Em formação

Qual é o melhor organismo modelo para implementar um estudo evolutivo para P.falciparum?


Tenho que estudar e implementar algumas estatísticas evolutivas para P.falciparum. Na sua opinião e pela sua experiência, qual organismo devo considerar a fim de levar os ortólogos para implementar este estudo? Em geral, se eu quisesse estender este estudo a P.knowlesi, P.vivax e em geral a todos os parasitas evolutivos relacionado ao plasmódio do macaco asiático, qual organismo você me sugere considerar como modelo? Pensei em P.berghei mas, como devo considerar também os parasitas Vinckeia (plasmódio de camundongo), existe um bom organismo, do gênero plasmódio, que poderia ser útil como referência para todas essas espécies?

Obrigado


Estrutura genética populacional e aptidão de Daphnia pulicaria através de um gradiente de pH em três lagos norte-americanos

Compreender a resposta evolutiva dos organismos aos gradientes ambientais é importante à luz das crescentes mudanças antropogênicas em nosso meio ambiente. Neste estudo, usamos ferramentas genéticas ecológicas para determinar a adaptação local do organismo modelo, Daphnia pulicaria, através de um gradiente de pH em três lagos da América do Norte. Previmos que haveria diferenciação genética e adaptação local entre as três populações de D. pulicaria. Para avaliar o grau de diferenciação genética, nós genotipamos indivíduos D. pulicaria usando 15 loci microssatélites através das três populações e realizada uma análise de ESTRUTURA corroborada com PCA com base na distância genética de Nei e múltipla F st comparações. Para testar as assinaturas de adaptação local, foi realizado um experimento de sobrevivência em um gradiente de pH sob condições de jardim comum. Determinamos que cada uma das três populações foi geneticamente diferenciada uma da outra, com populações de Hill e Madison Lake de D. pulicaria sendo mais semelhantes entre si do que a população do lago francês. Os resultados do experimento de sobrevivência mostraram um sinal de adaptação local, com Frenchman Lake mostrando maior sobrevivência em pH mais baixo [

6,5] quando comparados às populações de Hill e Madison, enquanto Hill e Madison tiveram maior sobrevivência em pH mais alto [7,9 e 8,6, respectivamente] quando comparados à população francesa.

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Resumo

Fundo

Com a transmissão da malária baixa e marcadamente sazonal, são necessárias ferramentas cada vez mais sensíveis para melhor estratificar o risco de infecção e direcionar as intervenções de controle. Uma pesquisa transversal para caracterizar os padrões atuais de transmissão da malária, identificar pontos críticos e detectar mudanças recentes usando medidas parasitológicas e sorológicas foi conduzida em três locais da Amazônia peruana.

Material e métodos

Após censo completo da população do estudo, 651 participantes foram entrevistados, examinados clinicamente e tiveram uma amostra de sangue coletada para a detecção de parasitas da malária (microscopia e PCR) e anticorpos contra P. vivax (PvMSP119, PvAMA1) e P. falciparum (PfGLURP, PfAMA1) antígenos por ELISA. Os fatores de risco para infecção por malária (PCR positivo) e exposição à malária (soropositividade) foram avaliados por modelos de regressão logística multivariada. A soroprevalência específica para a idade foi analisada usando um modelo de conversão catalítica reversível com base na probabilidade máxima para gerar taxas de soroconversão (SCR, λ). O SaTScan foi usado para detectar grupos espaciais de indivíduos sorológicos positivos em cada local.

Resultados

A prevalência geral de parasitas por PCR foi baixa, ou seja, 3,9% para P. vivax e 6,7% para P. falciparum, enquanto a soroprevalência foi substancialmente maior, 33,6% para P. vivax e 22,0% para P. falciparum, com grandes diferenças entre os locais de estudo. Idade e localização (local) foram significativamente associados com P. vivax exposição enquanto a localização, idade e ocupação ao ar livre foram associadas com P. falciparum exposição. P. falciparum curvas de seroprevalência mostraram uma transmissão estável ao longo do tempo, enquanto para P. vivax transmissão foi melhor descrita por um modelo com dois SCRs. A análise espacial identificou clusters bem definidos de P. falciparum indivíduos soropositivos em dois sites, embora tenha detectado apenas um pequeno grupo de P. vivax exposição.

Conclusão

O uso de um único inquérito parasitológico e sorológico da malária provou ser um método eficiente e preciso para caracterizar a heterogeneidade específica da espécie na transmissão da malária em nível micro-geográfico, bem como para identificar mudanças recentes na transmissão.

Citação: Rosas-Aguirre A, Speybroeck N, Llanos-Cuentas A, Rosanas-Urgell A, Carrasco-Escobar G, Rodriguez H, et al. (2015) Pontos críticos de transmissão da malária na Amazônia peruana: Avaliação rápida por meio de um levantamento parasitológico e sorológico. PLoS ONE 10 (9): e0137458. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137458

Editor: Luzia Helena Carvalho, Centro de Pesquisa Rene Rachou / Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz-Minas), BRASIL

Recebido: 21 de abril de 2015 Aceitaram: 17 de agosto de 2015 Publicados: 10 de setembro de 2015

Direito autoral: © 2015 Rosas-Aguirre et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão no documento e nos arquivos de informações de apoio.

Financiamento: O estudo foi financiado pela Direção Geral de Cooperação para o Desenvolvimento (DGCD) do Governo Belga no âmbito do Terceiro Acordo Marco de Colaboração Institucional entre o Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt” - Universidade Peruana Cayetano Heredia, Lima e o Instituto Tropical Medicina em Antuérpia, Bélgica (projeto FA3-II, 2011-2013)). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Interesses competitivos: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.


