Em formação

Inibição de divisão celular por contato: via de sinalização


O artigo a seguir refere-se à inibição por contato da divisão celular em células epiteliais, especificamente células MDCK: Comportamento coletivo e de célula única na inibição de contato epitelial.

Em sua revisão da literatura, há uma série de possíveis vias de sinalização implicadas na inibição por contato da divisão celular. Esses caminhos são descritos nas seguintes citações:

É amplamente aceito que a inibição de contato requer o estabelecimento de contatos célula-célula mediados por caderina-E e subsequente maturação das junções aderentes (AJs) que ligam a caderina-E e a actina-F em um complexo semelhante a uma sinapse envolvendo várias outras proteínas

Uma possível via envolve a β-catenina, um mediador da sinalização Wnt, que, além de sua função como um cofator transcricional, está associado aos AJs na superfície celular

Um papel de inibição de contato foi relatado para NF2 / Merlin, um gene supressor de tumor que codifica uma proteína de estrutura do citoesqueleto da membrana, que provavelmente atua através da via da hipocinase, controlando a localização nuclear do ativador transcricional YAP, um regulador celular conhecido proliferação.

A inibição de contato é conhecida por envolver a via MAPK, que, por sua vez, promove a entrada no ciclo celular ao regular a expressão da ciclinaD1. Também implicadas estão as nectinas - uma família de moléculas de adesão celular que estão envolvidas, junto com integrinas e outras proteínas, na regulação da motilidade e proliferação celular. No entanto, esse conhecimento acumulado está muito aquém de uma imagem abrangente da inibição de contato.

No artigo, as conclusões foram as seguintes:

Nossos resultados mostram que o contato entre as células não é suficiente para a inibição da mitose em células MDCK. Em vez disso, a inibição da proliferação celular é uma consequência da restrição mecânica que causa divisões celulares sucessivas para reduzir a área celular.

Onde, na discussão, eles observam o seguinte:

Nossas medições também sugerem que a inibição da divisão celular é um estado de célula única distinto, em vez de um estado global induzido pela sinalização célula-célula através da camada, como ilustrado na Fig. 4E. Na verdade, as culturas de células MDCK confluentes com uma densidade celular média correspondente à transição morfológica são frequentemente suficientemente heterogêneas na densidade celular local para que células altamente móveis e células completamente presas coexistam na mesma colônia. Assim, a inibição de contato é um fenômeno local ...

Publicado posteriormente, o artigo Restrições espaciais controlam a proliferação de células em tecidos mostraram que a redução da quantidade de espaço em um tecido impedia a entrada na fase S. Na verdade, o alongamento do tecido reativou rapidamente o ciclo celular, e a compressão leva rapidamente à paralisação. Mais ainda, eles descobriram que as células não tinham memória da restrição do passado e foram capazes de sugerir um modelo de crescimento em relação à restrição espacial.

Estou editando minha pergunta porque a maneira como a postei inicialmente, para mim, era irrespondível. Dito isto, suspeito que, neste ponto, o volume celular e os contatos extracelulares são sinérgicos. Provavelmente, serão necessárias duas perguntas separadas, mas:

1) Como a maquinaria de entrada mitótica responde aproximadamente ao volume da célula? No momento, estou lendo a regulamentação Cdc25 / Wee1, além de algumas coisas sobre fluidos internos que são influenciados pela água, canais iônicos, etc., mas ainda não entendo totalmente.

2) Qual é uma via relativamente direta a jusante (elementos centrais), começando nas junções aderentes, que ilustra como a sinalização célula-célula obtém o sinal STOP para a maquinaria de entrada mitótica (com base no que sabemos)? Isso pode exigir um conhecimento muito mais aprofundado sobre o campo, no entanto, mas artigos com alguns bons números também são apreciados.


Como a maquinaria de entrada mitótica responde aproximadamente ao volume da célula?

Esta é uma questão ampla, mas felizmente há um artigo que aborda essa questão precisa em detalhes. No entanto, é muito provável que mais descobertas sejam feitas sobre este tópico no futuro.

Neurohr et al. (2019) estudaram extensivamente o efeito do volume celular na reentrada mitótica e na progressão do ciclo celular. Eles usaram Saccharamyces cerevesiae com alelos sensíveis à temperatura de CDC28 para prender as células na fase G1. Neste estágio, a alta concentração de glicose (2%) levou a um aumento no volume celular em comparação com as células famintas (glicose 0,1%) ou inibidas pela síntese de proteínas (2% glicose + cicloheximida). Usando este modelo, eles descobriram que a diluição citoplasmática causa prejuízo da regulação da transcrição durante a progressão do ciclo celular. Isso ocorre porque o Fatores de transcrição não escalam com o tamanho da célula.

Leia o jornal para mais detalhes.


O que é uma via relativamente direta a jusante (elementos centrais), começando nas junções aderentes, que ilustra como a sinalização célula-célula obtém o sinal STOP para a maquinaria de entrada mitótica?

Esta é novamente uma questão ampla se você espera todos os detalhes. No entanto, a pesquisa acadêmica do Google sobre "via de inibição de contato" sugere que a via principal a jusante é a via de sinalização Hippo.

Principais acessos neste tópico:

  • Zeng, Qi e Wanjin Hong. "O papel emergente da via do hipopótamo na inibição do contato celular, controle do tamanho do órgão e desenvolvimento do câncer em mamíferos."Cancer cell 13.3 (2008): 188-192.
  • Kim, Nam-Gyun, et al. "A caderina-E medeia a inibição de contato da proliferação através dos componentes da via de sinalização do Hippo."PNAS 108.29 (2011): 11930-11935.
  • Gumbiner, Barry M. e Nam-Gyun Kim. "A via de sinalização Hippo-YAP e a inibição do crescimento por contato."J Cell Sci 127.4 (2014): 709-717.

Inibição de divisão celular por contato: via de sinalização - Biologia

As marcas registradas do câncer compreendem seis capacidades biológicas adquiridas durante o desenvolvimento em várias etapas de tumores humanos. As marcas registradas constituem um princípio organizador para racionalizar as complexidades das doenças neoplásicas. Eles incluem a sustentação da sinalização proliferativa, evitando supressores de crescimento, resistindo à morte celular, permitindo a imortalidade replicativa, induzindo a angiogênese e ativando a invasão e metástase. Subjacente a essas marcas estão a instabilidade do genoma, que gera a diversidade genética que acelera sua aquisição, e a inflamação, que promove várias funções marcantes. O progresso conceitual na última década adicionou duas marcas emergentes de generalidade potencial a esta lista - reprogramação do metabolismo energético e evasão da destruição do sistema imunológico. Além das células cancerosas, os tumores exibem outra dimensão de complexidade: eles contêm um repertório de células recrutadas, aparentemente normais, que contribuem para a aquisição de características marcantes, criando o "microambiente tumoral". O reconhecimento da ampla aplicabilidade desses conceitos afetará cada vez mais o desenvolvimento de novos meios para tratar o câncer humano.


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SINALIZAÇÃO CELULAR

As células são afetadas por seu ambiente e se comunicam com outras células:

As células, sejam organismos unicelulares ou células dentro de organismos multicelulares, respondem aos sinais dentro de seu ambiente. Esses sinais incluem estímulos mecânicos (luz, som) e produtos químicos. A origem dos estímulos químicos pode ser a própria célula (autócrina), células adjacentes (parácrinas), a membrana plasmática de células adjacentes (inibição de contato) ou células distantes (endócrinas).

A neurotransmissão incorpora a interação entre neurotransmissores e proteínas receptoras específicas. As citocinas medeiam a estimulação parácrina e os hormônios medeiam a estimulação endócrina.

As respostas celulares às moléculas de sinalização incluem alterações na expressão gênica (transcrição), alteração da carga eletrofisiológica e alteração da atividade metabólica da célula.

Interações intracelulares em procariotos
Quatro tipos de interações celulares podem ser distinguidos:
1) Transferência de um sinal químico de uma célula para outra. A variedade de tais transferências é apresentada em vários exemplos.
2) Sinalização por contato físico direto entre dois corpos celulares, que podem envolver suas superfícies ou apêndices celulares, como fibrilas, pili ou flagelos (flagelos bacterianos). O contato físico direto geralmente está envolvido no enxame de células.
3) Metabolismo sintrófico. Schink Syntrophism Between Prokaryotes.
4) Transferência de genes de uma célula para outra.

