Em formação

Que tipo de sistema CCD é necessário para tirar fotos da luciferase


Estou trabalhando com a luciferase e quero poder tirar uma foto dela. O problema é que posso ver a luciferase brilhando em toda a sua glória na minha frente, mas não importa o quanto eu tente, não consigo tirar uma foto da luciferase com minha DSLR (Nikon D80).

Estou curioso para saber se estou perdendo uma determinada lente ou se deveria fotografar usando uma configuração de iluminação diferente. Já estou expondo por 30 ". Talvez mais?


Você também vai querer ter certeza de que está capturando imagens em completa escuridão, pois pode ter emissão de fótons muito baixa de seu sistema de luciferase e qualquer quantidade de luz de fundo pode sobrecarregar seu sinal com ruído.


Você está procurando um dispositivo de imagem de bioluminescência. Eles têm uma câmera CCD muito sensível e os tempos de exposição são de cerca de 5 minutos na escuridão total.


Lançando luz sobre o metabolismo do câncer em tempo real com bioluminescência

Os cientistas da EPFL inventaram uma nova maneira de quantificar - em tempo real - o metabolismo da glicose de tumores cancerígenos, tornando-os bioluminescentes. Esta nova sonda de luz não é radioativa e funciona em organismos vivos como ratos que carregam as células tumorais. A técnica requer células tumorais marcadas, dois jabs e uma câmera. Os resultados são publicados em Métodos da Natureza.

Pegue um rato com um tumor marcado com luciferase. Os tumores que expressam luciferase são feitos retirando uma amostra do tumor canceroso de um paciente e marcando-os quimicamente com luciferase, uma classe de enzimas oxidativas que produzem bioluminescência. Essas células marcadas são cultivadas em camundongos para compreender a biologia básica do câncer e para o desenvolvimento de tratamentos eficazes contra o câncer.

Em seguida, injete um primeiro composto no camundongo que não se decompõe facilmente no sangue. Vinte e quatro horas depois, injete um segundo composto que é projetado para reagir apenas com o primeiro em condições muito específicas.

A reação entre os dois compostos é projetada para produzir luz bioluminescente que escapa do corpo, como em vaga-lumes, mas acontece onde tumores que expressam luciferase metabolizam açúcar. Aponte um sensor de câmera CCD para o corpo e você terá um instantâneo dos níveis metabólicos do tumor. A quantidade de luz produzida é diretamente proporcional à quantidade de açúcar metabolizado.

"Queríamos desenvolver uma ferramenta para ajudar a criar tratamentos de câncer mais eficazes", explica a química do EPFL Elena Goun, do Laboratório de Química Bioorgânica e Imagem Molecular, que liderou o estudo. "Nossa nova técnica de imagem nos permite quantificar quanto açúcar está sendo metabolizado em tempo real, fornecendo informações valiosas sobre o estado metabólico do tumor e os tipos de drogas que podem privar o tumor de sua principal fonte de energia."

Como funciona: de vaga-lumes a imagens de câncer

Goun e sua equipe encontraram inspiração na forma como os vaga-lumes brilham e combinaram com a química do clique, um ramo da biologia química em que as moléculas biocompatíveis são projetadas para "clicar" especificamente em uma reação personalizada que acontece diretamente no complexo ambiente dos vivos organismo.

Como o câncer tem uma alta taxa metabólica, ele consome açúcar em grandes quantidades. Este processo é importante para o crescimento e metástase do câncer, mas permanece pouco compreendido devido à falta de ferramentas não invasivas que funcionem em todo o organismo.

A ideia de Goun era projetar duas moléculas de clique, uma com açúcar e outra com a luciferina "enjaulada", o composto emissor de luz encontrado em vagalumes que os faz brilhar. E funciona.

Depois que o açúcar marcado com um clique é comido pelo tumor, ele reage com essa luciferina "enjaulada" por meio da reação de "clique" e produz luz bioluminescente proporcional à quantidade de açúcar que entra nas células. Ela chamou sua técnica de imagem do vaga-lume de BiGluc, abreviação de "glicose bioluminescente".

BiGluc pode ser usado para entender as necessidades metabólicas de diferentes tumores, abrindo caminhos para a geração de novos e eficazes tratamentos.

BiGluc em imagens pré-clínicas do metabolismo do câncer e desenvolvimento de drogas

"Nossa nova técnica de imagem óptica tem alta aplicabilidade clínica e muitas vantagens", diz Goun. "É não radioativo, altamente sensível e quantificável, os reagentes são estáveis ​​por anos e o brilho pode ser observado por muitas horas."

Devido à sua natureza versátil, BiGluc também pode ser estendido além do câncer para células disfuncionais de imagem de muitas outras patologias humanas importantes nas quais as alterações no metabolismo desempenham um papel fundamental, como diabetes, doenças neurodegenerativas, esteatohepatite não alcoólica e muitas outras.

"O que é empolgante sobre esses resultados é que criamos a base para o desenvolvimento de uma plataforma de imagem ultrassensível para quantificar a absorção de muitos metabólitos importantes que desempenham um papel central em várias doenças humanas com o objetivo de criar tratamentos mais eficazes." diz Goun.


Armazenamento de informações médicas abaixo da superfície da pele

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Todos os anos, a falta de vacinação leva a cerca de 1,5 milhão de mortes evitáveis, principalmente em países em desenvolvimento. Um fator que torna as campanhas de vacinação nessas nações mais difíceis é que há pouca infraestrutura para armazenar registros médicos, portanto, muitas vezes não há uma maneira fácil de determinar quem precisa de uma vacina específica.

Os pesquisadores do MIT desenvolveram agora uma nova maneira de registrar o histórico de vacinação de um paciente: armazenar os dados em um padrão de corante, invisível a olho nu, que é administrado sob a pele ao mesmo tempo que a vacina.

