Em formação

Fornecedores comerciais de vetores clonados?


Eu sou um transplante recente da academia para a indústria. Gostaria de fazer o acompanhamento de alguns experimentos na literatura, para os quais preciso de plasmídeos clonados. É claro que a Addgene não (em sua maior parte) envia material para fins lucrativos, e eu estava me perguntando se havia uma entidade comercial de quem eu pudesse fazer pedidos.

Existem vários 'serviços de clonagem', mas eles parecem exigir que eu envie o backbone e insira-os. Quando, na verdade, muito trabalho é obter os organismos e amplificar os genes de interesse em um vetor de clonagem. Suspeito que exista um serviço comercial com grandes bibliotecas de genes que podem fazer clonagem 'full stack' por um preço, mas ainda não encontrei uma.

Alguém sabe se existe um?

Obrigado!


Serviços de clonagem de genes, clonagem de PCR e subclonagem

Você está cansado de clonagem por PCR? GenScript oferece serviços de clonagem para que você possa se libertar da clonagem de genes de rotina e, em vez disso, dedicar sua energia e tempo a pesquisas mais criativas. Nossos especialistas em biologia molecular podem agrupar a síntese de genes com a clonagem em sua escolha de vetor, ou você pode terceirizar projetos de clonagem de DNA a partir de modelos que você já possui. Para sua conveniência, a clonagem de genes pode ser facilmente adicionada ao seu pedido de síntese de genes quando você solicitar um orçamento online.


Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Quarta edição)

Clonagem Molecular tem servido como base para conhecimento técnico em laboratórios em todo o mundo por 30 anos. Nenhum outro manual foi tão popular ou tão influente. Clonagem Molecular, Quarta Edição, do célebre autor fundador Joe Sambrook e novo co-autor, o distinto investigador HHMI Michael Green, preserva os detalhes altamente elogiados e a clareza das edições anteriores e inclui capítulos específicos e protocolos encomendados para o livro por especialistas em Yale, U Mass, Universidade Rockefeller, Texas Tech, Laboratório Cold Spring Harbor, Universidade de Washington e outras instituições importantes. Os fundamentos teóricos e históricos das técnicas são características proeminentes da apresentação, informações que ajudam muito a solucionar problemas experimentais.

Para a quarta edição deste trabalho clássico, o conteúdo foi totalmente reformulado para incluir métodos baseados em ácido nucleico selecionados como os mais amplamente usados ​​e valiosos em laboratórios de biologia celular e molecular.

Capítulos principais da terceira edição foram revisados ​​para apresentar estratégias e abordagens atuais para a preparação e clonagem de ácidos nucléicos, transferência de gene e análise de expressão. Eles são aumentados por 12 novos capítulos que mostram como DNA, RNA e proteínas devem ser preparados, avaliados e manipulados e como a geração e análise de dados podem ser tratadas.

O novo conteúdo inclui métodos para estudar as interações entre componentes celulares, como microarrays, tecnologias de sequenciamento de última geração, interferência de RNA e análise epigenética usando técnicas de metilação de DNA e imunoprecipitação da cromatina. Para compreender a riqueza de dados produzidos por essas técnicas, um capítulo de bioinformática descreve o uso de ferramentas analíticas para comparar sequências de genes e proteínas e identificar padrões de expressão comuns entre conjuntos de genes.

Com base em trinta anos de confiança, confiabilidade e autoridade, a quarta edição do Clonagem Molecular é o novo padrão ouro & # 151 o único manual e fonte de referência indispensável do laboratório de biologia molecular.