As interações de transferência de genes eubacterianas são generalizadas. Transferência dentro da Archaea foi recentemente observada, e sua genética está sendo desenvolvida (Stedman et al., 1999 Whitman et al., 1999). Os procariotos têm três mecanismos para a transferência unidirecional de genes de um doador para um receptor. Esses mecanismos são a transformação na qual o DNA nu do doador é captado pelo receptor, a transdução generalizada na qual um fago empacotou uma cabeça cheia de DNA do doador e injeta esse DNA no receptor e a conjugação na qual um aparelho especializado (pili ) no doador transfere um longo segmento de DNA diretamente para um receptor de conjugação.


Resultados e discussão

Uma nova maneira de olhar para a inibição de locomoção por contato: ensaios de colisão 1D em substratos micropadronizados

A micropadronização permite o controle da geometria de adesão celular em uma superfície e provou ser uma técnica inspiradora para várias questões em biologia celular. Isso permitiu importantes descobertas biológicas, nos campos da apoptose (Chen et al., 1997), controle da arquitetura celular & # x02013 (Th & # x000e9ry et al., 2006a), organização interna da célula (Th & # x000e9ry et al., 2006b) e eixo de divisão (Th & # x000e9ry et al., 2005). Aqui, adaptamos uma estratégia de micropadronização (Th & # x000e9ry e Piel, 2009) para padronizar a análise de CIL. As células da crista neural de Xenopus são cultivadas em linhas retas de fibronectina de 22 - & # x000b5m de largura. A largura da pista foi escolhida de acordo com o tamanho das células da crista neural, para evitar maiores efeitos na motilidade celular e na polaridade celular, conforme descrito para pistas mais estreitas (Doyle et al., 2009). As características migratórias de Xenopus NCCs sob condições de cultura 2D (Fig. & # X020052a, b material suplementar 1) e 1D (Fig. & # X020052c, d material suplementar Filme 1) condições de cultura foram comparadas. Células individuais sem colisão foram rastreadas ao longo do tempo e seu comportamento geral analisado. Descobrimos que a velocidade (Fig. & # X020052e) e a direcionalidade (Fig. & # X020052f) foram ligeiramente reduzidas em substratos 1D. Isso pode ser devido à restrição imposta pela cultura 1D. Enquanto em um substrato 2D as células podem se mover em qualquer direção em uma linha, as células são forçadas a continuar andando para frente ou a repolarizar completamente. Além disso, o processo de repolarização não é instantâneo. Assim, a restrição de espaço na cultura 1D é provavelmente responsável pela redução observada da velocidade e da direcionalidade.

(uma) Foto de um filme de lapso de tempo mostrando células NC dissociadas migrando em todas as direções em um substrato de fibronectina 2D. (b) A análise de rastreamento de células mostra que as células NC migram aleatoriamente (4 lotes representativos foram sobrepostos). (c) Migração de células NC em linhas de fibronectina 1D. (d) As trilhas de células revelam restrições espaciais impostas pelo padrão (4 lotes representativos foram sobrepostos). (e) Velocidade média em matrizes 2D e 1D (***P& # x0003c0.001). (f) Direcionalidade da migração em culturas 2D e 1D. (g) Tempo médio que as células em migração única gastam no modo & # x0201crun & # x0201d ou & # x0201ctumble & # x0201d em condições 2D e 1D. (h & # x02013m) Análise de subtração de imagem em células migratórias únicas em culturas de células 2D (h & # x02013j) e 1D (k & # x02013m). As saliências e retrações são codificadas por cores em vermelho e verde, respectivamente. (n) Área protrusiva média para substratos 2D e 1D. (o) Área de retração média em culturas 2D ou 1D. Todas as barras de erro representam o erro padrão da média. Barras de escala: 20 e # x000b5m.

A migração de células NCC individuais foi caracterizada por uma alternância entre duas fases: corrida e queda (Theveneau et al., 2010). & # x0201cRun & # x0201d corresponde a uma fase de migração direcional, enquanto & # x0201ctumble & # x0201d é uma fase de reorientação caracterizada pelo colapso de saliências e por uma série de pequenos movimentos orientados aleatoriamente, sem migração líquida. A alternância entre as fases de execução e tombamento reflete a tendência intrínseca dos NCCs de mudar de direção. É importante ressaltar que este ciclo de fases de corrida e queda, medido conforme descrito (Theveneau et al., 2010), não é alterado pelos substratos 1D (Fig. & # X020052g). Para caracterizar ainda mais o comportamento migratório de células individuais em culturas 1D, realizamos uma análise de subtração de imagem que permite distinguir e quantificar a atividade protrusiva na borda de ataque e a retração da borda de fuga de uma célula em migração (Fig. & # X020052h & # x02013m ) Medimos a área média de protrusão da membrana (Fig. & # X020052n) e as áreas médias de retração da borda posterior (Fig. & # X020052o), que não são afetadas pela restrição espacial da migração nas linhas 1D. No geral, nossa análise comparativa da migração de células NC em culturas 2D versus 1D não revela quaisquer diferenças importantes no comportamento celular e nas habilidades migratórias.

Análise de colisões em culturas 1D

Em seguida, comparamos as colisões que ocorrem em substratos 2D (Fig. & # X020053a, b) e 1D (Fig. & # X020053c, d). Primeiro, perguntamos se a frequência de colisão melhoraria com o plaqueamento das células em um substrato 1D. A frequência das colisões aumenta proporcionalmente à densidade celular de uma maneira exponencial em ambas as culturas 2D e 1D, mas nenhuma diferença significativa foi observada (Fig. & # X020053e). Em seguida, observamos o tempo que duas células passam em contato e como a distância entre elas evolui ao longo do tempo durante a CIL, usando os núcleos das células como referências. É importante ressaltar que o tempo médio que as células passam em contato umas com as outras permanece inalterado (Fig. & # X020053f), sugerindo que CIL ocorre com dinâmica comparável em culturas 2D e 1D. Durante a colisão, a distância entre os núcleos cai no ponto de contato físico e permanece constante enquanto as células permanecem juntas (Fig. & # X020053g). A distância então aumenta linearmente à medida que as células se afastam. Determinamos empiricamente que 30 & # x02005 minutos após a colisão, a maioria das células migrou para longe umas das outras e a distância entre as células neste momento pode, portanto, ser usada como uma leitura fácil de CIL.

(uma) Colisão 2D. (b) Traços das células mostradas no painel A. Ambas as células repolarizam após a colisão, fazendo uma protuberância para longe do contato (terceiro quadro). Como as células podem girar enquanto estão em contato, seu caminho geral não parece afetado pela colisão. Uma análise CIL típica medindo o ângulo de aceleração categorizaria erroneamente essas células como não respondentes. (c) Colisão 1D. (d) Trilhas das células mostradas no painel C. Observe que ambas as células se afastam uma da outra em um ângulo nítido de 180 & # x000b0. (e) Frequência de colisões por período de tempo plotado em relação à densidade celular. (f) Tempo médio que as células em colisão passam em contato. (g) Ao longo do tempo, variação da distância média entre os núcleos das células em colisão. O primeiro ponto de colisão é indicado pela seta preta. (h) A velocidade de colisão de células em linhas 1D é representada graficamente em função do tempo. O primeiro ponto de colisão é indicado pela seta preta (***P& # x0003c0.001). (eu) A aceleração de células em colisão em linhas 1D é representada graficamente em função do tempo. O primeiro ponto de colisão é indicado pela seta preta. (j & # x02013m) Análise de subtração de imagem de uma colisão NC & # x02013NC. A atividade protrusiva é representada em vermelho, a retração é representada em verde. Para análise quantitativa, cada célula em colisão foi subdividida (linha tracejada verde) em um lado da borda de ataque e um lado da borda de fuga. (n) A área de protrusão da borda de ataque foi calculada ao longo do tempo após colisões NC & # x02013NC. A barra preta sob o x-eixo representa o tempo médio que as células permaneceram em contato. A seta indica o ponto de tempo em que a saliência no local de contato da célula & # x02013 entra em colapso. (o) A área de protrusão da borda final foi calculada ao longo do tempo após colisões NC & # x02013NC. A barra preta sob o x-eixo representa o tempo médio que as células permaneceram em contato. A seta indica o ponto de tempo em que uma nova saliência é formada fora do contato da célula & # x02013célula. Barras de escala: 20 e # x000b5m.

