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Os primers ou detectores específicos, ou ambos, são usados ​​nos testes COVID-19?


Estou tentando aprender sobre o procedimento de teste rRT-PCR usado para testar COVID-19, mas estou um pouco confuso em um ponto. Os primers altamente específicos são usados ​​com um detector não específico, ou são usados ​​detectores altamente específicos, ou são usados ​​primers e detectores específicos? Algumas das fontes dizem que se utiliza PCR multiplex, o que indica um detector específico, mas como ainda sou um iniciante no assunto, não tenho certeza. Eu também apreciaria muito se alguém pudesse apontar para uma fonte que detalha alguns dos procedimentos de teste.

Obrigado


Quando você executa uma reação de PCR, está fazendo cópias de uma sequência de DNA de interesse (cDNA no caso de retrotranscrição, uma vez que retrovírus têm RNA como material genético). A sequência de interesse presume-se que esteja em uma amostra, que você tira do paciente, ou de algum organismo (digo 'presumida' porque o PCR é precisamente para confirmar isso). Essas cópias são feitas por um grupo de enzimas "generalistas", chamadas polimerases, e por generalistas quero dizer que elas não discriminam a sequência de DNA que estão copiando. Mas, eles não podem copiar DNA de novo (do princípio). O processo de cópia precisa ser "iniciado" por uma curta sequência de nucleotídeos que é complementar ao DNA de interesse. Eles são chamados de primers e servem efetivamente como sondas para direcionar a cópia da sequência específica que você precisa amplificar. E é aqui que os cientistas se preocupam muito: o design de primer. Os primers ruins não serão muito específicos ou não serão muito eficientes durante o processo de amplificação. Quanto à 'máquina' que realmente detecta as cópias, existem muitas variantes. O mais comumente usado em laboratórios de pesquisa e diagnóstico, envolve a coloração do DNA amplificado com alguma molécula que se liga aos ácidos nucléicos (que são muitos) e visualizá-lo via eletroforese de DNA. O que você visualiza é uma população de cópias de DNA (por meio da coloração que você faz), então você precisa saber de antemão o que esperar. Por exemplo, você espera um pequeno fragmento (algumas centenas de pares de bases) ou um grande (alguns milhares?). Você tem uma 'escada' (também chamada de marcador) que fornece uma referência para comparar, como nesta imagem:

As pessoas sabem o que esperar porque já conhecem a sequência de DNA (ou RNA) que estão amplificando (caso contrário, não poderiam ter projetado os primers-alvo). Eles conhecem a sequência porque já fizeram alguma forma de sequenciamento de ácido nucléico (laboratórios, institutos de saúde, etc., fazem isso o tempo todo e depositam as sequências em alguma plataforma, por exemplo, GeneBank).

Uma amplificação 'positiva' dará a você uma banda na faixa de tamanho esperada, e nenhuma outra banda (porque seus primers são direcionados para uma sequência de DNA específica). Mas, como você mencionou, também existe uma reação PCR multiplex. Nele, você projeta vários primers para direcionar sequências diferentes (usando a mesma amostra de DNA, por exemplo, de um paciente ou organismo), mas o processo de verificação é basicamente o mesmo. Aqui, as pessoas são extremamente cuidadosas para evitar interações cruzadas entre os primers adicionados à reação.

O PCR é uma família de técnicas, não uma única. Existem variações no processo real e também na 'detecção' (por exemplo, qPCR usa tempo real detecção de números de cópias). Mas o princípio geral é o mesmo: os primers são específicos, enquanto o 'dispositivo de detecção' não é realmente.