Introdução

Compreender os padrões espaço-temporais de disseminação de patógenos é crucial para implementar ações eficazes para conter epidemias (Ostfeld et al. 2005 Vander Wal et al. 2014). Patógenos de vida selvagem, incluindo alguns que podem ser muito prejudiciais para humanos e animais, são transmitidos quando hospedeiros infectados entram em contato direto ou indireto com indivíduos não infectados. Em doenças transmitidas direta e indiretamente, espera-se que a extensão e a velocidade de propagação estejam ligadas à capacidade de dispersão dos hospedeiros (Biek e Real 2010). Assim, as informações sobre o movimento e a dispersão dos hospedeiros são necessárias para identificar as vias de disseminação potenciais. Por exemplo, rios e rodovias parecem retardar a disseminação de doenças crônicas debilitantes em veados-de-cauda-branca (Odocoileus virginianus), provavelmente porque atuam como barreiras à dispersão e ao fluxo gênico para esta espécie (Blanchong et al. 2008). Da mesma forma, grandes rios dificultam o fluxo gênico em guaxinins (Procyon lotor) e pode reduzir a propagação da variante da raiva do guaxinim (RRV Cullingham et al. 2009). As operações de controle que visam conter e eventualmente erradicar uma determinada doença são, portanto, provavelmente mais eficientes se posicionadas ao lado dessas barreiras para fortalecer seu efeito (Russell et al. 2006). Essa estratégia foi adotada e evitou a disseminação da RRV para o norte em Ontário (Canadá), em 1999 (Rosatte et al. 2001). A distribuição de iscas de vacinas orais ao longo dos principais rios para controlar a raiva foi realizada já na década de 1980 para raposas vermelhas (Vulpes vulpes), eventualmente contribuindo para a eliminação da raiva na Suíça (Wandeler et al. 1988).

Nem todas as barreiras ambientais para a dispersão do hospedeiro e disseminação de patógenos, sejam naturais ou de origem antropogênica, são espacialmente discretas ou facilmente identificáveis, como rios e estradas, mas podem ser contínuas ou seguir um gradiente de condições bióticas ou abióticas (Storfer et al. 2007). Clima (Geffen et al. 2004), elevação (Shirk et al. 2010) e presença de habitats inadequados (Goldberg e Waits 2010) são todos exemplos de tais condições limitantes. Com base na ecologia, comportamento e capacidade de dispersão das espécies hospedeiras, essas características podem restringir a dispersão do patógeno ou promovê-la por meio de corredores de dispersão. A integração de características ambientais em modelos de disseminação de doenças pode ajudar a prever a disseminação e expansão geográfica de uma doença (Ostfeld et al. 2005).

Diferentes abordagens estão disponíveis para entender os efeitos da composição do habitat no movimento e dispersão dos animais. O primeiro depende da captura de animais para determinar sua seleção de recursos e densidade (Manly et al. 2002), o que requer tempo e recursos importantes para reunir grandes tamanhos de amostra. Estudos também foram conduzidos usando transmissores de frequência muito alta (VHF) e, mais recentemente, radiotelemetria do sistema de posicionamento global (GPS) para rastrear o movimento dos animais e analisar o uso do habitat (Cagnacci et al. 2010). Apesar das constantes melhorias tecnológicas, a coleta de grandes conjuntos de dados GPS continua sendo muito cara e um desafio logístico para várias espécies. Simulações espaciais também podem ser usadas para caracterizar fatores que afetam o movimento e a conectividade entre os indivíduos em uma população (Russell et al. 2006 Rees et al. 2013). Embora esses modelos possam trazer percepções sobre as ligações entre habitat e dispersão, a qualidade dos resultados do modelo dependerá de uma caracterização apropriada dos processos ecológicos, que só podem ser obtidos por meio de avaliação empírica. Finalmente, outra abordagem depende de ferramentas fornecidas pela genética da paisagem, uma disciplina que integra aspectos da genética de populações, ecologia da paisagem e análise espacial. Este campo progrediu tremendamente nos últimos 10 anos (Manel e Holderegger 2013). Normalmente, os geneticistas de paisagem estão interessados ​​em descrever como o fluxo gênico entre populações ou subpopulações é influenciado em paisagens frequentemente heterogêneas e fragmentadas, levando a estimativas de conectividade funcional (Manel e Holderegger 2013). No entanto, medir o fluxo gênico entre grupos de indivíduos impõe limitações na interpretabilidade dos resultados em termos de conectividade funcional porque (i) pode haver discrepâncias importantes entre o fluxo gênico e a dispersão ecológica, ou seja, o movimento entre fragmentos de habitat pode não estar necessariamente associado a oportunidades de acasalamento (Garant et al. 2007) e (ii) o fluxo gênico medido entre as populações reflete a migração que ocorreu por várias gerações no passado e pode não refletir com precisão os processos ecológicos atuais (Epps et al. 2007), incluindo o sexo diferenças específicas. Idealmente, a unidade operacional na genética da paisagem deve ser o indivíduo (Manel et al. 2003), caso em que estimativas de parentesco genético podem ser usadas como a variável de resposta para modelar a conectividade da paisagem de acordo com as características do habitat (Segelbacher et al. 2010 Etherington 2011 Shafer et al. 2012).

A raiva é enzoótica para muitas espécies de morcegos e carnívoros em todo o mundo e tem um período médio de incubação relativamente longo (entre 30 e 90 dias) em comparação com um curto período de morbidade (2 & # x0201310 dias) que quase sempre leva à morte (Leung et al. 2007). No leste da América do Norte, a cepa de raiva terrestre predominante é a RRV, que se espalhou em populações selvagens de guaxinins e gambás listrados (Mefite mefite, doravante gambás, Guerra et al. 2003). Esta variante da raiva foi historicamente restrita à Flórida, mas guaxinins infectados foram inadvertidamente transferidos para a Virgínia no final dos anos 1970 e o vírus desde então se expandiu para o norte a uma taxa de 30 & # x0201350 km / ano (Rupprecht et al. 2002). No Canadá, foi detectado pela primeira vez no sul de Ontário em 1999 (Rosatte et al. 2001), depois em New Brunswick em 2000 e finalmente em Qu & # x000e9bec em 2006 (Rees et al. 2011). Aqui, usamos estimativas de parentesco genético derivadas de genótipos de microssatélites multilocus para determinar quais características da paisagem promoveram ou limitaram a dispersão dos dois principais hospedeiros de RRV em uma área intensamente estudada do sul de Qu & # x000e9bec onde esta doença viral ainda está sob vigilância, controle e atividades de pesquisa (Boyer et al. 2011 Houle et al. 2011 Rees et al. 2011 C & # x000f4t & # x000e9 et al. 2012 Mainguy et al. 2012 Talbot et al. 2012).