“Em áreas onde os cartões de vacinação de papel são freqüentemente perdidos ou inexistentes e os bancos de dados eletrônicos são desconhecidos, esta tecnologia pode permitir a detecção rápida e anônima do histórico de vacinação do paciente para garantir que todas as crianças sejam vacinadas”, disse Kevin McHugh, um ex-pós-doutorado do MIT que agora é professor assistente de bioengenharia na Rice University.

Os pesquisadores mostraram que seu novo corante, que consiste em nanocristais chamados pontos quânticos, pode permanecer por pelo menos cinco anos sob a pele, onde emite luz infravermelha que pode ser detectada por um smartphone especialmente equipado.

McHugh e o ex-cientista visitante Lihong Jing são os principais autores do estudo, que aparece hoje em Ciência, Medicina Translacional. Ana Jaklenec, cientista pesquisadora do Instituto Koch para Pesquisa Integrativa do Câncer do MIT, e Robert Langer, professor do Instituto David H. Koch do MIT, são os autores sênior do artigo.

Um registro invisível

Vários anos atrás, a equipe do MIT decidiu criar um método para registrar as informações de vacinação de uma forma que não exigisse um banco de dados centralizado ou outra infraestrutura. Muitas vacinas, como a vacina para sarampo, caxumba e rubéola (MMR), requerem doses múltiplas espaçadas em determinados intervalos sem registros precisos; as crianças podem não receber todas as doses necessárias.

“Para estar protegido contra a maioria dos patógenos, são necessárias várias vacinações”, diz Jaklenec. “Em algumas áreas do mundo em desenvolvimento, pode ser muito difícil fazer isso, pois há uma falta de dados sobre quem foi vacinado e se eles precisam de injeções adicionais ou não.”

Para criar um prontuário médico descentralizado “no paciente”, os pesquisadores desenvolveram um novo tipo de pontos quânticos baseados em cobre, que emitem luz no espectro infravermelho próximo. Os pontos têm apenas cerca de 4 nanômetros de diâmetro, mas são encapsulados em micropartículas biocompatíveis que formam esferas com cerca de 20 mícrons de diâmetro. Esse encapsulamento permite que o corante permaneça no local, sob a pele, após ser injetado.

Os pesquisadores projetaram seu corante para ser aplicado por um patch de microagulha, em vez de uma seringa e agulha tradicionais. Esses adesivos agora estão sendo desenvolvidos para fornecer vacinas contra sarampo, rubéola e outras doenças, e os pesquisadores mostraram que seu corante poderia ser facilmente incorporado a esses adesivos.

As microagulhas utilizadas neste estudo são feitas de uma mistura de açúcar solúvel e um polímero denominado PVA, além do corante quantum-dot e da vacina. Quando o adesivo é aplicado na pele, as microagulhas, que têm 1,5 milímetros de comprimento, se dissolvem parcialmente, liberando sua carga útil em cerca de dois minutos.

Ao carregar seletivamente micropartículas em microagulhas, os patches fornecem um padrão na pele que é invisível a olho nu, mas pode ser verificado com um smartphone que tem o filtro infravermelho removido. O patch pode ser personalizado para imprimir padrões diferentes que correspondem ao tipo de vacina administrada.

“É possível que algum dia essa abordagem‘ invisível ’crie novas possibilidades para armazenamento de dados, biossensorio e aplicações de vacinas que podem melhorar a forma como o atendimento médico é fornecido, especialmente no mundo em desenvolvimento”, diz Langer.

Imunização eficaz

Testes usando pele de cadáver humano mostraram que os padrões de pontos quânticos podem ser detectados por câmeras de smartphones após até cinco anos de exposição solar simulada.

Os pesquisadores também testaram essa estratégia de vacinação em ratos, usando adesivos de microagulha que distribuíram os pontos quânticos junto com uma vacina contra a poliomielite. Eles descobriram que esses ratos geraram uma resposta imune semelhante à resposta de ratos que receberam uma vacina tradicional de pólio injetada.

“Este estudo confirmou que a incorporação da vacina com o corante nos adesivos de microagulha não afetou a eficácia da vacina ou nossa capacidade de detectar o corante”, diz Jaklenec.

Os pesquisadores agora planejam pesquisar profissionais de saúde em países em desenvolvimento na África para obter informações sobre a melhor maneira de implementar este tipo de manutenção de registros de vacinação. Eles também estão trabalhando para expandir a quantidade de dados que podem ser codificados em um único padrão, permitindo-lhes incluir informações como a data de administração da vacina e o número do lote do lote da vacina.

Os pesquisadores acreditam que os pontos quânticos são seguros para uso dessa forma porque são encapsulados em um polímero biocompatível, mas planejam fazer mais estudos de segurança antes de testá-los em pacientes.

“Armazenamento, acesso e controle de registros médicos é um tópico importante com muitas abordagens possíveis”, diz Mark Prausnitz, presidente de engenharia química e biomolecular da Georgia Tech, que não esteve envolvido na pesquisa. “Este estudo apresenta uma nova abordagem em que o registro médico é armazenado e controlado pelo paciente dentro da pele do paciente de uma forma minimamente invasiva e elegante.”

A pesquisa foi financiada pela Fundação Bill e Melinda Gates e pelo Koch Institute Support (core) Grant do National Cancer Institute. Outros autores do artigo incluem Sean Severt, Mache Cruz, Morteza Sarmadi, Hapuarachchige Surangi Jayawardena, Collin Perkinson, Fridrik Larusson, Sviatlana Rose, Stephanie Tomasic, Tyler Graf, Stephany Tzeng, James Petman, Daniel Vlasic, Matthew Peters, Nels Peterson, Lowell Wood, Wen Tang, Jihyeon Yeom, Joe Collins, Philip Welkhoff, Ari Karchin, Megan Tse, Mingyuan Gao e Moungi Bawendi.


Vacina MMRV pode previnir sarampo, caxumba, rubéola, e varicela.