KIT DE RT-PCR COVID-19 ONE-STEP

A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) é uma variante de PCR padrão que consiste em formas amplificadas de um mRNA específico, obtido a partir de amostras diminutas. Ele erradica os requisitos para o procedimento de purificação de mRNA pesado necessário nas práticas tradicionais de clonagem. Em RT-PCR, além dos reagentes de PCR padrão, são utilizadas transcriptase reversa e uma amostra de RNA. A mistura de reação é aquecida a uma temperatura de 37 ˚C, o que permite a produção de cDNA a partir da amostra de RNA por meio do mecanismo de transcrição reversa. Este cDNA endurece para um dos primers levando à síntese da primeira fita. O PCR padrão continua, produzindo dsDNA.

Os primers utilizados no procedimento devem ser concomitantes ao projeto. Os primers Oligo (dT) são suficientes no caso de a amplificação de todo o mRNA de uma célula ser necessária porque eles se fixam nas caudas poli (A). Pelo contrário, se um determinado mRNA precisa ser amplificado, um primer específico para a região de codificação pode ser usado.

RT-PCR é um procedimento geral de diagnóstico de virologia, frequentemente combinado com PCR quantitativo em tempo real (qPCR), que é amplamente utilizado para quantificação dos níveis de transcrição de RNA em células e tecidos. A combinação de PCR em tempo real (qPCR) e PCR de transcrição reversa é referida como RT-PCR quantitativo ou qRT-PCR

O que é Multiplex PCR?

A reação em cadeia da polimerase multiplex refere-se ao uso da reação em cadeia da polimerase para amplificar várias sequências de DNA diferentes simultaneamente. Este processo amplifica o DNA em amostras usando vários primers e uma DNA polimerase mediada por temperatura em um termociclador.

Kit Meril COVID-19 RT-PCR em uma etapa

Devido ao novo surto de coronavírus (SARS-CoV-2), a Meril Diagnostics trabalhou extensivamente para desenvolver um novo kit de RT-PCR em tempo real multiplex de uma etapa para permitir aos laboratórios diagnosticar COVID-19 causado pela infecção por SARS-CoV-2 com ensaios rápidos e fáceis de usar. O kit Meril Covid-19 Rt PCR é um kit de diagnóstico multiplex rápido e altamente sensível que contém os ensaios e controles necessários para a detecção PCR em tempo real de RNA do vírus SARS-CoV-2.

É uma reação PCR Multiplex de um tubo para identificação e detecção de 2019-ncov. Sua mistura de primer e sonda com base no gene de alvo duplo projeta os dois genes confirmatórios ORF 1ab e a nucleoproteína N para a detecção de Sars COV 2 em amostra humana, com uma precisão analítica analítica de & lt 5 cópias / reação de RNA que torna Meril COVID -19 One Step RT_PCR Kit um kit altamente sensível e específico para a detecção de SARS COV 2 RNA.

O kit é altamente compatível com instrumentos RT PCR abertos com canais FAM, HEX / VIC, RED / ROX. O protocolo fácil, o tempo mínimo de ensaio e a alta especificidade e sensibilidade tornam-no a escolha ideal para o seu laboratório para a detecção de pacientes suspeitos de COVID 19.

Kit Meril COVID-19 RT-PCR compatível com os populares Applied Biosystems (ABI) 7500, BioRad CFX 96, Shanghai Hongshi SLAN-96P, QIAGEN Rotor Gene Q e outros instrumentos de PCR com canais FAM, HEX / VIC, RED / ROX.

A mistura de iniciador e sonda para este kit aceita o projeto de gene de alvo duplo, que visa a sequência particularmente conservada que codifica o gene ORF 1ab e o gene N da nucleoproteína. A amplificação do template & rsquos pode ser monitorada quantitativamente pelo aumento do sinal de fluorescência detectado por um instrumento de PCR em tempo real, uma vez que a mistura de reação de PCR é prontamente fornecida.

O sistema de detecção de PCR é composto por um primer de controle interno endógeno e uma mistura de sondas. O resultado do controle interno fornece um processo preciso de amostragem e extração, para evitar resultados falsos negativos.

