Em formação

Posso usar um microscópio composto básico para analisar a ploidia dos cromossomos das plantas?


Então, eu realmente não sou nenhum tipo de botânico treinado. Mas eu tenho duas coisas: algumas sementes de dente-de-leão da França e, juntando poeira na minha garagem junto com acessórios relacionados, essa coisa.

Normalmente, os dentes-de-leão que crescem em um quintal americano são triplóides apomíticos, mas na Europa existem triplóides e diplóides sexuais, sendo que o último fica ainda mais comum no sul. Estou assumindo que, como essas sementes francesas são um cultivar comum específico (Vert de Montmagny), a seleção sexual regular foi usada para criá-la, tornando-a diplóide. Mas não sei a quem pedir para confirmar isso, então posso fazer alguns testes. Se for um diplóide, talvez eu possa fazer minha própria criação?

Mas eu nem sei o Primeiro passo. Existem algumas partes de uma planta nas quais terei mais facilidade para encontrar cromossomos? O que eu coloco para expressar seu DNA e o que é melhor para corar? Eu seria capaz de discernir as diferentes formas dos cromossomos sem treinamento? Ouvi dizer que a forma de projeto científico padrão de extrair DNA (sabão em pó, sal, álcool) danifica os cromossomos de modo que você não os encontraria realmente em um microscópio; se for verdade, espero que haja outra maneira.


Se você deseja cromossomos mitóticos, deve examinar os meristemas apicais - provavelmente a raiz primária das mudas em germinação será a mais fácil. Os meristemas apicais estão nas pontas crescentes das raízes (e brotos) e contêm regiões de células que se dividem rapidamente. Como você só pode ver os cromossomos como corpos separados quando eles são condensados ​​para a divisão celular, isso aumenta suas chances de visualizar os cromossomos.

No entanto, você precisará tingir as raízes para visualizar a cromatina (material que compõe os cromossomos).

Este artigo tem um protocolo para tingir as pontas das raízes do dente-de-leão, mas não sei se você pode obter todos os compostos necessários. No entanto, a colchicina e o para-diclorobenzeno provavelmente não são realmente necessários (eles aumentam o número de células na mitose) e são tóxicos, então é melhor evitar essas etapas de qualquer maneira.

Observe, parece que você também precisa de uma lente de imersão em óleo 100x, que não parece ter vindo com o microscópio que você listou.

Você também pode achar este artigo útil como um ponto de partida para fazer manchas de cromossomos "caseiras".

Boa sorte!


Como escolher o microscópio certo (microscópio composto vs. microscópio estéreo)

Comprar um microscópio pode ser a coisa mais emocionante quando você constrói sua sala de aula ou laboratório doméstico. No entanto, também pode ser um processo confuso para iniciantes. Este artigo tem como objetivo fornecer o conhecimento necessário e orientá-lo no processo de decisão. Vamos começar a procurar o microscópio "Certo" para você!


Ploidia e número cromossômico em Tuber aestivum

O número cromossômico é geralmente considerado a medida mais precisa e direta da ploidia. Em fungos, no entanto, a contagem de cromossomos é difícil e imprecisa devido ao seu pequeno tamanho. Até o momento, as trufas foram caracterizadas usando abordagens moleculares (análise de DNA e técnicas baseadas em PCR) para descobrir diferenças entre as espécies, mas não por uma abordagem citogenética. Embora o pequeno tamanho dos cromossomos das trufas seja um obstáculo para um estudo citogenético, no presente trabalho Tuber aestivum as contagens de cromossomos foram determinadas em configurações de metáfase de núcleos haplóides de ascósporos por coloração com aceto-orceína. O número de cromossomos nucleares e a topografia também foram avaliados por coloração de DNA com iodeto de propídio usando microscopia confocal. Tuber aestivum foi encontrado para possuir um número básico de 5 ou 6 cromossomos, comprimento médio ≤0,95 μm. A cariologia dos ascósporos durante seus estágios de desenvolvimento também foi investigada.


Microscópios iniciantes a intermediários

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Modelos Antigos

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Fórum de lírios e rarrPolyploidy e gametas não reduzidos

Por que me preocupo se uma planta é poliplóide?
A menos que você pretenda criar lírios ou cultivá-los a partir de sementes, a discussão sobre poliploidia é irrelevante. Se o seu interesse por lírios é simplesmente comprar lâmpadas para crescer e apreciá-los, então você realmente não precisa se preocupar com a marca de genes de designer que seus lírios usam. Por outro lado, se você gosta da ideia de criar lírios e cultivar seus próprios híbridos, é importante entender esse conceito, pois pode ter relevância em como você aborda seus objetivos de criação.

