Em formação

Se os mamíferos evoluíram para serem noturnos, como nos tornamos tão rigidamente diurnos em tão pouco tempo?


Grande parte da saúde humana gira em torno de dormir bem durante a noite. Sabemos sobre os ritmos circadianos e da temperatura corporal que nos deixam com sono à noite, pico de produção de melatonina no meio da noite, fases do sono profundo, distúrbios do sono devido à luz à noite e altas taxas de câncer entre as pessoas que trabalham no turno da noite.

Claramente, fomos feitos para dormir à noite. Você poderia supor, então, que devemos ter evoluído para ser diurnos há muito tempo e descender de uma longa linhagem de animais diurnos.

No entanto, o legado evolutivo dos mamíferos é predominantemente noturno. Os mamíferos começaram como noturnos (para evitar os répteis) e a maioria dos mamíferos hoje ainda é noturna.

Como nos tornamos tão fortemente diurnos tão rapidamente?


O gargalo noturno para mamíferos, como é chamado, foi assumido até recentemente que só terminou com o evento de extinção do Cretáceo-Paleógeno, há 66 milhões de anos.

Na base da hipótese do gargalo noturno está a ideia de que os répteis ectotérmicos do Mesozóico (incluindo os dinossauros) seriam restritos à atividade diurna nos momentos em que o sol pode ajudar a aquecer seu corpo até as temperaturas operacionais ...

Os argumentos contra:

incluir:

  • (i) presença de proto-penas isolantes,

  • (ii) fósseis de dinossauros reprodutores em regiões frias

  • (iii) postura corporal elevada

  • (iv) estruturas ósseas fibrolamelares

  • (v) presença de estruturas ósseas turbulentas nasais

  • (vi) taxa de crescimento estável (depósitos de isótopos nos ossos e dentes)

  • (vii) possível 'homeotermia em massa' ou 'homeotermia inerte' em grandes dinossauros

  • (viii) a ocorrência de pequenos dinossauros em regiões frias

  • (ix) a existência de potenciais estruturas termorregulatórias externas em algumas espécies de dinossauros (por exemplo, placas ósseas dorsais em Stegosauria).

Análises moleculares recentes aumentaram a dúvida da teoria original:

Atualmente, acredita-se que os saurísquios tenham tido endotermia parcial, o que lhes permite incubar seus ovos e habitar regiões mais frias ...

De forma independente, a evolução paralela em Synapsida levou à endotermia parcial em répteis terapsídeos (250 Ma, final do Permiano) e endotermia total em mamíferos

Nespolo RF, Bacigalupe LD, Figueroa CC, Koteja P, Opazo JC. 2011. Usando novas ferramentas para resolver um velho problema: a evolução da endotermia em vertebrados. Trends Ecol. Evol. 26, 414-423

A implicação é que a adaptação noturna pura em mamíferos não seria uma estratégia completamente eficaz para a evasão de predadores.

Em um grande estudo comparativo [Lista], dividiu 700 espécies em classes de nicho de atividade temporal dominante: noturno, diurno ou ambos (principalmente crepuscular). Eles usaram uma construção filogenética existente para reconstruir a evolução da diurnalidade em roedores, que se acredita terem se diversificado após o limite K / T. A reconstrução do uso de nicho temporal em roedores levou à conclusão de que os roedores compartilhavam um ancestral noturno que existia antes da fronteira K / T. Posteriormente, a diurnidade evoluiu por meio da evolução secundária pelo menos sete vezes de forma independente em Rodentia.

Usando a construção filogenética molecular de [Huchon et al], construímos a filogenia de nicho temporal dentro da subclasse Therian completa usando a classificação noturna, diurna e crepuscular / arrítmica de [Roll et al.]. A interpretação mais parcimoniosa leva a um mínimo de 16 mudanças de nicho temporal dominante.

Mina em negrito.

A maioria das subdivisões de Theria são de fato noturnas, mas muitas mudanças e reversões ocorreram, e diferentes interpretações podem ser possíveis, especialmente quando dados de alta qualidade sobre padrões de atividade em mais espécies se tornam disponíveis.

Conclusão.

Parece que os mamíferos podem ter sido perseguidos pelos saurísquios durante o dia, noite e crepúsculo e que muitas adaptações e reversões podem ter ocorrido durante um período (possivelmente) muito mais longo do que os 66 milhões de anos anteriormente pensados. A pesquisa está em andamento.

Referências em negrito:

Roll U, Dayan T, Kronfeld-Schor N. 2006. Sobre o papel da filogenia na determinação de padrões de atividade de roedores. Evol. Ecol. 20, 479-490

Huchon D, Madsen O, Sibbald MJ, Ament K, Stanhope MJ, Catzeflis F, de Jong WW, Douzery EJ. 2002. Filogenia de roedores e uma escala de tempo para a evolução de Glires: evidências de uma extensa amostragem de táxons usando três genes nucleares. Mol. Biol. Evol. 19, 1053-1065


Expansão de nicho temporal em mamíferos de um ancestral noturno após a extinção de dinossauros

A maioria dos mamíferos modernos, incluindo espécies estritamente diurnas, exibe adaptações sensoriais à atividade noturna que são consideradas o resultado de uma fase noturna prolongada ou "gargalo" durante a evolução inicial dos mamíferos. A noite pode ter permitido que os mamíferos evitassem interações antagônicas com os dinossauros diurnos durante o Mesozóico. No entanto, a compreensão da evolução dos padrões de atividade dos mamíferos é dificultada por evidências fósseis escassas e ambíguas. Embora reconstruções ancestrais de características comportamentais de espécies existentes tenham o potencial de elucidar esses padrões, os estudos existentes têm sido limitados no escopo taxonômico. Aqui, usamos um extenso conjunto de dados comportamentais para 2.415 espécies de todas as ordens existentes para reconstruir os padrões de atividade ancestral em Mammalia. Encontramos um forte apoio para a origem noturna dos mamíferos e o aparecimento Cenozóico da diurnalidade, embora a catemeralidade (periodicidade diária mista) possa ter aparecido no final do Cretáceo. Os primatas símios estão entre os primeiros mamíferos a exibir atividade diurna estrita, cerca de 52-33 milhões de anos atrás. Nosso estudo é consistente com a hipótese de que a partição temporal entre os primeiros mamíferos e dinossauros durante o Mesozóico levou a um gargalo noturno em mamíferos, mas também demonstra a necessidade de melhores estimativas filogenéticas para Mammalia.