Uso pretendido:

Este kit foi desenvolvido para detectar a doença COVID-19 usando PCR em tempo real. Os resultados podem ser usados ​​para auxiliar no diagnóstico de pacientes com infecção por COVID-19 e fornecer uma base de diagnóstico molecular para pacientes infectados.

Este kit RT-PCR pode ser utilizado por laboratórios clínicos e de saúde pública para avaliar rapidamente até 94 amostras de pacientes com um único kit, em um período de 3 horas. O kit é aprovado para uso com RNA retirado de esfregaços nasofaríngeos, aspirado nasofaríngeo (aspirado nasal) e lavado broncoalveolar (BAL) de pacientes em risco de exposição ao vírus SARS-CoV-2 ou com sinais e sintomas de COVID- 19

Os resultados são para o reconhecimento do RNA SARS-CoV-2. Durante a fase aguda da infecção, o RNA do SARS-CoV-2 geralmente é evidente em qualquer uma das amostras acima. Os resultados positivos são sugestivos da presença do ARN da SARS-CoV-2, embora a ligação clínica com a história do paciente e outras informações de diagnóstico sejam essenciais para decidir o estágio da infecção do paciente. Resultados positivos não excluem infecção bacteriana ou coinfecção com outros vírus. O agente identificado pode não ser a causa certa da doença.
Além disso, resultados negativos não desqualificam a infecção por SARS-CoV-2 e, portanto, não devem ser usados ​​como a única base para decidir o tratamento do paciente. Os resultados negativos devem ser combinados com observações clínicas, histórico do paciente e informações epidemiológicas.

A avaliação com o kit Meril COVID-19 One Step RT PCR destina-se ao uso por pessoal de laboratório clínico qualificado e treinado, especialmente instruído e treinado nos procedimentos de PCR em tempo real e procedimentos de diagnóstico in vitro.

Os resultados do teste deste kit são destinados apenas para referência clínica e não devem ser usados ​​como a única referência para diagnóstico clínico. A realização de uma análise inclusiva é sugerida combinando os resultados do teste com os sintomas do paciente e outros testes de laboratório.


Como funcionam os testes de antígeno e molecular?

Os vírus requerem um host para se replicar. O vírus sequestra as células do hospedeiro para produzir mais cópias virais de si mesmo. O material genômico para o vírus SARS-CoV-2 é o ácido ribonucleico (RNA), que permanece no corpo enquanto o vírus ainda está se replicando e se reproduzindo. Os testes de diagnóstico procuram evidências deste processo de replicação - que mais vírus estão sendo produzidos - para diagnosticar uma infecção ativa de COVID-19.

Os testes de diagnóstico de antígeno detectam características estruturais do lado de fora do vírus chamadas antígenos - pequenas proteínas que compõem o vírus - que podem estar presentes na amostra de um paciente.

Os testes de diagnóstico de antígeno funcionam por:

  • Encontrar evidências maiores de que o vírus SARS-CoV-2 está infectando ativamente uma pessoa
  • Detecção de antígenos tridimensionais específicos na parte externa do vírus SARS-CoV-2

Os testes moleculares amplificam pedaços de RNA viral para que a infecção viral possa ser detectada usando um teste especializado. & # 160Estes testes também são chamados de testes de amplificação de ácido nucleico (NAAT). O procedimento começa com a coleta de uma amostra do nariz ou boca (saliva) de uma pessoa potencialmente infectada, onde o vírus pode ser encontrado. Se o SARS-CoV-2 estiver presente na amostra, mesmo níveis baixos de material genômico do vírus podem ser amplificados em milhões de cópias detectadas durante um ensaio de diagnóstico molecular. Se uma pessoa estiver infectada, o RNA viral será detectado e produzirá um resultado de teste positivo. Se uma pessoa não estiver infectada, nenhum RNA viral será copiado ou detectado, o que produzirá um resultado de teste negativo. Amplificar o sinal permite que até mesmo pequenas quantidades de vírus sejam detectadas. Esta categoria de teste diagnóstico inclui testes de reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) e ensaios baseados em repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas (CRISPR). Há uma grande variedade de diagnósticos moleculares e alguns fornecem resultados mais rápidos do que os métodos tradicionais baseados em PCR. Esses testes moleculares rápidos incluem LAMP, que pode fornecer resultados em minutos, em vez de horas. Os testes moleculares rápidos que usam técnicas como LAMP são muito específicos, mas também muito sensíveis porque amplificam o material genômico na amostra do paciente. É importante ressaltar que nem todos os testes de diagnóstico rápido são testes de antígenos - alguns são testes moleculares rápidos que são altamente sensíveis, mas fornecem resultados em minutos.