  • MEASLES (M) pode causar febre, tosse, coriza e olhos vermelhos e lacrimejantes, geralmente seguidos por uma erupção cutânea que cobre todo o corpo. Pode causar convulsões (geralmente associadas a febre), infecções de ouvido, diarreia e pneumonia. Raramente, o sarampo pode causar danos cerebrais ou morte.
  • MUMPS (M) pode causar febre, dor de cabeça, dores musculares, cansaço, perda de apetite e glândulas salivares inchadas e sensíveis sob as orelhas. Pode causar surdez, inchaço do cérebro e / ou da medula espinhal, inchaço doloroso dos testículos ou ovários e, muito raramente, morte.
  • RUBELLA (R) pode causar febre, dor de garganta, erupção na pele, dor de cabeça e irritação nos olhos. Pode causar artrite em até metade das mulheres adolescentes e adultas. Se uma mulher contrair rubéola durante a gravidez, ela pode ter um aborto espontâneo ou seu bebê pode nascer com sérios defeitos de nascença.
  • VARICELLA (V), também chamada de catapora, pode causar erupções na pele com coceira, além de febre, cansaço, perda de apetite e dor de cabeça. Pode causar infecções de pele, pneumonia, inflamação dos vasos sanguíneos, inchaço do cérebro e / ou cobertura da medula espinhal e infecção do sangue, ossos ou articulações. Algumas pessoas que contraem varicela apresentam uma erupção na pele dolorosa chamada zona (também conhecida como herpes zóster) anos depois.

A maioria das pessoas vacinadas com MMRV ficará protegida para o resto da vida. Vacinas e altas taxas de vacinação tornaram essas doenças muito menos comuns nos Estados Unidos.

A vacina MMRV pode ser administrada a crianças de 12 meses a 12 anos de idade, usualmente:

A vacina MMRV pode ser administrada ao mesmo tempo que outras vacinas. Em vez de MMRV, algumas crianças podem receber vacinas separadas para MMR (sarampo, caxumba e rubéola) e varicela. Seu médico pode fornecer mais informações.

Informe o seu fornecedor da vacina se a pessoa que está tomando a vacina:

  • Teve um reação alérgica após uma dose anterior de vacina MMRV, MMR ou varicela, ou tem algum alergias graves com risco de vida.
  • É grávida, ou pensa que pode estar grávida.
  • Tem um sistema imunológico enfraquecido, ou tem um pai, irmão ou irmã com histórico de problemas hereditários ou congênitos do sistema imunológico.
  • Já teve um condição que o faz sofrer hematomas ou sangrar facilmente.
  • Tem um história de convulsões, ou tem um pai, irmão ou irmã com histórico de convulsões.
  • É tomando, ou planeja tomar salicilatos (como aspirina).
  • Tem recentemente recebeu uma transfusão de sangue ou recebeu outros hemoderivados.
  • Tem tuberculose.
  • Tem recebeu qualquer outra vacina nas últimas 4 semanas.

Em alguns casos, seu médico pode decidir adiar a vacinação MMRV para uma consulta futura ou pode recomendar que a criança receba vacinas MMR e varicela separadas em vez de MMRV.

Pessoas com doenças leves, como resfriado, podem ser vacinadas. As crianças que estão moderada ou gravemente doentes geralmente devem esperar até que se recuperem antes de receber a vacina MMRV.

Seu médico pode fornecer mais informações.

  • Dor, vermelhidão ou erupção cutânea no local da injeção podem ocorrer após a vacina MMRV.
  • Febre ou inchaço das glândulas nas bochechas ou pescoço às vezes ocorrem após a vacina MMRV.
  • Convulsões, frequentemente associadas a febre, podem ocorrer após a vacina MMRV. O risco de convulsões é maior após MMRV do que após vacinas separadas de MMR e varicela, quando administradas como a primeira dose da série em crianças mais novas. Seu médico pode aconselhá-lo sobre as vacinas apropriadas para seu filho.
  • Reações mais sérias raramente acontecem. Estes podem incluir pneumonia, inchaço do cérebro e / ou cobertura da medula espinhal ou contagem baixa temporária de plaquetas que pode causar sangramento ou hematomas incomuns.
  • Em pessoas com problemas graves no sistema imunológico, esta vacina pode causar uma infecção que pode ser fatal. Pessoas com problemas sérios no sistema imunológico não devem tomar a vacina MMRV.

É possível que uma pessoa vacinada desenvolva uma erupção cutânea. Se isso acontecer, pode estar relacionado ao componente da vacina contra a varicela, e o vírus da vacina da varicela pode se espalhar para uma pessoa desprotegida. Qualquer pessoa que tenha erupção na pele deve ficar longe de pessoas com sistema imunológico enfraquecido e bebês até que a erupção desapareça. Converse com seu médico para saber mais.

Algumas pessoas vacinadas contra a varicela desenvolvem herpes zoster anos depois. Isso é muito menos comum após a vacinação do que após a varicela.

As pessoas às vezes desmaiam após procedimentos médicos, incluindo vacinação. Informe o seu médico se sentir tonturas ou tiver alterações na visão ou zumbidos nos ouvidos.

Como acontece com qualquer medicamento, há uma chance muito remota de uma vacina causar uma reação alérgica grave, outras lesões graves ou morte.

Uma reação alérgica pode ocorrer após a pessoa vacinada deixar a clínica. Se você observar sinais de uma reação alérgica grave (urticária, inchaço no rosto e na garganta, dificuldade em respirar, batimento cardíaco acelerado, tontura ou fraqueza), ligue 9-1-1 e leve a pessoa ao hospital mais próximo.

Para outros sinais que dizem respeito a você, ligue para seu médico.

As reações adversas devem ser notificadas ao Sistema de Notificação de Eventos Adversos de Vacinas (VAERS). O seu provedor de cuidados de saúde geralmente irá apresentar este relatório, ou você mesmo pode fazê-lo. Visite o ícone externo do site VAERS ou ligue 1-800-822-7967. O VAERS serve apenas para relatar reações e os funcionários do VAERS não fornecem aconselhamento médico.