Mamíferos na Era dos Dinossauros

Sessenta e seis milhões de anos atrás, um evento cataclísmico mundial marcou o fim da Era Mesozóica e mudou todo o curso da vida na Terra (Fig. 1). Esta foi a extinção em massa do fim do Cretáceo, e se foi causada por um ataque de bólido ou desencadeada por enormes erupções vulcânicas ainda é um debate acalorado. Existem evidências geológicas para ambos na época. O resultado, entretanto, é indiscutível. Os dinossauros que haviam dominado a fauna de vertebrados terrestres nos 125 milhões de anos anteriores desapareceram completa e abruptamente, junto com os pterossauros voadores relacionados e os grandes répteis marinhos, os ictiossauros, plesiossauros e outros. Os sobreviventes dos vertebrados incluíam pássaros (que são tecnicamente dinossauros voadores em miniatura, com penas) e os crocodilos, lagartos, cobras e tartarugas. Todos esses grupos logo começaram a se diversificar, embora nenhum deles tenha passado por grandes transformações evolutivas na forma corporal. Um pequeno número de mamíferos pré-existentes também sobreviveu à extinção, mas sua história era muito diferente. Ao longo dos 66 milhões de anos seguintes da Era Cenozóica, uma gama surpreendente de tipos inteiramente novos de mamíferos logo se desenvolveu. Pequenos ancestrais noturnos deram origem a numerosos herbívoros de grande porte, como antílopes, camelos, hipopótamos, cavalos, rinocerontes, cangurus e elefantes, junto com os gatos carnívoros, lobos, ursos e hienas que os atacavam. Formas completamente novas, como tamanduás com línguas compridas e pegajosas e poderosas garras escavadoras, e macacos, macacos e preguiças adaptados para a vida nas árvores evoluíram e, em apenas 25 milhões de anos, os grupos de mamíferos mais especializados de todos aparecem no registro fóssil: os morcegos são tão habilidosos quanto os pássaros, e as baleias e dugongos são soberbamente adaptados fisiológica e anatomicamente para uma vida permanente no mar.


Testando a teoria de como os bastonetes na retina se originaram

Resumo: Um novo estudo relata que as retinas de nossos ancestrais vertebrados mais antigos tinham receptores em forma de cone, permitindo que vissem tanto à luz do dia quanto à noite.

Fonte: NIH / National Eye Institute.

A gênese de nossa retina dominante em bastão pode explicar a sobrevivência dos ancestrais & # 8217 por meio do & # 8216 gargalo noturno & # 8217.

As retinas de nossos primeiros ancestrais vertebrados tinham fotorreceptores em forma de cone, supostamente permitindo-lhes ver à luz do dia, mas pouca capacidade de ver à noite. Então, milhões de anos atrás, na era Mesozóica, e em relativamente pouco tempo, surgiram mamíferos que tinham retinas com fotorreceptores predominantemente de bastonetes, permitindo que vissem à noite, talvez para caçar comida enquanto seus predadores de dinossauros cochilavam. Agora, um novo estudo liderado por pesquisadores do National Eye Institute sugere como a gênese dos fotorreceptores de bastonetes pode ter ocorrido para dar origem aos mamíferos noturnos.

As descobertas abordam uma peça-chave do quebra-cabeça da evolução: como os primeiros mamíferos evoluíram tão rapidamente para ter visão noturna altamente sensível? Eles também sugerem como os mamíferos evoluíram além do & # 8220 gargalo noturno & # 8221, uma teoria que tenta explicar por que a maioria dos mamíferos hoje são noturnos ou pelo menos capazes de enxergar com pouca luz. Acontece que ver bem à noite não só permitiu que nossos ancestrais sobrevivessem, mas também prosperou, tanto que suas características retinais foram bem preservadas e transmitidas por milhões de anos de evolução.

Os resultados do estudo abordam outro mistério: por que os bastonetes são os fotorreceptores dominantes em nossas retinas? & # 8220Apesar do fato de que a visão nítida e aguda parece ser mais importante para nosso estilo de vida diurno, nossas retinas são predominantemente compostas de bastonetes, apenas 5 por cento dos fotorreceptores da retina & # 8217s são cones & # 8221 disse o estudo colaborativo & # 8217s investigador principal, Anand Swaroop, Ph.D., chefe do NEI & # 8217s Neurobiology-Neurodegeneration and Repair Laboratory. & # 8220A explicação mais simples que temos é que esse excesso de bastonetes na maioria dos mamíferos foi recrutado de cones para superar esse gargalo noturno. & # 8221

Ao estudar ratos, Swaroop e sua equipe observaram que um certo tipo de célula cone poderia ser persuadido a se tornar um fotorreceptor de bastonete alguns dias após o nascimento. Eles levantaram a hipótese de que essa transformação de um cone em uma célula de bastonete foi regulada por uma proteína chamada Nrl, que se liga ao DNA e direciona uma célula da retina que está destinada a se tornar um cone para se tornar um bastão. A equipe observou há muito tempo que, quando os ratos são criados para perder Nrl, eles não conseguem desenvolver bastonetes em sua retina.

No estudo atual, eles testaram sua teoria isolando células-bastonete de camundongos normais e sequenciando seus genes expressos. Geneticamente, as células dos bastonetes continham evidências da expressão do gene do cone, mas a expressão desses genes do cone diminui quando a célula do bastão amadurece. & # 8220Esta expressão de genes de células cone é um tipo de pegada que indica que as células bastonetes podem ter se originado de células cone, & # 8221 Swaroop explicou. Estudos da retina de camundongos durante os estágios principais de desenvolvimento após o nascimento apoiaram sua teoria de que no início do desenvolvimento os genes do cone são expressos, mas essa expressão é desativada quando o Nrl redireciona a célula para se tornar um bastão, e o bastão amadurece.

Evidências adicionais foram geradas traçando a linhagem de células em cones e bastonetes na retina do camundongo. Linhagens de camundongos transgênicos foram criados para permitir aos pesquisadores marcar permanentemente proteínas relacionadas ao cone na retina de seus descendentes. Essas células puderam ser rastreadas desde o nascimento, permitindo aos pesquisadores confirmar que a maioria dos bastonetes em camundongos tem atividade de células cônicas durante seu desenvolvimento.

Esta é uma imagem confocal de microscópio de fotorreceptores de bastonetes e cones em uma retina humana. Sondas fluorescentes têm sido usadas para identificar fotorreceptores de bastonete (verde) e fotorreceptores de cone e células horizontais (vermelho). A imagem da NeuroscienceNews.com é creditada ao National Eye Institute.

Em seguida, os pesquisadores examinaram uma ampla amostra de vertebrados (do ornitorrinco a mamíferos com bolsa e placentária) e compararam suas sequências genômicas abrangendo o gene Nrl. Eles descobriram que a codificação na região de Nrl era altamente conservada nas diferentes espécies, indicando que a sequência de Nrl foi bem preservada durante a evolução & # 8211, um sinal de que era importante para a sobrevivência. Seus dados sugerem que a primeira expressão de Nrl parece ter se originado entre vertebrados com mandíbula e que sua expressão ocorreu na mesma época em que os bastonetes se tornaram dominantes na retina.

Curiosamente, padrões semelhantes de atividade do cone não foram encontrados no rastreamento de linhagem de bastonetes na retina do peixe-zebra. & # 8220Isso & # 8217s importante, & # 8221 disse Swaroop & # 8220 porque o peixe-zebra, com suas retinas ricas em cone, ramificou-se antes dos mamíferos da história evolutiva dos vertebrados. & # 8221 A falta de linhagem do cone nos bastões do peixe-zebra sugere que a origem da dominância dos bastonetes, às custas das células cônicas, é uma inovação de desenvolvimento específica dos mamíferos. Os bastões de peixe-zebra podem ter surgido de um mecanismo diferente, disse ele.

As descobertas podem ser relevantes para os esforços atuais para regenerar as células da retina como uma forma de restaurar a visão em pessoas com doenças, como a retinite pigmentosa, que causa a degeneração das células da retina. & # 8220Fish, que tem retina dominante em cone, são capazes de regenerar sua retina após uma lesão. Portanto, se quisermos entender como regenerar a retina em humanos, precisamos entender o que acontece nos peixes. Compreender a evolução dos fotorreceptores é parte importante disso, & # 8221 disse ele.

Financiamento: O estudo foi apoiado em parte pelo programa de pesquisa intramural do NEI.