Poliploidia:
Para Lilium, todas as espécies têm 24 cromossomos em dois conjuntos de 12. Cada planta recebe um conjunto de 12 cromossomos da mãe ou pai da vagem e um conjunto de 12 cromossomos do pai ou pai do pólen. O estado de base é chamado diplóide (2 conjuntos de cromossomos) e as células-mãe (ovo e pólen) são haploides (1 conjunto de cromossomos) e, quando se fundem durante a fertilização, criam plantas diplóides. Erros acontecem na divisão celular que podem levar a mais de 2 conjuntos de cromossomos em uma planta e quando uma planta tem mais de dois conjuntos de cromossomos é chamada de poliploide. O prefixo indica quantos conjuntos de cromossomos ele possui (triploide = 3 conjuntos, tetraploide = 4 conjuntos, pentaplóide = 5 conjuntos, hexaploide = 6 conjuntos e assim por diante). Os erros também causam conjuntos incompletos / parciais e cromossomos extras, e uma planta com um número ímpar de cromossomos (algo diferente de conjuntos pares de 12) é chamada de aneuplóide.

Detalhes de como obtemos poliplóides:
Poliplóides são formados por erros na divisão celular. Existem dois tipos básicos de divisão celular - Mitose e Meiose. O processo usado no crescimento normal da planta é a mitose, onde uma célula se replica para fazer duas células idênticas nos tecidos do meristema - para os lírios, uma célula com 24 cromossomos produz 2 células com 24 cromossomos. Meiose é o processo de divisão celular usado para produzir células reprodutivas (ovo e pólen - também chamados de gametas) e resulta em células com metade do número de cromossomos das células-mãe - para os lírios, uma célula com 24 cromossomos produz muitas células com 12 cromossomos.

Poliplóides da mitose:
O processo de divisão celular é complexo e há nomes para as diferentes etapas - se quiser mais detalhes, pegue um livro de biologia ou faça uma pesquisa na internet sobre divisão de células vegetais. Uma explicação muito simplista é que a célula faz uma cópia de si mesma dentro da parede celular existente e, em seguida, puxa os cromossomos e órgãos para os dois lados da célula e, em seguida, uma nova parede celular se forma para separar uma grande célula dupla em duas novas pequenas. células idênticas à célula original que iniciou o processo. Se o processo de divisão celular for interrompido após a célula ter duplicado os cromossomos, mas antes que eles sejam puxados para os lados opostos da célula e a nova parede celular não se forme, isso resulta em uma célula com o dobro da informação genética e é uma célula poliplóide . Se essa célula puder ser cultivada em uma planta totalmente nova, você terá uma planta poliplóide. Na maioria dos casos, a célula teria um crescimento mais lento (dividir e fazer cópias de si mesma) como resultado do conteúdo anormal da célula e se duplicaria mais lentamente do que as outras células ao seu redor. Os pesquisadores descobriram que você pode causar artificialmente a formação de células poliplóides ao tratar as plantas com vários produtos químicos que interrompem a divisão celular. Isso é mais frequentemente feito tratando escamas de bulbo para tirar vantagem do processo de multiplicação de lírio de crescer novos bulbos a partir de escamas de bulbo onde o tecido caloso (meristema) na base da escama de bulbo é capaz de regenerar uma planta totalmente nova. Os produtos químicos normalmente usados ​​são colchicina e orizalina (herbicida Surflan). Existem muitos trabalhos de pesquisa escritos documentando o processo de tratamento de escama de bulbo de lírio. A razão para tentar converter lírios é usá-los na reprodução - o feedback de pessoas que fizeram uma boa quantidade de conversões é que as plantas convertidas resultantes tendem a ser mais fracas do que as plantas não convertidas e difíceis de manter a longo prazo. As plantas morrem ou se convertem novamente em diplóides (a planta era uma mistura de células diplóides e tetraplóides e as células diplóides crescem além das células tetraplóides com o tempo). A maioria dos poliplóides que existem hoje foi criada pela conversão de lírios durante a mitose e, posteriormente, usada para criar plantas que carregam os conjuntos extras de cromossomos. Enquanto as plantas convertidas tendem a ter um crescimento mais fraco, as mudas são muito mais fortes e têm melhor desempenho. A fertilidade pode ser um problema também nas plantas convertidas, mas pode ser melhorada nas gerações subsequentes.