Trabalhos anteriores na área de estudo (sudeste de Qu & # x000e9bec) mostraram muito pouca estruturação genética em guaxinins e gambás residentes, com rodovias e rios geralmente gerando um efeito bastante fraco nos padrões de diferenciação genética (C & # x000f4t & # x000e9 et al. 2012 Talbot et al. 2012). Esses resultados ambíguos podem ocultar o efeito de variáveis ​​espaciais não medidas e não permitem modelar a dispersão de mesocarnívoros na escala da paisagem. Nosso principal objetivo aqui foi construir sobre os resultados genéticos populacionais obtidos no trabalho anterior, usando uma abordagem que aplica análises genéticas de paisagem e modelos espacialmente explícitos, para prever as vias mais prováveis ​​de dispersão de gambás e guaxinins e, por extensão, disseminação da raiva terrestre nesta área. Com base no conhecimento ecológico do uso do habitat por esses dois hospedeiros, esperávamos que a dispersão em ambas as espécies fosse reduzida em campos agrícolas, mas esperávamos que o movimento aumentasse em habitats caracterizados por uma alta densidade de bordas (por exemplo, Glueck et al. 1988 Dijak e Thompson 2000 Larivi & # x000e8re e Messier 2000). Esperávamos que os gambás fossem mais sensíveis à presença de campos e áreas residenciais do que os guaxinins, já que os guaxinins normalmente mostram uma maior afinidade para a dispersão e usam campos de milho e outras fontes de alimento relacionadas com o homem (Riley et al. 1998 Prange et al. 2004). Também esperávamos que as fêmeas fossem mais sensíveis à estrutura da paisagem do que os machos em ambas as espécies, já que a dispersão costuma ser tendenciosa para os machos em mamíferos em geral (Greenwood 1980), incluindo guaxinins e gambás (Cullingham et al. 2008 C & # x000f4t & # x000e9 et al . 2012 Talbot et al. 2012). Até onde sabemos, este é o primeiro trabalho empírico que aborda o movimento desses dois importantes hospedeiros da raiva em uma estrutura genética de paisagem espacialmente explícita e também a primeira tentativa de quantificar o efeito da composição do habitat em sua dispersão. Esse trabalho é importante para refinar modelos preditivos de propagação da raiva que usam rios (ou outras barreiras discretas, como cadeias de montanhas) e índices de densidade humana para prever a taxa de propagação da raiva (por exemplo, Smith et al. 2002 Russell et al. 2005, 2006 )


CRISPR-Cas9: Institut Curie é equipado com tesouras genéticas para triagem

O CRISPR-Cas9 funciona como uma tesoura capaz de cortar o genoma com precisão. Esta tecnologia é baseada em um complexo composto por um pequeno RNA denominado & # 8220guide & # 8221 e a nuclease Cas9. O complexo assim formado liga-se a uma sequência específica de DNA, complementar ao RNA guia. Esta ligação é seguida por um corte de fita dupla do DNA por Cas9. Os mecanismos de reparo do DNA podem ser subsequentemente usados ​​para introduzir mutações precisas. Desta forma, os pesquisadores podem manipular o DNA para suprimir a função de um gene ou substituí-lo por um gene modificado (o chamado método de & # 8220 recombinação homóloga & # 8221).

CRISPR-Cas9, uma nova tecnologia? O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) existe há milhões de anos. As bactérias o utilizam como mecanismo de defesa imunológica adaptativa contra vírus. A metodologia é simples e extremamente eficaz: ao entrar na bactéria, o genoma viral é reconhecido por este sistema de memória imunológica dedicado. As bactérias então destroem o genoma de seu inimigo, cortando-o.

O uso de nucleases programáveis ​​para fins de modificação do genoma está em andamento há cerca de 12 anos em laboratórios. No entanto, as nucleases de primeira geração eram muito complexas de implementar. CRISPR-Cas9 é revolucionário em sua facilidade de programação, velocidade de execução e menor custo em comparação com outras nucleases. A alta flexibilidade do sistema CRISPR-Cas9 torna possível a realização de experimentos de triagem genética. Essa metodologia envolve a mutação de todos os genes conhecidos em uma população de células, cada célula carregando uma única mutação. Assim, é possível determinar quais genes estão envolvidos em um processo biológico de interesse (crescimento celular, resistência a tratamentos, etc.).

Uma nova plataforma de triagem genética baseada em CRISPR-Cas9 acaba de ser criada no Institut Curie & # 8217s centro de pesquisa. A plataforma CRISPR & # 8217it gerou muito entusiasmo. & # 8221 Já estamos trabalhando com 15 equipes de pesquisa que abrangem vários tópicos & # 8220, disse Camille Fouassier, o gerente da plataforma.

A evolução da tecnologia
A tecnologia CRISPR-Cas9 ainda apresenta limitações importantes. Ele só pode ser usado em determinados locais na sequência de DNA. E o complexo sgRNA / Cas9 pode cortar sequências que se assemelham à sequência alvo (os chamados & # 8216 off targets & # 8221). Além disso, o corte de DNA pode induzir um estado de estresse celular e, portanto, influenciar a análise dos fenótipos resultantes. Finalmente, o processo de reparo do DNA leva a tipos altamente variáveis ​​de mutações que nem sempre eliminam a função do gene.

Para superar essas limitações, os cientistas estão trabalhando em derivados do sistema CRISPR-Cas9. As abordagens alternativas em estudo incluem um spinoff mais preciso e menos tóxico que introduz substituições de DNA. Em particular, este método tem a capacidade de alterar um códon em um sinal de parada prematuro para a síntese de proteínas (códon & # 8220stop & # 8221).