Kiwi e visão noturna 29 de janeiro de 2008

Um (razoavelmente) novo artigo de Graham Martin et al. no maravilhoso PLoS ONE discute kiwi e seus olhos. Vindo (quase) do lado oposto do mundo, sou (era) embaraçosamente ignorante sobre o kiwi. Eu sabia que eles eram pássaros grandes e que não voavam da Nova Zelândia, mas era só isso. (Eu até pensei que o plural fosse & # 8220kiwis & # 8221 [1].) Agora sei que eles & # 8217são noturnos, como alguns pássaros, mas eles desenvolveram olhos surpreendentes.

Para ver no escuro, muitos animais noturnos desenvolveram olhos relativamente grandes, como corujas, lêmures e alguns macacos, para captar a pouca luz que existe. Contra isso, entretanto, os olhos são pesados, sendo bolas de água em sua maioria, e o peso é sempre uma preocupação se você estiver voando. Portanto, à primeira vista, você pode esperar (como os autores mencionam) que um pássaro que para de voar possa evoluir para ter olhos cada vez maiores, à medida que o peso se torna menos problemático. Especialmente se for noturno. No entanto, kiwi tem pequena olhos para seus corpos, e o que mais, eles têm pequenos nervos ópticos e pequenos córtices visuais. Eles não são cegos como os peixes das cavernas, embora alguns milhões de anos a mais, quem sabe?

Avançando alguns centímetros, todas as aves têm narinas, geralmente na base do bico ou mesmo dentro da boca. Kiwi, exclusivamente, tem suas narinas no gorjeta de suas notas, juntamente com sensores de toque finos em todas as pontas das notas. Eles se alimentam bicando insetos que vivem na superfície ou sondando o solo com seu bico longo e detectando insetos subterrâneos, sugerindo uma evolução convergente para o mesmo nicho ecológico preenchido por mamíferos em muitas partes do mundo. E se você está encontrando larvas no subsolo, você não precisa de visão, é claro.

De acordo com a página & # 8220wiki-kiwi & # 8221, em áreas onde as pessoas estão ausentes, kiwi estão ativo durante o dia. O que me faz pensar se eles acabaram com o processamento visual reduzido simplesmente porque não conseguem ver o que estão comendo de qualquer maneira, seja dia ou noite, então por que desperdiçar o esforço? Parece-me que há duas histórias evolutivas que se encaixam nesses dados:

  1. Na versão um, o kiwi evoluiu para encontrar comida na camada superficial do solo com seus bicos e, por isso, não precisava de uma boa visão, eles gastavam menos energia crescendo e usando os olhos e, finalmente, tendiam ao comportamento noturno porque não havia nenhum custo extra para eles .
  2. Na versão dois, o kiwi tornou-se noturno para evitar predadores (não que houvesse mamíferos com os quais competir até recentemente) ou para encontrar insetos noturnos, talvez, e então desenvolveram visão deficiente porque uma boa visão não era mais necessária.

Claro que poderia ser uma mistura dos dois, já que as histórias evolucionárias não precisam ter uma narrativa clara e agradável. Em qualquer dos casos, acho que eles ainda precisam de pelo menos uma visão rudimentar para a seleção de parceiros, não andar em árvores, esse tipo de coisa. De qualquer forma, aprendi muito sobre kiwi, pelo qual sou grato!

Martin, G.R., Wilson, K., Wild, J.M., Parsons, S., Kubke, M.F., Corfield, J., Iwaniuk, A. (2007). Kiwi renuncia à visão na orientação de suas atividades noturnas. PLoS ONE, 2 (2), e198. DOI: 10.1371 / journal.pone.0000198

Veja também: & # 8220A alometria e escala do tamanho dos olhos dos vertebrados & # 8221 doi: 10.1016 / j.visres.2004.03.023
& # 8220Alguns animais noturnos dependem de outros sentidos além da visão, o que se reflete em seu pequeno tamanho de olho. Outros adotam a estratégia de aumentar o tamanho dos olhos tanto quanto possível para compensar as condições de pouca luz. & # 8221

[1] Eu verifiquei o OED para ver o que dizia sobre a palavra & # 8220kiwi & # 8221. Fornece a etimologia como & # 8220Maori & # 8221, que não é terrivelmente informativa, mas tem uma citação de Walter Lawry Buller e seu texto de 1873, Uma história das aves da Nova Zelândia: & # 8220 Último domingo jantei Kiwi cozido, na cabana de um solitário garimpeiro. & # 8221 Então eu & # 8217 já aprendi algo & # 8230


Conclusões

As linhas de evidência genômica e filogenética avançadas aqui fornecem novos insights sobre a evolução dos olhos dos mamíferos: (eu) padrões iguais e diferenciados de perda de opsina em mamíferos sugeriram um período noturno que afetou tanto a linhagem comum quanto a emergente de mamíferos, além disso, avançamos que os mamíferos ancestrais possuíam (ii) um padrão de atividade noturna, (iii) Visão UVS e um olho adaptado ao escotópico com (4) baixa acuidade visual e (v) visão panorâmica. Em suma, fornecemos evidências conclusivas de que os mamíferos (e não apenas eutéricos como Walls inicialmente assumiu [1]) foram adaptados para a escotopia durante a maior parte de sua história evolutiva, apoiando um gargalo noturno global começando em & gt & gt 215,5 mya e durando até 66 mya.


Morfologia da asa do morcego e seu papel no vôo motorizado

A principal entre as muitas adaptações do morcego para o vôo motorizado é a asa do morcego e o estilo de vôo oscilante que usa a força muscular para gerar sustentação e impulso. A asa do morcego evoluiu dos membros anteriores de um ancestral mamífero terrestre. O membro anterior dos mamíferos é extremamente móvel porque a articulação do ombro entre a escápula (osso do ombro) e o úmero (osso do membro anterior superior) é fracamente mantida junto com os músculos. Isso permite a rotação real do braço em torno da articulação do ombro em muitas espécies. Os primatas têm essa mobilidade, e os morcegos também.

O nome taxonômico dos morcegos, ordem Chiroptera (que significa "asa de mão"), descreve perfeitamente a morfologia da asa do morcego. A estrutura esquelética da asa do morcego consiste no úmero, um rádio bem desenvolvido e uma ulna muito reduzida. Em humanos, a ulna é o principal osso do antebraço e forma uma articulação na região do cotovelo com o úmero. Os ossos altamente alongados da mão (metacarpo) e dos dedos (falanges) formam o resto do esqueleto da asa do morcego. Apenas o pollex (ou polegar) retém a garra do ancestral mamífero, embora nos morcegos frugívoros e raposas voadoras o segundo dedo também retenha uma garra. Os ossos da asa fornecem uma estrutura esquelética segmentada para suporte e controle da membrana de vôo.

A membrana de voo (chamada de patágio) é uma estrutura flexível de camada dupla composta por pele, músculo e tecido conjuntivo. É rico em vasos sanguíneos. A região do patágio que se estende das laterais do corpo e dos membros posteriores até o braço e o quinto dedo é chamada de plagiopatágio. Outras porções da membrana se estendem do ombro ao pollexo (primeiro dedo) ao longo da porção anterior da asa (propatagium), entre os dedos (o quiropatagium) e dos membros posteriores à cauda (o uropatagium, também chamado de interfemoral membrana). A asa opera em um projeto de aerofólio, com os segmentos de membrana flexível mudando de forma para produzir gradientes de pressão variáveis ​​ao longo da superfície da asa que resultam em quantidades variáveis ​​de sustentação e empuxo. O controle preciso dos morcegos sobre a forma do patágio lhes dá uma capacidade de manobra que não pode ser igualada pelos pássaros.