Os dados extraídos da análise de rastreamento de células em substratos 1D revelaram um comportamento semelhante em CIL àqueles descritos anteriormente para células em condições 2D (Carmona-Fontaine et al., 2008). Uma queda na velocidade da célula no momento do contato (Fig. & # X020053h, seta) é seguida por um aumento repentino (Fig. & # X020053h). Isso pode ser mostrado como uma desaceleração ao contato (Fig. & # X020053i, seta) seguida por uma aceleração (Fig. & # X020053i). É importante ressaltar que essa aceleração está associada a uma repolarização na direção oposta. Isso pode ser avaliado monitorando a dinâmica de protrusão / retração ao longo do tempo. Para fazer isso, as regiões de crescimento e retração das células são codificadas por cores por subtração de imagem (Fig. & # X020053j & # x02013m consulte Materiais e Métodos para obter detalhes). Antes da colisão, a célula estende uma saliência em sua borda de ataque (Fig. & # X020053j, vermelho) orientada para a outra célula. Após a colisão (Fig. & # X020053k), a protuberância colapsa e uma nova protuberância é estendida na antiga borda posterior da célula (Fig. & # X020053l). Isso representa uma mudança completa da polaridade da célula. As células eventualmente se separam (Fig. & # X020053m). As áreas médias de protrusão e retração foram medidas ao longo do tempo (Fig. & # X020053n, o). Curiosamente, a mudança de polaridade ocorre imediatamente após as duas células fazerem contato. A protrusão inicial colapsa no momento do contato (Fig. & # X020053n, seta) e uma nova protusão é criada no lado oposto da célula (Fig. & # X020053o, seta).

Para resumir, CIL ocorre com frequência semelhante e tempo comparável em culturas 2D e 1D. Criticamente, a duração do contato celular & # x02013célula, a dinâmica da protrusão celular que leva à repolarização e suas consequências na velocidade e aceleração celular são preservadas em substratos 1D.

Padronização e validação de um parâmetro único para ensaio de CIL

Em um ensaio de colisão 1D, a migração celular é restrita em linhas retas. Quando as células entram em contato umas com as outras, ocorrem três resultados principais. Se as células exibem uma resposta CIL clara, o contato da célula & # x02013célula resulta em repolarização completa e migração das duas células para longe uma da outra (Fig. & # X020054ai, filme de material b suplementar 2). Se as células não exibem CIL entre si, elas podem não dissociar o contato estabelecido na colisão e permanecer juntas (Fig. & # X020054aii, material bii suplementar Filme 2) ou podem não ser afetadas por sua interação física e passarem uma pela outra (Fig. . & # x020054aiii, biii material suplementar Filme 2). Portanto, o confinamento espacial da migração celular simplifica a distinção entre uma resposta CIL e uma não-CIL. Em seguida, analisamos se a qualidade das colisões seria melhorada pelas condições de cultura 1D. Em 2D, definimos uma colisão & # x0201cs bem-sucedida & # x0201d como um evento em que ambas as células se repolarizam de forma eficiente ao entrarem em contato uma com a outra e se afastam. É importante ressaltar que observamos que a porcentagem de colisões bem-sucedidas foi significativamente aumentada em substratos 1D (Fig. & # X020054c). As primeiras observações de Abercrombie e Dunn em fibroblastos de coração de pinto indicaram que as células sofrem uma resposta de repolarização mais forte quando entram em contato uma com a outra de forma direta, quando ambas as bordas de ataque fazem contato frontal (Abercrombie e Dunn, 1975) . Uma vez que as células são forçadas a interagir cabeça a cabeça quando cultivadas em substratos 1D, isso pode explicar a melhoria observada da eficiência de CIL em culturas 1D versus 2D.

(uma) Diagrama que mostra os resultados possíveis de colisões de células & # x02013 células em linhas de fibronectina. (b) Exemplos que mostram os diferentes resultados descritos no painel A. Quando ocorre CIL, leva à repolarização completa da direção de migração com células se afastando umas das outras (ai,bi) Alternativamente, as células podem falhar em se dissociar após o contato e aderir umas às outras (aii,bii) Finalmente, as células podem não reagir ao seu contato físico e passarem umas pelas outras seguindo seu caminho original de migração (aiii,biii). (c) Porcentagem de colisões de células & # x02013 células em que ambas as células em colisão se repolarizam após o contato em culturas 2D ou 1D (*P& # x0003c0.05). (d) Porcentagens de células NC exibindo comportamento CIL, adesão ou Walk-Past em condições de controle ou após inibição de Wnt / PCP (DEP +) ou inibição de Rho quinase (Y-27632). *P& # x0003c0.05 **P& # x0003c0.01. (e) Distância entre núcleos de células em colisão 30 & # x02005 minutos após o contato inicial em condições de controle ou após tratamento DEP + ou Y-27632 (**P& # x0003c0.01). Barra de escala: 10 e # x02005 e # x000b5m (b).

A técnica de micropadrão aqui descrita permite maior previsibilidade e maior eficiência da resposta CIL em colisões de células & # x02013. Como todos os ensaios funcionais disponíveis até agora para avaliar CIL requerem mais de uma etapa de quantificação e muitas vezes incluem rastreamento de células, nosso objetivo foi identificar um parâmetro celular cuja medição direta pudesse fornecer uma leitura fácil de CIL. A distância entre os núcleos de duas células em colisão (Fig. & # X020053k) apareceu como um parâmetro candidato interessante, pois é mantida relativamente constante se as células estabelecem um contato, mas aumenta linearmente quando duas células se repolarizam e se afastam. Os filmes de lapso de tempo ainda são necessários para distinguir as células que estão distantes devido ao CIL ou comportamento de caminhada, mas o rastreamento de células não é necessário.

Para validar este método, testamos algumas das vias de sinalização que foram descritas como envolvidas na CIL de células da crista neural (Carmona-Fontaine et al., 2008). Bloqueamos CIL interferindo na sinalização Wnt / PCP e Rho usando um negativo dominante de Desgrenhado (DshDEP +) (Carmona-Fontaine et al., 2008) e o inibidor ROCK Y-27632 (Carmona-Fontaine et al., 2008 Kadir et al. al., 2011). A colisão entre células de controle, células que expressam DshDEP + ou células tratadas com Y-27632 foram analisadas qualitativamente (Fig. & # X020054d) e a distância entre os núcleos foi medida em paralelo (Fig. & # X020054e). Uma redução significativa na resposta CIL foi observada para ambos os tratamentos. É importante ressaltar que a perda de CIL foi associada a uma redução significativa da distância entre os núcleos das células em colisão 30 & # x02005 minutos após o contato inicial (Fig. & # X020054e), confirmando que a distância entre os núcleos das células em um determinado ponto de tempo após a colisão é um boa leitura de CIL.

Aqui, mostramos como uma técnica de micropadronização pode facilitar a análise de um fenômeno de relevância biológica significativa, como CIL. O confinamento fornecido por culturas unidimensionais facilita a identificação de colisões de células & # x02013, aumentando sua previsibilidade. Ele melhora a eficiência do CIL, forçando as células a sofrerem colisões frontais e eliminando as colisões frontais. Além disso, evitando o movimento e a rotação aleatórios durante a colisão, as culturas 1D abolem as etapas demoradas de monitorar ângulos de aceleração e realizar o rastreamento de células. Além disso, simplifica a análise das mudanças na polaridade por subtração da imagem. Finalmente, a simplificação fornecida por culturas em linhas de fibronectina permite a detecção de uma resposta CIL funcional pela medição de um parâmetro simples e único, como a distância entre dois núcleos celulares.


Métodos

Preparação de microesferas revestidas com proteínas e lamínulas de vidro revestidas com proteínas.

As contas revestidas com proteína A foram preparadas como descrito na ref. 13, com pequenas modificações. Vinte e cinco microlitros de microesferas de poliestireno revestidas com proteína A (Bangs Laboratories) foram lavadas em acetato de sódio 1 mM, pH 3,9, seguido por lavagem duas vezes com tampão de contas (Hepes 20 mM, NaCl 50 mM e CaCl 2 mM2, pH 8,0). Em seguida, 5 μg de proteína recombinante Fc-hE foram ligados às microesferas, suspensos em 50 μL de tampão de grânulos e incubados por 2 h a 4 ° C com agitação. Anticorpo anti-HLA (para células MCF-7) ou polilisina (para células MCF10A) foi usado como controle. Os grânulos revestidos foram lavados duas vezes com tampão de grânulos e incubados com BSA a 1% e 5 μg de proteína Fc humana em 50 μL de tampão de grânulos por 1 h para bloquear a ligação de proteína não específica. Depois de serem lavadas três vezes em tampão de grânulos, os grânulos foram ressuspensos em 250 μL de CaCl 2 mM2 e 1 mM de MgCl2 contendo HBSS ++. Após breve sonicação no sonicador de chifre de copo para dissociar agregados de grânulos, 15 μL de grânulos foram transferidos para revestir a superfície das células. Os experimentos também foram feitos usando lamínulas de vidro revestidas com proteína, nas quais lamínulas foram revestidas durante a noite a 4 ° C com 10 μg de fibronectina junto com 10 μg de Fc-hE ou 10 μg de anticorpo anti-HLA. As lamelas foram lavadas em PBS e revestidas com BSA a 1% em PBS por 1 h antes do plaqueamento das células.

