Em formação

Volume máximo de carga para gel de agarose com pente de 10 poços


Quero carregar meu gel de agarose com meus produtos de PCR, que são reações de 50 µL.

Estou me perguntando quanto dessa reação eu posso carregar em um poço se usar um minigel de agarose padrão (pente de 10 poços, espessura de ~ 8 mm, 1,2%).

Devo tentar carregar todos os 50 µL em um poço ou devo dividi-los em dois?

desde já, obrigado

Phil


Quantas amostras você tem? Você pode prender os dentes vizinhos do pente para criar poços de largura dupla ou tripla para carregar mais amostra.

Normalmente não carrego mais que cerca de 20 µL.

Você também pode tornar o gel potencialmente mais espesso.


Espessura recomendada de géis de agarose

Temos tido alguns problemas no laboratório com os géis de agarose, a qualidade dos géis de agarose TAE de alguma forma caiu.

Ao conversar com um colega de laboratório sobre isso, ele insistiu que os géis deveriam ser muito finos para os melhores resultados, enquanto eu aprendi durante o treinamento que géis grossos são melhores, porque funcionam de maneira mais uniforme.

O teste em laboratório seria muito difícil, porque geralmente trabalhamos com produtos de PCR que variam muito em sua eficiência.

Alguém tem alguma experiência com espessura de gel?

Interessante. A única razão pela qual opto por géis mais espessos é se minha reação for um grande volume. Se eu estiver executando um resumo de 50ul, usarei os pentes grossos e tornarei o gel espesso o suficiente para caber no volume da reação. Eu não tive nenhuma experiência onde os géis mais finos funcionaram de forma desigual.

Concordo totalmente com isso. A única vantagem de um gel mais espesso é que você pode colocar mais em uma faixa. Caso contrário, géis mais finos sempre produzirão uma imagem muito mais bonita, em minha experiência.

Não consigo ver a espessura afetando a qualidade, apenas o que você pode carregar. Dependendo de como você está visualizando o DNA, a espessura pode desempenhar um pequeno papel.

Quando você diz que está tendo problemas, suas escadas também são afetadas? O que exatamente não está funcionando com eles (por exemplo, migração ou visualização)? Eu ficaria preocupado com o lote de buffer ruim (isso não é incomum) ou agarose estragando (isso acontece). Você pode solucionar isso pegando emprestado um pouco de um laboratório diferente para ver se alguma coisa foi resolvida. Além disso, como você está visualizando? EtBr em gel, coloração pós-execução, SYRB ou alternativa? Além disso, dependendo do sistema de fundição, você deve ser capaz de pesquisar a espessura recomendada do fabricante e # x27s, qual delas você está usando?

Acabei de perceber que não toquei em tudo no meu post original, desculpe por isso. Soo.

Não estávamos usando escadas nos géis, procuramos apenas uma ou duas bandas.

Os tampões e a agarose têm uma vida útil muito curta em nosso laboratório, usamos cerca de 50 a 100 géis por semana. Além disso, também executamos géis TAE a 2% e SB a 2%, ambos com a mesma agarose, os géis TAE com o mesmo tampão, e esses têm resultados satisfatórios. Os géis originais mencionados são de 3%.

Estamos fazendo uma coloração pós-corrida com EtBR, com 1% de EtBr diluído 1: 10.000 no respectivo tampão. Normalmente, nós manchamos por 30 a 60 minutos e, em seguida, fotografamos sob luz ultravioleta (as lâmpadas ultravioleta estão ok, foram trocadas na semana passada)

O sistema de fundição é incorporado dentro das câmaras de gel, que são feitas sob medida na oficina de nossa universidade local. Nenhuma recomendação lá.


Pente Mini-PROTEAN, 15 poços, 1,0 mm, 26 e mul # 1653360

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Volume máximo de carga para gel de agarose com pente de 10 poços - Biologia

Como fazer um gel de agarose para eletroforese

A agarose é cara, então não a desperdice. Não faça um gel enorme se não tiver muitas amostras para testar ou se não precisar testá-las tão longe.

Os géis são descritos em termos de porcentagens: 0,7%, 0,8%, 1% e 1,2% são porcentagens de gel bastante comuns. A porcentagem de gel que você executa depende de algumas coisas: o tamanho do fragmento que você está procurando, quão boa você precisa que a separação dos fragmentos seja e se você vai ou não ser fatias de gel do Gene Cleaning depois de submetê-las à eletroforese.

A medição da porcentagem é uma questão de peso / volume. Por exemplo, um gel 100% seria 100g de agarose em 100mL de TAE. (TAE é Tris-Acetato-EDTA, é um tampão e fazemos géis com TAE e os executamos em tampão TAE.) Você não faria um gel 100%, no entanto, era apenas um exemplo. Mais comumente, um gel a 1% seria 1g de agarose em 100mL de TAE.

Temos caixas de gel e bandejas de fundição que variam em tamanho. O volume de gel que você precisará fazer dependerá do tamanho da bandeja de moldagem. Para as bandejas de gel menores, 30-40mL é um volume conveniente. Os poços do gel são feitos inserindo-se um pente nas ranhuras da bandeja e, à medida que a agarose endurece ao redor do pente, poços são formados. Quanto mais espesso você derramar o gel, mais profundos serão os poços.