O vôo do morcego é controlado por dezessete pares diferentes de músculos. Três músculos diferentes fornecem força para a descida. Outros três músculos executam o movimento ascendente. Isso é muito diferente dos pássaros, onde dois pares de músculos fornecem a força para a depressão e elevação das asas. O esterno (esterno) em morcegos não é particularmente bem desenvolvido, enquanto em pássaros é muito proeminente com uma quilha bem desenvolvida. O músculo peitoral que se origina no esterno é o maior músculo de vôo do morcego e possui o suprimento mais rico de vasos sanguíneos conhecido para qualquer mamífero. Outros músculos que se originam ao longo da coluna vertebral (coluna vertebral) e da escápula ajudam a fornecer tensão à membrana e ajustar a posição da asa. As fibras musculares embutidas na membrana auxiliam na regulação da tensão do patágio. Muitos músculos existentes nos mamíferos terrestres foram ligeiramente reposicionados, enquanto outros, exclusivos dos morcegos, ajudam a manter o patágio tenso. A asa opera em um projeto de aerofólio, com os segmentos de patágio flexíveis mudando de forma para fornecer quantidades variáveis ​​de sustentação e empuxo.

O membro posterior possui um esporão ósseo exclusivo dos morcegos, chamado calcar, que se projeta para dentro da tíbia. Este osso se liga ao uropatagium e funciona para evitar que a cauda se agite durante o vôo. As pernas também podem formar uma bolsa com o uropatagium usado para capturar insetos. Na maioria dos morcegos, os membros posteriores giraram 90 ° para fora e assumiram uma posição semelhante à de um réptil. As pernas são usadas para controlar o uropatagium durante o vôo. Outra adaptação importante das patas traseiras é como um gancho, uma adaptação para pendurar de cabeça para baixo. Os morcegos são capazes de enganchar as garras de suas patas traseiras em suportes horizontais ou arestas em paredes ou tetos de cavernas. As garras desenvolveram um mecanismo de travamento que permite segurar sem qualquer envolvimento muscular. Pendurado de cabeça para baixo permite que os morcegos ocupem áreas indisponíveis para os pássaros e permite que um morcego use a gravidade para iniciar o voo ao cair. Muitas vezes, acredita-se que os morcegos são completamente indefesos no solo por causa da disposição de suas pernas, isso não é verdade. Algumas espécies saltam enquanto outras se movem quadrúpede. Se um morcego cair na água, ele pode nadar até a terra. No entanto, eles não usam essas formas de locomoção habitualmente. O arranjo das patas traseiras do morcego provavelmente restringiu a linhagem do morcego aos voadores. Não há morcegos que não voam nem morcegos nadadores comparáveis ​​aos encontrados entre as aves (por exemplo, avestruzes e pinguins, respectivamente).


MATERIAIS E MÉTODOS

Locais de estudo

A pesquisa foi conduzida em duas florestas em Madagascar, representando diferentes tipos de habitat: Parque Nacional Kirindy Mitea e Parque Nacional Ranomafana. Kirindy Mitea é um habitat de floresta estacional decidual e suculenta de copa aberta (Burgess et al., 2004). Os dados foram coletados exclusivamente na Estação de Pesquisa Ankoasifaka (Anko) (20 ° 47.25′S, 44 ° 10.14′E) entre julho e setembro de 2009. Este período representa o final da estação seca, quando a maioria das espécies de árvores caíram folhas (Sorg e Rohner, 1996) e, portanto, seria esperado que mostrassem o maior contraste com florestas tropicais fechadas. Embora Anko não tenha histórico de extração sistemática de madeira, um ciclone atingiu a floresta em janeiro de 2009, que afetou a estrutura da floresta em comparação com as condições pré-ciclone (Lewis e Bannar-Martin, 2012). No entanto, uma comparação das classes de tamanho das árvores revelou que a estrutura da floresta em Anko não diferia significativamente daquela de outras florestas secas em Madgascar (C.C.V., não publicado). Ranomafana é uma floresta úmida com habitats de planície a montanha (Wright, 1992). Os dados foram coletados nos locais de pesquisa Valohoaka (Valo 21 ° 17.76′S, 47 ° 26.35′E) e Talatakely (Tala 21 ° 15.75′S, 47 ° 25.25′E) em setembro e outubro de 2009. Valo (altitude de 1200 m) é uma floresta primária intacta (Balko e Underwood, 2005). Tala (500 m de altitude) experimentou a exploração madeireira no final dos anos 1980 e é caracterizada como floresta úmida secundária (Wright, 1992).

Medições de densidade de folhagem

Em todos os locais, nove transectos de 50 m foram estabelecidos de 3 a 10 m paralelos aos sistemas de trilhas. A 3 m de distância, a trilha não era visível e, portanto, não teve efeito nas medições da densidade da folhagem. A densidade da folhagem foi medida em intervalos de 10 m ao longo de cada transecto usando fotografia hemisférica. As fotos foram tiradas com uma câmera digital Nikon Coolpix 5700 e lente fisheye FC-E9 Nikon (Nikon, Tóquio, Japão) posicionada em um tripé (0,89 m de altura). A densidade da folhagem foi quantificada como a porcentagem de abertura do dossel calculada a partir de fotografias digitais no Gap Light Analyzer v.2.0 (Frazer et al., 1999). No local da floresta seca em Anko, a abertura do dossel variou de 19 a 50%, com uma abertura mediana do dossel de 38%. Em contraste, a abertura do dossel na floresta tropical variou de 13 a 26% aberto (medianas: Valo = 16%, Tala = 20%).

Medidas de irradiância noturna

Coletamos 532 medições de irradiância noturna, incluindo 514 medições de Anko, oito de Valo e 10 de Tala. Todas as medições foram coletadas usando um radiômetro de pesquisa International Light IL1700 e detector fotomultiplicador PMC271C calibrado (faixa de sensibilidade de 200-675 nm Peabody, MA, EUA) posicionado em um tripé (0,89 m de altura) com 12 filtros de interferência de passagem de banda estreita (Newport Oriel Corporation, Irvine, CA, EUA) posicionado em uma roda de filtro apoiada no detector. Os filtros tinham comprimentos de onda centrais em todo o espectro visível, comprimentos de onda máximos de metade da largura total de 10 ± 2 nm e transmissão de pico mínimo de 30–50%. Os números do modelo de filtro foram: 10BPF10, 400 nm 10BPF10, 420 nm 10BPF10, 430 nm 10BPF10, 440 nm 10BPF10, 460 nm 10BPF10, 490 nm 10BPF10, 520 nm 10BPF10, 540 nm 10BPF10, 560 nm 10BPF10, 580 nm, 10BPF10 nm e 10BPF10, 650 nm. Devido a um erro técnico, um filtro adicional (comprimento de onda central de 680 nm, modelo 10BPF10, 680 nm) foi usado no lugar do filtro de 650 nm para 90 medições de lua cheia em Anko. Como resultado, algumas comparações incluem essas medições de 680 nm. O fluxo total foi medido diretamente pelo IL1700 e PMC271C sem qualquer filtro e registrado como a média de duas medições feitas consecutivamente. Usando uma lâmpada de radiação espectral LI-COR (1800-02L, LI-COR Biosciences, Lincoln, NB, EUA) e uma série de filtros de densidade neutra (NDFs) [um Edmund Optics 2.0 NDF (Barrington, NJ, EUA), um Oriel 1.0 NDF (Newport Oriel Corporation, Irvine, CA, EUA) e dois LEE 0.6 NDFs (LEE Filters, Andover, Hampshire, UK)], calibramos o IL1700 com cada um dos 13 filtros de interferência para converter unidades fotomultiplicadoras (W cm −2 s −1) em unidades fotométricas (μmol fótons μmol m −2 s −1 nm −1).