O Programa Nacional de Compensação por Lesões por Vacinas (VICP) é um programa federal criado para indenizar pessoas que podem ter sido feridas por certas vacinas. Visite o ícone externo do site VICP em ou ligue 1-800-338-2382 para saber mais sobre o programa e como fazer uma reclamação. Existe um limite de tempo para apresentar um pedido de indemnização.

  • Pergunte ao seu médico.
  • Ligue para o departamento de saúde local ou estadual.
  • Entre em contato com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC):
    • Ligar 1-800-232-4636 (1-800-CDC-INFO) ou
    • Visite o site de vacinas CDC e rsquos

    Muitas Declarações de Informações sobre Vacinas estão disponíveis em espa & ntildeol e em outros idiomas. Consulte http://www.immunize.org/vis ícone externo.

    Hojas de informaci & oacuten sobre vacunas est & aacuten disponibles en espa & ntildeol y en muchos otros idiomas. Visite http://www.immunize.org/vis/vis_spanish.asp ícone externo

    Declaração de informações de vacinas (provisória)
    Vacina MMRV (15/08/19)
    42 U.S.C. & sect300aa-26

    Departamento de Saúde e Serviços Humanos
    Centros de Controle e Prevenção de Doenças


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    Introdução à eletroforese de proteínas

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    Que tipo de sistema CCD é necessário para tirar fotos da luciferase - Biologia

    Departamento de Química
    Connecticut College
    New London, CT 06320
    [email protected]

    Introdução
    A bioluminescência é um processo encantador no qual organismos vivos convertem energia química em luz. A luz resulta da oxidação de um substrato orgânico, uma luciferina, catalisada por uma enzima chamada luciferase. Na natureza, existe uma incrível diversidade de organismos que emitem luz, incluindo bactérias, fungos, crustáceos, moluscos, peixes e insetos (Hastings, 1995). Embora as bioquímicas específicas da bioluminescência sejam diversas, todas incluem uma reação mediada por enzimas entre o oxigênio molecular e um substrato orgânico. É provável também que todos os processos de bioluminescência envolvam a formação e a quebra de um peróxido de anel de quatro membros ou um hidroperóxido linear (Wilson, 1995 Wood, 1995). Uma visão geral dos aspectos químicos e mecanísticos de um importante processo de bioluminescência, o dos besouros bioluminescentes, será apresentada aqui. O leitor também é direcionado para outra revisão da luciferase do pirilampo (Inouye, 2010).

    Representando cerca de 2.000 espécies de besouros luminosos (Coeleoptera), existem três famílias: Lampyridae (os verdadeiros vaga-lumes), Phengodidae (besouros click) e Elateridae (pirilampos). Começando há aproximadamente 60 anos com o trabalho pioneiro dos cientistas da Universidade Johns Hopkins, William McElroy, Emil White e Howard Seliger, a pesquisa básica se concentrou principalmente no vaga-lume comum norte-americano Photinus pyralis (Figura 1) progrediu em direção a um entendimento muito bom de como a luz é produzida por vaga-lumes (DeLuca, 1976 McElroy e DeLuca, 1985 White et al., 1971). A recente disponibilidade de Luciola Cruciata e Photinus pyralis As estruturas cristalinas da luciferase avançaram significativamente a compreensão das relações principais entre a estrutura e a função que são responsáveis ​​pela emissão eficiente de luz catalisada por enzima no vaga-lume (Nakatsu et al., 2006 Sundlov et al., 2012). Por sua vez, as perspectivas são brilhantes para a aplicação contínua da bioluminescência do vaga-lume à já impressionante lista de métodos médicos e farmacêuticos (Gould e Subramani, 1998 Contag et al., 1997 Campbell e Sala-Newby, 1993 Kang et al., 2006 Naylor , 1999 Gelmini et al., 2000 Kalra et al., 2011 Dragulescu-Andrasi et al., 2011 Branchini et al., 2010), incluindo na Vivo imagem para visualizar tumores e para monitorar a expressão e regulação gênica (Figura 2).



    Reações bioquímicas de bioluminescência
    A bioluminescência do vagalume é um processo de várias etapas que é descrito nas Eqs 1-3 na Figura 3. Luc representa a luciferase do vagalume, ATP é a fonte de energia bioquímica universal trifosfato de adenosina, PPeu é pirofosfato inorgânico, e as estruturas que correspondem às outras abreviaturas são mostradas abaixo. A luciferase do vagalume tem uma especificidade extraordinária para esse trifosfato de nucleotídeo. O adenilato é o verdadeiro substrato da química oxidativa subsequente. Na primeira etapa (Eq. 1), a luciferase converte a D-luciferina do vaga-lume (LH2) no adenilato de luciferil ligado à enzima correspondente. Na verdade, D-LH2-AMP produzido sinteticamente reage com o oxigênio na presença de luciferase para produzir emissão de luz idêntica à obtida com os substratos naturais D-luciferina e Mg-ATP.

    0,4-0,6 (Niwa et al., 2010a, b) para este processo (a emissão de um fóton de um LH reagido2 molécula) reflete não apenas maquinaria catalítica eficiente, mas também um ambiente altamente favorável que evita a perda de energia do estado excitado eletronicamente por vias não emissoras de luz.


    Mecanismo de bioluminescência geralmente aceito
    Os detalhes mecanísticos geralmente aceitos do processo geral de bioluminescência do vaga-lume são apresentados em mais detalhes abaixo na Figura 4.

    Formação de estado eletronicamente excitado
    Uma quantidade relativamente grande de energia de excitação é necessária para produzir luz visível, da ordem de 40-70 kcal / mol. O principal intermediário de dioxetanona mostrado na sequência de reação acima e na Figura 5 abaixo contém um anel tenso de quatro membros e uma ligação de peróxido fraco (O-O). A clivagem do anel de dioxetanona de alta energia é capaz de liberar energia suficiente como resultado da baixa energia de ativação necessária para clivar a ligação de peróxido e o alívio da tensão do anel inerente à estrutura.