Para fazer um gel, primeiro descubra o volume que você deseja. Você pode derramar água na bandeja e quando os poços parecerem profundos o suficiente, você pode registrar o volume e fazer o seu gel usando esse volume. Alternativamente, você pode fazer uma determinada quantidade de gel e examiná-lo enquanto o despeja, guardando o resto em um frasco com filme plástico na parte superior (para que o TAE não evapore com o tempo).

Em seguida, descubra que massa de agarose usar para a porcentagem de gel desejada. Por exemplo, se você estiver fazendo um gel de 30mL que deseja que seja 0,8%, a quantidade de agarose a ser usada é 0,24g. Meça a agarose usando papel para pesar cera. Nós mantemos um pouco de agarose em um frasco de cintilação perto da balança, de forma que você não precise de uma espátula para medi-la. Coloque a agarose em um frasco Erlenmeyer. Meça o volume correto de TAE usando um cilindro graduado. 1X TAE está em um jarro perto da porta. Agite o conteúdo do frasco e cubra a parte superior com uma toalha de papel.

Coloque seu gel no microondas pelo tempo que for necessário para derreter completamente. Você não quer partículas em seu gel. Tenha cuidado para não se queimar, porque estará quente. Deixe esfriar na bancada por cerca de cinco minutos (se você estiver com muita pressa, pode correr água sobre a superfície do frasco para esfriá-lo).

Em seguida, adicione brometo de etídio - este é um produto químico que intercala o DNA e o torna visível sob a luz ultravioleta. EtBr é um mutagênico potente, portanto, certifique-se de não deixar nenhum nos seus dedos ou em você, e não o espalhe pelo laboratório. Você pode querer usar luvas. A quantidade de EtBr a ser adicionada é a seguinte: de uma solução estoque de 0,5mg / mL (que é a maioria das coisas no laboratório), adicione 1/1000 ao seu gel. Por exemplo, se voltarmos ao nosso gel de 30 mL, então você adicionaria 30 & degL de EtBr.

As bandejas de fundição que temos têm esse material de borracha em torno das bordas que faz uma vedação firme quando você as coloca nas caixas de gel de lado. Eles também têm entalhes onde você pode inserir um pente. O tamanho do pente a ser usado depende da largura que você deseja que seus poços tenham. Agite o frasco imediatamente antes de derramar o gel na bandeja para ter certeza de que está quase todo na mesma temperatura, caso contrário, o gel endurecerá de uma maneira estranha e ficará estragado. Um gel pequeno levará cerca de 20 minutos para endurecer o suficiente para ser usado, mais tempo para géis maiores. Se você estiver com muita pressa, pode colocá-los na sala fria.

Quando terminar de derramar o gel, enxágue muito bem o Erlenmeyer com água antes de colocá-lo na tina de lavagem, porque quem estiver lavando a louça não vai querer se sujar de EtBr. Além disso, a agarose endurecida é difícil de limpar de vidraria.


Eletroforese em gel de DNA

A eletroforese em gel de DNA é uma técnica usada para a detecção e separação de moléculas de DNA. Um campo elétrico é aplicado a uma matriz de gel composta de agarose e, dentro do gel, as partículas de carga migram e se separam com base no tamanho. Os fosfatos carregados negativamente da estrutura do DNA fazem com que os fragmentos de DNA se movam em direção ao ânodo - um eletrodo carregado positivamente.

O vídeo explica o mecanismo pelo qual os fragmentos de DNA são resolvidos em um gel de agarose e fornece um procedimento generalizado passo a passo sobre como preparar géis de agarose, carregar amostras de DNA, executar um gel de DNA, visualizar fragmentos de DNA e descartar adequadamente do gel e tampão de corrida após a conclusão do experimento.

Procedimento

Eletroforese em gel de DNA é uma técnica usada para separar e identificar fragmentos de DNA com base no tamanho.

Fragmentos de DNA de vários tamanhos são carregados em um gel poroso feito de agarose & # x2013, um carboidrato encontrado em algas vermelhas.

Quando um campo elétrico é aplicado, os fragmentos migram através do gel, graças aos grupos fosfato carregados negativamente nos nucleotídeos do DNA.

Pedaços menores de DNA migrarão mais facilmente através do gel do que fragmentos maiores, que têm mais dificuldade de se mover através da matriz do gel.

Quando a execução do gel estiver concluída, a localização de suas amostras de DNA pode ser comparada a uma série de fragmentos ou bandas de tamanhos conhecidos, chamados de escada de DNA.

A presença de seu fragmento de interesse pode então ser confirmada com base em seu tamanho, que é determinado pela comparação da localização relativa de sua amostra de teste com os fragmentos da escada.

Os géis de agarose são preparados usando uma solução de porcentagem de peso sobre volume. Portanto, 1 grama de agarose em 100 ml de tampão formará um gel a 1%. Géis de porcentagem mais baixa resolverão melhor os fragmentos maiores e géis de porcentagem mais alta tornarão os fragmentos menores mais fáceis de identificar. Para iniciar o procedimento de fabricação do gel, pese a massa apropriada de agarose em um frasco Erlenmeyer.

Adicione o tampão de corrida ao frasco, de modo que o volume do tampão não seja maior que 1/3 da capacidade do frasco. Em seguida, gire para misturar.

Derreta a mistura de agarose / tampão aquecendo em um microondas na potência máxima. A cada trinta segundos, remova o frasco e agite o conteúdo para misturar bem. Repita até que a agarose esteja completamente dissolvida.