Outros derivados aproveitam a oportunidade oferecida pelo sistema CRISPR-Cas9 para atingir uma sequência de DNA de interesse. Em vez de usar a atividade de nuclease CAS9 para editar a sequência de DNA, o recrutamento CAS9 local pode ser usado para modular os processos biológicos subjacentes. Por exemplo, é possível aumentar ou diminuir a expressão gênica ou modificar localmente a composição química do DNA ou das proteínas histonas a ele associadas. Essas mudanças químicas, por sua vez, influenciam diferentes processos biológicos, como reparo de DNA ou expressão gênica.

Aplicações do CRISPR-Cas9 no Institut Curie
As aplicações em pesquisa são imensas, já que os biólogos agora têm a capacidade de introduzir todos os tipos de modificações genéticas em células ou organismos modelo. Em apenas alguns anos, o CRISPR-Cas9 se tornou uma ferramenta central em muitos programas de pesquisa.

Em particular, o rastreamento genético por CRISPR-Cas9 representa um recurso chave para a pesquisa do câncer. Por exemplo, é possível resolver o problema da resistência aos tratamentos antitumorais. A triagem genética pode ser usada para identificar genes cuja mutação torna as células resistentes a uma molécula terapêutica. A tecnologia também é usada para identificar o calcanhar de Aquiles de cada tipo de câncer por meio de uma abordagem de letalidade sintética. Esta última estratégia é baseada na suposição de que as mutações que causam câncer criam novas vulnerabilidades que podem ser usadas para matar células cancerosas. Embora a triagem CRISPR-Cas9 seja mais frequentemente implantada em em vitro sistemas de cultura de células, a ambição da nova plataforma é trabalhar o mais próximo possível do ambiente natural do tumor. Em particular, sistemas de cultura 3D (conhecidos como organoides), que recriam em vitro parte das propriedades arquitetônicas dos tumores, representam sistemas de modelos atraentes. Uma abordagem também sob investigação é o uso de telas genéticas em xenoenxertos derivados de pacientes, que atualmente representam os melhores modelos de câncer para estudos pré-clínicos.

Outra aplicação da tecnologia é o estudo de mutações recorrentes encontradas no câncer. Essas mutações podem levar a um aumento da atividade de proteínas oncogênicas ou, inversamente, a uma perda da função de proteínas que inibem o desenvolvimento do tumor. No entanto, ainda não compreendemos a função da maioria dos genes mutantes no câncer. & # 8221 Ao reintroduzir essas anormalidades genéticas em linhas celulares graças ao CRISPR-Cas9, os pesquisadores são capazes de avaliar seu impacto no desenvolvimento do tumor & # 8221, disse Michel Wassef, científico co-diretor da plataforma.

Os pedidos de imunoterapia também estão em desenvolvimento. Os linfócitos T retirados de pacientes são geneticamente modificados para expressar um receptor quimérico programado para reconhecer um marcador tumoral (células T CAR) e, assim, destruir as células doentes.


Resultados

Análise de espaço químico

Inicialmente, um limite de atividade de 1 μM com base na metade da concentração efetiva máxima (CE50) contra P. falciparum foi definido para a discriminação entre compostos ativos e inativos previamente testados contra estágios assexuados de sangue de P. falciparum. Além disso, um limite de 10 μM com base na metade da concentração citotóxica máxima (CC50) para as células NIH / 3T3 foi definido para discriminação entre compostos tóxicos e não tóxicos [42]. A análise do espaço químico foi realizada usando os conjuntos de dados curados (ver Materiais e Métodos) para estágios eritrocíticos de P. falciparum Conjunto de dados da cepa 3D7 (sensível à cloroquina) contendo 1.162 compostos (P. falciparum conjunto de dados) e conjunto de dados de citotoxicidade testado contra fibroblastos embrionários de camundongo (linha celular NIH / 3T3) contendo 1.270 compostos (conjunto de dados de citotoxicidade). Esta análise foi realizada agrupando os dois conjuntos de dados separadamente, o que revelou que ambos são estruturalmente diferentes, contendo agrupamentos menores de compostos semelhantes (Fig. 2).

Análise de agrupamento de A) 1.162 compostos de P. falciparum conjunto de dados e B) 1.270 compostos do conjunto de dados de citotoxicidade. O dendrograma e o mapa de calor da matriz de distância são coloridos de acordo com a semelhança estrutural (laranja / vermelho = azul / violeta semelhante = diferente). Os rótulos dos eixos xey do mapa de calor representam compostos.

O gráfico foi obtido usando coordenadas baricêntricas de descritores RDKit 2D mostrando compostos ativos (pontos azuis) e inativos (diamantes negros) de P. falciparum conjunto de dados e tóxico (estrelas vermelhas) e não tóxico (triângulos verdes) do conjunto de dados de citotoxicidade.

Embora os conjuntos de dados sejam estruturalmente diversos, eles compartilham as mesmas regiões do espaço químico. Ao analisar o espaço químico de ambos os conjuntos de dados juntos, protegendo as coordenadas barcentricas bidimensionais [43] (Fig 3, consulte Materiais e Métodos para obter detalhes), pode-se ver que a maioria dos compostos ativos e inativos de P. falciparum o conjunto de dados se sobrepõe nas mesmas regiões do espaço químico de compostos tóxicos e não tóxicos do conjunto de dados de citotoxicidade. Esta análise revela que vários compostos ativos contra P. falciparum no estágio eritrocítico são potencialmente tóxicos em fibroblastos embrionários de camundongo. Por esta razão, desenvolvemos modelos computacionais preditivos para ambas as propriedades biológicas, a fim de selecionar apenas os compostos previstos como ativos para P. falciparum e não tóxico para células de mamíferos.