Poliplóides da Meiose:
O processo de produção de células reprodutivas é denominado meiose. O processo de meiose é mais complicado do que a mitose e detalhes do processo podem ser encontrados em livros de biologia e por meio de uma busca na Internet. Semelhante à mitose, o processo de meiose inclui a replicação dos cromossomos, mas a replicação na verdade ocorre em dois momentos diferentes e há duas oportunidades para erros na produção de células reprodutivas poliplóides. A meiose normalmente começa com uma célula diplóide e termina com várias células haplóides. Se ocorrer um erro resultando na duplicação dos cromossomos à medida que as células passam pelo processo, o resultado é um ovo diplóide ou célula de pólen. Na meiose, a menos que essas células estejam envolvidas na fertilização para fazer um embrião, as células morrem durante o ciclo de vida normal do lírio e nada acontece. Se as células estão envolvidas na fertilização, então embriões poliplóides são formados, o que pode resultar em sementes poliplóides. O nível de ploidia da semente depende do nível de ploidia das células-mãe (ovo / pólen). Em lírios diplóides, o ovo e o pólen são haplóides n + n = 2n resultando em um diplóide onde o “n” representa um conjunto completo de cromossomos. Se o ovo ou o pólen são diplóides, o resultado é n + 2n ou 2n + n = 3n e chamamos isso de triplóide. Para obter tetraplóides, geralmente é 2n + 2n = 4n, mas também é possível ter n + 3n = 4n. Assim como na mitose, na meiose existem diferentes maneiras pelas quais os erros podem ocorrer para produzir o ovo poliplóide ou células de pólen - essas células produzidas a partir desses erros são chamadas de gametas não reduzidos porque a redução normal no conteúdo cromossômico não ocorreu. Os gametas não reduzidos podem se formar como resultado de altas temperaturas, erros na divisão celular ou devido a tratamentos químicos que interrompem o processo normal. Existem casos documentados em que as plantas foram submetidas a altas temperaturas (com a intenção de aumentar a fertilidade) que produziram uma prole poliplóide (geralmente triploide). Alguns híbridos resultantes de cruzamentos amplos (cruzamentos de lírios de diferentes grupos de reprodução natural) mostraram produzir gametas não reduzidos em frequência alta o suficiente para serem usados ​​em cruzamentos poliplóides e acredito que isso se deve ao fato de os cromossomos de cada pai serem muito diferentes para permiti-los para emparelhar normalmente causando erros na meiose. Alguns cruzamentos largos são completamente estéreis e outros têm alguma fertilidade normal e outros ainda produzem gametas não reduzidos e não está claro por que esses diferentes híbridos de origens diferentes e semelhantes se comportam de maneira diferente. Por último, os produtos químicos provaram ser eficazes na produção de gametas não reduzidos. Estudos de pesquisa demonstraram que o tratamento de botões de lírio no estágio correto de desenvolvimento com certos produtos químicos interromperá a meiose normal em algumas das células reprodutivas, fazendo com que uma parte dos gametas tenha números cromossômicos não reduzidos. Os produtos químicos usados ​​para isso são colchicina, cafeína e óxido nitroso. Tenho feito experiências com o tratamento de botões com uma mistura contendo orizalina (herbicida Surflan) com a intenção de produzir gametas não reduzidos, mas é muito cedo para ter certeza de algum sucesso.

Valor de poliploides de gametas não reduzidos:
A pesquisa mostrou que cruzamentos largos que são convertidos de diplóides para tetraploides tendem a ter uma variabilidade muito limitada em suas mudas (às vezes chamadas de híbridos permanentes). Além disso, por meio da pesquisa com gametas não reduzidos, foi demonstrado que, ao usar gametas não reduzidos versus conversão poliplóide da planta original, as mudas produzidas têm uma variação significativamente maior. Por meio de técnicas muito complexas (GISH), os pesquisadores demonstraram que os gametas não reduzidos permitem um cruzamento significativamente maior durante o processo de formação do gameta, que é o processo na meiose que cria variabilidade adicional de mudas ao misturar as porções dos cromossomos da mãe e do pai de forma diferente para cada ovo / célula de pólen. Em muitos casos, os melhoristas buscam grande variabilidade nas mudas com o objetivo de encontrar algo novo que não tenham visto antes.