Em seguida, adicione brometo de etídio a uma concentração de 0,5 mg / ml. O brometo de etídio é um composto aromático que se encaixa entre pares de bases individuais de DNA, ou intercala, e faz com que o DNA emita fluorescência laranja intensa sob luz ultravioleta. É importante observar que o brometo de etídio é cancerígeno, portanto, sempre se use luvas ao manusear géis que contenham este composto.

Para evitar que a bandeja de gel deforme, deixe a agarose esfriar colocando-a em banho-maria a 65 & # 186C.

Enquanto a agarose está esfriando, prepare o molde de gel, colocando a bandeja de gel no aparelho de fundição. Como alternativa, você pode usar fita adesiva para selar as bordas abertas da bandeja de gel para criar o molde. Colocar um pente no gel cria os poços onde o DNA é carregado. Certifique-se de que o pente criará um poço do tamanho apropriado para sua amostra de DNA.

Despeje a agarose fundida no molde de gel e deixe endurecer em temperatura ambiente.

Após o endurecimento da agarose, retire o pente. Se o gel não for usado imediatamente, embrulhe-o em filme plástico e guarde a 4 & # 186C até o uso.

Se o gel for usado imediatamente, coloque-o na caixa de gel.

Para iniciar este procedimento, adicione corante de carregamento de gel às amostras de DNA a serem separadas. O corante de carregamento é normalmente feito em uma concentração de 6X. Carregar corante ajuda a visualizar e carregar amostras nos poços e ajuda a determinar o quão longe as amostras migraram durante a execução.

Defina a fonte de alimentação para a tensão desejada.

Agora adicione tampão de corrida suficiente na caixa de gel para cobrir a superfície do gel. Certifique-se de usar o mesmo tampão de corrida usado para preparar o gel.

Conecte os cabos da caixa de gel à fonte de alimentação e ligue-a. Lembre-se de que o DNA tem carga negativa e se moverá em direção ao ânodo, que é positivo e geralmente de cor vermelha. Certifique-se de não conectar o cabo preto, ou cátodo, ao fundo da caixa de gel. Para não se esquecer, lembre-se de que gatos pretos dão azar, ou negativos, e que o CAThode preto é, portanto, negativo. Passe o gel para o vermelho, ou ânodo. Para verificar se a caixa de gel e a fonte de alimentação estão funcionando, o aparecimento de bolhas nos eletrodos indica que a corrente está passando.

Remova a tampa da caixa de gel. Coloque lenta e cuidadosamente as amostras de DNA no gel. Novamente, o corante de carregamento na amostra permite que a amostra afunde no gel e ajudará a rastrear o quão longe a amostra viajou. Um marcador de tamanho de DNA, ou escada, deve sempre ser carregado junto com as amostras experimentais.

Substitua a tampa. Verifique novamente se os eletrodos estão conectados nas ranhuras corretas da fonte de alimentação.

Ligue a energia. Execute o gel até que o corante tenha migrado para uma distância apropriada.

Quando a eletroforese terminar, desligue a fonte de alimentação e remova a tampa da caixa de gel.

Remova o gel da caixa de gel e escorra o excesso de tampão na superfície do gel. Coloque a bandeja de gel em toalhas de papel para absorver qualquer tampão restante em execução.

Para visualizar os fragmentos de DNA, remova o gel da bandeja de gel e exponha o gel à luz ultravioleta.

O fragmento de DNA deve aparecer como bandas fluorescentes laranja. Tire uma foto do gel.

No final do experimento, descarte adequadamente o gel e o tampão de corrida de acordo com os regulamentos da instituição. Novamente, lembre-se de sempre manusear o gel e os tampões corridos com luvas para evitar a exposição ao brometo de etídio.

Agora que você viu como realizar a eletroforese em gel de DNA. Vamos dar uma olhada em alguns aplicativos downstream e variações desse método altamente útil.

Aqui você vê um resultado de eletroforese em gel de agarose após a separação dos produtos de PCR. Os fragmentos de DNA carregados no gel são visíveis como bandas claramente definidas. O padrão ou escada de DNA deve ser separado a um grau que permita a determinação útil dos tamanhos das bandas de amostra. Neste exemplo, fragmentos de DNA de 765 pares de bases, 880 pares de bases e 1022 pares de bases são separados em um gel de agarose a 1,5% com uma escada de DNA de 2 log.

Além de confirmar a presença de um fragmento de DNA de interesse, a eletroforese em gel de DNA pode ser combinada com procedimentos de purificação em gel. Normalmente, uma lâmina de barbear é usada para cortar o fragmento de DNA de interesse, para que ele possa ser coletado e a amostra de DNA dentro dele recuperada.

A eletrofese em gel de agarose também pode ser combinada com transferência de transferência, que envolve permitir que o DNA, ou RNA, seja transferido para uma membrana de celulose, onde sondas radioativas podem ser usadas para identificar sequências específicas de DNA ou RNA em sua amostra separada por eletroforese.