Destaques da nova edição:

  • Novo conteúdo extenso: 12 capítulos inteiramente novos são dedicados às estratégias de pesquisa atuais mais interessantes, incluindo análise epigenética, interferência de RNA, sequenciamento de genoma e bioinformática
  • Escopo expandido: as técnicas baseadas em ácido nucleico selecionadas para inclusão promoveram avanços recentes na transferência de genes, expressão de proteínas, análise de RNA e expressão de genes clonados
  • Conteúdo clássico: 10 capítulos centrais originais foram atualizados para refletir os desenvolvimentos e inovações em técnicas padrão e para apresentar novos protocolos de ponta
  • Formato fácil de seguir: a renomada atenção aos detalhes e precisão das edições anteriores foi totalmente mantida
  • Apêndices essenciais: uma coleção atualizada de reagentes, vetores, mídia, sistemas de detecção e técnicas comumente usadas estão incluídos
  • Autoria expandida: capítulos e protocolos foram especificamente encomendados por especialistas renomados em instituições líderes

Elogios pela edição anterior:

& # 147Qualquer laboratório de pesquisa básica que use técnicas de biologia molecular se beneficiará de ter uma cópia em mãos da recém-publicada Terceira edição do Clonagem molecular: um manual de laboratório. as duas primeiras edições deste livro foram essenciais para a biologia molecular com uma reputação comprovada de precisão e meticulosidade. & # 148 & # 151 O Cientista

& # 147Em cada cozinha há pelo menos um livro de receitas indispensável. Clonagem molecular: um manual de laboratório preenche o mesmo nicho no laboratório (com) informações para ajudar tanto o usuário inexperiente quanto o avançado. (Ele) mais uma vez estabeleceu sua primazia como manual de laboratório molecular e é provável que seja encontrado em bancadas de laboratório. em todo o mundo. & # 148 & # 151 — Tendências em neurociências

& # 147Molecular Cloning: A Laboratory Manual sempre foi o pilar do laboratório para protocolos e técnicas. Ele tem uma ancestralidade pura e a nova edição não decepciona. (Inclui) painéis de informações no final de cada capítulo que descrevem os princípios por trás dos protocolos. A adição desta informação estende Clonagem Molecular de um recurso laboratorial essencial para um novo reino, que une o protótipo anterior com uma monografia molecular moderna. a próxima geração de Clonagem Molecular não apenas continua a orgulhosa herança das duas primeiras edições, mas também expande admiravelmente essa tradição para fornecer um manual de laboratório verdadeiramente essencial. & # 148 & # 151 Tendências em Microbiologia


  • Expressar constitutivamente uma proteína de interesse e uma proteína repórter (ou duas proteínas de interesse)
  • Escolha entre repórteres fluorescentes verdes ou vermelhos
    • O pBI-CMV1 possui dois sítios de clonagem e permite a expressão constitutiva de duas proteínas de interesse.
    • pBI-CMV2 permite que você expresse uma proteína de interesse e AcGFP1, uma proteína fluorescente verde monomérica derivada de Aequorea coerulescens.
    • pBI-CMV3 permite que você expresse uma proteína de interesse e ZsGreen1, uma proteína fluorescente verde extremamente brilhante derivada de Zoanthus sp. coral de recife.
    • pBI-CMV4 permite que você expresse uma proteína de interesse e DsRed2, uma proteína fluorescente vermelha derivada de Discosoma sp. coral de recife.
    • pBI-CMV5 permite expressar uma proteína de interesse e a luciferase do pirilampo. pBI-CMV5 não é vendido separadamente. É vendido como parte do Bidirectional Secreted Luciferase System, junto com seu ensaio repórter.

    Consulte o Certificado de Análise do produto para obter informações sobre as condições de armazenamento, componentes do produto e especificações técnicas. Consulte a Lista de componentes do kit para determinar os componentes do kit. Certificados de análise e listas de componentes do kit estão localizados na guia Documentos.

    Takara Bio USA, Inc.
    Estados Unidos / Canadá: +1.800.662.2566 & bull Asia Pacific: +1.650.919.7300 & bull Europe: +33. (0) 1.3904.6880 & bull Japan: +81. (0) 77.565.6999
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    A Takara Bio Europe é membro do Takara Bio Group, uma empresa líder em ciências da vida que está comprometida em melhorar a condição humana por meio da biotecnologia. Por meio de nossas marcas Takara, Clontech e Cellartis, nossa missão é desenvolver ferramentas e serviços inovadores de alta qualidade para acelerar a descoberta.