Os testes de diagnóstico molecular funcionam por:

  • Detectar que o vírus SARS-CoV-2 está infectando ativamente uma pessoa
  • Criação de milhões de cópias de pequenos segmentos do vírus SARS-CoV-2, se estiver presente na amostra do paciente, amplificando o sinal
  • Detectando milhões de cópias em máquinas especializadas

Teste para infecção por SARS-CoV-2

Muitas categorias de testes são usadas para detectar SARS-CoV-2, 1 e suas características de desempenho variam.

  • Alguns testes fornecem resultados rapidamente (em minutos), outros requerem tempo para processamento.
  • Alguns devem ser realizados em um laboratório por pessoal treinado, alguns podem ser realizados no local de atendimento e outros podem ser realizados em casa.
  • Alguns testes são muito sensíveis (ou seja, poucos resultados falso-negativos ou poucas detecções perdidas de SARS-CoV-2) outros são muito específicos (ou seja, poucos resultados falso-positivos ou poucos testes que identificam incorretamente o SARS-CoV-2 quando o vírus não é presente) e alguns são sensíveis e específicos.
  • Alguns testes podem ser realizados com frequência porque são mais baratos, mais fáceis de usar e os suprimentos estão prontamente disponíveis.

A seleção e interpretação dos testes SARS-CoV-2 devem ser baseadas no contexto em que estão sendo usados, incluindo a prevalência de SARS-CoV-2 na população sendo testada (ver Tabela 1) e o estado (sinais, sintomas , contatos) da pessoa que está sendo testada.

Tipos de teste

Testes virais, incluindo testes de amplificação de ácido nucleico (NAATs) e testes de antígeno são usados ​​como testes de diagnóstico para detectar infecção com SARS-CoV-2 e para informar um indivíduo & rsquos cuidados médicos. Os testes virais também podem ser usados ​​como testes de triagem para reduzir a transmissão do SARS-CoV-2, identificando pessoas infectadas que precisam ser isoladas de outras. Consulte a lista FDA & rsquos do ícone externo de Autorizações de Uso de Emergência para Diagnósticos In Vitro para obter mais informações sobre o desempenho de testes autorizados específicos.

    Os NAATs, como a reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real (RT-PCR), são testes de alta sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de infecção por SARS-CoV-2. Os NAATs detectam um ou mais genes de ácido ribonucleico (RNA) viral e indicam uma infecção atual ou recente, mas, devido à detecção prolongada de RNA viral, nem sempre são evidências diretas da presença de vírus capazes de se replicar ou de serem transmitidos a outros. A maioria dos NAATs precisa ser processada em um laboratório e o tempo para os resultados pode variar (

A interpretação correta dos resultados do teste de antígeno e dos NAATs confirmatórios, quando indicado, é importante.

Resultados de teste positivos permitir a identificação e isolamento de pessoas infectadas, bem como uma entrevista de caso para identificar e notificar o (s) contato (s) próximo (s) da exposição e da necessidade de quarentena.

