamento para câncer de mama (192).

Uma estratégia alternativa é converter TAMs pró-tumor em um fenótipo antitumoral. CD40 agonists (193), PI3Kγ inhibitors (194), CD47 inhibitors (195), and a class IIa HDAC inhibitor (179) have all been shown to reduce primary and metastatic murine breast tumors (179) and have emerged as novel modalities to convert TAMs to anti-tumor macrophages. In addition, other strategies have been shown to convert TAMs to an M1 phenotype and include Bruton's tyrosine kinase (BTK) inhibitors (196), TLR agonists (197), STAT3 inhibitors (198), IL-1Ra inhibitors (199), and LILRB2 inhibitors (200) Taken together, strategies to deplete or inhibit suppressive TAM functions or activate anti-tumor TAMs combined with chemotherapy and/or immunotherapy may have a great potential for the treatment of breast cancer patients. However, while many of these compounds in preclinical and clinical development are now filling our toolbox with TAM-targeting strategies, it will likely be necessary to further elucidate the complexity of TAM subsets including their ontogeny and phenotype for successful therapeutic targeting ( Figure 4 ).

Macrophage-targeting strategies for anti-cancer therapy have started to fill our toolbox. We now need to understand how these compounds work, which subsets of TAMs they modulate, and which breast cancer patients will benefit.

Therapeutic Targeting of TAM Metabolism for Anti-Cancer Therapy

The metabolic programming of TAMs is complex, and the underlying molecular mechanisms and crosstalk between tumor cells and stroma remain to be characterized. An in-depth analysis of these metabolic circuits may facilitate better appreciation for the functional fates of macrophages, including their pro- vs. anti-tumor phenotype. This important information would further support the clinical application of targeting TAM metabolism for anti-cancer therapy. There is some insight of the potential of this strategy from several recent publications that utilized other immune cell types including Tregs. Recently, Tregs were shown to activate the sterol regulatory element-binding protein 1 (SREBP1)-mediated fatty acid synthesis pathway in TAMs. SREBP1 induced M2-TAM metabolic fitness, mitochondrial integrity, and survival (201). Pharmacological inhibition of de novo fatty acid synthesis using a SREBP1 inhibitor, fatostatin, showed anti-tumor immunity when combined with ICB (anti-PD-1) in a B16 melanoma preclinical tumor model (201). Our group recently reported that PARP inhibition directly modulated macrophage metabolism by shunting glycolysis and inducing a dependence on lipid metabolism, which generated an immunosuppressive TME by inhibiting T cell function and thereby contributed to PARP inhibitor resistance (159). The use of fatostatin in combination with PARP inhibition and macrophage modulation significantly enhanced the overall survival of mice bearing brca1-deficeint TNBC (159). In line with our findings, inhibition of PARP induced upregulation of lipogenic genes by modulating the transcription factor specificity protein 1 (Sp1), which leads to the accumulation of lipid droplets in the liver (202). Similarly, a study suggested that genetic deletion as well as pharmacologic inhibition of PARP induced the expression of ATP-binding cassette transporters (ABCA1) and cholesterol efflux in macrophages (203). These studies highlight the role of both Tregs and PARP inhibitors in regulating macrophage lipid metabolism. Further molecular understanding on the mechanisms of how PARP inhibitors regulate TAM metabolism would provide future opportunity for promising therapeutic strategies.