Durante a medição, o detector fotomultiplicador foi apontado diretamente para o céu (ângulo zenital de 90 graus) e os pesquisadores agacharam-se abaixo da altura do detector. A cobertura de nuvens foi avaliada se quaisquer nuvens foram detectadas ao olhar diretamente para cima ('claro' ou 'nublado'). Não tínhamos meios de quantificar o grau de nebulosidade, portanto, restringimos a maioria das análises de irradiância noturna a céus limpos. No entanto, o céu estava completamente encoberto por três medições em Anko, então pudemos comparar os mesmos três locais de medição sob céu claro e nublado completo. O tempo de coleta de dados variava todas as noites, mas sempre começava depois que o crepúsculo astronômico terminava [ou seja, quando o sol não contribui mais para a irradiância noturna (Martin, 1990)], conforme determinado para a latitude e longitude do local de estudo (Observatório Naval dos Estados Unidos, 2011). Em Anko e Valo, as medições ocorreram entre 19:18 e 00:52 h. Na Tala a medição ocorreu entre 23:51 e 04:00 h. Usando a hora / data da medição e a latitude / longitude do local de estudo, a posição da lua no céu (altitude lunar) e a fração da face lunar iluminada (fração lunar) foram determinadas para cada medição a partir dos dados disponíveis em o Observatório Naval dos Estados Unidos (Observatório Naval dos Estados Unidos, 2011). Em Anko, a irradiância noturna foi medida em 32 noites (29 de julho a 8 de setembro de 2009). Os dados foram coletados em intervalos de 10 m ao longo dos nove transectos botânicos (54 locais de medição). Cada local de medição foi revisitado aproximadamente a cada quatro noites para amostrar locais ao longo de um ciclo lunar. Em Valo e Tala, a irradiância noturna foi medida em uma noite cada. Em Tala, os dados foram coletados para 10 locais de medição em uma noite de lua gibosa (8 de outubro de 2009, três céu limpo, sete nublado). Em Valo, os dados foram coletados em 12 locais em uma noite de lua crescente (22 de setembro de 2009). No entanto, quatro locais no Valo foram excluídos da análise porque a irradiância era muito baixa para medir com filtros espectrais.

Análises de irradiância noturna

Construímos espectros de irradiância noturna para cada observação combinando as 12 medições de filtro (em unidades fotométricas, μmol m −2 s −1 nm −1) e exploramos como a fase lunar, altitude lunar, abertura do dossel, cobertura de nuvens e tipo de habitat influenciam espectral e características de intensidade de ambientes de luz noturna. Restringimos a maioria das comparações dentro da floresta estacional decidual em Anko para condições de céu claro (N= 347 medições). As frações lunares foram agrupadas em fases lunares: crescente (0,01–0,39), quarto (0,40–0,69), gibosa (0,70–0,90) e cheia (0,91–1,0). Para comparar as influências desses fatores na forma do espectro independente do fluxo total, normalizamos cada espectro de observação para seu próprio fluxo máximo. Em seguida, calculamos a média e o erro padrão em subconjuntos dos espectros sob diferentes condições para cada comprimento de onda do filtro. Porque às vezes havia variação entre os espectros no comprimento de onda do fluxo de pico, este método representa o grau de variação na forma espectral dentro de subconjuntos (ou seja, se o fluxo de pico médio em uma condição é igual a 1 ou é mais variável).

Também procuramos quantificar os efeitos desses fatores (fase lunar, altitude lunar, abertura do dossel) na irradiância noturna (intensidade e características espectrais) usando modelagem linear de efeitos mistos. Restringimos as análises a subconjuntos de dados que representam observações de céu claro em Anko (luar = 242 medições, sem lua = 99 medições). Definimos a luz noturna em termos de fluxo total (em W cm-2, medido diretamente pelo IL1700 e PMC271C sem qualquer filtro), bem como fluxo proporcional em diferentes larguras de banda (comprimentos de onda curtos,% SW: comprimentos de onda médios de 400-460 nm, % MW: comprimentos de onda longos de 490–540 nm,% LW: 560–650 / 680 nm). The spectral variables (%SW, %MW and %LW) were calculated from raw measurements (W cm −2 ) taken with the relevant filters (i.e. 400–460 for %SW) divided by the sum of measurements from all filters. We chose the spectral bandwidths to correspond to typical categories of mammalian visual pigments [SW: 400–460 nm MW: 510–540 nm LW: >540 nm (Jacobs, 2009)]. For these data, we transformed lunar fraction to a measure of ‘lunar phase angle’, where 0 deg is full moon (fraction=1.0) and 180 deg is new moon (fraction=0). Because lunar irradiance exhibits a nonlinear relationship with lunar phase angle (Miller and Turner, 2009 Johnsen, 2012), we interpolated the lunar phase function for each lunar phase angle using lunar phase function values at 501.2 nm from Miller and Turner (Miller and Turner, 2009). Lunar altitude was also cosine-transformed for each measurement. We designated measurement location and transect as nested random effects (locations nested within transects) to prevent spatial and temporal autocorrelation.

We had no a priori expectations regarding the relative importance of interactions between the factors (cosine lunar altitude, lunar phase function and canopy openness). Therefore, we ran the full set of possible models (including all interactions) for each nocturnal irradiance variable using the lme4 package (Bates et al., 2012) in R v.2.12.2 (R Development Core Team, 2011). For each model, we used maximum likelihood estimates to determine Akaike's information criterion (AIC). We then calculated ΔAIC (the difference in AIC between the best model and each of the other models), evidence ratios and Akaike weights for the models of each nocturnal irradiance variable following Symonds and Moussalli (Symonds and Moussalli, 2011). In general, models with ΔAIC <2 are considered ‘almost as good’ as the best model, while models with ΔAIC >9 have relatively little to no support (Burnham and Anderson, 2004 Burnham et al., 2011 Symonds and Moussalli, 2011). Evidence ratios and Akaike weights are alternative measures of the relative model strength that estimate how much better the best model fits the data compared with the given model and the probability that the given model is the best of competing models, respectively (Burnham and Anderson, 2002 Burnham and Anderson, 2004 Symonds and Moussalli, 2011). We also calculated the relative importance of each factor/interaction by summing the Akaike weights of all models including that factor/interaction (Burnham and Anderson, 2002). This factor weight reflects the probability that the factor/interaction is a component of the best model (Symonds and Moussalli, 2011). We chose the model with the lowest AIC value for each nocturnal irradiance variable and reran the model with restricted maximum likelihood estimates to determine the model parameters. For variables where multiple models had ΔAIC <2, we utilized the simplest model (fewest number of terms). We then evaluated how well the model predicted each nocturnal irradiance variable by comparing estimates predicted by the best model with values observed in the data set.