Resultados de teste negativos em pessoas com exposição conhecida a SARS-CoV-2 sugerem nenhuma evidência atual de infecção. Esses resultados representam um instantâneo do tempo em torno da coleta da amostra e podem mudar se o mesmo teste for realizado novamente em um ou mais dias. Indivíduos não vacinados com resultado negativo devem continuar em quarentena por 14 dias ou pelo período estabelecido pelas autoridades locais de saúde pública. Pessoas totalmente vacinadas sem sintomas semelhantes aos do COVID não precisam ser colocadas em quarentena ou testadas após exposição a alguém com suspeita ou confirmação de COVID-19, pois o risco de infecção é baixo. Para obter orientação sobre quarentena e teste de pessoas totalmente vacinadas, visite Recomendações provisórias de saúde pública para pessoas totalmente vacinadas para obter mais informações.

Teste negativo resultados em pessoas sem sintomas e sem exposição conhecida sugerem nenhuma infecção. Todas as pessoas sendo testadas, independentemente dos resultados, devem receber aconselhamento sobre a continuação de comportamentos de redução de risco que ajudam a prevenir a transmissão de SARS-CoV-2 (por exemplo, uso de máscaras, distanciamento físico, evitando multidões e espaços mal ventilados).

Testes de anticorpos (ou sorologia) são usados ​​para detectar infecção prévia com SARS-CoV-2 e podem auxiliar no diagnóstico da Síndrome Inflamatória Multissistêmica em Crianças (MIS-C) e em adultos (MIS-A) 2. O CDC não recomenda o uso de testes de anticorpos para diagnosticar a infecção atual. Dependendo da época em que alguém foi infectado e do momento do teste, o teste pode não detectar anticorpos em alguém com uma infecção no momento. Além disso, atualmente não se sabe se um resultado de teste de anticorpos positivo indica imunidade contra SARS-CoV-2, portanto, neste momento, os testes de anticorpos não devem ser usados ​​para determinar se um indivíduo está imune contra reinfecção. O teste de anticorpos está sendo usado para vigilância de saúde pública e propósitos epidemiológicos. Como os testes de anticorpos podem ter diferentes alvos no vírus, testes específicos podem ser necessários para avaliar os anticorpos originados de infecção anterior em comparação com os da vacinação. Para obter mais informações sobre as vacinas COVID-19 e os resultados dos testes de anticorpos, consulte Considerações clínicas provisórias para o uso de vacinas COVID-19 de mRNA atualmente autorizadas nos Estados Unidos.

Visão geral dos cenários de teste

Teste de diagnóstico destina-se a identificar a infecção atual em indivíduos e é realizada quando uma pessoa apresenta sinais ou sintomas consistentes com COVID-19, ou quando uma pessoa é assintomática, mas teve exposição recente ou suspeita de exposição ao SARS-CoV-2.

Exemplos de testes de diagnóstico incluem:

  • Testando pessoas que apresentam sintomas consistentes com COVID-19 e que apresentam ao seu provedor de saúde
  • Testar pessoas como resultado de esforços de rastreamento de contato
  • Testar pessoas que indicam que foram expostas a alguém com um caso confirmado ou suspeito de COVID-19
  • Testar pessoas que participaram de um evento em que outro participante foi posteriormente confirmado como tendo COVID-19

Teste de tela destinam-se a identificar pessoas infectadas que são assintomáticas e não têm exposição conhecida, suspeita ou relatada ao SARS-CoV-2. A triagem ajuda a identificar casos desconhecidos para que medidas possam ser tomadas para prevenir futuras transmissões.

Exemplos de triagem incluem:

  • Testando funcionários em um ambiente de trabalho
  • Testar alunos, professores e funcionários em uma escola ou universidade
  • Testar uma pessoa antes ou depois da viagem
  • Teste em casa para alguém que não tem sintomas associados ao COVID-19 e nenhuma exposição conhecida a alguém com COVID-19

Vigilância em saúde pública tem como objetivo monitorar a carga de doenças em nível populacional ou caracterizar a incidência e prevalência de doenças. O teste de vigilância é usado principalmente para obter informações em nível populacional, e não em nível individual. Os resultados dos testes de vigilância não são informados ao indivíduo. Como tal, o teste de vigilância não pode ser usado para uma tomada de decisão individual sobre cuidados de saúde ou ações individuais de saúde pública, como isolamento ou quarentena.