A eletroforese em gel de DNA padrão não é ideal para a separação de DNA de alto peso molecular com tamanho superior a 15-20 kb, como o DNA genômico. Para separar grandes amostras de DNA, é usada a eletroforese em gel de campo de pulso, que envolve sujeitar o gel a um campo elétrico variável ou pulsante em diferentes direções. Essa técnica envolve um aparelho de corrida de gel especializado, que possui pares de eletrodos dispostos em diferentes orientações ao redor do gel. Isso pode ser usado para detectar diferenças nos tamanhos do genoma entre populações de organismos, como as amostras de DNA agrupadas de diferentes comunidades microbianas, que você vê aqui, que são retiradas de diferentes ambientes de lagos.

Você acabou de ver uma introdução à eletroforese em gel de DNA. Mostramos o conceito por trás do método, como preparar o gel de agarose, como carregar suas amostras, como executar o gel e analisá-lo e algumas aplicações comuns da eletroforese em gel de agarose. Obrigado por assistir e boa sorte na execução do seu gel.


Purificação de gel após digestão de restrição - (10/11/2005)

Gostaria de saber se ainda é possível realizar uma extração de fenol de um digest de restrição se eu acidentalmente adicionar buffer de carga à minha amostra. há algo mais que eu preciso adicionar?

Ah, agora vejo o seu problema, como já respondi antes, eu correria tudo em um gel.

mantenha sua amostra de DNA a 4C enquanto prepara um gel com porcentagem de agarose adequada e tamanho de poço adequado.

Se você carregar todo o seu plasmídeo digerido por restrição em um gel (para executar tudo, você pode combinar ranhuras / poços com fita) e, então, poderá isolar facilmente e com segurança o DNA do gel com uma coluna.

Para uma digestão de 50ul geralmente uso o seguinte gel:
0,7 ou 0,8% de gel de agarose se for para isolamento de plasmídeo
usando uma bandeja de gel média (não sei agora o tamanho), eu uso 2 poços combinados com fita (de um pente de 16 poços) para carregar 50ul de amostra. Geralmente se encaixa bem, mas se você tiver dúvidas sobre como fazer esse tamanho duplo bem, execute a amostra em diferentes poços e isole o DNA do gel para cada pista.

Após eluir o DNA da matriz da coluna com o mínimo de volume de H2O possível (15 ul talvez) e combinar todas as alíquotas purificadas.

Se sua pergunta é apenas sobre como tirar o DNA - sim, você pode. buffer de carga em sua natureza não interfere com a qualidade do DNA ou o próprio DNA.

Você pode executar a amostra em um gel e purificar ou ir para a extração de clorofórmio fenol. Sem problemas.

Gostaria de saber se ainda é possível realizar uma extração de fenol de um digest de restrição se eu acidentalmente adicionar buffer de carga à minha amostra. há algo mais que eu preciso adicionar?


Sequenciamento¶

Esta seção explica como compor o vetor e inserir o DNA de maneira geral.

Procedimento¶

Isso leva pelo menos quatro dias para extrair o DNA do plasmídeo ligado.

Prepare amostras (várias horas)

Ver Amplificação de PCR seção para detalhes. Após a amplificação, é necessário purificar o DNA do produto porque existem polimerase / endonuclease e essas proteínas podem afetar as etapas posteriores.

Se você quiser usar DNA extraído do plasmídeo, certifique-se de que a concentração da amostra é suficiente.

Estimar a concentração da amostra (1 hora)

Use a seguinte fórmula para calcular a massa necessária para digestão

Mensagem do sistema: ERROR / 3 (/home/docs/sites/readthedocs.org/checkouts/readthedocs.org/user_builds/molecular-biology-protocols/checkouts/latest/DNA.rst, linha 562)

Comando LaTeX desconhecido: pontos

Digere a massa apropriada da amostra de DNA. Ajuste o volume da solução de digestão com | ddH2O | . Ver Restriction Digest seção para detalhes. A seção assumiu a mesma condição deste procedimento.

Após digerido, precipitar para 10 | ul | por Precipitação de etanol

Ver Ligadura de DNA seção para detalhes. A seção assumiu a mesma condição deste procedimento.

Transformação (durante a noite)

Ver Protocolos para | E.coli | protocolos para detalhes. Incubar a 37 | C | durante a noite

Ver Protocolos para | E.coli | protocolos para detalhes. Na maioria das vezes, 5 colônias para cada amostra são suficientes para escolher (depende da dificuldade de ligação)

Isolamento de Colônia Única (durante a noite)

Transferir a colônia isolada para o meio (durante a noite)

Para extrair o DNA do plasmídeo, escolha uma colônia e dilua-a para 2 | ml | de SOC e incubar a 37 | C | durante a noite


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Como preparar e carregar um marcador de gel de campo pulsado

Neste vídeo, vou demonstrar como usar e carregar um marcador de campo de gel pulsado, ou marcador PFG. Os marcadores NEB PFG vêm em tampões de agarose sólidos contidos em seringas.

1. Faça Gel para Sistema PFGE

Primeiro, você precisará fazer um gel para o seu sistema de eletroforese PFG. Recomendamos fazer um gel de agarose a 1% com um tampão TBE 0,5X.

Para isso, você precisa de um sistema de fundição de gel compatível com o seu sistema PFGE e um banho-maria previamente ajustado para 60 ° C. Este molde de gel tem 13 cm x 13 cm, o que requer uma solução de gel de agarose de 150 ml.