Nocturnal vertebrate visual pigments

From the published literature, we compiled a data set of known visual pigment peak spectral sensitivities (λmax), habitat preferences and diet for 40 nocturnal vertebrates across a variety of taxonomic and ecological groups (supplementary material Table S1). Visual pigment spectral sensitivities were grouped into three categories based on typical mammalian photoreceptor pigment classes (Jacobs, 2009): rods, short-wavelength-sensitive (SWS) cones (including ultraviolet sensitivity) and medium to long-wavelength-sensitive (LWS) cones. We restricted statistical analyses of cone pigments to placental and marsupial mammals in order to limit phylogenetic effects on spectral tuning. Most vertebrates possess four cone pigment (opsin) genes (SWS1, SWS2, Rh2 e LWS) that produce different classes of cones, including two types sensitive to shorter wavelengths (355–470 nm) and two sensitive to middle and longer wavelengths (480–570 nm) (Hunt et al., 2009). In contrast, mammals have an evolutionary history of nocturnality that resulted in the shared loss of the SWS2 e Rh2 genes (Jacobs and Rowe, 2004 Hunt et al., 2009). Consequently, most nocturnal mammals have only two cone classes (SWS and LWS) derived from homologous genes (SWS1 e LWS, respectively), which allows a more controlled comparison of ecological effects on spectral tuning.

We used a phylogenetic generalized least squares (PGLS) approach to explore the association between habitat type and dietary composition with SWS and LWS spectral tuning in nocturnal mammals (N=32 species). PGLS utilizes known taxonomic relationships and branch lengths to compensate for the influence of phylogeny on trait covariation (Garland and Ives, 2000). For each species, we categorized habitats as ‘open canopy/woodland’ (including seasonally open forests, forest edges), ‘closed canopy’ (including rainforests, cloud forests), ‘open/closed canopy’ (if a species is present in both types) or ‘open’ (if savannah/desert). One primate (Cheirogaleus medius), while inhabiting seasonally open canopy deciduous forests, hibernates through the dry season and is only active in the rainy season, when the forest has a closed canopy (Fietz and Ganzhorn, 1999). This species was thus included in the ‘closed canopy’ habitat group. We restricted PGLS analyses to species from ‘open canopy/woodland’ or ‘closed canopy’ habitats, excluding those from both habitats (‘open/closed’). We also categorized each species depending on whether it included fruit or flower products, which advertise visually to consumers, as 10% or more of its diet (Y/N). Dietary data were collected from studies of feeding time, fecal content or gut content (see supplementary material Table S1 for references).

We utilized phylogenetic and branch length data from a published mammalian supertree (Bininda-Emonds et al., 2007). PGLS analyses were performed in R using the ape (Paradis et al., 2004), caper (Orme et al., 2010) and geiger packages (Harmon et al., 2008). We conducted separate PGLS analyses for habitat and diet categorical factors, excluding taxa with missing values. Trees used for each analysis are presented in supplementary material Fig. S1. For each comparison, we also calculated Pagel's lambda, which measures the effect of phylogeny in the data, where 0 reflects no phylogenetic influence and 1 reflects a strong phylogenetic signal (Pagel, 1999 Kamilar et al., 2012). We excluded one species (Phodopus sungorus) because it has SWS and LWS pigment co-expression (both pigments present in a single cone) in all cones and no functional color vision (Lukáts et al., 2002). While most mammals are dichromats (having two cone types), one nocturnal marsupial (Setonix brachyurus) has three cone types (Cowing et al., 2008), two of which are categorized as medium/long-wavelength-sensitive (502 and 538 nm). To account for this second cone type in PGLS analyses involving LWS pigments, S. brachyurus was represented by two branches (branch length set at 0.0001).


Stress and the Natural History of Mammals—Complications and Methods

Compared to the number of studies that have examined baseline and stress-induced glucocorticoid levels in reptiles, amphibians, and especially in birds, data for free-living mammals are sparse ( Romero 2002). In addition, some studies of variation in glucocorticoid levels in mammals did not report sampling times or exceeded 3 min, making the interpretation of these data as baseline values questionable. The scarcity of data on baseline HPA function in mammals is largely due to difficulties in obtaining samples within the 3-min window necessary to avoid measuring the response to capture and sampling itself, further complicated by the fact that most mammals are nocturnal and solitary. However, baseline samples have been successfully collected from free-living mammals by constantly monitoring traps (e.g., yellow-pine chipmunks— Kenagy and Place 2000 Place and Kenagy 2000 and little brown myotis— Reeder et al. 2004). Baseline samples also have been collected by terminal sampling (e.g., gun shot— Boonstra and Singleton 1993). Nonbaseline (presumably “stress-induced”) levels of glucocorticoid secretion are easier to measure in free-living mammals than are baseline samples, because most mammals spend >3 min in a trap before being sampled ( Romero 2002). For example, seasonal changes in glucocorticoid levels have been described for animals that have either been in a trap ≥1 h (e.g., Boswell et al. 1994 Kenagy and Place 2000 Kenagy et al. 1999 Place and Kenagy 2000) or that were collected in the field and sampled later in the laboratory (e.g., Gustafson and Belt 1981 Krishna et al. 1998). Place and Kenagy (2000) and Kenagy and Place (2000) compared this standard protocol with one that assessed both baseline and stress-induced levels in the same individuals and found that both methodologies told roughly the same story regarding seasonal variation in glucocorticoid levels in yellow-pine chipmunks.

Comparison of baseline glucocorticoids with glucocorticoid levels reached some time after the application of a stressor is one of the primary methods used to assess the stress response in mammals and other vertebrates. Some also have used a hormone-challenge protocol (see Boonstra 2005). In this instance, animals held in traps for unknown periods of time are brought to roughly equivalent glucocorticoid levels through administration of the synthetic glucocorticoid dexamethasone, which feeds back negatively on the HPA axis and thus returns glucocorticoids to “baseline” levels. ACTH is then administered, stimulating glucocorticoid production, and glucocorticoid levels at subsequent time points can be assessed. Variation in the level of glucocorticoid suppression in response to dexamethasone (the dexamethasone suppression test) and in the response of glucocorticoids to ACTH administration can be used to compare HPA activity levels both across species and within species across different life-history stages or environments. Animals in which glucocorticoid levels remain high after dexamethasone administration are often thought to be under chronic stress (e.g., arctic ground squirrels in some environments— Hik et al. 2001). Another method to assess the response of the HPA axis is to collect adrenal glands from individuals, superfuse them with ACTH, and measure resultant glucocorticoid production. This technique was used to show that meadow voles (Microtus pennyslvanicus) have higher adrenal responsiveness in the spring ( Seabloom et al. 1978).

Hypothalamic–pituitary–adrenal function in free-ranging mammals also has been assessed by measuring glucocorticoid metabolites in urine or feces (e.g., Carlstead et al. 1992 Möstl et al. 1999 Zav'yalov et al. 2003). This avoids the necessity of collecting samples within 3 min but the results represent total glucocorticoid output over an unknown period of time rather than acute or immediate values ( Boonstra 2005). For these data to be interpretable, the individual that produced the sample and the time the sample was produced must be known. In some cases, this cumulative glucocorticoid level may in fact be of greater interest than acute or immediate glucocorticoid levels. In many species (especially larger species and those that are difficult to trap), this noninvasive monitoring is the only currently feasible way to collect samples.