Ensaio de proliferação baseado em esferas de E-caderina.

Monocamadas de células foram lavadas duas vezes em HBSS ++ e incubadas com 0,02% de tripsina em HBSS ++ por 30 min. As células foram centrifugadas e ressuspensas em meio completo. Em seguida, 1.500 células por poço foram transferidas para placas de 24 poços contendo 10 μg de lamínulas revestidas com fibronectina e incubadas por 4 h para permitir a fixação das células. Depois de adicionar 15 μL de anticorpo ou grânulos revestidos de proteína, as células foram incubadas por 24 a 37 ° C e 5% de CO2. Seis horas antes da fixação das células, 50 μM de BrdU foi adicionado. As lamelas foram lavadas e a incorporação de BrdU foi detectada por coloração de imunofluorescência usando um anticorpo monoclonal anti-BrdU, enquanto os núcleos foram detectados por coloração com DAPI. As células marcadas com BrdU foram contadas a partir da população de células completamente isoladas presentes nas lamelas, e a porcentagem de incorporação de BrdU nesta população foi calculada. Para examinar o efeito do grânulo de E-caderina na localização de YAP, as células MCF10A foram cultivadas em meio DMEM / F12 suplementado com 5% de soro de cavalo, 0,5 μg / mL de hidrocortisona, 100 ng / mL de toxina da cólera e 10 μg / mL de insulina . Os grânulos de E-caderina foram ligados como descrito acima e a proteína YAP endógena foi determinada por coloração de imunofluorescência indireta.


Fatores de crescimento solúveis

Vários estudos recentes descobriram que os hormônios solúveis ou o fator de crescimento podem regular o Hippo-YAP, além de sua regulação pelo contato celular, polaridade e propriedades mecânicas que são importantes para a organização do tecido. Na maioria dos casos, esses fatores de crescimento solúveis inibem a sinalização do Hippo-YAP e neutralizam os efeitos do contato celular (Straßburger et al., 2012 Yu et al., 2012 Fan et al., 2013 Reddy e Irvine, 2013), sugerindo que o Hippo via medeia uma relação recíproca entre a inibição de contato e a sinalização mitogênica (Fig. 3). Vários fatores de crescimento, incluindo EGF, IGF, soro e LPA, inibem a sinalização da via Hippo e levam ao acúmulo nuclear de Yorkie / YAP, que então ativa genes relacionados ao crescimento. Significativamente, Yorkie / YAP é considerado necessário para a proliferação induzida pelo fator de crescimento, sugerindo que a inibição da sinalização da via do Hippo é um componente crucial da sinalização mitogênica. Usando estudos genéticos, isso se mostrou verdadeiro na Vivo no Drosófila, mas quão importante é para a sinalização do fator de crescimento mitogênico na Vivo em tecidos de mamíferos ou câncer ainda precisa ser determinado.

A via Hippo medeia a regulação recíproca da proliferação celular por inibição de contato e sinalização mitogênica. O contato célula-célula inibe a proliferação celular através da estimulação da via Hipopótamo. Fatores de crescimento mitogênicos estimulam a proliferação por mecanismos de sinalização bem conhecidos, mas também neutralizam os efeitos inibitórios do crescimento da via de sinalização do Hippo. Assim, a via Hippo pode coordenar a sinalização mitogênica clássica com o estado físico das células em um tecido. TJ, RTK de junção apertada, receptor tirosina quinase GPCR, receptor acoplado à proteína G.

A via Hippo medeia a regulação recíproca da proliferação celular por inibição de contato e sinalização mitogênica. O contato célula-célula inibe a proliferação celular através da estimulação da via Hippo. Fatores de crescimento mitogênicos estimulam a proliferação por mecanismos de sinalização bem conhecidos, mas também neutralizam os efeitos inibitórios do crescimento da via de sinalização do Hippo. Assim, a via Hippo pode coordenar a sinalização mitogênica clássica com o estado físico das células em um tecido. TJ, RTK de junção apertada, receptor tirosina quinase GPCR, receptor acoplado à proteína G.

Alguns mecanismos diferentes foram encontrados para mediar a regulação da sinalização Hippo-YAP por fatores solúveis. Em células de mamíferos, EGF, soro e LPA foram encontrados para estimular rapidamente o acúmulo nuclear de YAP por um novo efeito a jusante de PI 3-quinase (PI3K) e PDPK1 (PDK1) na via Hippo, em grande parte independente da sinalização Akt. Foi descoberto que PDK1 interage com o complexo central Hippo quinase, e a estimulação de PI3K por EGF faz com que o complexo se dissocie, o que presumivelmente prejudica a capacidade de Lats de fosforilar YAP (Fan et al., 2013) (Fig. 4). A via PI3K-PDK foi igualmente encontrada para mediar a inibição da via Hipopótamo através da sinalização de IGF em Drosófila (Straßburger et al., 2012). A sinalização de EGF também foi encontrada para inibir a sinalização da via de hipopótamo em Drosófila, mas neste caso verificou-se que era mediada pela MAP-quinase e a regulação das verrugas por Ajuba (Reddy e Irvine, 2013). Em alguns casos, os hormônios podem estimular, em vez de inibir, a via Hipopótamo, por exemplo, através da estimulação mediada por receptor acoplado à proteína G da sinalização de adenil-ciclase-PKA para estimular a atividade Lats (Yu et al., 2012 Yu et al., 2013). Será interessante ver o quão difundida é a regulação da via do Hipopótamo por fatores solúveis.

Dois mecanismos para a regulação da via Hipopótamo mediada por fator de crescimento: ativação da sinalização Ras-MAPK e ativação da sinalização PI3K-PDK1. (Painel esquerdo, via de hipopótamo ativada) Em células confluentes na ausência de fatores de crescimento, PDK1 forma um complexo com os componentes da via de hipopótamo (Lats, Mst e Sav1) e a via de hipopótamo está ativa. Mst fosforila Mob e Lats, que então fosforila YAP. YAP é então excluído do núcleo e o crescimento celular é interrompido. (Painel direito, via Hipopótamo desativada) A ativação da via Ras-MAPK pela sinalização de EGF fosforila Ajuba, que se liga e inibe a atividade do complexo Sav -Wts, levando à desfosforilação de Yorkie, seu acúmulo no núcleo e aumento da célula proliferação. Fatores de crescimento (EGF, LPA ou soro) também podem ativar PI3K e recrutar PDK1 para a membrana, resultando na dissociação do complexo PDK1-Hipopótamo. Como resultado, a regulação de Lats por Mst é evitada, o que eventualmente leva ao acúmulo nuclear de YAP e à proliferação celular. A figura foi modificada com permissão (Fan et al., 2013). PIP2, PtdIns (4,5)P2 PIP3, PtdIns (3,4,5)P3.

Dois mecanismos para a regulação da via Hipopótamo mediada por fator de crescimento: ativação da sinalização Ras-MAPK e ativação da sinalização PI3K-PDK1. (Left panel, Hippo pathway on) In confluent cells in the absence of growth factors, PDK1 forms a complex with Hippo pathway components (Lats, Mst and Sav1) and the Hippo pathway is active. Mst phosphorylates Mob and Lats, which then phosphorylate YAP. YAP is then excluded from the nucleus and cell growth is arrested. (Right panel, Hippo pathway off) Activation of the Ras-MAPK pathway by EGF signaling phosphorylates Ajuba, which binds to and inhibits the activity of the Sav –Wts complex, leading to dephosphorylation of Yorkie, its accumulation in the nucleus and increased cell proliferation. Growth factors (EGF, LPA or serum) can also activate PI3K and recruit PDK1 to the membrane, resulting in the dissociation of the PDK1–Hippo complex. As a result, the regulation of Lats by Mst is prevented, which eventually leads to nuclear accumulation of YAP and cell proliferation. Figure was modified with permission (Fan et al., 2013). PIP2, PtdIns(4,5)P2 PIP3, PtdIns(3,4,5)P3.