In a preclinical syngeneic model of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), a TLR9 agonist, CpG oligodeoxynucleotide, induced a metabolic state that required fatty acid oxidation and shunting of TCA intermediates for de novo lipid biosynthesis. This shift in central carbon metabolism activated highly phagocytic macrophage that could overcome the CD47 𠇍on't-eat-me” signals on tumor cells to mediate an antitumor response (204). Macrophages cultured with PDAC-conditioned media compared to normal pancreatic cells had higher levels of vascular network formation, enhanced metastatic potential, increased levels of EMT, and a pronounced glycolytic signature. Inhibiting hexokinase II (HK2) with 2-deoxyglucose (2DG) inhibited glycolysis and reversed the pro-tumor TAM phenotype, highlighting the therapeutic potential of modulating TAM metabolism for anti-cancer therapy (205). Molecular metabolic control of TAMs has been demonstrated em vitro by inhibiting glutamine synthetase (GS). In human monocytes, GS expression activates an M2-like phenotype, which is reversed through pharmacological inhibition of GS by methionine sulfoximine (MSO). Inhibition of GS resulted in production of succinate, a critical regulator of the pro-inflammatory response, and enhanced glucose flux through glycolysis. Importantly, in ex vivo studies, GS restored T cell recruitment. Na Vivo, genetic deletion of macrophage-specific GS reduced metastasis in a preclinical mouse model of lung cancer (206). Taken together, precisely targeting the metabolic rewiring of TAMs may re-educate their phenotype and may overcome TAM-associated immunosuppression.


Results And Discussion

DAI/ZBP1 recruits RIP1 and RIP3 through RHIM domains

Analysis of the DAI amino-acid sequence revealed, in addition to the two known amino-terminal Z-DNA binding domains Zα and Zβ, two other conserved regions located in the central portion of the protein (supplementary Fig S1 online). Further analysis identified these two sequences as potential RHIMs (RHIM1 and RHIM2 Fig 1A), which are known to mediate homotypic protein–protein interactions. For example, a RHIM is present in the TLR-adaptor protein TRIF, in which it is responsible for the recruitment of the kinases RIP1 and RIP3, two other RHIM-domain-containing proteins ( Meylan et al, 2004). Interaction between RIP1 and RIP3 was also shown to take place through a homotypic RHIM–RHIM interaction ( Sun et al, 2002). In TLR3 signalling, the RHIM-dependent TRIF–RIP1 interaction is crucial for NF-κB activation, whereas RIP3 competes for this interaction and thus acts as an inhibitor of TLR3-mediated NF-κB activation ( Meylan et al, 2004 ).

The presence of two RHIM domains in DAI suggested that, similar to TRIF, DAI might also interact with one or both of the RIP kinases. Indeed when co-expressed in human embryonic kidney (HEK)293T cells, human DAI co-immunoprecipitated with RIP1 and RIP3, but not with RIP2 and RIP4 (which lack RHIMs), nor with Cardif (MAVS, IPS-1, VISA), the adaptor protein essential for RIG-I/MDA5 signalling (Fig 1B Meylan et al, 2005). Similarly, murine DAI interacted with RIP1 and RIP3 (supplementary Fig S2 online).

To map the DAI–RIP1/3 interaction site, various deletion constructs were generated (Fig 1D). Co-immunoprecipitation experiments showed that only the constructs of RIP1 and RIP3 that retained the RHIM domain-coding region were able to bind co-expressed DAI (Fig 1C,E). Four residues in the RHIM domain of RIP1 and RIP3 were previously shown to be essential for RHIM-based interactions ( Sun et al, 2002). When these crucial residues were mutated to alanines, a total impairment of DAI recruitment was observed (Fig 1C,F).

To investigate the involvement of the two DAI RHIM domains in RIP1/3 recruitment, we also generated DAI constructs with alanine substitutions in the corresponding four core residues of their RHIMs, as well as DAI deletion constructs for the first or second RHIM, or entire region comprising these two domains (Fig 1G). All DAI constructs lacking a functional RHIM1 were unable to bind to RIP1/3, whereas the targeting of the RHIM2 did not affect this interaction when DAI and RIPs were overexpressed (Fig 1H,I supplementary Fig S2C,D online). Taken together, these results show that DAI has two RHIM domains, in addition to the two described Z-DNA binding domains, and that it recruits RIP1 and RIP3 through RHIM–RHIM homotypic interactions.

DAI-induced NF-κB activation is RHIM-dependent

Considering the crucial role of the RHIM-dependent TRIF–RIP1 association in mediating NF-κB activation on TLR3 stimulation, we next examined whether this domain has a similar role in DAI signalling.