    No vaga-lume, a energia liberada é muito eficientemente direcionada para a produção de um estado eletronicamente excitado da oxiluciferina, produto da bioluminescência. O rápido relaxamento subsequente do estado excitado para o estado fundamental é então acompanhado pela emissão de um fóton de luz. Uma visão mecanicista detalhada deste processo é denominado mecanismo CIEEL (Chemically Initiated Electron Exchange Luminescence) (Figura 5) (Schuster et al., 1979 Koo et al., 1978). Na bioluminescência do vaga-lume, a transferência intramolecular de elétrons da porção heterocíclica da molécula para a dioxetanona produz um par de íons radical e o ânion radical de dióxido de carbono. Em seguida, a transferência reversa de um elétron do ânion radical de dióxido de carbono para a forma radical de oxiluciferina resulta na formação de oxiluciferina e dióxido de carbono eletronicamente excitados. Embora o mecanismo CIEEL possa ocorrer em outros sistemas bioluminescentes, bem como no vaga-lume (Mager e Tu, 1995), deve-se notar que um artigo recente apresenta dados experimentais que são inconsistentes com este mecanismo, fornecendo energia de excitação suficiente para uma bioluminescência eficiente (de Oliveira et al., 2012).


    Estrutura da luciferase do Firefly e funções mecanísticas
    A clonagem e sequenciamento de P. pyralis luciferase e enzimas semelhantes de aproximadamente quinze outras espécies de besouro revelaram que essas luciferases estão intimamente relacionadas a uma grande família de enzimas não bioluminescentes que catalisam reações de ATP com substratos de carboxilato para formar adenilatos de acila (Conti et al., 1996). A formação de LH ligado à luciferase2-AMP e L-AMP (Eqs. 1 e 4) ilustram a química comum a este grande grupo de enzimas e é considerada uma função da ligase. Este grupo de enzimas "formador de acil-adenilato / tioéster" compartilha um motivo de identificação, também chamado de sequência de assinatura ( 198SSGSTGLPKG 207 em Luc), que se liga aos grupos fosfato do ATP, contribuindo para a função catalítica da ligase. Recentemente, Gulick (2009) revisou os aspectos estrutura-função do ANL superfamília de enzimas adenilantes que inclui o umacil- e aril-CoA-sintetases, os domínios de adenilação de nsobre-ribossomal peptide sintetases (NRPSs). e vaga-lume euuciferases. Os NRPSs são particularmente interessantes uma vez que estão envolvidos na biossíntese de antibióticos por fungos. As acil CoA-sintetases e NRPSs também geram tioéster (por exemplo, da Coenzima A) intermediários ou produtos dos acil-adenilatos correspondentes inicialmente formados, e essas reações são semelhantes a uma sugerida para explicar o efeito estimulador da Coenzima A na atividade da luciferase ( Fraga, 2008 Marques e da Silva, 2009). No entanto, CoA não é um substrato Luc necessário, e a conversão do adenilato em oxiluciferina e luz (Figura 4) é uma função da oxidase. Portanto, todas as enzimas ANL catalisam duas reações, e uma delas é uma reação de ligase. As luciferases diferem por serem as únicas enzimas da superfamília que podem oxidar os adenilatos, e é essa reação que leva à bioluminescência. Assim, a luciferase exibe duas funções enzimáticas distintas: como uma sintetase na formação de um adenilato de acila e como uma monooxigenase.

    A estrutura de cristal da luciferase do pirilampo (Figura 6), a primeira estrutura de um membro da família de enzimas ANL, revelou uma arquitetura molecular única que consiste em um grande domínio N-terminal (resíduos 1-436) e um pequeno domínio C-terminal ( resíduos 440-550). A estrutura foi resolvida por Brick e colaboradores (Conti et al., 1996) sem substratos ou produtos presentes, portanto não foi possível determinar quais resíduos de aminoácidos participaram do processo de bioluminescência. No entanto, com base na análise das posições de vários resíduos estritamente conservados entre um grupo de enzimas que compartilham a função de adenilação, foi proposta uma localização geral do sítio ativo da luciferase (Conti et al., 1996).



    Em seguida, a estrutura cristalina de um segundo membro da família formadora de adenilato, a subunidade ativadora de fenilalanina da gramicidina sintetase 1 (PheA) em um complexo com fenilalanina, íon Mg e AMP, foi relatada (Conti et al., 1997). O sítio ativo de PheA foi determinado estar na interface dos dois domínios, que eram notavelmente semelhantes em tamanho e forma aos domínios correspondentes da luciferase. Na estrutura PheA, no entanto, o domínio C-terminal foi girado 94 ° e estava 5 Å mais próximo do domínio N-terminal do que na estrutura da luciferase. Começando com as duas estruturas cristalinas disponíveis, técnicas de modelagem molecular foram usadas para produzir um modelo de trabalho potencial do sítio ativo da luciferase contendo substratos luciferina e Mg-ATP. O modelo produzido em nosso laboratório é mostrado abaixo na Figura 7 (Branchini et al., 1998, 2003).

    Este modelo provou ser bastante útil no projeto racional de estudos de função da estrutura da luciferase baseados na mutagênese dirigida ao local, incluindo vários relacionados à determinação da cor da bioluminescência e à caracterização do local de ligação da luciferina. A ideia com esta abordagem é mudar os aminoácidos e determinar o efeito que a mudança tem nas propriedades da enzima luciferase variante que contém a mudança. A mutação sistemática de quinze resíduos de aminoácidos da luciferase e estudos bioquímicos nas proteínas mutantes resultantes produziram dados que comprovam a visão do local de ligação da luciferina do vaga-lume mostrado na Figura 7. Estes e resultados relacionados podem ser encontrados em Branchini et al., 2001, 2003 e Leach, 2008.

    Com base em estudos mutacionais das luciferases e enzimas na superfamília formadora de acil adenilato, um possível mecanismo para a formação catalisada por luciferase de adenilatos (Eqs. 1 e 4) é apresentado na Figura 8.