Desempenho de modelos binários QSAR

Modelos binários QSAR foram construídos para distinguir vs. compostos inativos para P. falciparum e tóxico vs. compostos não tóxicos para células NIH / 3T3. De acordo com os resultados estatísticos de um procedimento de validação cruzada externa de 5 vezes (consulte Materiais e Métodos), a combinação das impressões digitais Morgan e FeatMorgan (raio 2: FeatMorgan_2, Morgan_2 raio 4: FeatMorgan_4, Morgan_4) com aprendizagem profunda (consulte Materiais e Métodos para detalhes) levaram a modelos binários preditivos QSAR. As características estatísticas dos modelos QSAR desenvolvidos estimados por validação cruzada externa de 5 vezes são relatadas na Tabela 1. Resumidamente, os valores da taxa de classificação correta (CCR) variaram entre 0,82–0,87 sensibilidade (SE) - 0,82–0,87 especificidade (SP) - 0,82 –0,87 e uma cobertura– 0,77–0,87. A Tabela 1 mostra os desempenhos detalhados dos modelos binários QSAR. O modelo construído usando Morgan_2 demonstrou o melhor desempenho entre todos os outros modelos desenvolvidos para P. falciparum (CCR = 0,84 SE = 0,82 SP = 0,86 e PPV = 0,86). Por outro lado, o melhor modelo desenvolvido para predição de citotoxicidade para fibroblastos de mamíferos foi construído usando FeatMorgan_4 (CCR = 0,87 SE = 0,87 e SP = 0,87).

Desempenho de modelos QSAR contínuos

Desenvolvemos modelos QSAR contínuos com o objetivo de prever unidades logarítmicas negativas de CE50 valores (pEC50) contra P. falciparum e CC50 valores (pCC50) contra a linha celular NIH / 3T3. De acordo com os resultados estatísticos de um procedimento de validação cruzada externa de 5 vezes, a combinação das impressões digitais Morgan e FeatMorgan (raio 2: FeatMorgan_2, Morgan_2) com aprendizado profundo levou a modelos estatisticamente preditivos (Tabela 2), com coeficiente de correlação quadrático preditivo para os valores do conjunto de teste () variam entre 0,70–0,88, erro quadrático médio da raiz da validação cruzada (RMSECV) de 0,44–0,55, erro absoluto médio (MAE) de 0,31–0,43 e cobertura de 0,79–0,81. O modelo construído usando Morgan_2 demonstrou o melhor desempenho entre todos os outros modelos desenvolvidos para P. falciparum (= 0,88, RMSECV = 0,49 e MAE = 0,43). Por outro lado, o melhor modelo desenvolvido para predição de citotoxicidade para fibroblastos de mamíferos foi construído usando FeatMorgan_2 (= 0,74, RMSECV = 0,44 e MAE = 0,31).

Interpretação do modelo

Para fornecer uma interpretação mecanicista e lançar alguma luz dos dados estruturais e biológicos usados ​​para construir os modelos QSAR contínuos, traçamos a importância do recurso previsto (impressão digital) para visualizar como os fragmentos contribuíram para a atividade antiplasmódica e a citotoxicidade (Fig. 4 e S1 FIG). De acordo com nossos resultados, átomos ou fragmentos que promovem contribuição positiva para a atividade antiplasmódica são destacados em vermelho, enquanto as frações estruturais que diminuem a atividade são destacadas em verde.

Compostos testados experimentalmente no ensaio de P. falciparum, extraídos da literatura e usados ​​para construir / validar nossos modelos. Os fragmentos que aumentam a atividade são coloridos em porções estruturais vermelhas, diminuindo a atividade, são destacados em verde. Os fragmentos indiferentes não são destacados. pEC50 exp = pEC50 pEC experimental50 pred = pEC50 previsto.

Ao analisar os mapas de contribuição gerados para o P. falciparum conjunto de dados, identificamos seis fragmentos principais com contribuição favorável para a atividade antiplasmódica. Exemplos de fragmentos favoráveis ​​são os seguintes: 1,2,4,5-tetraoxaspiro [5.5] undecano 7-cloroquinolina 2,5-dimetilhexa-1,5-dieno piridin-2-amina 1,4-dihidroquinolin-4-ona e 1,3,5-triazina-2,4,6-triamina. Também identificamos seis fragmentos com contribuição desfavorável para a atividade antiplasmódica, tais como: 1,2-dimetil-1,4-dihidropiridin-4-ona 2-metilfurano 5-guanidina N-etilpropanamida 2,6-dimetilhepta-1,5-dieno e 4H-pirido [1,2-a] pirimidin-4-ona. Além disso, também calculamos a influência prevista de fragmentos estruturais na citotoxicidade. Uma lista resumida de átomos ou fragmentos com contribuição favorável e desfavorável para citotoxicidade em fibroblastos de mamíferos está disponível na Fig. S1. As informações estruturais e biológicas fornecidas pelos modelos QSAR desenvolvidos usando aprendizado profundo podem ser úteis para projetar ou otimizar compostos antiplasmodiais potentes e seletivos por substituindo fragmentos desfavoráveis ​​por fragmentos favoráveis, assumindo verdadeira independência dos efeitos físico-químicos.

Triagem virtual

A triagem virtual (VS) foi realizada seguindo o fluxo de trabalho apresentado na Fig 5. Inicialmente, 486.115 compostos disponíveis na coleção EXPRESS-Pick do ChemBridge foram baixados e padronizados para VS. Em seguida, filtros de semelhança de drogas (regras de Veber [44] e Lipinski [45]) foram aplicados para priorizar moléculas com boa biodisponibilidade oral, para garantir que o composto tenha propriedades básicas de drogas ativas. Em paralelo, a ferramenta de agregação coloidal foi usada para filtrar moléculas que são conhecidas por agregar em ensaios experimentais [46,47]. Após essas etapas, 72.260 compostos foram excluídos. Posteriormente, os demais compostos foram submetidos a modelos conservadores binários e contínuos QSAR para predição da atividade contra estágios sanguíneos de P. falciparum e citotoxicidade contra células de mamíferos. A seleção final de compostos candidatos pode ser resumida da seguinte forma: (i) os compostos previstos como ativos e não citotóxicos pelos modelos binários QSAR (ii) compostos com pEC50 ≥6.00 (eu.e., EC50 ≤1 μM para P. falciparum) e pCC50 & lt5,00 (eu.e., CC50 & gt10 μM para células de mamíferos) previsto pelos modelos QSAR contínuos (iii) e compostos dentro do domínio de aplicabilidade (AD) dos modelos QSAR. A combinação de modelos QSAR binários e contínuos foi implementada para aumentar as taxas de sucesso na campanha de triagem virtual. Além disso, o AD foi determinado a fim de definir previsões “confiáveis” e “não confiáveis” [48,49]. As previsões foram consideradas confiáveis ​​quando estavam dentro do espaço químico usado para treinar os modelos. Finalmente, realizamos uma análise de similaridade química para selecionar um subconjunto de compostos estruturalmente diversos. Ao final desse processo, cinco compostos candidatos foram selecionados para avaliação biológica (Fig. 6).