Overexpression of human or murine DAI in HEK293T cells activated an NF-κB-dependent promoter in a dose-dependent manner (Fig 2A data not shown). For this activity, the full-length protein was required, as the N- or C-terminal deletion constructs were inactive, regardless of the presence or absence of the RHIM domains (supplementary Fig S3A online). In contrast to NF-κB, neither human nor murine full-length or deletion DAI constructs significantly activated IRF transcription factors, as monitored by an interferon-stimulated regulatory element promoter (supplementary Fig S3B online data not shown) or by the upregulation of the interferon-inducible protein RIG-I (supplementary Fig S3C online). By contrast, Cardif or a dominant-active form of RIG-I potently activated IRFs in the same experimental setting, and acted as positive controls.

DAI constructs with mutations in the first or in both RHIMs were found to be unable to induce NF-κB activation (Fig 2A). Identical results were obtained with the corresponding deletion constructs, supporting the essential requirement of a functional RHIM1 domain. Furthermore, mutation or deletion of DAI RHIM2 resulted in a strong impairment of DAI activity (Fig 2A), indicating that RHIM2 is also important for DAI function.

In accordance with these functional data, we observed that overexpressed wild-type DAI co-immunoprecipitated with endogenous RIP1, and that mutation or deletion of RHIM2 strongly affected this interaction (Fig 2B supplementary Fig S4A online). This is in contrast to the data with overexpressed proteins (Fig 1H,I) and suggests that the DAI RHIM2 domain also contributes to the recruitment of RIP1 under more physiological conditions. As expected, DAI constructs lacking functional RHIM1 were unable to bind to endogenous RIP1 (Fig 2B supplementary Fig S4A online).

In addition to these observations, it was also observed that DAI induces NF-κB activation synergistically when co-expressed with RIP1 and RIP3 (supplementary Fig S4B,C online). This effect was not observed on co-expression of DAI 2RHIM * mutant, which is unable to bind to the two RIPs, nor when the RIP3 RHIM mutant was used. It should be noted that a kinase-inactive RIP3 (K50A) mutant did not show the synergistic NF-κB activation with DAI.

To corroborate the results of the NF-κB reporter assay, we generated HEK293-TRex cells expressing full-length or Δ2RHIM DAI in an inducible manner. In this system, induced expression of wild-type DAI led to spontaneous I-κB phosphorylation and degradation, whereas induction of the DAI Δ2RHIM protein had no effect (Fig 2C).

These observations emphasize the ability of DAI to activate NF-κB and further show that both RHIM domains are crucial for this activity.

RIP1 and RIP3 mediate DAI signalling to NF-κB

The results presented above suggest that RIP1 and possibly RIP3 are essential for DAI-mediated NF-κB activation. To verify this, the expression of RIP1 and RIP3 was knocked down using short interfering RNA (siRNA supplementary Fig S5A,B online). Silencing of RIP1 with two different oligonucleotides (but not a control siRNA) clearly impaired DAI-mediated NF-κB activation (Fig 3A). Interestingly, downregulation of RIP3 using two different siRNAs also resulted in a strong reduction of DAI signalling to NF-κB (Fig 3A). Therefore, it seems that both RIP1 and RIP3 participate in mediating DAI downstream events resulting in NF-κB activation. This situation is different from that which occurs in TRIF signalling, the second RHIM-dependent NF-κB activating pathway, where RIP3 acts as an inhibitor by competing with RIP1 for binding to the RHIM of TRIF ( Meylan et al, 2004). In support of the requirement of both kinases for DAI signalling, RIP1 and RIP3 can form a complex with DAI (Fig 3B).