Soluble growth-factor-mediated regulation of the Hippo pathway may explain some of the cell nonautonomous features of Hippo-YAP signaling. Two of the well-established target genes for YAP and TEAD are connective tissue growth factor (CTGF) and amphiregulin (AREG), which can mediate effects of Hippo-YAP signaling on neighboring cells (Zhao et al., 2008 Zhang et al., 2009). Increased production of amphiregulin occurs at low-cell density due to loss of contact inhibition, decreased Hippo pathway signaling and increased concentration of nuclear YAP, which allows cells to proliferate rapidly (Zhang et al., 2009). Because amphiregulin is an EGF receptor (EGFR) ligand it can, in turn, inhibit Hippo pathway signaling and increase the nuclear accumulation of YAP (Fan et al., 2013), creating a positive autocrine or paracrine feedback loop to stimulate and spread the transcriptional activity of YAP. Several other examples of cell nonautonomy in Hippo pathway signaling have been observed, including Src kinase activation of Yorkie in neighboring cells (Enomoto and Igaki, 2013) and the effects of cell-cell competition on Hippo pathway signaling (Chen et al., 2012) (see below). In these cases the mediators that act between cells are not yet known, but soluble growth factors are likely to be candidates.

The findings that inhibition of Hippo pathway signaling can be a component of mitogenic signaling has important general implications and raises questions with regard to many different biological processes. How common is it for regulation of Hippo-YAP signaling to be coordinated with mitogenic signaling pathways during embryonic and/or tissue development? Is this coordination important for cancer growth? For example, mutational activation of the PI3K pathway, due to constitutively active mutations in PI3K or inactivation of PTEN, or activation of the EGFR pathway are known to drive the growth of many tumors (Engelman et al., 2006). Stimulation of PI3K signaling, including the presence of mutations that render PI3K constitutively active, cause nuclear accumulation of YAP (Fan et al., 2013), which suggests that YAP regulation by PI3K signaling is an important general mechanism in cancer. Understanding the role of Hippo-YAP signaling inhibition in mitogenic signaling na Vivo is likely to be important for future research.


Cadherins and Pak1 Control Contact Inhibition of Proliferation by Pak1-βPIX-GIT Complex-Dependent Regulation of Cell-Matrix Signaling

FIGO. 1 DN-Pak1 perturbs contact inhibition and inhibits lateral βPIX recruitment. (A and B) Parental MDCK cells were plated on Transwell filters at confluent densities. (A) Cell proliferation was determined by BrdU incorporation assays 1, 3, and 6 days after plating. (B) Cell lysates were analyzed for p27 kip1 , βPIX, and β-tubulin (loading control) expression by Western blotting. (C and D) All cells were grown for 6 days on Transwell filters. (C) Cells were induced to express Pak1-WT (WT), Pak1-K299R (K299R), the Pak1 autoinhibitory domain (AID), or an inactive mutant of Pak1-AID (AID-L107F). The graph shows cell proliferation, as assayed by BrdU incorporation into control (black bars) and induced (gray bars) cells. (D) Western blot of p27 kip1 levels in control cells (+dox) and cells expressing Pak1-K299R (−dox). (E) Cell lysates of cells expressing the indicated Pak1 mutants were analyzed for Pak1 expression by Western blotting with antibodies against the Pak1 N terminus and C terminus. The arrow indicates a N-terminal cleavage product in cells expressing Pak1-T423E. (F) Control (+dox) and HA-tagged (−dox) Pak1-K299R-expressing cells were fixed and stained for βPIX (green), HA (red), and nuclei (blue). Bar, 10 μm. FIGO. 2 Kinetics of lateral βPIX recruitment and establishment of contact inhibition. (A) Parental MDCK cells were plated on Transwell filters at confluent densities. Cells were fixed after 1 to 6 days and costained for βPIX and β-catenin. (B and C) Cells were transfected with siRNAs against βPIX or appropriate controls, as indicated in Materials and Methods, and plated on Transwell filters. The βPIX-KD1 (PIX-1) siRNA was transfected into parental MDCK cells. βPIX-KD2 (PIX-2), which is specific for canine βPIX, was transfected in cells that inducibly express human βPIX (hPIX) under the control of the Tet-off system. Cell proliferation was determined 3 days after plating (B), and Western blots of lysates were stained for βPIX (C), using a polyclonal antibody that recognizes both endogenous canine and human βPIX. The top band in induced cells (−dox) represents human βPIX, which can be detected as a slightly-slower-migrating band due to its Myc tag. FIGO. 3 Knockdown of βPIX or expression of DN-Pak1 does not affect cell-cell junctions. (A and B) Cells were transfected with siRNA against GFP (control) or βPIX and plated on Transwell filters. (A) Western blots of cell lysates prepared 3 days after plating show that βPIX knockdown did not affect expression levels of E-cadherin or the tight junction component ZO-1. β-Tubulin was used as a loading control. (B) Cells were also fixed and costained for βPIX and E-cadherin, showing that βPIX knockdown by two different oligonucleotides did not affect the lateral localization of E-cadherin. (C and D) Control cells (+dox) and cells expressing Pak1-K299R (−dox) were plated on Transwell filters and grown for 5 days. (C) Western blot showing that Pak1-K299R expression does not affect expression levels of E-cadherin and ZO-1. β-Tubulin was used as a loading control. (D) Cells were also fixed and costained for a desmosomal marker, the adherens junction marker β-catenin, and the tight junction marker ZO-1. Because cells that express Pak1-K299R form multilayers, the tight junctions are not all within the same focal plane. We therefore made projections of images showing ZO-1 from several optical sections to show that tight junctions were not disrupted. Bars, 10 μm. FIGO. 4 Lateral recruitment of βPIX requires functional adherens junctions. (A) Western blot showing levels of E-cadherin and cadherin-6 in cells expressing DN-Cad and E-Cad-KD. Controls for DN-Cad expression were cells grown in the presence of DOX (+dox), and controls for E-Cad-KD samples were cells stably expressing shRNA against GFP (con). Note that the loss of E-cadherin by shRNA-mediated E-cadherin knockdown was compensated by cadherin-6 expression but that E-cadherin and cadherin-6 were both downregulated in DN-Cad-expressing cells. β-Tubulin was used as a loading control. (B) Western blot showing downregulation of E-cadherin and small increases in protein levels of β-catenin and α-catenin upon expression of DN-Cad (−dox). The upper band in the HA-stained Western blot represents an intact DN-Cad construct, and the lower band likely represents a degradation product. (C to F) Control cells (+dox) and cells expressing DN-Cad (−dox) were fixed and stained for HA-tagged DN-Cad (HA), βPIX, and β-catenin. Note that DN-Cad is partially recruited to the plasma membrane (D), disrupts adherens junctions, as seen by cytosolic translocation of β-catenin (F), and causes a loss of lateral βPIX (D′ and F′). Arrowheads in panels D and F point to cells that do not express DN-Cad and which retain βPIX and β-catenin at the lateral membrane. (G) Western blot showing that DN-Cad does not affect expression of Pak1, βPIX, and GIT1. (H) Disruption of adherens junctions by calcium depletion (dep) leads to rapid removal of βPIX from the lateral membrane. Cells were stained for βPIX and E-cadherin. Bars, 10 μm. FIGO. 5 E-cadherin and βPIX-GIT1 complex do not cofractionate during gradient centrifugation. (A and B) Western blots of fractions collected after nonequilibrium gradient centrifugation of postnuclear supernatants run in the absence (A) or presence (B) of octylglucoside. FIGO. 6 Perturbation of contact inhibition in DN-Cad-expressing cells by a β-catenin-TCF/LEF-independent mechanism. (A) Control cells grown in the presence of DOX (+dox) and cells expressing DN-Cad (−dox) were plated on Transwell filters. Cell proliferation at the indicated times after plating was determined by BrdU incorporation assays. (B) Cells were plated as described above. Western blots show expression levels of βPIX and p27 kip1 . (C) β-Catenin-TCF/LEF-dependent transcriptional activation in subconfluent and confluent control cells (+dox) or cells expressing DN-Cad (−dox) was determined by the TOPFLASH luciferase reporter assay. Cells expressing β-catenin-S37A were used as a positive control (white bar). FIGO. 7 Cell density-dependent downregulation of PI3K signaling is abrogated in cells expressing DN-Cad and Pak1-K299R. (A) Downregulation of MEK-ERK and PI3K signaling pathways in confluent cells. Western blots prepared from lysates of subconfluent (SC) (50% confluence 1 day after plating) and confluent (Conf) (confluent density 6 days after plating) parental MDCK cells show a strong decrease in phosphorylation of MEK1/2 at Ser298 and at Ser218/222 in confluent cells. PI3K-dependent phosphorylation of Akt at Ser473 was also inhibited in confluent cells. (B) Confluent and subconfluent control cells (+dox) and cells expressing DN-Cad or Pak1-K299R (−dox) were plated as described above and grown in the presence of serum (fetal calf serum [FCS]) or serum starved overnight. Note that the downregulation of PI3K signaling in confluent cells, as determined by phospho-Ser473-Akt signaling, was independent of the presence of serum but was abrogated in cells expressing DN-Cad or Pak1-K299R. (C) Serum-starved lysates of Pak1-K299R-expressing cells were prepared as for panel B but were treated with 20 μM LY294002 or vehicle control (dimethyl sulfoxide [DMSO]) for 3 h before cell lysis. (D) Western blots of confluent cell lysates of control cells (+dox) and cells expressing Pak1-K299R (−dox) or Pak1-K299RΔPIX. FIGO. 8 DN-Cad or Pak1-K299R expression induces similar changes in focal contacts. (A to E") Confluent control cells (A and C) and cells expressing DN-Cad (B), Pak1-K299R (D), or Pak1-K299RΔPIX (E) were plated on glass coverslips and stained for βPIX (green), paxillin (red), and nuclei (blue). Confocal images taken from the basal surface are shown. Hence, nuclei, which are located above this focal plane, are only partially visible. The inset in panel A′ shows that focal contacts in control cells, stained with paxillin antibodies, are long, well-organized structures which colocalize with βPIX only in dots at the cell cortex. Expression of DN-Cad (B), Pak1-K299R (D), or Pak1-K299RΔPIX (E) disrupts this specific type of colocalization as well as the general organization of focal contacts. (F) Western blot of cell lysates nucleofected with oligonucleotides against Pak1 or Pak2, showing that MDCK cells express both isoforms, which can be knocked down effectively by siRNA. Con, cells transfected with a scrambled oligonucleotide. β-Tubulin was used as a loading control. (G to K") Cells were nucleofected with a scrambled control siRNA (G) or siRNA against Pak1 (H and I), Pak2 (J), or both (Pak1 KD-1 and Pak2 KD-1) (K). Cells were plated and stained as in panels A to E". Bar in panel A", 5 μm bar in panel E (for panels A to E" and G to K"), 10 μm. FIGO. 9 Elevated Rac1-GTP levels in cells expressing DN-Pak1 and DN-Cad. Cells expressing DN-Cad, Pak1-K299R, Pak1-AID, Pak1-AID, and wild-type Pak (Pak1-wt) were cultured for 5 days with or without DOX, and Rac1-GTP levels were determined as described in Materials and Methods. Lanes show Rac1-GTP or total levels of Rac1 for comparison. FIGO. 10 Inhibition of PI3K inhibits lateral recruitment of βPIX by inhibiting turnover of focal adhesions. (A to B") Parental MDCK cells were plated at confluent densities on glass coverslips and grown for 4 days before being fixed. (D to J") Cells were treated with 20 μM LY294002 1 day after plating. Cells were then grown for an additional 3 days and fixed (D to F′), or the LY294002 was removed and cells were allowed to grow for an additional 24 (G to H′) or 48 h (I to J") before being fixed. Cells were costained for βPIX (green) and paxillin (red) (A, D, G, and I) or for β-catenin (green) and F-actin (phalloidin red) (C and F), and confocal images taken from the basal surface of the cell were obtained. Asterisks in x-z images in panels C and F denote the positions of cell-cell contacts. Alternatively, cells were costained for βPIX (green) and β-catenin (red), in which case images were taken through a medial focal plane (B, E, H, and J). All figure panels are shown at the same magnification. Bar, 10 μm bars for panels C and F, 20 μm. (K to N) Parental MDCK cells were grown for 6 days on Transwell filters. Cells were fixed (control) (K) or grown in low-calcium medium for 90 min (L to N). Next, cells were fixed (L) or grown in medium containing a normal level of calcium for 3 h in the absence (M) or presence (N) of 20 μM LY294002 before being fixed. Cells were stained for βPIX (green) and nuclei (blue). Note that LY294002 does not inhibit the reappearance of lateral βPIX upon calcium repletion.