    4 Å) são indicados (& harr). Para átomos de cadeia principal (mc), apenas aqueles que interagem com substratos são incluídos. O íon metil amônio foi usado para representar possíveis interações da cadeia lateral K529. As setas azuis curvas representam o ataque nucleofílico do carboxilato de luciferina no alfa-fósforo do ATP e a formação correspondente do intermediário pentavalente.

    Os resíduos da luciferase R218, F247, S347 e A348 são mostrados fazendo interações com a D-luciferina, fixando sua posição no sítio ativo. O anel de adenina do ATP é mantido no lugar por interações com G339, Y340, G341 e A317, enquanto o carboxilato da cadeia lateral de D422 está ligado em H aos grupos hidroxila da ribose. Os resíduos S199 e K206, altamente conservados em toda a superfamília de formação de adenilato de acila, são mostrados quelando a porção beta e gama fosfato de ATP. O principal resíduo no processo catalítico responsável por diminuir a energia do estado de transição é o K529, que provavelmente é auxiliado por T343. O grupo de amônio da cadeia lateral de K529 é mostrado orientando D-luciferina e ATP para uma reação bimolecular produtiva. As setas curvas mostram um átomo de oxigênio do íon carboxilato da D-luciferina realizando um ataque nucleofílico ao átomo de fósforo do alfa-fosfato de ATP. Um estado de transição pentavalente é formado que é provavelmente estabilizado por interações eletrostáticas com o íon amônio de K529 e interações de ligação H com o grupo hidroxila da cadeia lateral de T343. A estabilização da proteína do estado de transição é responsável pela catálise da reação de adenilação. Além disso, os resíduos da sequência de assinatura S199 e K206 funcionam para remover o grupo de saída de fosfato inorgânico à medida que o produto adenilato é formado.

    Os achados de mutagênese, incluindo a importância do resíduo K529 na meia-reação de adenilação, foram principalmente comprovados pelos resultados cristalográficos de Kato e colegas de trabalho sobre a estrutura da luciferase do vagalume da espécie japonesa L. cruciata (Nakatsu et al., 2006) (Figura 9) e um muito recente P. pyralis Estrutura da luciferase (Sundlov et al., 2012) (Figura 10) em complexo com o inibidor potente DLSA, um análogo não reativo do adenilato de luciferil. As principais diferenças são que Arg218 não se liga diretamente em H ao grupo fenol de DLSA, e Ser347 está ligado em H ao átomo de N do benzotiazol por meio de uma molécula de água em ponte. As estruturas do tipo selvagem representam conformações da luciferase que revelaram interações importantes para a reação de adenilação.


    Rotação de 140 ° do C-domínio em torno da região da dobradiça conectando o N-domínio. Até muito recentemente, não estava claro se as luciferases catalisavam a reação de oxidação de acordo com esse mecanismo que requer rotação. A evidência de mutagênese favoreceu essa hipótese, pois nosso laboratório havia mostrado anteriormente que dois resíduos de aminoácidos K443 e K529, que são

    30 Å separados em lados opostos do C-domain of Luc, are each essential for the catalysis of either the adenylation (K529) or oxidation (K443) half-reactions, but not both (Branchini et al., 2005).

    Recently, we constructed a Luc variant called Ppy9 - C108/C447 and cross-linked it with BMOE (1,2-bis(maleimido)ethane) trapping the enzyme in a C-domain rotated conformation. The reagent contains reactive groups at each end that formed covalent bonds with the Cys residues that we introduced by mutagenesis on the surface of the N- and C-domains. Since the residues are

    25 Å apart, they could only be cross linked if the C-domain rotated as predicted by the domain alternation mechanism. Importantly, the cross linked Luc variant could not adenylate LH2, but was able to oxidize synthetic LH2-AMP as expected for an enzyme trapped in the rotated conformation poised to catalyze the oxidation of the adenylate. The existence of the two Luc conformations was directly observed in subsequent crystallographic studies of P. pyralis wild type luciferase and Ppy9 - C108/C447 DLSA complexes (Figure 10) as predicted by the domain alternation mechanism (Sundlov et al., 2012).

    The mutagenesis and crystallographic studies revealed mechanistic details relating the luciferase structure to its function as an oxidase (Eqs. 2 and 3 in Figure 3). In particular, two structural motifs identified in the acyl-adenylate forming superfamily ( 340YGLTE 344 e 442IKYKGYQV 449 in luciferase) play significant roles in the catalysis of the oxidative reactions leading to the emission of light in the firefly. The structural results have confirmed the key role of K443 and identified a tunnel that provides molecular O2 access to the active site only in the second partial reaction (Sundlov et al., 2012). Additionally, the results also call into question details of the chemistry of dioxetanone formation (Figure 4), and an alternative hypothesis involving a radical-based mechanism has been proposed (Sundlov et al., 2012). Research continues to be aimed at developing a detailed explanation of just how the firefly oxidizes its substrate to process the familiar lights many associate with beautiful warm summer evenings.

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    BioLux® Gaussia Luciferase Assay Kit

    The BioLux® Gaussia Luciferase Assay Kit contains the reagents necessary for assaying Gaussia Luciferase (GLuc) activity, most commonly from cell culture supernatants. Gaussia Luciferase is a reporter luciferase from the marine copepod Gaussia princeps (1,2). Gaussia Luciferase can be expressed in mammalian cells using reporter plasmids available from NEB (Refer to the Companion Products). This luciferase, which does not require ATP, catalyzes the oxidation of the substrate coelenterazine in a reaction that produces light (Figure 1), and has considerable advantages over other luminescent reporter genes.

    This kit now includes an additional stabilizer component, which allows the use of the assay in high throughput format or without the requirement of an injector-equipped luminometer. This three-component assay system provides the user with 2 options: (a) use the assay without stabilizer for enhanced light output or (b) use with the desired amount of stabilizer for enhanced signal stability. The stabilizer component allows the use of the assay in high throughput format or without the requirement of an injector-luminometer. For standard assays giving the highest activity, the kit can be used with the GLuc substrate mixed in the assay buffer. With the stabilized assay protocols, the light emission decays slowly with a half-life of approximately 25 minutes. The addition of stabilizer decreases the absolute value of light output but confers signal stability over time (Figure 2).