Como posso saber se tenho um poliplóide?
Existem várias maneiras de estimar o nível de ploidia de um lírio, mas a única maneira certa de saber com certeza é preparar uma amostra da planta e contar os cromossomos em um microscópio. Até mesmo a contagem de cromossomos pode levar a alguns erros se a planta tiver diferentes números de cromossomos em diferentes tecidos (quimera). O método típico para contar cromossomos é a partir de uma preparação da ponta da raiz, onde a ponta da raiz é tratada com produtos químicos para amolecer o tecido e, em seguida, tingir os cromossomos e o pequeno pedaço da raiz é achatado em uma lâmina de microscópio para inspeção por um microscópio. Sob o microscópio, você verá células individuais e literalmente contará os cromossomos individuais na célula.
Os estômatos das folhas e o tamanho do pólen foram correlacionados com o número de cromossomos que uma planta possui. Estômatos são as pequenas aberturas na parte inferior das folhas que podem ser observadas em aumento de 50x. O tamanho dessas aberturas formadas por duas células guarda foi bem correlacionado à contagem de cromossomos, com estômatos maiores indicando maior número de cromossomos. O mesmo com o pólen - o tamanho e a forma do pólen foram correlacionados geralmente com o número de cromossomos, mas se a planta não produz pólen viável, isso é menos útil. Um desafio com essas técnicas é que há uma sobreposição de faixas, o que significa que alguns diplóides são maiores do que alguns triplóides e alguns triplóides são maiores do que alguns tetraploides.
Outra técnica mais recente para estimar a ploidia é a citometria de fluxo. Esta é uma técnica analítica onde um pedaço da planta é preparado e analisado para determinar o conteúdo genético da quantidade relativa. É fácil se confundir com os dados dessa técnica e por isso é muito importante entender o que ela realmente está dizendo a você. O ponto chave para entender é que é uma medida do conteúdo genético, mas não uma contagem absoluta de cromossomos. Se você olhar fotos de cromossomos, verá que alguns são maiores do que outros e, com essa técnica, todos eles se misturam. É como olhar para uma quantidade de cenouras desfiadas e tentar descobrir quantas cenouras foram usadas para obter essa quantidade de cenouras desfiadas (foram necessárias 24, 36 ou 48 cenouras para obter essa quantidade ou é algo entre os dois?) Uma parte absolutamente crítica do uso da citometria de fluxo é ter material de referência com uma contagem de cromossomos conhecida para comparação. Também é importante que o material de referência tenha um fundo genético semelhante, pois diferentes espécies de lírios têm diferentes formas e tamanhos de cromossomos e diferentes quantidades de material genético. Sem o padrão adequado para comparação, qualquer conclusão tirada dos dados de teste pode ser significativamente distorcida. Eu vi dados publicados de citometria de fluxo para alguns lírios que não fazem sentido. Por exemplo - houve um relatório mostrando que o híbrido OT Anastasia é um tetraplóide. Não é um tetraplóide - foi confirmado pela contagem de cromossomos ser um triploide. A citometria de fluxo não é mais precisa do que contar cromossomos e pode não ser mais precisa do que medir os estômatos das folhas. É uma ferramenta útil que pode ser usada para estimar se um lírio é diplóide, triplóide ou tetraploide, mas não é sensível o suficiente para indicar se um determinado cultivar é aneuploidia (tendo alguns cromossomos extras ou ausentes dos conjuntos normais de 12 ) Com qualquer lista publicada de lírios poliplóides, é muito importante entender quais métodos eles usaram para fazer essa determinação, pois às vezes eles usaram um método mais preciso e outras vezes é apenas um “melhor palpite”.

Espero que este artigo seja útil e não ficaria surpreso se levantasse algumas questões. Não incluí referências específicas a artigos de pesquisa, mas posso fazê-lo se houver um aspecto específico sobre o qual alguém gostaria de ler mais diretamente no artigo.


Biografia dos autores e informações de contato

Bio: Robert Berdan é um fotógrafo profissional da natureza que mora em Calgary, AB, especializado em fotografia de natureza, vida selvagem e ciência. Robert aposentou-se da pesquisa Cell Neurobiology para dedicar-se à fotografia em tempo integral anos atrás. Robert oferece orientação fotográfica e instrução particular em todos os aspectos da fotografia da natureza e treinamento em Adobe Photoshop - incluindo fotomicrografia e macrofotografia. Retrato de Robert Berdan com fotos de algumas de suas publicações científicas tiradas pelo Dr. Sharif Galal. Seu primeiro microscópio de pesquisa é mostrado à direita.


Uma visão da biologia, genética e evolução do Centella asiatica complexo poliplóide em Madagascar

Centella asiatica é um importante cultivo industrial em Madagascar, coletado na natureza por seus compostos glicosídeos triterpênicos. Uma abordagem multidisciplinar foi aplicada para estudar a diversidade de 6 populações de C. asiatica. Abordagem citogenética e análise de hibridização fluorescente in situ (FISH) juntamente com avaliação citológica da densidade estomática revelada diplóide (2n = 2x = 18) e tetraplóide (2n = 4x = 36) populações. A diversidade genética foi avaliada por meio de análise SSR e indica três grupos separados, claramente distintos dos genótipos indianos e sul-africanos. A análise da diversidade de cloroplastos revela dois clorotipos correspondentes a populações diplóides e tetraplóides, respectivamente, indicando uma origem antiga de poliploidia. O teor de glicosídeo triterpênico de alguns clones foi avaliado, confirmando que o teor de composto ativo é altamente variável. São discutidas as implicações de nossos resultados para estudos genéticos adicionais e programa de melhoramento.