Methods and materials

Genome sequence assembly and annotation

We sequenced Apteryx mantelli female individuals, which originate from the far North (kiwi code 73) and central part – Lake Waikaremoana (kiwi code AT5 and kiwi code 16–12) of North Island (Additional file 1: Figure S10). They were sampled in 1986 (kiwi code 73) and 1997 (kiwi code AT5 and 16–12) in ‘operation nest egg’ carried out by Rainbow and Fairy Springs, Rotorua. No animals were killed or captured as a result of this study and genome assembly was performed with iwi approval from the Te Parawhau and Waikaremoana Māori Elders Trust.

We extracted genomic DNA from Apteryx mantelli embryos. Libraries with insert sizes of 240 bp, 420 bp, 800 bp, 2 kb, 3 kb, and 4 kb were obtained from individual kiwi code 73, and mate-paired-end libraries 7 kb, 9 kb, 11 kb, and 13 kb, from individual kiwi code 16–12. DNA from individual AT5 was used to build a 350 bp insert-size library with the purpose of confirming kiwi-specific sequence polymorphisms and was not included in the genome assembly (Additional file 1: Note: Sampling, DNA library preparation and sequencing Additional file 1: Table S1). Paired-end sequencing was performed on HiScanSQ and HiSeq platforms with read lengths of 101 bp and 96 bp, respectively.

Sequencing errors were corrected using Quake [5] (Additional file 1: Note: Filtering and read correction Additional file 1: Figure S1). A total of 52.53 Gb of high-quality sequence was used for de novo assembly with SOAPdenovo [6]. The short-insert-size libraries (240 bp, 420 bp, 800 bp) were used to build contigs. Based on paired-end information scaffolds were generated using all libraries (2 kb, 3 kb, 4 kb, 7 kb, 9 kb, 11 kb, 13 kb). Remaining gaps in the scaffolds were closed using the paired-end information (Additional file 1: Note: Genome assembly). This final assembly (AptMant0) was used for all subsequent analyses.

Gene annotation was performed with the MAKER pipeline [10], using several sources of evidence: de novo gene predictions, RNA-Seq data, and protein evidence from three species (G. gallus, T. guttata, e M. gallopavo) (Ensembl version 72). Briefly, after repeat masking, gene models were predicted by Augustus version 2.7 [74] using the training dataset for chicken. Apteryx mantelli RNA-Seq data were then aligned to AptMant0 using NCBI BLASTN version 2.2.27+ [75] and BLASTX was used to align protein sequences to identify regions of homology. Finally, using both the ab initio and evidence-informed gene predictions, Maker updated features such as 5’ and 3’ UTRs based on RNA-Seq evidence and a consensus gene set was retrieved (Additional file 1: Note: De novo gene prediction and gene annotation).

Comparative genome analysis

Triplet orthologs between chicken, zebra finch, and turkey were downloaded from Ensembl 73. Kiwi genes were considered orthologs to a triplet if the ortholog assignment from Maker agreed with the orthologous gene assigned in each of the three considered species. The ostrich, tinamou, chuck-will’s-widow, and barn owl orthologs were assigned by orthology to the chicken proteins. After assigning orthology in the eight avian species, coding sequences were aligned and two different sets of alignments were compiled for further analysis:

Set 1: alignments of all eight species that do not contain a single frameshift indel.

Set 2: the longest uninterrupted run of at least 200 aligned bases in each multiple sequence alignment, for which we first ensured that gaps in the alignment were not introduced by unresolved bases in our assembly.

The CODEML program from the package PAML [24] was run first on four avian lineages: G. gallus, T. guttata, M. gallopavo, e A. mantelli to compare the kiwi genome to high-quality annotated ones. Six pairwise combinations were run to obtain estimates of non-synonymous (Ka) and synonymous (Ks) changes in the four avian lineages. Ka and Ks distributions were compared pairwise between all four avian species on a set of 3,754 orthologous genes which presented no frameshifts or indels (Additional file 1: Figure S11).

We next scanned for differently evolving genes with the CODEML program under a branch model (model = 2, two ωs for foreground and background branches, respectively, vs. model = 0, one ω for all branches, compared via likelihood ratio test) [24] using the set of orthologs as defined above in the eight bird species (Additional file 1: Note: Orthologs and Ka/Ks calculation).

Branch specific ω values were used to identify GO categories that are evolving significantly different on each of the following bird species: kiwi, ostrich, tinamou, barn owl, and chuck-will’s-widow. GO categories enrichment was tested using the FUNC [76] package.

A hypergeometric test was run for each species separately on genes having a significantly higher ω. Multiple testing correction was done using family-wise error rate. Categories with P value <0.05 were considered for further analysis if at least three significantly changed genes were present in the GO category, and the number of significant genes was greater or equal to 5 % of the total genes annotated in the respective GO category. The same test was applied on genes with a significantly smaller ω in each of the species. Kiwi-specific categories were considered those which showed no enrichment in any of the other ratites or night birds (Additional file 1: Note: Gene Ontology and rapidly evolving genes).

We used the TreeFam methodology to define gene families [12] across 16 genomes: Gallus gallus, Anas platyrhynchos, Ficedula albicollis, Meleagris gallopavo, Taeniopygia guttata, Pelodiscus sinensis, Anolis carolinensis, Homo sapiens, Mus musculus, Gasterosteus aculeatus, Ornithorhynchus anatinus, downloaded from Ensembl 73 [14], Tinamus guttatus, Struthio camelus, Antrostomus carolinensis, Tyto alba, downloaded from GigaDB [13], and Apteryx mantelli. The longest transcript was chosen for further analysis. For the single-copy orthologous families, genes were aligned against each other. To build a consensus phylogenetic tree (Fig. 1) the resulting alignments were loaded in PAUP* [15] version 4.0d105 and trees were inferred using maximum likelihood, with default parameters. To measure the confidence for certain subtrees, a series of 100 bootstrap replicates were performed (Additional file 1: Note: Nuclear loci phylogeny).

We determined the branch-specific expansion and contraction of the orthologous protein families among the 16 species using CAFE (computational analysis of gene family evolution) version 3.0 [77] with lambda option of 0.0007 (Additional file 1: Note: Gene families evolution using CAFE). Pfam IDs corresponding to the TreeFam families were assigned to GO categories. We tested whether significant (P <0.05) contraction/expansion events cluster in different GO categories using ClueGO with a hypergeometric test [78] (Additional file 1: Figure S2).

Membrane proteome annotation

Complete protein sequence sets for the following bird and reptile species were downloaded from Ensembl 74 [14]: Taeniopygia guttata, Meleagris gallopavo, Ficedula albicollis, Anas platyrhynchos, Pelodiscus sinensis, Gallus gallus, e Anolis carolinensis. Homo sapiens from the same Ensembl version was used as outgroup. Protein sequences of ratites (Tinamus guttatus, Struthio camelus) and nocturnal birds (Antrostomus carolinensis, Tyto alba) were downloaded from GigaDB [13] although these genomes are more fragmented than the ones from Ensembl, annotation of the membrane proteome in birds adapted, like kiwi, to the nocturnal niche and the ones belonging to the same clade as kiwi, allows to differentiate between events that are clade-specific or shaped by nocturnality. Only the longest protein sequence for each gene was considered for analysis. Membrane proteins and signal peptides were predicted for all species with Phobius [79]. These proteins were classified based on a manually curated human membrane proteome dataset, which describes family relationship and molecular function. The predicted membrane proteins were aligned to the human membrane proteome dataset with the BLASTP program of the BLAST package using default settings (v. 2.2.27+) [75]. Each predicted membrane protein was classified according to its best human hit with an e-value <10 −6 . Predicted membrane proteins with no hit were deemed unclassified, along with those proteins that hit an unclassified human protein (Additional file 1: Note: Detection and classification of the membrane proteome Additional file 1: Table S7).