Em um frasco de 500 ml, adicionar 135 ml de água purificada. Em seguida, adicione lentamente 1,5 g de agarose ao frasco. Agite o frasco para dispersar o pó de agarose na solução. Pesar o frasco e aquecer no micro-ondas por 2 minutos. Pese o frasco novamente e adicione água para retornar o frasco ao seu peso original e misture bem. Adicione 15 ml de tampão TBE 5X. Misture suavemente para minimizar as bolhas de ar. A solução de agarose está então pronta.

Transfira 4 ml da agarose fundida para um tubo cônico de 15 ml e coloque em banho-maria a 60 ° C. Esta alíquota será usada posteriormente para selar os poços contendo os plugues do marcador PFG.

Despeje o restante da solução de agarose quente do frasco em sua bandeja de moldagem de gel. Deixe o gel esfriar em temperatura ambiente até solidificar. Normalmente, cerca de 30 a 60 minutos.

Assim que o gel solidificar, remova a alíquota de 4 ml do banho-maria e deixe esfriar em temperatura ambiente por cerca de 4 a 5 minutos enquanto carrega os plugues do marcador PFG sólido no gel.

Não deixe a agarose solidificar, pois você precisará que esta agarose esteja no estado líquido para selar os poços.

No entanto, é importante que a agarose não esteja muito quente, pois pode derreter os tampões dos poços.

2. Carregar escada no gel

Para carregar os plugues do marcador PFG, remova-os do freezer e extraia a agarose da seringa com cuidado. Corte um plugue da extremidade com uma lâmina limpa e afiada. Quanto mais fino e plano for o plugue, melhor. Recomendamos um tamanho de plug entre 5 e 10 & microl. Para referência, um plugue de 10 µg corresponde a uma pequena graduação na escala de volume da seringa.

Coloque o tampão na frente do poço, empurrando-o cuidadosamente com a ponta da pipeta limpa. Em seguida, selar o poço com a agarose fundida, que agora está um pouco acima da temperatura de gelificação.

Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar nos poços. Se a agarose fundida estiver muito quente quando você selar os poços, o calor fará com que os concatemers Lambda se desnaturem, o que pode resultar em um padrão de banda anormal, por isso é importante resfriar a agarose fundida antes de selar.

Após selar os poços, deixe a agarose solidificar por cerca de 5 minutos em temperatura ambiente. Assim que os poços solidificarem, o gel estará pronto para ser executado.

Insira o gel em seu sistema PFG, contendo tampão de corrida TBE 0,5X resfriado.

3 Carregue as amostras e execute o gel

Carregue as amostras de DNA líquido e execute o programa de migração apropriado.

4 Gel de Coloração

Quando a migração for concluída, remova o gel do sistema PFG e corante com seu corante de visualização preferido. Agora você está pronto para capturar uma imagem do seu gel.


Volume máximo de carga para gel de agarose com pente de 10 poços - Biologia

Os gel de poliacrilamida podem separar pequenos fragmentos de DNA (5-1000 pares de bases) de maneira eficaz. A resolução e a capacidade dos géis de poliacrilamida são geralmente maiores do que as das agaroseonas. Os fragmentos purificados podem então ser usados ​​para clonagem, sequenciação ou marcação. Os protocolos nesta unidade descrevem o derramamento e a eletroforese de géis de poliacrilamida não desnaturantes. Além disso, a eluição dos fragmentos de DNA marcados ou não separados dos géis por difusão passiva (protocolo básico) ou eletroeluição (protocolos alternativos) é discutida.

O protocolo básico descreve a preparação de géis de poliacrilamida para separação de pequenos fragmentos de DNA de fita dupla. Após a configuração do gel, as amostras de DNA são carregadas, submetidas à eletroforese através do gel e, finalmente, purificadas das fatias de gel.

Tampão de eletroforese TBE 10x e 1x, pH 8,0 (APÊNDICE 2)
29: 1 (w / w) acrilamida / bisacrilamida (consulte Reagentes e Soluções)
TEMED (N, N, N ', N' -tetrametiletilenodiamina)
10% (p / v) de persulfato de amônio (em água "com 1 mês de idade, armazenar a 4 ° C)
Buffer de carregamento 10x (UNIDADE 2.5)
Marcadores de peso molecular de DNA: por exemplo, pBR322 cortado com Hin fI ou M13 cortado com Hpa II
0,5mg / ml de brometo de etídio
Tampão de eluição, pH 8,0
100% e 70% de etanol
Tampão de TE, pH 7,5 (APÊNDICE 2)
Acetato de sódio 3M (APÊNDICE 2)
Placa de cromatografia em camada fina (TLC) com indicador fluorescente (por exemplo, Sílica GelF-254 ou IB-F)
Placas de vidro, espaçadores e pentes para despejar géis
Aparelho de eletroforese de acrilamidegel
Fonte de alimentação DC
Seringa equipada com tampão de lã de vidro silanizada (UNIDADE 5.6) ou filtro de 2 micron
Rotor BeckmanJA-20 ou equivalente

Reagentes e equipamentos adicionais para precipitação de etanol (Protocolos AtuaisUNIT2.1)

1.Monte o aparelho de fundição de gel.