Destaques

► Populações de Centella asiatica de Madagascar são diplóides (2n = 2x = 18) e tetraplóide (2n = 4x = 36). ► A presença de dois clorotipos em Madagascar sugere origem antiga da poliploidia e pelo menos duas populações distintas. ► Examinamos a diversidade genética por meio de análise SSR e C. asiatica de Madagascar estão claramente separados dos genótipos indianos e sul-africanos ► O conteúdo de glicosídeos triterpênicos é altamente variável.


Este trabalho foi apoiado por doações dos Centros de Excelência de Ontário e do Conselho de Pesquisa de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (OCE VIPI & # x2013 NSERC Engage # 27272), com contribuições equiparadas da Canopy Growth Corporation para tempo de funcionários, materiais e equipamentos. Este projeto não teria sido possível sem o tempo e a experiência das equipes de produção e análise da Tweed Inc.

JP, GG e EB são funcionários da Canopy Growth Corporation. Existe uma patente pendente para o método de poliploidização em Cannabis.

Os demais autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.


MÉTODOS E RESULTADOS

A parte de coloração e esmagamento do protocolo (etapas 5–20) geralmente requer 1–2 horas, dependendo da familiaridade com a técnica e o táxon em estudo. Embora uma ou mais preparações sem sucesso (isto é, incontáveis) sejam frequentemente necessárias para identificar tamanhos de botões apropriados (etapa 7), as preparações subsequentes do mesmo táxon são geralmente bem-sucedidas. As etapas abaixo são demonstradas nos Vídeos S1 e S2, com as partes relevantes anotadas abaixo. Uma lista de materiais e reagentes necessários é fornecida no Apêndice 1. Uma lista de problemas comumente encontrados e soluções potenciais é fornecida no Apêndice 2.

Amostragem de tecidos nos estágios corretos de desenvolvimento (Vídeo S1, 1: 20–2: 35)

Passo 1

É importante coletar amostras em toda a gama de idades dos botões de flores, voltando-se para materiais mais jovens. A maioria dos botões mais velhos já passou da meiose ativa, e deixar de coletar amostras de material suficientemente jovem é um dos erros mais comuns cometidos. Sempre que possível, amostrar o conhecimento de inflorescências inteiras ou parciais do arranjo dos botões em relação uns aos outros simplificará muito os esforços posteriores para localizar as anteras no estágio adequado da meiose. Em alguns taxa, você será capaz de amostrar uma grande quantidade de material apropriado do mesmo indivíduo. Esses taxa incluem espécies que apresentam inflorescências grandes e / ou muitas apresentando uma variedade de tamanhos de botões em um determinado momento. Em muitos casos, no entanto, o material de vários indivíduos precisará ser amostrado para garantir que uma contagem possa ser obtida. Nestes casos, é importante amostrar o menor número possível de indivíduos próximos. Se coletarmos amostras de vários indivíduos, é provável que qualquer variação seja aparente na lâmina, já que vários botões são rompidos, manchados e examinados simultaneamente em cada abóbora.

Material de fixação (Vídeo S1, 2: 35–7: 00)

Passo 2

Na primeira etapa do processo de fixação, os lenços devem ser colocados em solução 3: 1 de etanol 95%: ácido acético glacial, conhecido como fixador Farmer's, que deve ser preparado na hora no dia do uso e preferencialmente mantido no gelo antes e depois usar. A substituição desta solução pelo fixador Carnoy (6: 3: 1 etanol 95%: clorofórmio: ácido acético glacial) é recomendada para plantas nas quais as anteras são envolvidas por tecidos que são física ou quimicamente resistentes à penetração do fixador. Qualquer frasco com uma vedação de gaxeta segura deve ser suficiente, e os frascos de cintilação Wheaton de 20 mL com revestimento de tampa cônica funcionam bem. Para melhores resultados, os botões fixos não devem ocupar mais do que 50% de um frasco cheio de fixador.

Etapa 3

Deve ser preparada uma amostra de voucher a partir do (s) indivíduo (s) amostrado (s) e o número do coletor / coleta registrado na tampa do frasco e, a lápis, em uma pequena tira de papel que é mantida dentro do frasco.

Passo 4

Após 24 horas de espera, o fixador pode ser retirado, substituído por etanol 70% e colocado em um freezer a −20 °. Os materiais fixados e armazenados dessa maneira podem durar muitos anos.