Vision evolutionary analysis

Opsins are G protein-coupled receptors known to play a role in light signal transduction and night-day cycle (Table 2). For these genes ω was estimated by appointing sequentially kiwi, ostrich, tinamou, chuck-will’s-widow, and barn owl as the foreground branch under the CODEML branch model (model = 2) [24] as described for comparative genome analysis. Inactivating mutations were verified by checking that they were present in reads from both sequenced individuals and in other kiwi species, by Sanger sequencing (OPN1MW) (Fig. 2 Additional file 1: Note: Vision analysis).

Olfaction evolutionary analysis

Olfactory receptors (ORs) in kiwi were annotated using both the Augustus de novo gene prediction and the Maker information after scaffold positions were checked and redundant sequences were removed.

We then performed four steps (Additional file 1: Figure S12):

Functional ORs from chicken [45] were downloaded and aligned against the kiwi transcriptome using TblastN with default parameters. After collecting overall hits for each query (every chicken OR served as query), identical (same) hits from each run were removed to obtain a non-redundant dataset.

A Pfam search against the kiwi proteome with a default e-value cutoff of 1.0 was used to identify sequences that contained 7tm_4 domain (olfactory domain).

The 7tm_4 domain was searched against the kiwi proteome by a CDD search (conserved domain database search).

Separate HMM profiles were built from conserved 7tm regions of functional ORs of chicken, turkey, and zebra finch obtained from previous studies [45]. Using the three HMM profiles, HMM searches were performed against the kiwi proteome and non-redundant hits were retrieved from combined results of all three searches.

A CD-HIT (Cluster Database at High Identity with Tolerance) was performed to remove identical sequences with a cutoff of 100 %. Preliminary phylogenetic analysis was performed using a maximum likelihood approach (Additional file 1: Note: Olfactory receptor genes identification and annotation). Non-ORs were removed if they clustered separately from ORs. We excluded pseudogene candidates if at least one premature stop codon and/or frameshifts could be identified in the kiwi sequence.

OR repertoire estimates were curated based on genomic coverage calculated using samtools mpileup version 0.1.18 [80] on the alignment of the 240 bp, 420 bp, 800 bp insert-size libraries to AptMant0 (Additional file 1: Note: Olfactory receptor genes identification and annotation). The correction factor for each annotated OR was obtained by dividing the read coverage in that region to the GC-content corresponding average coverage over the entire genome. For example, if an OR sequence had a GC content of 50 %, we calculated the average genome-wide coverage corresponding to the GC bin of 50 % to be 35-fold (Additional file 1: Note: Genome coverage and estimation of genome size Additional file 1: Figure S13). Given a coverage in the respective OR region of 105-fold, we obtained a correction factor of 3 after dividing the OR sequence coverage (that is, 105-fold) by the GC-bin corresponding coverage (that is, 35-fold). The final number of estimated ORs was obtained by multiplying the number of initially annotated genes with their corresponding correction factors.

Using the same annotation procedure, the OR gene repertoire was estimated in all bird and reptile genomes from Ensembl 74, two nocturnal birds (chuck-will’s-widow and barn owl) and two Palaeognathae (ostrich and tinamou) for comparative phylogenetic analysis with the kiwi OR dataset. All obtained OR genes were then aligned using MAFFT [81] v7, with BLOSUM62 as the scoring matrix and default settings of option E-INS-I. Phylogenetic analyses were run using both maximum likelihood (ML) and neighbor joining (NJ) methods (Additional file 1: Note: Comparative phylogenetic analysis on ORs from kiwi and other bird and reptile genomes). The reliability of the phylogenetic trees was evaluated with 500 bootstrap replicates.

We calculated Shannon entropy (H) using within species multiple sequence alignments of γ ORs for all birds and reptiles genomes separately with a built-in function from BioEdit [82] (Additional file 1: Note: γ-c clade OR within-species protein sequence entropy).

Kiwi morphology

Previously characterized wing development genes [53] were assigned orthologs in kiwi, chicken, zebra finch, and turkey (Additional file 1: Figure S3 Additional file 1: Table S12). We aligned the sequences and multiple alignments were translated and manually inspected for sequence differences as well as insertions/deletions and rearrangements. We examined selective pressures under the branch models implemented in CODEML [24]. The one-ratio model (model = 0, NSsites = 0) was used to estimate the same ω ratio for all branches in the phylogeny. Then, the two-ratio model (model = 2, NSsites = 0), with a background ω ratio and a different ω on the kiwi branch, was used to detect selective pressure acting specifically on the kiwi branch. These two models were compared via a LRT (1 degree of freedom), as mentioned above [83].

Scaffolds and isolated contigs harboring (putative) HOX genes were identified by BLAST and mapped to all 673 sauropsid HOX protein sequences from GenBank. Traduzido HOX sequences of Apteryx were aligned to the HOX proteins extracted from Genbank and differences were identified by manual inspection. Potential regulatory sequences in the HOX cluster region were identified by phylogenetic footprinting using tracker2 [84] (Additional file 1: Figure S4).

To retrieve the entire coding region of the FIBIN gene in kiwi, we designed primers based on the chicken and ostrich sequence (Additional file 1: Table S14). Using the 276-bp fragment amplified by Sanger sequencing, we blasted transcriptome sequences from kiwi and iteratively assembled the entire coding sequence. Desde a FIBIN showed signs of positive selection in the preliminary analysis as described above, extended selection analysis was performed using 15 species: human, mouse, bat, whale, dolphin, turtle, lizard, python, flycatcher, chicken, zebra finch, frog, zebrafish, and pufferfish (Additional file 1: Note: Fibin identification and selection analysis Additional file 1: Figure S5). The branch-site tests were used to detect signals of selective pressure on each branch (NSsites = 2, model = 2, compared to the same model but with omega fixed to 1, via LRT). Amino acid changes with signs of selection and specific for the kiwi were visualized in both sequenced individuals.

Chicken UCNEs annotations were downloaded from the ultra-conserved non-coding element UCNEbase [55]. Orthologous regions in Apteryx mantelli e Struthio camelus, Tinamus guttatus, Tyto alba, Antrostomus carolinensis genomes, downloaded from GigaDB [13], and birds from Ensembl 74 [14] Ficedula albicollis, Taeniopygia guttata, Anas platyrhynchos, e Meleagris gallopavo were established using Blast 2.2.25 [85] with ‘blastn’ and default parameters. Gallus gallus genome Ensembl 74 was used as control in the orthology assignment. Orthologous regions from each of the species were aligned [86] to the reference UCNE and the number of mismatches between the UCNE and the target genomes were determined (Additional file 1: Note: Ultra-conserved non-coding elements analysis).

Disponibilidade de dados

Assembly, raw DNA, and RNA sequencing reads have been deposited in the European Nucleotide Archive under the BioProject with accession number: PRJEB6383.

HOX Cluster annotation files were deposited on [87] and [88].

UCNEs multiple fasta files and analysis have been deposited on [89].

The kiwi FIBIN sequence was deposited in GenBank under BankIt 1821198 FIBIN KR364000.


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