A further indication that RIP3 is part of the DAI signalling complex comes from the observation that co-expression of these two proteins resulted in the appearance of a form of RIP3 that migrates more slowly on SDS–PAGE, which probably originates from post-translational modifications (Figs 1F, 3C,D). This change was absent when the RIP3 RHIM mutant (Figs 1F, 3C) or the DAI double-RHIM mutant constructs (Fig 3D) were used, but was present on RIP1 and RIP3 co-expression. This suggests that the assembly of the DAI–RIP1–RIP3 complex is necessary to induce RIP3 modifications. To determine the nature of the upper form of RIP3, immunoprecipitates of RIP3 were analysed using antibodies specific for phosphorylated serine (P-Ser), phosphorylated threonine (P-Thr) and ubiquitin. No signal was detected for P-Ser or ubiquitin by contrast, a strong signal corresponding to the upper form of RIP3 was obtained using the P-Thr antibody (Fig 3C data not shown). The absence of a P-Thr signal in the RIP3 RHIM-mutant immunoprecipitate argues for its specificity. Furthermore, treatment with calf intestinal alkaline phosphatase abolished the basal, as well as the DAI- and RIP1-induced migratory shift of RIP3 (Fig 3D), further indicating that this upper band is a hyper-phosphorylated form. When a kinase-inactive RIP3 (K50A) mutant construct was used, both basal and DAI-induced phosphorylations were abolished (Fig 3E). This suggests that the DAI and RIP3 interaction drives RIP3 autophosphorylation. RIP1 does not seem to be essential for DAI-induced RIP3 phosphorylation as this is still observed after RIP1 knockdown (supplementary Fig S6 online). Our results raise the interesting question of whether the lack of synergy in NF-κB induction between the kinase-inactive RIP3 and DAI (supplementary Fig S4C online) might be due to the absence of DAI-induced RIP3 autophosphorylation.

Collectively, these results show that both RIP1 and RIP3 contribute to DAI-induced NF-κB activation, and that recruitment of RIP3 to DAI induces its autophosphorylation.

The MCMV protein M45 inhibits DAI signalling

Viruses have evolved strategies to interfere with antiviral signalling pathways. A clear example is the RIG-I/MDA5 viral RNA-sensing pathway, which is targeted by various viruses such as hepatitis C or influenza viruses.

In a bioinformatics search for other RHIM-containing proteins, we found that this domain was also present in protein 45 of three related double-stranded DNA-containing herpes viruses: MCMV (or murid herpesvirus1), rat cytomegalovirus and tupaiid herpesvirus 1 (supplementary Fig S7A online). Interestingly, protein 45 of the MCMV (M45) is crucial for productive viral replication in macrophages and endothelial cells ( Brune et al, 2001 ), and is essential for the MCMV spread and pathogenesis na Vivo ( Lembo et al, 2004). Recently, Upton et al (2008) identified the RHIM of MCMV M45 to be crucial for the suppression of cell death during infection. Moreover, M45 inhibits RIP1-dependent signalling by tumour necrosis factor (TNF Mack et al, 2008 ).

These observations led us to hypothesize that M45 could target DAI signalling. M45 is post-translationally processed at amino acid 277 during infection ( Lembo et al, 2004 ) and the RHIM-containing fragment (aa 1–277) retains RIP-binding and cell death suppression activity ( Upton et al, 2008). Therefore, we generated a construct corresponding to this polypeptide and tested its ability to bind to DAI, RIP1 and RIP3. As expected, interaction with both RIP kinases was observed (Fig 4A). M451−277 also bound to DAI, which was dependent on functional DAI RHIMs as shown by the absence of binding to the DAI RHIM double mutant (Fig 4A).

Next we tested the effect of M451−277 on DAI signalling. Co-expression of M451−277 inhibited DAI-induced NF-κB activation in a dose-dependent manner as monitored by reporter assay (Fig 4B). This inhibitory activity was again completely dependent on a functional RHIM, as a RHIM-mutated M451−277 construct had no effect (Fig 4B).