As regras de Veber e Lipinski foram usadas para priorizar compostos candidatos com boa biodisponibilidade oral, para garantir que o composto tenha propriedades básicas de drogas ativas. A ferramenta de agregação coloidal foi usada para filtrar moléculas que são conhecidas por agregar em ensaios experimentais, análises de similaridade química e inspeção visual foram realizada para selecionar um subconjunto de compostos candidatos estruturalmente diversos.

Os átomos ou fragmentos que promovem a contribuição positiva para a atividade antiplasmódica são destacados em vermelho.

Validação experimental

Os cinco compostos candidatos foram avaliados em vitro contra estágios de sangue assexuado de P. falciparum sensíveis (3D7) e cepas multirresistentes (W2). A CE50 para cada composto (Tabela 3) indicam que dois compostos, 2- (4,6-difenil-1,2-di-hidro-1,3,5-triazin-2-il) fenol (LabMol-149), 4-ácido benzóico (LabMol-151) e N2- (3-fluorofenil) -N4 - [(oxolan-2-il) metil] quinazolina-2,4-diamina (LabMol-152), foram potentes na inibição do crescimento do parasita, mostrando atividades na faixa submicromolar e nanomolar baixa contra as cepas 3D7 e W2. Além disso, o composto LabMol-152 (EC50 = 0,049 μM e 0,078 μM para 3D7 e W2, respectivamente) mostraram eficácia na mesma faixa de atividade dos medicamentos de referência, cloroquina (CE50 = 0,011 μM) e pirimetamina (EC50 = 0,037 μM). Os compostos candidatos também foram avaliados quanto à sua citotoxicidade contra linhas de células semelhantes a fibroblastos derivadas de rim de macaco (células COS-7). Com relação à seletividade, LabMol-149 e LabMol-152 mostraram os resultados mais promissores (índice de seletividade, SI, variando entre 71,4–340,8, Tabela 3).


Todos os modelos são criados iguais

Por Ronald Hammond, PhD
Gerente de Produto, Fisiologia e Segurança de Laboratório


Os modelos estão entre os itens mais tradicionais e úteis em uma caixa de ferramentas do educador de ciências. Quer o objeto de estudo seja a morfologia foliar, zoologia de invertebrados, biologia geral ou anatomia humana, os modelos são o complemento perfeito para textos e diagramas. Eles permitem que os alunos examinem, em perspectiva tridimensional, os melhores detalhes estruturais de um organismo ou seus componentes.

Em muitos casos, os modelos podem ser desmontados de maneira semelhante à realização de uma dissecção. Como complemento da dissecção, os modelos são uma excelente ferramenta de referência para a identificação de estruturas pequenas e indistintas. Com o cuidadoso planejamento e execução da escultura mestra (da qual o molde é feito), os modelos de alta qualidade exibem o número máximo de estruturas anatômicas.

Modelos de anatomia humana

Nenhuma disciplina da ciência depende mais do uso de modelos do que a anatomia e a fisiologia humanas. Preserved human tissues are not readily available for educational purposes and, when they are, the condition of the specimens is usually not satisfactory to show detailed morphology. Many structures, such as the components of the middle and inner ear, are much too small for convenient study from natural specimens.

A thorough knowledge of the structure of cells and tissues is an absolute prerequisite for an understanding of the physiology, or function, of the various organ systems. An enlarged model is an indispensable teaching aid in such instances.

A complete human figure or torso model with head is actually a collection of models of individual organs, many of which can be separated and even opened for internal inspection. A human torso model of high quality is a valuable acquisition for any anatomy classroom. Generally, those with the largest number of removable components have the greatest teaching value.

Care of models

  1. Photocopy the identification key that accompanies each model and store the original key in a safe place.
  2. To avoid fading and deterioration of models, keep them in a reasonably cool area away from direct sunlight. Drape them with untreated cloth to prevent the accumulation of dirt and dust.
  3. Gently clean your models with a soft cloth and warm, soapy water to restore the surface without damaging the finish. Never use abrasives and solvents.
  • Molded from durable materials that guarantee long life and resistance to breakage
  • Painted with nontoxic, acrylic formulations bonded securely to the substrate to last the life of the model
  • Crafted carefully by a skilled artisan to assure that every minute detail is represented correctly
  • Mounted on attractive, reinforced display bases
  • Complete with identification keys
  • Backed by the unconditional Carolina guarantee

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Explanatory pluralism and integration

Above I have argued that, from a pragmatic point of view, psychopathological research should embrace research at multiple levels. In other words, if the aim is to make progress in treating and understanding mental disorder, explanatory pluralism is preferable to explanatory reductionism. Explanatory pluralism in psychopathology has been defended by many authors (e.g. Kendler, Reference Kendler 2005 Miller, Reference Miller 2010 Borsboom et al., Reference Borsboom, Cramer and Kalis 2019), and it is also inherent in the biopsychosocial model that has been influential in psychiatry at least since the 1970s and is still widely taught to students (Pilgrim, Reference Pilgrim 2002 Frisch, Reference Frisch 2016).