Escolha do material para esmagar (Vídeo S2, 2: 55-7: 40)

Etapa 5

Para preparar o material para a abóbora, primeiro use Kimwipes e etanol para limpar completamente uma lâmina de microscópio padrão de 75 x 25 mm e uma lamínula de 30 x 22 mm. Observe que essas lamínulas são maiores do que o tamanho mais comum de 22 × 22 mm. Todas as impressões digitais, fiapos e partículas de poeira precisam ser removidos para facilitar uma boa compressão. Etiquete a lâmina com a data e o número da coleta para manter um link para a amostra do voucher.

Etapa 6

A pinça pode então ser usada para transferir os materiais fixos de seu armazenamento em etanol 70% para uma placa de Petri de vidro limpa. Uma série de tamanhos de botões deve ser transferida e submersa em uma pequena quantidade de etanol 70% para evitar que a amostra seque.

Etapa 7

Sob um microscópio de dissecação, botões de tamanho apropriado devem ser selecionados para extração de anteras. Ao iniciar o trabalho com uma nova espécie, é melhor começar com os botões de flores mais jovens disponíveis. Primeiro abra um botão e remova uma antera, se a última mostrar qualquer coloração diferente de branco, provavelmente é muito antigo. Se a antera excisada for branca e normalmente desenvolvida, quebre-a delicadamente com a ponta de uma agulha sob grande ampliação. Se o conteúdo consistir em células abundantes, isoladas e de aparência vítrea, o botão é pós-meiótico. Em seguida, mova para um botão ligeiramente menor e repita até que o conteúdo da antera surja como aglomerados irregulares de células. Se algum tecido puder ser facilmente separado das anteras, faça isso agora em etanol na placa de Petri com agulhas de dissecação afiadas e / ou lâminas de barbear. As anteras são o único alvo desse esforço, quanto mais elas puderem ser isoladas de outras estruturas florais, melhor.

Material de isolamento (Vídeo S2, 7: 40–14: 00)

Etapa 8

Uma lâmina de microscópio limpa deve ser colocada sobre um fundo de cor clara sob um microscópio de dissecação. Se você for destro, posicione uma gota de corante diluído de acetocarmina (para receita, veja Vídeo S1: 9: 10–10: 10) no lado esquerdo da lâmina limpa (localização 1 na Fig. 2A). Faça isso fechando a pinça, mergulhando-a no frasco de corante diluído e, em seguida, tocando a lâmina no local 1 e liberando as pontas da pinça. Transfira os materiais isolados na etapa 7 para esta gota.

Etapa 9

Sob o microscópio de dissecação, isole ainda mais as anteras do material transferido. O isolamento completo será possível para alguns taxa, mas para outros, apenas a remoção de certas estruturas acessórias (ou seja, pappus e cipselas imaturas em Asteraceae) pode ser viável devido às restrições de tempo. À medida que o material que não é das anteras é removido, use suas agulhas de dissecação para empurrar esses tecidos para o lado e reunir as anteras em uma pequena pilha no centro da gota diluída da mancha de acetocarmina. A pinça pode ser usada para adicionar pequenas quantidades de acetocarmina diluída à borda da gota para conter o encolhimento devido à evaporação nenhuma área contendo anteras destinadas a esmagamento deve secar.

Etapa 10

O número ideal de anteras por lâmina varia amplamente com base no tamanho das estruturas florais envolvidas, mas a quantidade de material vegetal na gota não deve exceder 10% do seu volume. Anteras de tamanhos ligeiramente diferentes e / ou derivadas de mais de um botão devem ser combinadas em uma gota para melhorar a probabilidade de encontrar células no estágio correto da meiose. Uma vez que a amostra da antera foi montada, coloque uma pequena gota de acetocarmina de força total (para receita, veja Vídeo S1: 9: 10–10: 10) perto da extremidade direita da lâmina (localização 2 na Fig. 2A). Como antes, faça isso mergulhando a pinça no frasco de tinta e, em seguida, tocando a lâmina no local 2 com as pontas da pinça. Aplique uma gota de acetocarmina tão pequena quanto possível, tente criar uma poça rasa de & lt5 mm de diâmetro. As anteras dissecadas podem então ser transferidas do local 1 para esta gota e misturadas na mancha. A gota de acetocarmina diluída no local 1 será relativamente pequena neste ponto devido à evaporação, e todas as anteras podem ser movidas para a gota da mancha no local 2 usando a ponta de uma agulha de dissecação. Observe que, assim que você começar a trabalhar com a acetocarmina de força total, a preparação se tornará mais sensível ao tempo devido à rápida evaporação da mancha. Assim, é importante que todos os reagentes e materiais a jusante estejam prontos antes de passar para a coloração de força total.