    The luminescence measured from the supernatant of cultured cells transfected with a plasmid expressing GLuc is proportional to the amount of enzyme produced, which in turn, reflects the level of transcription. Alternatively, a cell lysate sample can be used for the assay. Although most of the GLuc is secreted, the high sensitivity of GLuc allows measurements from the cellular fraction.


    Figure 1: The Photo-oxidation catalyzed by Gaussia Luciferase.
    Haddock, S.H.D., McDougall, C.M. and Case, J.F., The Bioluminescence Web Page, http://lifesci.ucsb.edu/

    Recursos

    • Gaussia Luciferase (GLuc) possesses a natural secretory signal and upon expression is secreted into the cell medium. Therefore, lysing cells in order to assay GLuc activity is not necessary. As a result, GLuc is an ideal reporter gene for time course studies (3).
    • GLuc generates over 1000-fold higher bioluminescent signal intensity, when compared to Firefly and Renilla luciferases, making it an ideal transcriptional reporter (3).
    • GLuc show the highest reported activity of any characterized luciferases (4).
    • The secreted protein is thermally stable (Figure 3) and has extremely high activity in light production for very sensitive assays (2).
    • The secreted GLuc is also very stable in the presence of 55µM ß-mercaptoethanol, which is typically used in culturing mouse stem cells (Figure 4).
    • The GLuc-containing samples, i.e., growth media or cell lysates, can be stored at -20˚C for long-term storage or 4˚C for several days without loss of activity.
    • The stabilizer component of the this assay system provides steady kinetics over a long period of time allowing users the time required for high throughput analysis as well as manually delivered assays.

    1. Because of the stability of GLuc, the activity measured in the growth media of GLuc-expressing culture reflects the protein that has accumulated up to the time of sampling.

    After adding the equilibrated GLuc assay solution to the sample, we recommend a delay time of 35-40 seconds before taking a measurement in order to reach maximum level of detection. This is especially important when the GLuc activity level is low (e.g. < e4 RLU). For example, the readout obtained after 35-40 seconds of delay is

    e4 when compare to 30, 20 and 10 seconds of delay, the readouts are as follows:


    Informação relacionada

    During the winter of 2006-2007, some beekeepers began to report unusually high losses of 30-90 percent of their hives. As many as 50 percent of all affected colonies demonstrated symptoms inconsistent with any known causes of honey bee death:

    • Sudden loss of a colony’s worker bee population with very few dead bees found near the colony.
    • The queen and brood (young) remained, and the colonies had relatively abundant honey and pollen reserves.

    But hives cannot sustain themselves without worker bees and would eventually die. This combination of events resulting in the loss of a bee colony has been called Colony Collapse Disorder.

    Though agricultural records from more than a century ago note occasional bee “disappearances” and “dwindling” colonies in some years, it is uncertain whether the colonies had the same combination of factors associated with CCD. What we do know from the data from beekeepers for 2014/2015 is that, while colony loss from CCD has declined, colony loss is still a concern.


    Holography “Quantum Leap” Using Entangled Photons Could Revolutionize Imaging

    A new type of quantum holography that uses entangled photons to overcome the limitations of conventional holographic approaches could lead to improved medical imaging and speed the advance of quantum information science.

    A team of physicists from the University of Glasgow are the first in the world to find a way to use quantum-entangled photons to encode information in a hologram. The process behind their breakthrough is outlined in a paper published on February 4, 2021, in the journal Física da Natureza.

    Holography is familiar to many from its use as security images printed on credit cards and passports, but it has many other practical applications, including data storage, medical imaging, and defense.

    Classical holography creates two-dimensional renderings of three-dimensional objects with a beam of laser light split into two paths. The path of one beam, known as the object beam, illuminates the holograph’s subject, with the reflected light collected by a camera or special holographic film. The path of the second beam, known as the reference beam, is bounced from a mirror directly onto the collection surface without touching the subject.

    The holograph is created by measuring the differences in the light’s phase where the two beams meet. The phase is the amount that the waves of the subject and object beams mingle and interfere with each other, a process enabled by a property of light known as ‘coherence.’

    The Glasgow team’s new quantum holography process also uses a beam of laser light split into two paths, but, unlike in classical holography, the beams are never reunited. Instead, the process harnesses the unique properties of quantum entanglement – a process Einstein famously called ‘spooky action at a distance’ – to gather the coherence information required to construct a holograph even though the beams

    Their process begins in the lab by shining a blue laser through a special nonlinear crystal which splits the beam into two, creating entangled photons in the process. Entangled photons are intrinsically linked – when an agent acts on one photon, its partner is also affected, no matter how far apart they are. The photons in the team’s process are entangled in both in their direction of travel but also in their polarisation.

    The two streams of entangled photons are then sent along different paths. One photon stream – the equivalent of the object beam in classical holography – is used to probe the thickness and polarisation response of a target object by measuring the deceleration of the photons as they pass through it. The waveform of the light shifts to different degrees it passes through the object, changing the phase of the light.

    Meanwhile, its entangled partner hits a spatial light modulator, the equivalent of the reference beam. Spatial light modulators are optical devices that can fractionally slow the speed of light that passes through them. Once the photons pass through the modulator, they have a different phase compared to their entangled partners which have probed the target object.

    In standard holography, the two paths would then be superimposed on each other, and the degree of phase interference between them would be used to generate a hologram on the camera. In the most striking aspect of the team’s quantum version of holography, the photons never overlap with each other after passing through their respective targets.

    Instead, because the photons are entangled as a single ‘non-local’ particle, the phase shifts experienced by each photon individually are simultaneously shared by both.

    The interference phenomenon occurs remotely, and a hologram is obtained by measuring correlations between the entangled photon positions using separate megapixel digital cameras. A high-quality phase image of the object is finally retrieved by combining four holograms measured for four different global phase shifts implemented by the spatial light modulator on one of the two photons.