However, the basic idea that explanations need to be looked for at multiple levels is compatible with many different scenarios of how such multilevel research will actually play out (Marchionni, Reference Marchionni 2008 Sullivan, Reference Sullivan, Kincaid and Sullivan 2014, Reference Sullivan 2017 Gijsbers, Reference Gijsbers 2016 Love, Reference Love, Massimi, Romeijn and Schurz 2017). Most importantly, pluralism can lead to (1) a patchwork of explanations at different levels, or (2) integration of explanations at different levels. In the first scenario, the different perspectives or different levels that are needed for fully explaining psychopathology cannot be combined to one grand multilevel explanation, but are somehow incompatible or incongruent. In the second scenario, the different perspectives and different levels are compatible and complement each other in such a way that they can be combined to one grand harmonious multilevel explanation. These two scenarios should be seen as the extreme ends of a continuum, as the success of integration is not a yes-or-no thing but a matter of degree.

Most philosophers, researchers, and clinicians would probably agree that something like the integrative scenario is the more preferable and attractive alternative. Many authors have also explicitly advocated integrative pluralism for psychopathology (e.g. Kendler, Reference Kendler 2005 Mitchell, Reference Mitchell, Kendler and Parnas 2008 Miller, Reference Miller 2010). However, what has received less attention is how integration would work in practice, and what are the challenges and hurdles that hold back integration. In this section, I will focus on these questions, drawing from recent philosophy of biology where these issues have been more extensively discussed.

First of all, an important feature of integration that is often forgotten in theoretical discussions, also in psychopathology, is that it is case-specific. Philosophers and researchers often search for a general answer to the question of reduction and integration, arguing for example that mental disorders can be explained based on brain circuits, or that psychological explanations are always indispensable. In contrast, the degree to which multiple disciplines and levels are needed, and the degree to which the different perspectives can be integrated, can both vary from disorder to disorder (or even from symptom to symptom). The phenomenon that is studied or the problem that needs to be solved (the ‘problem agenda’, Love, Reference Love 2008) determines what fields and what levels are needed (Love, Reference Love 2008 Brigandt, Reference Brigandt 2010). For example, it is plausible that there will be satisfactory low-level biological explanations for disorders such as dementia, but that such explanations will be insufficient for depression or posttraumatic stress disorder (PTSD). Similarly, the integration of explanations or models of different levels might work out well and lead to new insights in one context, but face profound obstacles in another context (see below). In other words, accounts of pluralism and integration in psychopathology should not be overgeneralized, but should be case-specific and sensitive to the scientific details of each case.

Another crucial point is that integration should be seen as an active and dynamic process, and not just as the final goal or end result of pursuing research at different levels. As O'Malley and Soyer ( Reference O'Malley and Soyer 2012) show in the context of systems biology, integration has often led to new insights, or even to the emergence of new and flourishing research fields. They also emphasize that integration does not occur just by combining explanations or theories of different levels, but often involves importing and translating data and models of one discipline to another. For example, in the recently emerged field of evolutionary systems biology, insights and data from evolutionary biology are imported into the cellular and molecular models of systems biology (O'Malley and Soyer, Reference O'Malley and Soyer 2012). One recent example of this in psychopathology is the Ising model. This model represents a network of binary variables that interact with their neighbors, and was originally introduced in the 1920s to model the behavior of magnetic particles. However, it turns out that the same model can also be used to describe neural networks (Yuste, Reference Yuste 2015), and more recently, the Ising model has been shown to be mathematically equivalent to Item Response Theory models and binary symptom network models in psychology (Van Borkulo et al., Reference Van Borkulo, Borsboom, Epskamp, Blanken, Boschloo, Schoevers and Waldorp 2014 Kruis and Maris, Reference Kruis and Maris 2016 Marsman et al., Reference Marsman, Borsboom, Kruis, Epskamp, van Bork, Waldorp, Maas and Maris 2018). The fact that integrative multilevel research has been so fruitful in other fields should provide a strong incentive for pursuing such research in psychopathology as well.

However, although it is clear that there is much to be gained from integrating methods, data, and perspectives of different levels, there are several obstacles to such integration in psychopathology. First of all, in the biological sciences integration often occurs through the elaboration of multilevel mechanisms through constraints (Bechtel and Richardson, Reference Bechtel and Richardson 1993 Craver and Darden, Reference Craver and Darden 2013). The idea is that different fields impose different constraints on what the explanatory mechanism for a phenomenon could be, and in this way the space of possible mechanisms is narrowed down. Often researchers start with a sketch of a mechanism, and as more evidence is gathered, this sketch can be refined and black boxes are filled in. This can involve many different disciplines and perspectives. For example, the discovery and refinement of the model of protein synthesis in the 1950 and 1960s involved integrating knowledge from biochemistry (e.g. chemical reactions involving amino acids) and molecular biology, resulting in constraints on how the mechanism of protein synthesis could look like. Eventually these constraints and inputs from multiple fields resulted in the DNA–RNA theory of protein synthesis.

One obstacle to this kind of integration is the incommensurability of levels discussed in section 2. The part-whole hierarchies in psychology are different from the (mechanistic) part-whole hierarchies in biology, and it is not clear how the two can be integrated. Thus, the mechanistic picture needs to be complemented with an account of how psychological states can be integrated into mechanistic explanations. So far, this has been only done in the context of computational or functional states in psychology (e.g. Piccinini and Craver, Reference Piccinini and Craver 2011 Thomas and Sharp, Reference Thomas and Sharp 2019), but it is not clear how this kind of integration would work for phenomena such as affect states, beliefs, and symptoms. Such integration is also challenged by the fact that psychological processes often unfold and interact at different time scales than biological processes (section 2). Integrating models and explanations that pertain to different time scales are not impossible, but currently there is little understanding on how it should be done.