Rompendo o tecido e removendo pedaços grandes (Vídeo S2, 14: 00-27: 25)

Etapa 11

Com a amostra suspensa na película fina de acetocarmina de força total, uma agulha de dissecação deve ser mantida quase na horizontal e usada para esmagar as anteras. O esmagamento quando a gota é relativamente pequena é importante, pois isso irá minimizar o quão longe a gota de acetocarmina se espalha além de seus limites iniciais. A mancha não deve secar em nenhum momento durante o processo. Quando necessário, uma pequena quantidade adicional de acetocarmina de força total pode ser adicionada com uma pinça para umedecer as bordas de secagem. A mancha precipitada em torno das bordas da gota deve ser ressuspensa por agitação, ao mesmo tempo mantendo a gota tão pequena quanto possível. Repita este processo (adicione a mancha, esmague as anteras, mexa, etc.) até que a maior parte da amostra não possa ser homogeneizada mais.

Etapa 12

Neste ponto, qualquer material não homogeneizado restante pode ser reunido em uma pilha na borda da gota e removido com uma pinça ou agulhas de dissecação. Se deixados na gota, esses pedaços maiores irão interferir na sua capacidade de achatar totalmente as células. Como antes, adicione a mancha conforme necessário para evitar que qualquer área ocupada pela gota seque. O tamanho final da gota não deve ser superior a 1 cm de diâmetro.

Etapa 13

Usando uma agulha de dissecação, adicione uma gota de solução de Hoyer (Hempstead Halide, Galveston, Texas, EUA) aproximadamente igual em volume à gota da mancha e misture a acetocarmina, Hoyer e o material corado completamente. A solução de Hoyer (Anderson, 1954) é um meio de montagem e preservação que reduz o rebote da lamínula após o esmagamento e melhora a visibilidade do cromossomo ao remover parcialmente a coloração do citoplasma da célula. Observe que, embora as luvas não tenham sido usadas no vídeo que acompanha, elas são recomendadas durante esta e as etapas subsequentes devido à toxicidade da solução de Hoyer.

Adicionando a lamínula e comprimindo (Vídeo S2, 27: 25–33: 30)

Etapa 14

Com a lâmina de microscópio sobre um fundo de cor clara sob um microscópio de dissecação, a lamínula limpa deve ser centralizada sobre a mistura de acetocarmina / Hoyer e colocada na posição. Se a gota se espalhar lentamente para as bordas da lamínula, a mistura da solução de Hoyer e a mancha está quase certa. Se correr para as bordas, a quantidade de acetocarmina em relação à solução de Hoyer precisará ser reduzida em preparações futuras. Se não alcançar as bordas da lamínula, menos solução de Hoyer deve ser adicionada em preparações futuras.

Etapa 15

Enquanto segura a lamínula no lugar com a ponta do dedo enluvada, a lamínula deve ser batida suavemente com uma agulha de dissecação para dispersar as células e liberar bolhas de sob a lamínula. Quaisquer bolhas visíveis com uma ampliação de 10 × devem ser removidas se possível, embora isso possa ser difícil se tecidos não homogeneizados estiverem presentes.

Etapa 16

Escolha uma superfície plana logo abaixo da altura da cintura e certifique-se de que não haja sujeira ou areia. O slide deve ser colocado na dobra de uma toalha de papel próximo à borda dessa superfície. Pressione suavemente a lamínula para empurrar o excesso de líquido para as bordas. This excess will seep through the towel and reveal the edges of the cover slip to facilitate proper positioning of your fingers and thumbs in steps 17 and 18.

Step 17

Place the thumb and index finger of your non-dominant hand on two opposite corners of the cover slip and press straight down on one of the two open corners with the thumb of your dominant hand (Fig. 2B). pressione straight down with as much pressure as you can while using the thumb and index finger of your non-dominant hand to prevent the cover slip from moving. Strictly vertical pressure with minimal side slippage is critical. Press for 15 seconds, gently release, then press on the other open corner for 15 seconds (Fig. 2C). Switch your non-dominant thumb and index finger to the two corners you just pressed and press for 15 seconds each on the two open corners (Fig. 2D, E).

Etapa 18

Next, turn the slide so you can comfortably place both thumbs on the short edges of the cover slip (Fig. 2F). Simultaneously (both thumbs at once) press for 15 seconds on these portions. This step is designed to additionally flatten the short edges of the preparation, which is where most countable cells will be found. Note that numerous strategies for thumb placement and order exist, such as the alternative presented in Fig. 2G. You will optimize what works best for you through trial and error.