Gelspacer e sistemas de fundição foram desenvolvidos para evitar vazamentos. Aqueles que evitam selar o gel com fita adesiva são os melhores e, recentemente, botas de fundição de gel sem espaçadores inferiores tornaram-se disponíveis (GibcoBRL). Lubrificar os espaçadores laterais / inferiores ou derramar um tampão de agarose para o gel não é necessário se algum cuidado for tomado para garantir que a parte inferior da montagem da placa esteja completamente vedada. Limpe bem as placas de gel, lavando-as com água morna e sabão e, em seguida, enxágue com etanol: água. No entanto, se as placas estiverem particularmente sujas ou se for necessária a remoção completa de quaisquer ácidos nucleicos residuais, as placas podem ser embebidas em NaOH 0,1 M por 30 minutos antes da lavagem. Se o gel for particularmente fino (& lt1 mm), a silanização de uma ou ambas as placas (APÊNDICE 3) facilita a separação pós-eletroforese do gel da placa.

2. Prepare a solução de gel (consulte a Tabela 2.7.1 para obter as concentrações de acrilamida adequadas para a resolução de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes). Para um gel de poliacrilamida a 5% não desnaturante de 20 cm x 16 cm x 1,6 mm, 60 ml de solução de gel são suficientes, e pode ser feito misturando o seguinte:

6ml tampão TBE 10x
10ml de acrilamida / bisacrilamida 29: 1
44ml de agua

A distância de migração (D) de DNA de fita dupla através de um gel não desnaturante é inversamente proporcional ao log de seu peso molecular (D & Aring-log (MW)). Escolha uma concentração de acrilamida que permitirá que os fragmentos de DNA desejados migrem aproximadamente metade a três quartos do caminho através do gel quando o corante de carga atingiu o fundo do gel. Além disso, observe que a composição de base de uma sequência afeta sua mobilidade eletroforética e pode causar migração aberrante.

Use um frasco com boca larga e bico para verter.

Cuidado: Sempre use luvas, óculos de segurança e máscara cirúrgica ao trabalhar com pó de acrilamida, pois é uma neurotoxina.

Soluções de poliacrilamida preparadas comercialmente (National Diagnostics) estão disponíveis e são altamente recomendadas, uma vez que têm longa vida útil e não envolvem a acumulação do pó de acrilamida neurotóxico.

3. Agite vigorosamente a solução por aproximadamente 1 minuto com agitação magnética para garantir a mistura completa.

4. Adicione 34 ml de TEMED e agite o frasco para garantir uma mistura completa. Imediatamente adicione 250 ml de APS a 10% e misture bem. A POLIMERIZAÇÃO COMEÇOU SOB AS ETAPAS DE SUCESSO DEVEM SER REALIZADAS IMEDIATAMENTE. Pour the acrylamide betweenthe gel plates and insert the comb. Clamp the comb in place at the topof the gel to avoid separation of the gel from the plates as the acrylamidepolymerizes. Allow the gel to polymerize for approximately 30 minutes.

Forthick gels, pour the acrylamide directly from the mixing flask, but forthinner ones, a syringe fitted with a needle is useful. By pouring thegel slowly with a tilt 45° relative to the bench top and starting fromone corner, bubbles may be largely avoided. Also, polymerize the gel whileit is lying flat to avoid undesirable hydrostatic pressure on the gel bottom.

TEMEDmay be stored indefinitely at 4°C, but the ability of APS to efficientlyinitiate the free radical induced acrylamide polymerization diminishesgreatly over time. Make a new stock every month and store at 4°C.

Caution:Be sure to wear safety glasses while pouring the gel since splashing ofthe neurotoxic, unpolymerized acrylamide is common.

5.After polymerization is complete, remove the comb and any bottom spacersfrom the gel. Wash the gel plates free of spilled acrylamide and be surethat the spacers are properly seated and clean.

6.Fill the lower reservoir of the electrophoresis tank with 1X TBE. Initially,place the gel into the lower tank at an angle to avoid air bubbles formingbetween the plates and the gel bottom. Clamp the gel plates to the topof the electrophoresis tank and fill the upper reservoir with 1X TBE sothat the wells are covered.

Asyringe with a bent needle may be used to remove air bubbles trapped underthe gel that will disrupt the current flow.

7.Use a DC power supply to prerun and warm the gel for a least 30 minutesat 5 V/cm (constant voltage).

8.Add 10x loading buffer to DNA samples and molecular-weight markers (to1x final) and load on gel.

Loadan amount of DNA that correlates with the visualization technique to beused. If the sample is to be UV shadowed (UNIT 2.12), then 2 mg of DNAwill be required per band in a 2 cm x 2 cm x 1.6 mm well. Ethidium bromidestaining lowers the detection limit to 15 ng DNA per band. If good resolutionis desired, then only 25 mg of material should be loaded per 2 cm x 2 cmx 1.6 mm well.

Plasticdisposable pipette tips are available in a variety of styles and sizes.Choose one that fits the application. Alternatively, particularly for largervolumes, use a micropipette or pulled plastic capillary, prepared as describedin the support protocol.

9.Run the gel at about 5 V/cm, taking care to avoid excessive heating. Shorterelectrophoresis times may be achieved by running the gel at higher voltagein a cold room so long as the temperature of the gel remains below thedenaturation temperature of the sample. Run the gel until the desired resolutionhas been obtained as determined empirically or from Table 2.7.1.

From2 to 10 V/cm is acceptable. If the gel is noticeably warm to the touch,the samples in the middle will run faster or may even be denatured.

11.Turn off the power supply, and detach the gel plates from electrophoresisapparatus. Carefully pry apart the plates such that the gel is still attachedto one plate.