Um exemplo de teste de vigilância é a vigilância de águas residuais.

Escolhendo um Teste

Ao escolher qual teste usar, é importante entender o propósito do teste (por exemplo, diagnóstico, triagem), desempenho analítico do teste dentro do contexto do nível de transmissão da comunidade, necessidade de resultados rápidos e outras considerações (ver Tabela 1). Por exemplo, mesmo um teste de antígeno altamente específico pode ter um valor preditivo positivo baixo (ou seja, alto número de falsos positivos) quando usado em uma comunidade onde a prevalência de infecção é baixa. Como um exemplo adicional, o uso de um NAAT baseado em laboratório em uma comunidade com alta transmissão e maior demanda de teste pode resultar em atrasos no diagnóstico devido ao tempo de processamento e tempo para retornar os resultados. Os valores preditivos positivos e negativos de NAAT e testes de antígeno variam dependendo da probabilidade pré-teste. A probabilidade do pré-teste considera tanto a prevalência do nível de transmissão na comunidade quanto o contexto clínico do indivíduo que está sendo testado. Informações adicionais sobre sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos para testes de antígenos e testes de anticorpos e para a relação entre a probabilidade pré-teste e a probabilidade de valores preditivos positivos e negativos estão disponíveis. Consulte também as cartas da FDA e rsquos para a equipe do laboratório clínico e provedores de saúde sobre o potencial para resultados falso-positivos com o ícone externo de testes de antígeno e o potencial para resultados falso-negativos com testes moleculares se uma variante genética do ícone externo SARS-CoV-2 ocorrer no parte do genoma viral avaliada pelo teste.

A Tabela 1 resume algumas características dos NAATs e testes de antígeno a serem considerados para um programa de teste. A maioria dos testes de antígenos que receberam EUA do ícone externo do FDA ícone externo são autorizados para testar pessoas sintomáticas nos primeiros 5, 7, 12 ou 14 dias após o início dos sintomas. Dado o risco de transmissão de SARS-CoV-2 de pessoas assintomáticas e pré-sintomáticas com infecção por SARS-CoV-2, o uso de testes de antígeno em pessoas assintomáticas e pré-sintomáticas pode ser considerado. A FDA forneceu uma lista de perguntas frequentes para provedores de saúde que estão usando testes de diagnóstico na triagem de indivíduos assintomáticos ícone externo ícone externo, e os Centros de Serviços Medicare & amp Medicaid exercerão temporariamente o ícone externo de aplicação de critério para permitir o uso de testes de antígeno em indivíduos assintomáticos para a duração da emergência de saúde pública COVID-19 no âmbito das Alterações de Melhoria do Laboratório Clínico de 1988 (CLIA). Os laboratórios que realizam triagem ou testes de diagnóstico para SARS-CoV-2 devem ter um certificado CLIA e atender aos requisitos regulamentares. Os testes que receberam uma EUA do FDA para uso no ponto de atendimento (POC) podem ser realizados com um certificado de isenção CLIA.


Testes de antígeno

Os testes de antígenos podem reverter os resultados em minutos e mdash, mas a velocidade vem com compensações.

Como os testes de PCR, os testes de antígeno geralmente exigem um cotonete no nariz ou na garganta. Mas, ao contrário dos testes de PCR, que procuram material genético do vírus SARS-CoV-2, os testes de antígenos procuram proteínas que vivem na superfície do vírus. Este processo é um pouco menos trabalhoso do que o teste de PCR, uma vez que não há tanta química envolvida, mas também é menos sensível. Mehta diz que isso abre a porta para possíveis falsos positivos (se o teste detectar proteínas que se parecem com as do SARS-CoV-2) ou negativos (se as proteínas perderem totalmente). Falsos positivos são raros com testes de antígeno, mas até a metade dos resultados negativos são relatados como imprecisos. Se o teste for negativo, mas mostrar sintomas ou se tiver sido exposto a risco, seu médico pode solicitar um teste de PCR para confirmar o resultado.