Slide cleanup and sealing (Video S2 , 33:30–37:10)

Step 19

Remove the slide from the folded paper towel and place it over a clean section of the towel. Bubbles may appear under the cover slip, with more being drawn in along the edges by cover slip rebound. To counter this, the tip of a dissecting needle should be dipped in Hoyer's solution and used to transfer a small droplet to the edge of the slip where bubbles are forming, dragging the excess along that edge. Repeat for all edges, wiping the dissecting needle between dips. This small bead of Hoyer's solution along the cover slip edge secures the slip and prevents additional air from entering. Use as little as possible, as excess Hoyer's will seep under the slip and overly lighten the stained cells in that critical edge region.

Step 20

Finally, a Kimwipe or paper towel should be folded into a small point, moistened with ethanol, and used to wipe any excess Hoyer's solution away from the surface of the cover slip. A single motion should be used to swipe toward the edge of the slip, and the Kimwipe should be changed after each swipe. Clean until no streaks are visible, as Hoyer's on the cover slip surface will hinder examination of that area.

Slide scanning and storage

To identify countable chromosomes, carefully scan the slide using a medium power (40×) objective, preferably on a phase-contrast microscope equipped with a digital camera. Start at the top corner of one of the short edges of the cover slip. Scan down until you encounter the bottom edge. Move the field of view to the side a bit and scan upwards. Repeat this up and down process, moving across the slide. Note that while you can scan left to right, we have found scanning up and down reduces nausea. Identify cells that are worth revisiting later at higher magnification by recording the X/Y coordinates on the microscope stage. Note that most countable cells will be near the edges of the cover slip due to a greater concentration of cells near the cover slip center. The slip will be less flattened near the center, and it will be difficult to view all chromosomes of a single cell simultaneously in one focal plane. If an abundance of well-squashed cells are found in the first few scans, you can switch to the 100× objective however, we generally recommend scanning the entire slide. The 100× objective requires applying immersion oil to the cover slip, which limits the future use of lower power objectives unless the slide is removed and cleaned. Take images of a variety of cells exhibiting countable chromosomes, saving each image using the sample's collector/collection number and X/Y coordinates of the cell as the image name. When this process is complete, carefully remove the immersion oil from the cover slip with an ethanol-moistened Kimwipe and store in a slide storage cabinet, preferably horizontally. Slides prepared and stored in this way will remain viewable for several months, perhaps longer.

Basic data interpretation

Any anther can yield at least a few cells with condensed, stainable chromosomes. Very young anthers will show only mitotic cell divisions (often in abundance) the same is true of older anthers in which mitotic cell divisions are concentrated in the tapetum and maturing pollen grains. At the peak of microsporogenesis, cells undergoing meiotic divisions far outnumber those dividing by mitosis, but the latter are always present to some degree. Therefore, the first step in interpreting plant chromosome squashes involves being able to distinguish between cells undergoing meiotic and mitotic cell divisions.

Meiotic chromosome squash cells should ideally be observed at a variety of stages, and it is critical to know exactly which phases are represented on your slide. The most easily interpreted stage of meiosis is typically diakinesis (very late prophase I Fig. 3C). Here the chromosomes are tightly paired (so the number of observed units is at its lowest the n number), maximally condensed, and scattered throughout the cytoplasm (so there is less potential for overlap), and the only other dark staining body in the cell that might be mistaken for a chromosome (the nucleolus present at earlier stages) has dissipated. Metaphase I (Fig. 3D) has many of the same advantages, except that the close proximity of the chromosome pairs aligned along the cell equator means that overlap can be a problem, especially for organisms with higher chromosome numbers. Cells at anaphase I (Fig. 3E), late prophase II (Fig. 3G), and metaphase II (Fig. 3H) are also countable, but it is imperative to recognize that there are two clusters of unpaired chromosomes within the undivided cell for these post–metaphase I squashes to be correctly interpreted (in our example, n = 7, 2n = 14, rather than n = 14). Squashes of cells in anaphase II (Fig. 3I) occasionally contribute useful information, but the presence of four spatially discrete chromatid clusters must be noted to prevent misinterpretation. If cells are squashed in non-classic orientations (e.g., polar rather than equatorial views), the relative size of the stained bodies can help distinguish among the six stages of meiosis in which DNA is fully condensed. The paired chromosomes of very late prophase I (Fig. 3C) and metaphase I (Fig. 3D) are about twice the size of the unpaired chromosomes of anaphase I (Fig. 3E), late prophase II (Fig. 3G), and metaphase II (Fig. 3H), and the latter are about twice the size of the individual chromatids observed in anaphase II (Fig. 3I). It is very rare to be able to count chromosomes at early prophase I (Fig. 3A), telophase I (Fig. 3F), telophase II (Fig. 3J), or at the microspore tetrad stage (Fig. 3K) however, the presence of any of these stages on your slide is promising, as it indicates that the tissue you prepared is undergoing meiosis.


Assista o vídeo: Utilizando o Microscópio bem básico. link na descrição! (Janeiro 2022).