12.Visualize the DNA with UV shadowing (UNIT 2.12) if appropriate (sample2 mg or greater) Otherwise, stain the gel while it is still attached tothe plate for 5 to 10 min in 0.5 mg/ml ethidium bromide. If necessary,soak the gel and plate in water for 10 to 30 min to remove non-intercalatedethidium bromide and lower the background absorption.

13.Carefully wrap the gel and plate with plastic wrap. Invert and place thegel onto a UV transilluminator and photograph.

LongwaveUV light transmits through plastic wrap. Alternatively, the gel can beput directly on the transilluminator. If a photograph is not required,a longwave UV light may be shined onto the stained preparative gel to locatethe DNA fragment of interest. Avoid unnecessarily long UV exposure whichwill damage the nucleic acids. Unpolymerized acrylamide absorbs stronglyat 211 nm and may also cause shadowing that is confined to the edges andwells of the gel.

14.Cut out the desired DNA band with a scalpel or razor blade.

15.Crush the gel into many fine pieces by pushing it through a 3 ml smallbore disposable syringe to aid the diffusion of the DNA from the matrix.

Ifyou plan to use electroelution, omit this step and proceed to the alternativeprotocol.

16.Collect the pieces in an appropriately sized microcentrifuge tube.

17.Add 2 volumes elution buffer for every volume of gel. Incubate the tubewith rotation or in a shaking air incubator at room temperature.

Sinceelution is a diffusion-controlled process, more buffer will aid in elutionefficiency. Also, note that longer DNAs will take longer to diffuse fromthe gel. If speed is essential and high yields are dispensable, enoughsample can be obtained for most experiments in only a few hours of extraction.Increasing the temperature to 37°C will also speed the process. Yieldmay be increased upon repeated elutions. Small fragments (<300 basepairs)should be mostly eluted in 4 hr, but large fragments (>750 basepairs) shouldbe eluted overnight.

18.If the gel slice was cut into pieces, pellet the fragments at room temperaturefor 10 min in a tabletop centrifuge or 1 min in a microcentrifuge. Pipetteoff the supernatant solution, taking care to avoid the polyacrylamide pieces.

19.Recover any residual DNA by rinsing the gel with a small volume of elutionbuffer. Recentrifuge if necessary and combine the two supernatant solutions.

Ifnecessary, remove any remaining acrylamide pieces by filtering the supernatantthrough a syringe equipped with a disposable 0.2 micron filter.

Also,if the volume of elution buffer is too large to allow for convient precipitation,it may be reduced by successive extractions against equal volumes of butanolto concentrate the sample. About 1/5 volume of the aqueous layer is extractedinto the organic butanol layer for every volume of butanol used. If toomuch butanol is added and the water is completely extracted in the butanol,simply add more water and concentrated again.

20.Precipitate the DNA with 2 vol of 100 % ethanol by chilling for 30 minat -20°C or 10 min at -70°C. Pellet DNA by centrifuging 10 minat 12,000 x g .

Itis generally not necessary to add carrier to aid precipitation since thesmall acrylamide polymers released from the gel slice will suffice. Ifcarrier is necessary, then use either 10 mg of carrier such as tRNA orglycogen depending on the application.

21.Redissolve the DNA pellet in 100 ml TE buffer, pH 7.5, and if necessary,transfer to a microcentrifuge tube. Add 10 ml of 3 M sodium acetate, reprecipitatethe DNA with 2 vol of 100 % ethanol, and chill for 30 min at -20°Cor 10 min at -70°C. Recover the DNA by microcentrifugation as in step20.

22.Rinse the pellet twice with 70 % ethanol. After drying, the pellet maybe resuspend in TE buffer, pH 7.5, if appropriate.

Table1 Concentrations of Acrylamide Giving Maximum Resolution of DNA Fragments a
Acrylamide (%) Migrationof
bromphenol
bluemarker (base pairs)
Migrationof
xylenecyanol
marker(base pairs)
3.5 100 460
5.0 65 260
8.0 45 160
12.0 20 70
20.0 12 45
a Data are compiled from articles by Maniatis and Ptashne (1973a,b) andManiatis et al. (1975).
ALTERNATEPROTOCOL: PURIFICATION OF FRAGMENTS BY ELECTROELUTION FROM POLYACRYLAMIDEGELS

Iftime is at a premium, the elution steps (15 to 19) of the basic protocolmay be replaced with the following electroelution protocol for small DNAs(<300 basepairs). Recovery of DNA fragments should be similar to thepassive elution by diffusion.

Additionalreagents and equipment for agarose gel electrophoresis ( UNIT 2.5A )

1.Carry out steps 1 to 14 of the basic protocol. After cutting out the DNAband of interest without crushing, place the gel slab into a small dialysisbag with an appropriate molecular weight cutoff. Use enough 0.5x TBE bufferto surround and immerse the slab.

Thegel slabs are not crushed to allow for easy monitoring of the electroelutionprocess and to speed the elution of the DNA.

Manycommercial apparatus with less cumbersome handling procedures are alsoavailable (Schleicher & Schuell and Sialomed).

2.Place bag in a small horizontal electrophoresis apparatus containing 0.5xTBE buffer.