A more general problem for integration in psychopathology is descriptive complexity: different conceptual frameworks often do not carve phenomena in the same way, but result in mismatching and conflicting categorizations (Wimsatt, Reference Wimsatt, Schaffner and Cohen 1972 Sullivan, Reference Sullivan, Kincaid and Sullivan 2014, Reference Sullivan 2017 Tabb and Schaffner, Reference Tabb, Schaffner, Kendler and Parnas 2017). This can be vividly seen in schizophrenia research. As Sullivan ( Reference Sullivan, Kincaid and Sullivan 2014) points out, the cognitive deficits that are important to schizophrenia are studied both in cognitive neuroscience and in cognitive neurobiology, but from different perspectives. In cognitive neuroscience, the aim is to probe specific cognitive functions and to localize them in the brain with neuroimaging techniques. In cognitive neurobiology, the cognitive deficits underlying schizophrenia are studied through animal models (e.g. rats). In such experiments, the aim is to discover differences in the behavior of rats, which are taken to indicate a cognitive deficit, but no mapping to specific human cognitive functions is made. Thus, even though the same phenomenon is nominally being targeted, it is conceptualized in different ways. More generally, Tabb and Schaffner ( Reference Tabb, Schaffner, Kendler and Parnas 2017) point out that different state-of-the-art models of schizophrenia that focus on different levels do not even agree on what are the defining features or key symptoms of schizophrenia.

Issues like this abound in psychopathology. For example, fear extinction is studied in neurobiology with rodents based on freezing behavior after a foot shock. In humans, fear extinction is measured with more complex stimuli, and typically with skin conductance responses as the dependent variable (Lonsdorf et al., Reference Lonsdorf, Menz, Andreatta, Fullana, Golkar, Haaker and Drexler 2017). Recently doubts have been raised regarding this translation, as it is far from clear that the setups are measuring the same phenomena (Lonsdorf et al., Reference Lonsdorf, Merz and Fullana 2019 see also Glas, Reference Glas 2004 Khalidi, Reference Khalidi 2005). In psychopathology, descriptive complexity seems to be the rule rather than the exception.

However, this does not mean that there is no hope for integration. In biology, there are many success stories of integrating fields that seem to conceptualize phenomena in different ways (e.g. in the context of systems biology mentioned above O'Malley and Soyer, Reference O'Malley and Soyer 2012). Also in psychopathology, concentrated interdisciplinary efforts, involving both scientists from different fields and philosophers of science, can help to aligning concepts and models of different fields in the context of a specific problem or phenomenon (see also Love, Reference Love 2008 Sullivan, Reference Sullivan 2017 Laplane et al., Reference Laplane, Mantovani, Adolphs, Chang, Mantovani, McFall-Ngai and Pradeu 2019).


Financiamento

The authors would like to thank Brazilian funding agencies, CNPq, FAPEG, FAPESP, and CAPES for financial support and fellowships. FC, GC, and CA were supported by FAPESP (Grants #2012/16525-2, #2015/20774-6, and #2017/02353-9, respectively). DB was supported by FAPESP (Grant #2013/13119-6) and CNPq (Grant #405996/2016-0). JC was supported by FAPESP fellowship (#2016/16649-4). EM appreciates support from NIH (Grant 1U01CA207160 and GM5105946) and CNPq (Grant #400760/2014-2). CA, PC, and FC are CNPq research fellows. PC was partially supported by the Fundação Nacional de Desenvolvimento do Ensino Superior Particular – Funadesp, via UniEvangélica – Centro Universitário de Anápolis.


Métodos

We recently sequenced five additional SAR11 genomes from three phylogenetically distinct clades, corresponding to the subgroups Ia, III and a new, distantly related subgroup (Group V) 46 (Figs. 6 & 7), which were annotated consistently with others used in this study by IMG 47 (http://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/m/main.cgi). We made exclusive use of publicly available bacterial genome sequences from the IMG database to control for gene-calling methodological differences across databases. The 127 taxa used in the whole alphaproteobacterial dataset (Table S1) were a subset of the total available sequences chosen to represent all sequenced genera. Given that some species are highly overrepresented in the database, we omitted several taxa from these overrepresented groups. Datasets with mitochondrial sequences included most available genome sequences from the respective Alphaproteobacteria orders (Table S2). Mitochondrial sequences (Table S3) were obtained from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The sequences were analyzed using Hal, an automated pipeline for phylogenetic analysis of genomic protein sequence data.

The Hal pipeline 23,48 (http://aftol.org/pages/Halweb3.htm http://sourceforge.net/projects/bio-hal/) consists of a set of Perl scripts that automates a series of phylogenomic analyses using existing software and sequence analysis programs and was executed on a 64-bit Linux cluster operating Red Hat Linux 3.2.3, Linux version 2.4.21. For this study, the Hal pipeline directed the following analyses: Protein sequences were imported in fasta format from sequenced genomes listed in Table S1–3 and subjected to an all-vs-all BLASTP with the output E-values provided to the program MCL 49 . Using a Markov Clustering algorithm, MCL grouped proteins into orthologous clusters (OCs) as function of the all-vs-all BLASTP E-values. Clustering was executed across a range of stringencies (inflation parameters 1.1 – 5.0) and OCs were filtered for any redundant clusters (clusters found at more than one inflation parameter), clusters containing more than one protein per genome (multi-copy OC) and clusters containing proteins whose best reciprocal BLAST hit was outside of the cluster (clusters more likely to contain paralogs). Clusters were also filtered across a range of missing values settings (10–60%) whereby a cluster may contain only one protein per genome but a defined percentage of the genomes may be missing from the cluster. This function allows for the incorporation for more single-copy clusters when such proteins are either missing from a given genome or missing from a genome annotation.

Protein sequences for accepted OCs were extracted from their respective genome fasta sequence files and aligned using MUSCLE 50 with default settings. To accommodate for problematic regions of the alignments, three separate alignments were created for each protein alignment: one removing all gap-containing columns (remgaps) and two removing problematic regions of the alignments based on the default conservative (Glocks-con) and liberal (Gblocks-lib) options of the program GBlocks 51 . Best models of amino acid substitution for each protein alignment were estimated using ProtTest 52 . Individual protein alignments were concatenated into one super-alignment and analyzed using RAxML 53 with the PROTCAT setting for the rate model and with each protein partition of the super-alignment assigned its best model of amino acid substitution. Nodal support was estimated based on 100 bootstrap replications using the rapid bootstrapping option as implemented in RAxML. For each analysis, three phylogenetic trees were generated, representing the three super-alignments (remgaps, GBlocks-con and GBlocks-lib) produced as part of the automated alignment routine.


Assista o vídeo: Plasmodium falciparum gametocito y trofozoito (Dezembro 2021).