    Detalhes do produto

    • Geração rápida de vetores personalizados - Menos de um dia do design ao vetor, em comparação com 4 semanas para serviços de vetores personalizados
    • Montagem confiável e precisa - SureVector é amplamente validado para garantir que as peças padrão possam ser trocadas, sem perda de funcionalidade
    • Mais flexível do que os sistemas tradicionais - Monte novos vetores em seu laboratório conforme os requisitos experimentais mudam, em vez de sempre solicitar um novo
    • Controle seus experimentos - assuma o controle de seus experimentos, solucione seus próprios problemas, não o da montagem de DNA de seus prestadores de serviços
    • Personalize seu vetor - Através de nossa parceria com a Eurofins, você pode personalizar qualquer fragmento de SureVector ou solicitar qualquer construção única configurável no sistema SureVector
    • Explore a nova ferramenta de design de bioengenharia Biotech Doulix, com SureVector

    Programa de kit de amostra

    Folheto de soluções de biologia molecular e sintética 5991-9163EN

    SureVector, o primeiro sistema vetorial modular do mundo, aproveita o poder da biologia sintética para fornecer personalização rápida e amigável de vetores de clonagem e expressão. Em contraste com as tecnologias alternativas de clonagem de última geração, o SureVector oferece um conjunto exclusivo de peças padrão que podem ser montadas em um suprimento infinito de vetores personalizados - tudo com um sistema de montagem validado com o qual você pode contar.


    Conteúdo

    A técnica utiliza a atividade biológica inerente da DNA topoisomerase I. O papel biológico da topoisomerase é clivar e reunir as extremidades superenroladas do DNA para facilitar a replicação. A topoisomerase I do vírus vaccinia reconhece especificamente a sequência de DNA 5´- (C / T) CCTT-3 '. Durante a replicação, a enzima digere o DNA especificamente nesta sequência, desenrola o DNA e liga-o novamente no grupo fosfato 3 'da base timidina. [1]

    Os vetores TOPO são projetados de tal forma que carregam esta sequência específica 5´- (C / T) CCTT-3 'nas duas extremidades lineares. O DNA do vetor linear já tem a enzima topoisomerase covalentemente ligada a ambas as extremidades '3' livres de suas fitas. Este é então misturado com produtos de PCR. Quando as extremidades 5 'livres das fitas do produto de PCR se ligam à extremidade 3' da topoisomerase de cada fita do vetor, as fitas são covalentemente ligadas pela topoisomerase já ligada. Esta reação prossegue de forma eficiente quando esta solução é incubada à temperatura ambiente com o sal necessário. Diferentes tipos de vetores são usados ​​para clonar fragmentos amplificados por Taq ou Pfu polimerase, pois a Taq polimerase (ao contrário de Pfu) deixa um nucleotídeo "A" extra na extremidade 3 'durante a amplificação. [1]

    A técnica de clonagem TA TOPO depende da capacidade da adenina (A) e da timina (T) (pares de bases complementares) em diferentes fragmentos de DNA para hibridizar e, na presença de ligase ou topoisomerase, se ligarem. A inserção é criada por PCR usando Taq DNA polimerase, uma polimerase que carece de atividade de revisão de 3 'a 5' e com alta probabilidade adiciona uma única saliência de 3'-adenina a cada extremidade do produto de PCR. É melhor se os primers de PCR tiverem guaninas na extremidade 5 ', pois isso maximiza a probabilidade da Taq DNA polimerase adicionar a saliência de adenosina terminal. Polimerases termoestáveis ​​contendo atividade extensa de 3 'a 5' exonuclease não devem ser usadas, pois não deixam as saliências de adenina 3 '. O vetor alvo é linearizado e cortado com uma enzima de restrição de ponta cega. Este vetor é então marcado com trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) usando transferase terminal. É importante usar ddTTP para garantir a adição de apenas um resíduo T. Esta cauda deixa o vetor com um único resíduo de timina pendendo 3 'em cada extremidade cega. [1]

    Polimerases (como Phusion) ou enzimas de restrição que produzem extremidades cegas também podem ser usadas para clonagem TOPO. Em vez de depender de extremidades pegajosas, o vetor TOPO de extremidade cega possui extremidades cegas onde as moléculas de topoisomerase estão ligadas. Kits comerciais, como o Zero Blunt® Cloning Kit da Invitrogen, estão disponíveis. [2]