3.Electrophorese the DNA out of the polyacrylamide gel at

4 V/cm acrossthe apparatus for 2 hr for small DNAs (<300 basepairs) or 6 hours forlonger DNAs.

Becauseelution times are variable and if near complete recovery is required, thegel should be UV shadowed/stained again after elution to insure that theDNA has been quantitatively removed. Should some DNA remain in the gel,

continuethe elution process.

4.Recover the DNA in the 0.5x TBE buffer. Reverse the polarity of the apparatusfor about a minute to free any bound DNA and rinse the gel slab and innersurface of dialysis bag to recover residual DNA.

5.Add 0.1 vol of 3 M sodium acetate and ethanol precipitate as describedin step 21 of the basic protocol (a second ethanol precipitation may bedone if desired).

Polyacrylamidegel electrophoresis (PAGE) offers high resolution of low-molecular-weightnucleic acids. In particular, small DNA fragments (<500 bp) that arepoorly resolved by ordinary agarose gels are easily separated on polyacrylamidegels. Depending on the pore size of the gel (3.5% to 20% polyacrylamide),a separation from 10 to 1000 bp can be achieved. The concentrations ofacrylamide that give the maximum resolution of DNA fragments have beenempirically determined as shown in Table 2.7.1.

Polyacrylamidegels have a much higher capacity for DNA than agarose gels. Up to 15 mgof material can be loaded per 2 cm x 2 cm x 1.6 mm well. This is particularlyimportant for preparation of significant amounts of small fragments. Elutionof fragments from polyacrylamide gels yields DNA that is generally devoidof contaminating material that could interfere with enzymes used in cloning,sequencing, or labeling DNA. These two qualities make polyacrylamide gelsthe preferred method for purifying significant quantities of small fragments.

Apolyacrylamide gel is formed by the polymerization of acrylamide monomersinto long chains, which are further covalently attached by a cross-linkingagent, most commonly N,N '-methylene-bisacrylamide. Polymerizationof a polyacrylamide gel is initiated by free radicals provided by ammoniumpersulfate and stabilized by TEMED. The reaction takes about 10 to 20 minto go to completion, but the reaction rate can be varied by adjusting theTEMED and ammonium persulfate concentrations.

Thepore size of a polyacrylamide gel is determined by the total percentageof acrylamide (the sum of the weights of the acrylamide monomer and cross-linker).Historically, this has been expressed as %T. For example, the 5%T gel describedabove would contain 5% (w/v) of acrylamide plus bisacrylamide. As the %Tincreases, the pore size decreases. An appropriate %T for various rangesof fragment sizes can be determined by using Table 2.7.1. The migrationdistance (D) of double stranded DNA through a nondenaturing gel is inverselyproportional to the log of its molecular weight (DÅ -log(MW)). Also,the base composition of a sequence affects its electrophoretic mobilityand may cause aberrant migration. Size markers of similar composition shouldbe used to confirm the size of the desired fragment. To separate fragmentsover a wide range of molecular weights, a pore-gradient gel can be used.In such a gel the pore size is larger at the top than at the bottom, andthe gel becomes more restrictive as the fragment runs down the gel. Suchgradient gels are difficult to pour, however, and are not commonly used.A general description of gels as electric circuits can be found in theintroduction to this chapter.

CriticalParameters and Troubleshooting

Themost important parameter for the successful separation of small DNA fragmentsby polyacrylamide gels is the polymerization reaction itself. It is importantto use only high-quality electrophoresis-grade reagents when running thegels. Acrylamide and bisacrylamide both break down in solution to acrylicacid, which affects the mobility of molecules through the gel matrix. Acrylamidesolutions should be protected from light and should not be stored for morethan a few months. Commercially prepared polyacrylamide solutions (NationalDiagnostics) are available and highly recommended since they have longshelf lives due to the incorporation of a gaseous inhibitor that preventsthe initiation of polymerization. Ammonium persulfate is stable for approximately1 month at 4°C. Clean plates are also essential in order to avoid theintroduction of bubbles into the gel when pouring.

Oneof the most common problems encountered in polyacrylamide gels is "smiling,"in which the lanes in the center of an overheated gel run faster than thelanes at the sides. This is caused by uneven dissipation of heat by thegel: the sides are cooler than the center, and samples run faster at highertemperatures. There are several ways to avoid smiling, the simplest ofwhich is to run the gel at lower voltage. An alternative is to use an apparatusthat incorporates a mechanism such as a metal plate to disperse heat evenlythroughout the gel, or an active cooling mechanism.

Inelectroelution onto DEAE membrane, the presence of a large, insoluble pelletafter recovering DNA from the membrane is probably due to acrylamide impurities.Inclusion of 0.1% SDS in the agarose minigel inhibits binding of theseimpurities. However, SDS competes weakly for DNA binding to DEAE, necessitatinga minimal electroelution time.

Becauseof the high capacity of acrylamide relative to agarose, up to 2 ug of afragment larger than 250 bp and up to 5 ug of a smaller fragment can bepurified on 2 cm x 2 cm x 1 mm lane by this method. Up to 25 mg of materialcan be purified on the larger 2 cm x 2 cm x 1.6 mm preparative gels. Afterseveral hours of shaking at 37°C, the eluted yield should be 60% to75% for larger fragment and >85% for smaller fragments. Essentially quantitativerecovery will be able to be obtained by overnight elution. Similar recoveriescan be obtained using the slightly more cumbersome electroelution alternateprotocols.


Assista o vídeo: Agarose (Dezembro 2021).