Embora o teste de antígeno esteja se tornando mais comum nos EUA, apenas alguns desses testes foram aprovados pelo FDA até agora. Muito parecido com os testes genéticos rápidos, alguns especialistas argumentam que os testes rápidos de antígenos podem ajudar a aliviar os gargalos dos testes o suficiente para compensar sua precisão reduzida.


RT-PCR como método de diagnóstico de linha de frente para o diagnóstico COVID-19

As abordagens de diagnóstico molecular são apropriadas em comparação com outras abordagens de teste sindrômico porque o diagnóstico molecular tem como alvo o genoma ou proteoma do patógeno, tornando-o um método de diagnóstico específico e confiável (Zhou et & # xa0al., 2020b). Para um novo patógeno, o sequenciamento e diagnóstico torna-se imperativo reconhecer a natureza do patógeno e sua composição genômica. As estratégias de amplificação aleatória e sequenciamento profundo desempenharam um papel crítico na identificação precoce do SARS-CoV-2, que foi posteriormente confirmado como um membro da família do coronavírus através da diferentes abordagens de bioinformática (Briese et & # xa0al., 2014). Usando sequenciamento metagenômico, o primeiro sequenciamento genômico foi conduzido para SARS-CoV-2 (Miller et & # xa0al., 2019 Sheridan 2020a). Em 10 de janeiro de 2020, os resultados foram divulgados e as sequências enviadas para o repositório de sequências do GenBank (Wu et & # xa0al., 2020). A liberação de toda a sequência do genoma de SARS-CoV-2 para bancos de dados públicos facilitou para os cientistas projetar primers e sondas para a realização de diagnósticos laboratoriais de COVID-19 (Corman et & # xa0al., 2020). Após a identificação desse vírus, a OMS recomendou a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa em tempo real (RT-PCR em tempo real), que é uma técnica baseada em ácido nucléico, como a abordagem diagnóstica de primeira linha para detectar infecção por SARS-CoV-2 em pacientes suspeitos. O RT-PCR é altamente sensível e pode detectar a infecção em níveis mínimos do patógeno presente na amostra do paciente. É uma técnica baseada em ácido nucleico usada para amplificar um gene / nucleotídeo alvo presente em uma amostra, o que ajuda a detectar um patógeno específico e discriminá-lo de outros patógenos relacionados. Normalmente, há duas maneiras possíveis de realizar RT-PCR, incluindo ensaio de uma etapa ou ensaio de duas etapas. O ensaio de uma etapa consolida a transcrição reversa e a amplificação por PCR em um único tubo, tornando o processo de detecção rápido e reproduzível; no entanto, esse ensaio fornece uma geração de amplicon alvo inferior. No caso do ensaio de duas etapas, as reações são realizadas sequencialmente em dois tubos separados, tornando-o demorado, mas um ensaio sensível em comparação com o formato de ensaio de uma etapa (Wong e Medrano, 2005).

Embora onze protocolos baseados em ácido nucléico e oito kits de detecção de anticorpos tenham sido aprovados pela National Medical Product Administration (NMPA) na China, a PCR foi considerada a técnica de diagnóstico preferida. O Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos EUA usa um formato de PCR de uma etapa para diagnosticar COVID-19 (https://www.fda.gov/media/134922/download). O ensaio é realizado isolando o RNA da amostra e adicionando ao master mix contendo primers direto e reverso, água sem nuclease, mistura de reação (transcriptase reversa, polimerase, nucleotídeos, magnésio e outros aditivos). Um termociclador de PCR é carregado com o RNA extraído e o mastermix, e a temperatura é definida para executar a reação de PCR (https://www.fda.gov/media/134922/download). A clivagem de uma sonda supressora de fluoróforo durante esta reação gera um sinal de fluorescência que é detectado pelo termociclador e o progresso da amplificação é registrado. Os controles positivos e negativos devem ser incluídos sempre que executar qualquer reação RT-PCR, o que torna a interpretação dos resultados fácil e rigorosa (Chan et & # xa0al., 2020). RT-PCR e alguns kits de diagnóstico baseados em biossensores podem detectar nucleotídeos SARS-CoV-2 em amostras fecais ou água de esgoto que podem ser um alerta de um surto de doença infecciosa em uma área específica. O SARS-CoV-2 pode sobreviver de horas a dias na água de esgoto não tratada (Orive et & # xa0al., 2020).