Gumbiner, Barry M.

Contact inhibition of cell growth is essential for the development and maintenance of tissue architecture and the prevention of dysplastic growth in cancer. It is highly regulated, since growth can occur in rapidly developing tissues despite cell contact, and the growth of tumors is characterized by a loss of contact inhibition of proliferation. The recently identified Hippo signaling pathway has been implicated in contact inhibition of proliferation as well as organ size control. The modulation of the phosphorylation and nuclear localization of the YAP transcriptional regulator by the highly conserved kinase cascade of the Hippo signaling pathway has been intensively studied, but less is known about cell surface receptors regulating the Hippo signaling pathway. We discovered that the Hippo signaling pathway mediates E-cadherin-dependent contact inhibition of proliferation. E-cadherin stimulates Hippo signaling and YAP nuclear exclusion via several membrane associated proteins, and we are actively investigating the molecular mechanism linking E-cadherin engagement and the hippo pathway. Knowledge of this mechanism is being used to determine the specific role of cadherin-hippo-mediated signaling in the control of cell proliferation and tumor growth in vivo using genetic manipulations of animal models of mammary tumors.

Contact inhibition of growth can be antagonized by mitogenic growth factor signaling. We report an important mechanism for this antagonism, the inhibition of Hippo pathway signaling by mitogenic growth factors. Epidermal growth factor (EGF) treatment cells triggers the rapid translocation of YAP into the nucleus and YAP dephosphorylation, both of which depend on Lats, the terminal kinase in the Hippo pathway. A small molecule inhibitor screen revealed that EGF signaling inhibits the Hippo pathway through activation of PI3-kinase (PI3K) and phosphoinositide-dependent kinase (PDK1), but independent of AKT activity. This pathway is not unique to EGF signaling because the PI3K-PDK1 pathway also mediates YAP nuclear translocation downstream of lysophosphatidic acid and serum as a result of constitutive oncogenic activation of PI3K. PDK1 associates with the core Hippo pathway-kinase complex, which dissociates in response to EGF signaling, leading to inactivation of Lats, dephosphorylation of YAP, and YAP nuclear accumulation. These findings show that an important activity of mitogenic signaling pathways is to inactivate the growth-inhibitory Hippo pathway and provide a mechanism for antagonism between contact inhibition and growth factor action. We are currently investigating the detailed molecular mechanism underlying this regulation, which will also be used to determine its role of in the control of cell proliferation and tumor growth in vivo using genetic manipulations of animal models of mammary tumors.

Regulation of cadherin-mediated adhesion in tissue morphogenesis, cancer, and inflammation.

We discovered many years ago that cadherin adhesive function can be regulated of at the cell surface to mediate dynamic changes in cell interactions in tissues, including morphogenetic cell movements during embryonic development. New findings from my laboratory provide important new insights into the mechanisms of E-cadherin regulation in epithelia as well as novel approaches to manipulate cadherin activity experimentally. We discovered a mechanism that controls cadherin conformation and adhesive activity at the cell surface independent of any changes in levels of expression or amounts of associated catenins. We are able to distinguish the inactive and active states of E-cadherin at the cell surface by using a special set of monoclonal antibodies (mAbs). Another set of mAbs binds E-cadherin and strongly activates adhesion. Both types of mAbs recognize specific conformational epitopes at different interfaces between extracellular cadherin repeat domains (ECs), especially near calcium-binding sites. Moreover, we discovered a role for p120-catenin phosphorylation and microtubules in the control of E-cadherin activity state. Activation induces p120-catenin dephosphorylation, and phospho-site mutations indicate that dephosphorylation of specific Ser/Thr residues in the N-terminal domain of p120-catenin mediate adhesion activation. Thus physiological regulation of the adhesive state of E-cadherin involves physical and/or conformational changes in the EC interface regions of the ectodomain at the cell surface that are mediated by catenin-associated changes across the membrane.