Reports from Upton et al (2008) and Mack et al (2008) showed the ability of M45 to target RIP1. The first identified the RHIM of MCMV M45 to be crucial for suppression of cell death, whereas the second mapped the inhibitory activity of M45 in RIP1-dependent signalling by TNF to its C-terminal portion (aa 977–1174). To clarify which of these two mechanisms account for the effect on DAI signalling, we generated the various M45 constructs used in these studies (supplementary Fig S7B online).

According to Mack et al (2008) , M45 constructs with the C-terminal part (aa 977–1174) could reduce TNF-induced NF-κB activation. By contrast, we found that these same constructs, when expressed alone, induced a moderate but consistent NF-κB activation on their own (supplementary Fig S7C online). In support of the requirement for the RHIM, but not the C-terminal domain of M45 to inhibit DAI signalling, we observed that an M45 construct comprising amino acids 1–976 blocked the DAI-induced NF-κB activation, and that this effect was abrogated by mutating the RHIM domain (Fig 4B).

Considering that M451−277 interacts with the DAI RHIM domain, we hypothesized that this could affect the recruitment of RIP1 and RIP3. Indeed, binding of RIP1 and/or RIP3 to DAI was strongly affected by the co-expression of RHIM-containing M45 constructs (Fig 4C,D data not shown). By contrast, the interaction between DAI and RIP kinases was altered neither by the expression of RHIM-mutated M45 constructs nor by the M45 C-terminal cleavage fragment. Interestingly, RIP3 phosphorylation was inhibited by M45 in an identical RHIM-dependent manner (Fig 4D). Thus, the MCMV M45 protein has the potential to block DAI signalling to NF-κB by interfering with the RHIM-dependent recruitment of RIP1 and RIP3. In line with this, one might consider the idea that M45 could also interfere with the DAI–RIPs complex by targeting not only DAI RHIMs but also RIP1 and RIP3 RHIM domains.

In summary, we have identified DAI as a new RHIM-containing protein, and provide evidence that these domains are crucial for the recruitment of RIP1 and RIP3, and subsequent NF-κB activation, which is in agreement with the recent report from Kaiser et al (2008 ). Furthermore, the MCMV M45 protein has the potential to block this pathway by disrupting DAI–RIP interactions. This, together with the observation by Upton et al (2008) that M45 is crucial for the suppression of cell death during MCMV infection, makes it highly probable that inhibition of DAI signalling contributes to the requirement of M45 for MCMV replication and pathogenesis na Vivo.


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Keywords: NFAT, Syk, CR3, phenol glycolipid-1, Mycobacterium leprae, dendritic cell, macrophage, neutrophil

Citation: Doz-Deblauwe É, Carreras F, Arbues A, Remot A, Epardaud M, Malaga W, Mayau V, Prandi J, Astarie-Dequeker C, Guilhot C, Demangel C and Winter N (2019) CR3 Engaged by PGL-I Triggers Syk-Calcineurin-NFATc to Rewire the Innate Immune Response in Leprosy. Frente. Immunol. 10:2913. doi: 10.3389/fimmu.2019.02913

Received: 30 August 2019 Accepted: 27 November 2019
Published: 17 December 2019.

Andrea Cooper, University of Leicester, United Kingdom

Roland Lang, University Hospital Erlangen, Germany
John S. Spencer, Colorado State University, United States

Copyright © 2019 Doz-Deblauwe, Carreras, Arbues, Remot, Epardaud, Malaga, Mayau, Prandi, Astarie-Dequeker, Guilhot, Demangel and Winter. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License (CC BY). O uso, distribuição ou reprodução em outros fóruns é permitido, desde que o (s) autor (es) original (is) e o (s) proprietário (s) dos direitos autorais sejam creditados e que a publicação original nesta revista seja citada, de acordo com a prática acadêmica aceita. Não é permitida a utilização, distribuição ou reprodução em desacordo com estes termos.

† Present address: Ainhoa Arbues, Department of Medical Parasitology and Infection Biology, Swiss Tropical and Public Health Institute, University of Basel, Basel, Switzerland


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