    Clonagem e Biologia Sintética

    O DNA de interesse, como um gene, elemento (s) regulador (es) ou operon, etc., é preparado para clonagem por excisão do DNA de origem usando enzimas de restrição, copiando-o usando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ou montagem a partir de oligonucleotídeos individuais. Ao mesmo tempo, um vetor plasmídeo é preparado em forma linear usando enzimas de restrição ou PCR. O plasmídeo é um pequeno pedaço circular de DNA que é replicado dentro do hospedeiro e existe separadamente do DNA cromossômico ou genômico do hospedeiro. Ao unir fisicamente o DNA de interesse ao vetor plasmídeo por meio de ligações fosfodiéster, o DNA de interesse torna-se parte do novo plasmídeo recombinante e é replicado pelo hospedeiro.

    Os vetores plasmídicos permitem que o DNA de interesse seja copiado em grandes quantidades e, frequentemente, fornecem os elementos de controle necessários a serem usados ​​para dirigir a transcrição e a tradução do DNA clonado. Como tal, eles se tornaram o carro-chefe para muitos métodos moleculares, como expressão de proteínas, estudos de expressão de genes e análise funcional de biomoléculas.

    Durante o processo de clonagem, as extremidades do DNA de interesse e do vetor devem ser modificadas para torná-las compatíveis para a união por meio da ação de uma DNA ligase, recombinase ou na Vivo Mecanismo de reparo de DNA. Essas etapas normalmente utilizam enzimas, como nucleases, fosfatases, quinases e / ou ligases. Muitas metodologias de clonagem e, mais recentemente, kits foram desenvolvidos para simplificar e padronizar esses processos.

    Use o NEBcloner para encontrar os produtos e protocolos certos para cada etapa de clonagem.

    História da Clonagem

    Saiba mais sobre os vários tipos de clonagem molecular encontrados no fluxo de trabalho abaixo: Clonagem Tradicional, Clonagem PCR, Clonagem Contínua, Clonagem Independente de Ligadura (LIC) e Clonagem Recombinacional.

    Fluxo de Trabalho de Clonagem

    Biologia sintética
    A Biologia Sintética é uma expansão mais recente do campo da biotecnologia, na qual genes e proteínas são vistos como partes ou dispositivos, com o objetivo de redesenhar e / ou montar essas partes de novas maneiras para criar uma funcionalidade nova e útil. Avanços recentes na geração de biocombustíveis, produção de bioquímicos e compreensão do genoma mínimo se beneficiam de abordagens biológicas sintéticas. Freqüentemente, esses projetos dependem da montagem ordenada de múltiplas sequências de DNA para criar grandes estruturas artificiais de DNA. Para este fim, os métodos evoluíram para simplificar esse processo. NEBuilder & reg HiFi DNA Assembly e Golden Gate Assembly podem ser usados ​​para criar muitas estruturas funcionais de DNA, desde uma simples união de dois genes metabólicos até a criação de um genoma artificial.

    Para ajudar a selecionar o melhor método de montagem de DNA para as suas necessidades, use nossa Tabela de Seleção de Biologia Sintética / Montagem de DNA.


    Bibliografia

    Alberts, Bruce, et al. Biologia molecular da célula, 4ª ed. Nova York: Garland Publishing, 2000.

    Felsenfeld, Gary. & # x0022DNA. & # x0022 Americano científico 253 (1985): 58 & # x201367.

    Levin, Benjamin. Genes VII. Nova York: Oxford University Press, 1999.

    Watson, James D. e Francis H. Crick. & # x0022A Estrutura para ácido nucléico desoxirribose. & # x0022 Natureza 171 (1953): 737.

    Watson, James D., Michael Gilman, Jan Witkowski e Mark Zoller. DNA recombinante, 2ª ed. Nova York: Scientific American Books, 1992.


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    Nós adaptamos nossos materiais para sua aplicação específica.

    BSL 1

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    Ásia Pacífico

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