We hypothesize that regulation of the adhesive homophilic bond itself is a key event in cell junction regulation, allowing the catenin-associated cytoskeleton to pull the junctions apart once the adhesive bond is broken, and that this mechanism plays a role in morphogenetic cell movements, barrier regulation in both epithelia and endothelia during inflammatory processes, and cancer metastasis. We are working to understand in greater depth the mechanisms by which cadherins are regulated at the cell surface, including: the nature of the changes in the properties of the homophilic adhesive bond the cytoplasmic mechanisms regulating p120-catenin phosphorylation and the effectors through which p120-catenin phosphorylation controls adhesion activity the role of E-cadherin activity state in the regulation of tumor metastasis and epithelial barrier function during inflammatory processes in both cell culture and animal models.


DISCUSSÃO

Cells within tissues receive instructive cues to regulate proliferation and differentiation. Changes in how this information is processed lie at the core of many diseases—particularly cancer—and can act as biomarkers for detection and therapy response. Concurrently, preceding full transformation, tissue aberrations are already detectable, such as the altered distribution of proliferating cells in preadenomatous intestinal crypts exposed to γ-radiation (Trani et al., 2014). In addition to providing potential biomarkers, such changes can reveal how mechanisms that control cell behavior in healthy crypts are altered to initiate tumors.

Computational modeling is a powerful tool for testing hypotheses derived from experimental data. We describe a 3D computational model geometrically constrained according to the size, shape, and composition of small intestinal crypts. Within this framework, we compare six alternative hypotheses about the mechanisms that control cell division, which differ in how cells interpret Wnt signals to set their proliferative status and the duration of the cell cycle. We directly compare model simulations with experimental measurements to identify parameters that most accurately reproduce the situation in tissue. We focus on Wnt signaling as the major signaling pathway that regulates proliferation and differentiation in many tissues, particularly in intestinal crypts, where it is absolutely required. Changes in key proteins that regulate Wnt signaling are known to be key drivers of cancer in this tissue (Anastas and Moon, 2012 Polakis, 2012). Concurrently, we examine the role of density-dependent inhibition of mitosis to account for cell size. By sweeping over two parameters—a Wnt, or pedigree, threshold that defines when a cell is no longer proliferative, and a volume threshold that determines when the cell cycle pauses—we identify both the model and parameter set that most closely match experimental data.

Our simulations reveal that the concentration of Wnt a cell experiences when it is generated by a division (i.e., when it is born) dictates its proliferative status. Furthermore, simulations suggest that cell cycle duration is proportional to Wnt stimulus, with cell cycle times decreasing linearly along the crypt axis. We predict the Wnt concentration threshold required to maintain cells in cycle, such that cells residing in the lower 40% of the crypt receive sufficient Wnt to proliferate. We also find that, normally, the cell cycle will pause due to contact inhibition if cell volumes are <90% of equilibrium. Crucially, the same optimal model most closely recapitulates the mitotic distribution of γ-irradiated crypts 48 h postirradiation. In this precancerous situation, both the Wnt concentration threshold and the threshold volume for division are lower than in the control. This means that cells proliferate at lower Wnt concentrations and can divide despite not having reached normal size, which could happen under increased compression or because a checkpoint that links cell growth to mitotic entry is defective.

Mutations that stimulate Wnt signaling are common to almost all human tumors in intestinal tissue (Schneikert and Behrens, 2007 Polakis, 2012). Therefore the finding that precancerous cells are more sensitive to Wnt may appear inconsistent with elevated Wnt signaling in tumors (Anastas and Moon, 2012). However, an alternative way to interpret our results is that the cells act as if they perceive higher Wnt concentrations than they actually receive. Our models assume that Wnt ligands in the environment are unchanged, and parameter sweeps compare cellular response to external Wnt concentrations that vary spatially. Therefore in our simulations, a mutation that produces increased Wnt signaling in a cell is equivalent to a lowered Wnt stimulus threshold, making it appear as if a cell maintains its proliferative state at a lower Wnt concentration. Our modeling work supports the idea that mutations that cause or mimic increased Wnt signaling in addition to decreasing sensitivity to compression are sufficient to produce observable changes in proliferation patterns in precancerous crypts, suggesting that even before overt tissue changes are in place, Wnt signaling is up-regulated so that lower external Wnt concentrations can stimulate proliferation.

Similar considerations apply to the data and models for irradiated tissue. Radiation damage requires tissue repair, which involves up-regulation of Wnt signaling. Intestinal tissue damage causes local up-regulation of Wnt5a to support tissue repair (Miyoshi et al., 2012). Further support for the idea that Wnt activation is involved in recovering from radiation-induced damage in crypts relates to the finding that lack of Mtg16 causes improved recovery of intestinal crypts and organoids from radiation damage (Poindexter et al., 2015). Mtg16 competes with beta-catenin for binding to (and thus activating) Tcf4 (Moore et al., 2008). In the absence of Mtg16 β-catenin can activate Tcf4 more effectively (akin to increased Wnt signaling) and recovery from radiation is improved. In addition, radiation damage produces free oxygen radicals, which causes stabilization of hypoxia-inducible factor α (HIF1a). Hif1a represses APC (Newton et al., 2010), which in turn activates Wnt target genes. Our finding that mutant cells respond to lower Wnt concentrations creates the same situation, and cells proliferate when they normally would not. However, in our model, it is the concentration of Wnt required to stimulate proliferation that is lowered in response to injury, an increase in the locally available Wnt could have the same effect.

A novel distinction that our models can make is whether the proliferative state of a cell is decided when it is first produced by cell division or depends critically on (and thus varies with) its spatial position. Cells in the crypt move rapidly and can cover up to 50 μm in 12 h (Nelson et al., 2012). This means that the Wnt concentration that cells experience could vary significantly between divisions. We find that the Wnt concentration a cell experiences is set when it emerges from a division, which means that the position where a cell is born is crucial for its fate. This is consistent with the emerging idea that differentiation signals are most effective in the G1 stage of the cell cycle, that is, after mitosis (Dalton, 2015).

This behavior is particularly relevant for stem cells, which reside at the crypt base. In the optimal model we identify, the high Wnt concentration at the crypt base induces a long cell cycle time (22–24 h), such that stem cells can theoretically move a significant distance between birth and committing to the next cell cycle. However, stem cells may not move significantly unless they are positioned close to the stem cell niche boundary. This was recently suggested by lineage-tracing experiments, which showed that the probability of a stem cell, or its progeny, of exiting the stem cell zone is highest when it is positioned near the boundary between the stem cell niche and the transit-amplifying compartment (Ritsma et al., 2014). Consistent with these data, our model shows that where a cell is born predicts whether it or its daughters will reenter the cell cycle or differentiate. Thus our models provide key insights into how signaling events in one compartment affect cellular behavior in another. This in turn explains the hierarchical organization of the intestinal crypt and also the relationship between cell position and fate.

Our simulation results show that if radiation induces a conversion to a mutant state in at least 40% of proliferating cells, these mutants will have a sufficient growth advantage and can colonize an entire crypt, even without a change in mechanical properties. For lower proportions of mutant cells, nonmutant cells can also win out. Previous modeling work found that mutant cells needed to exhibit stronger adhesion to the substrate than healthy cells to colonize the crypt however, these investigations were constructed in a simpler, 2D geometry (Mirams et al., 2012). We predict the time for conversion to be short in either case, on average requiring <800 h, consistent with idea that crypts are clonal (Ritsma et al., 2014). This leads to a situation with some crypts fully mutant and some fully nonmutant after a recovery period, with the ratio between these two types of crypts dependent on how many mutant cells were created by the initial insult.

We examined this situation in the context of such “recovered” tissue that had been exposed to radiation and was then allowed to recover for 3 mo before mitotic events were recorded. In this scenario, the mitotic distribution in the crypts remained broadened, suggesting that the tissue had permanently changed. We predict that the mitotic distribution in recovered tissue reflects division events in monoclonal crypts. Our analysis confirmed the existence of two types of crypts: one comprising solely mutant, the other solely healthy cells, with a relative abundance of 64% and 36%, respectively. On the basis of these numbers, we predict that the initial insult affected <40% of proliferating cells in each crypt.

Our result is consistent with the long time it takes for the development of fully transformed tissue. The fact that the altered mitotic distribution preceded tumor development is also consistent with the idea that mutant crypts can expand and produce adenomas and with the fact that additional mutations are required to develop the necessary growth advantage to fully transform and generate tumors (Fearon and Vogelstein, 1990). Overall, the ability for radiation to induce initial tumorigenic changes is consistent with the delayed onset of colon cancer in patients receiving radiation therapy and also professionals exposed to elevated radiation, such as astronauts (Chancellor et al., 2014).