    Credit: University of Glasgow

    In the team’s experiment, phase patterns were reconstructed from artificial objects like the letters ‘UofG’ programmed on a liquid crystal display, but also from real objects such as a transparent tape, silicon oil droplets positioned on a microscope slide and a bird feather.

    Dr. Hugo Defienne, of the University of Glasgow’s School of Physics and Astronomy, is the paper’s lead author. Dr. Defienne said: “Classical holography does very clever things with the direction, color, and polarisation of light, but it has limitations, such as interference from unwanted light sources and strong sensitivity to mechanical instabilities.

    “The process we’ve developed frees us from those limitations of classical coherence and ushers holography into the quantum realm. Using entangled photons offers new ways to create sharper, more richly detailed holograms, which open up new possibilities for practical applications of the technique.

    “One of those applications could be in medical imaging, where holography is already used in microscopy to scrutinise details of delicate samples which are often near-transparent. Our process allows the creation of higher-resolution, lower-noise images, which could help reveal finer details of cells and help us learn more about how biology functions at the cellular level.”

    The University of Glasgow’s Professor Daniele Faccio leads the group which made the breakthrough and is a co-author of the paper.

    Prof Faccio said: “Part of what’s really exciting about this is that we’ve found a way to integrate megapixel digital cameras into the detection system.

    “Many big discoveries in optical quantum physics in recent years have been made using simple, single-pixel sensors. They have the advantage of being small, quick and affordable, but their disadvantage is that they capture only very limited data about the state of the entangled photons involved in the process. It would take an extraordinary amount of time to capture the level of detail we can collect in a single image.

    “The CCD sensors that we’re using give us an unprecedented amount of resolution to play with – up to 10,000 pixels per image of each entangled photon. That means we can measure the quality of their entanglement and the quantity of the photons in the beams with remarkable accuracy.

    “The quantum computers and quantum communications networks of the future will require at least that level of detail about the entangled particles they will use. It puts us one step closer to enabling real step-change in those fast-developing fields. It’s a really exciting breakthrough and we’re keen to build on this success with further refinements.”

    Reference: “Polarization entanglement-enabled quantum holography” by Hugo Defienne, Bienvenu Ndagano, Ashley Lyons and Daniele Faccio, 4 February 2021, Física da Natureza.
    DOI: 10.1038/s41567-020-01156-1

    The team’s paper, titled ‘Polarization Entanglement-enabled quantum holography’, is published in Física da Natureza. Their work was supported by funding from the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC), and the European Union’s Horizon 2020 and Marie-Curie Sklodowska Actions initiatives.


    DISCUSSÃO

    Here, we demonstrate the applicability of bioluminescence and, more specifically, the bacterial luciferase operon, for natural transformation studies involving both circular plasmid DNA and integrative DNA fragments. The method is very simple and rapid, and it does not require any selection steps or separation of cells. It can also be applied for different culture types at different growth phases.

    The system showed very high sensitivity, allowing the detection of a genetic transformation event directly at the population level in <1 h after introducing DNA to the culture. Due to the modularity and versatility of the lux operon, the DNA sample characteristics can be readily altered. For example, the genetic element can be reduced from the complete luxCDABE operon down to the two relevant genes luxAB. Moreover, by changing the construct architecture from replicative plasmid to integrative genomic component, the system could be made ∼100-fold more sensitive. It was also observed that the aldehyde required by LuxAB for the light-emitting reaction can be provided either by internal aldehyde production (by LuxCDE) or by external aldehyde addition without affecting the kinetics of luminescence production. Under the studied conditions, the transformation events could not be detected by using fluorescent reporters. Furthermore, in contrast to fluorescence-based methods, the bioluminescence method is applicable for real-time transformation studies even at low transformation frequencies, and in cases involving extremely rare transformation events reported for the first time, the system allowed the real-time detection of two simultaneous transformation events in a population without a selection pressure.

    The introduced method is suitable for investigating the effects of different perturbations, such as antimicrobial agents or competitive bacteria, on transformation efficiency, kinetics and induction in a high-throughput manner. Moreover, the system could be potentially applied for enhancing the transformation efficiency of naturally competent bacteria, such as A. baylyi ADP1. However, despite the many advantages, the method has some limitations. For example, development of the luminescence signal is dependent on the host's metabolism which provides cofactors for the light-producing reaction. Thus, bioluminescence production is to some extent growth phase dependent, which can limit its use in certain applications. Moreover, luminescence is less persistent than fluorescence signal produced by reporter proteins such as GFP which gives a cumulative signal due to its high stability and non-enzymatic nature. Furthermore, the multistep reaction of bioluminescence generation requires the expression of several genes, or, alternatively, an external supply of the aldehyde substrate, which slightly complicates the system. Alternative reporters encoded by a single luciferase gene, such as the luc a partir de Photinus pyralis (de Wet et al. 1985), Gaussia princeps (Wiles et al. 2005) or Renilla reniformis (Greer and Szalay 2002), can serve as convenient tools for HGT research (Ulrich et al. 2015). However, methods employing the eukaryotic luciferase are all dependent on external substrate addition which requires specific assay techniques, complicated substrate transfer mechanisms and strictly adjusted conditions, and are thus not suited for kinetic online measurements.

    Understanding the mechanisms and kinetics of gene transfer in bacteria is of great importance, and versatile tools are required to uncover the diverse aspects of HGT. The introduced system is very well suited for population-level high-throughput transformation studies, whereas fluorescent-based methods are more convenient for studies exploiting microscopic techniques at the single-cell level. In addition, the introduced system is primarily qualitative and provides only relative quantitative results enhancing the system to be truly quantitative requires further standardization. Thus, the system is not suggested to replace the existing tools and methods, but provides a very convenient addition to complement the toolbox for HGT investigations.


    Assista o vídeo: Sensores digitales de nuestras cámaras fotográficas: CCD y CMOS (Novembro 2021).