Another important finding is that the response to contact inhibition is reduced after tumorigenic insult and that cells are smaller when they divide (Table 2). The complex relationship between cell cycle duration and cell size is affected by many different signaling pathways (Ginzberg et al., 2015), including Wnt, and what governs the mechanical properties of cells is just beginning to be understood. The limited data available suggest that cancer cells in situ are indeed softer and more readily compressed than healthy cells, consistent with our finding that mutant cells are smaller. However, high-resolution direct measurements of mechanical properties of cancer and healthy cells in situ are currently available only in the context of breast tissue (Plodinec et al., 2012). Further elucidating the relationships between different signaling pathways, mechanical properties, and cell size requires the ability to measure cell size accurately, which is nontrivial in whole tissue. This is further complicated by the fact that the maximum volume change we predict is only 10% (Supplemental Table S4). Using tissue sections to measure cell size only allows 2D measurement. If we assume that size changes result from a decrease in diameter rather than height, the maximum measurable change would be a 5% reduction in cell diameter. The curvature of crypts together with the natural variability of cell packing makes it unlikely that such a small difference can be measured reliably. An alternative, more sensitive approach is flow-activated cell sorting. However, we predict size changes in situ where compression by neighboring cells affects cell size. Thus interpreting results generated from isolated cells requires first testing the assumption that mechanical properties of mutant and nonmutant cells are identical. Tissue organoids may be a useful experimental system in which to explore this, as they are amenable to experimental manipulation and contain only epithelial cells. Indeed, when epithelial cells with homozygous mutations in Apc form organoids, they appear smaller when examined in cross section (Fatehullah et al., 2013). However, how these organoids relate to the situation in irradiated crypts needs to be established before valid conclusions can be drawn.

Our results help to identify mechanisms that are disrupted at the earliest stages of tumor development, thus providing potential biomarkers for CRC. Here we consider only one signaling pathway and one of its outputs: proliferation. However, the close fit between experimental and in silico results suggests that how cells interpret Wnt is sufficient to explain their proliferative behavior, confirming that it is at the core of the regulation of intestinal tissue. On the other hand, it is well established that other signaling pathways, including Notch/Delta, bone morphogenic protein (BMP), and epidermal growth factor (EGF), also affect proliferation in the intestinal crypt, and cross-talk between them is likely to fine-tune behavior of cells. Our results suggest that it may be the ability of these pathways to modulate Wnt signaling that is key. Including additional parameters in our model could help to identify their contribution. For example, it is possible that when the Wnt concentration threshold is low, Notch signaling, which normally inhibits differentiation into the secretory lineage, becomes irrelevant, but that if the Wnt threshold is high and cells require a significant Wnt stimulus to remain proliferative, Notch signals may have a more potent effect to maintain cells dedifferentiated and closer to cycling.


Contact inhibition is a mechanism that suppresses cell division, halting the cell cycle in a densely packed cluster of cells. Much more efficient contact inhibition is presently a leading candidate for the reason why naked mole-rats do not suffer cancer: cancer creates dense masses of cells, and thus is halted at the outset in this species. There is considerable interest in the research community in finding ways to exploit this sort of mechanism, bringing it to humans as a therapy of some sort. Hence investigations are presently underway on a range of related mechanisms in cellular biology.

Here a researcher focused on the role of mTOR considers contact inhibition in that context, which spans cancer, cellular senescence, and numerous other aspects of aging. Of particular interest are the mechanisms determining the difference between reversible arrest of cell division, called quiescence, and irreversible arrest as occurs in cellular senescence:

Numerous studies have been aimed to pinpoint the difference between quiescence and senescence based on either the point of cell cycle arrest, the nature of stresses or peculiarities of Cyclin Dependent Kinase-inhibitor (CDKi)-induced arrest (p21 versus p16). Yet, despite all efforts, the distinction remained elusive. In fact, the difference between quiescence and senescence lies outside the cell cycle. A senescent program consists of two steps: cell cycle arrest and mitogen-activated and growth-promoting signaling pathways. Rapamycin suppresses geroconversion, maintaining quiescence instead. Furthermore, any condition that directly or indirectly inhibits mTOR in turn suppresses geroconversion.

The two-step model is applicable to contact inhibition. Given that contact inhibition is reversible, we predicted that mTOR is inhibited. In fact, we found that mTORC1 targets are dephosphorylated in contact inhibited cells. Furthermore, activation of mTOR shifts reversible contact inhibition towards senescence. Thus, it is deactivation of mTOR that suppresses geroconversion in contact inhibited cells. Deactivation of mTOR was associated with induction of p27. In cancer cells, there is no induction of p27 in high cell density. Accordingly, cancer cells do not get arrested in confluent cultures.

There is a complex relationship between p27 and mTOR. It turned out that the mTOR pathway was inhibited in dense cultures of cancer cells. Yet, cancer cells do not induce p27 and do not undergo contact inhibition. mTOR is constitutively activated in cancer and induction of p21 by itself does not inhibit mTOR. So why mTOR is deactivated not only in contact-inhibited but also in confluent cancer cells? The answer is that cancer cells with highly increased metabolism rapidly exhaust and acidify the medium, thus inhibiting mTOR by starvation-like mechanism. In fact, change of the medium restored mTOR activity. Therefore, in normal cells with low metabolism, mTOR is deactivated by contact inhibition and the change of the medium only marginally affects mTOR. In cancer cells, mTOR is inhibited due to exhaustion of the medium. And some cell lines are somewhere in between.

It would interesting to know if cell-to-cell gap junctions play a role.
They appear to be quite important in guiding cells through proper differentiation and avoiding unregulated cancerous growth.


EMT promotes contact inhibition of locomotion

Collision between cells can cause them to move away from each other, a process that is known as contact inhibition of locomotion (CIL). Scarpa et al. shed new light on the molecular mechanisms behind this phenomenon, showing that neural crest cells must switch from expressing epithelial cadherin (E-cadherin) to expressing neural cadherin (N-cadherin) during epithelial–mesenchymal transition (EMT) for CIL to occur.

“cells seem to acquire the ability to undergo CIL during developmental EMT”

Neural crest cells from Xenopus laevis undergo CIL, and the authors asked whether their ability to do so is intrinsic or is acquired during development. They looked at cell populations before (premigratory neural crest (Premig-NC) cells) and after (migratory neural crest (Mig-NC) cells) EMT had taken place and observed that 80% of collisions between cultured Mig-NC cells showed CIL compared with only 40% of such collisions in Premig-NC cells. Furthermore, cell mixing in cultures was higher for Premig-NC cells, most of which formed stable contacts on collision and thus could not disperse, whereas Mig-NC cells underwent dispersion, which requires EMT. Thus, cells seem to acquire the ability to undergo CIL during developmental EMT.

Importantly, the authors noticed that colliding Premig-NC and Mig-NC cells formed junctions with similar dynamics. However, junctions disassembled more quickly in Mig-NC cells, reducing the duration of cell–cell contact. Cells are known to 'switch' the type of cadherin (an adhesion junction component) that they express during neural crest EMT, and the authors found that Premig-NC cells predominantly express E-cadherin and Mig-NC cells predominantly express N-cadherin. Thus, 'cadherin switching' might be necessary for CIL.

Indeed, experiments showed that E-cadherin suppresses CIL. CIL is required for na Vivo migration, and overexpressing E-cadherin reduced neural crest migration in X. laevis and zebrafish embryos. Também, em vitro, E-cadherin overexpression in Mig-NC cells reduced CIL, increased cell mixing and promoted the formation of RAC1-positive protrusions near cell–cell contacts such protrusions normally form near the cell free edge during CIL. Conversely, inhibiting E-cadherin in Premig-NC cells reduced cell intermixing and changed the position of protrusions from cell–cell contacts to the cell free edge where they might support CIL.

How does E-cadherin suppress CIL? RAC1 activity was shown to increase at the cell free edge during CIL to form new protrusions and, importantly, this promoted junction disassembly. By contrast, the authors found that E-cadherin interacts with the adhesion junction component p120 catenin to promote RAC1 activity (and presumably protrusions) at cell–cell junctions, preventing junction disassembly and CIL. Finally, using traction force microscopy, the authors showed that overexpressing E-cadherin in Mig-NC cells disrupts the distribution of cellular forces that pull junctions apart in wild-type Mig-NC cells undergoing CIL.

Thus, this study shows why switching from E-cadherin to N-cadherin expression during developmental EMT is crucial for CIL of neural crest cells and thus developmental migration.