RT-PCR é uma ferramenta de detecção rápida e sensível em diagnóstico molecular. Ele pode detectar e amplificar até mesmo algumas cópias da sequência genômica específica em uma variedade de amostras, mas depende de certos aspectos para entregar resultados confiáveis, como coleta, transporte, armazenamento e processamento adequados de amostras (Afzal, 2020). Tem sido usado para detecção de diversos vírus como adenovírus, rotavírus, astrovírus e muitos vírus entéricos isolados de amostras fecais (Kowada et & # xa0al., 2018). Uma grande desvantagem desta técnica é a necessidade de um laboratório bem equipado e pessoal técnico para lidar com o experimento, o que não pode mitigar o aumento da demanda de testes rápidos durante situações de pandemia como COVID-19 (Bustin e Nolan, 2004). Os kits baseados em RT-PCR são muito caros e demoram muito para entregar resultados, portanto, é essencial procurar outros métodos de diagnóstico rápidos e confiáveis ​​(Hofman et & # xa0al., 2020 Sheridan 2020b).


Por Rachel West, Gigi Kwik Gronvall e Amanda Kobokovich & # 160 | 2 de fevereiro de 2021

Há alguns meses, as preocupações com o teste de diagnóstico COVID-19 eram principalmente uma questão de disponibilidade do teste e se os resultados seriam devolvidos em breve para fazer uma diferença na saúde pública.

Agora, as variantes emergentes do SARS-CoV-2 e as campanhas de vacinação do COVID-19 aumentaram a complexidade do teste do COVID-19. & # 160 Muitos se perguntam se os testes diagnosticarão com precisão a infecção com uma cepa variante do SARS-CoV-2, e se a vacinação levará a resultados imprecisos com um teste diagnóstico ou sorológico. A boa notícia é que a maioria dos testes de diagnóstico atualmente em uso permanecerão precisos com as cepas variantes, e a vacinação não deve interferir no diagnóstico ou nos testes de anticorpos. No entanto, a manutenção da precisão dos testes diagnósticos é outra razão pela qual a vigilância de novas variantes do SARS-CoV-2 é extremamente importante e por que devemos avançar com os programas de vacinação o mais rapidamente possível. Com o aumento das preocupações com os resultados dos testes e como eles se relacionam com as vacinas, é importante entender a precisão e a relevância dos testes.

Variantes SARS-CoV-2 e diagnóstico molecular: eles ainda são precisos?

Variantes do SARS-CoV-2 estão circulando amplamente em pelo menos 37 países, incluindo os Estados Unidos. Variantes particulares preocupantes, que parecem ser mais transmissíveis, incluem B.1.1.7, originalmente sequenciado no Reino Unido, e 501Y.V2, originalmente sequenciado na África do Sul. O surgimento dessas variantes levanta preocupações sobre os testes de diagnóstico molecular que podem ser usados ​​para identificar a infecção por SARS-CoV-2 se a variante tiver uma sequência genética diferente na área sondada pelo teste, ela não diagnosticará SARS-CoV-2, potencialmente levando a um resultado falso negativo. Na verdade, a identificação inicial de B.1.1.7 foi parcialmente devido a um problema de teste de diagnóstico, chamado falha no alvo do gene S. Esta falha técnica levanta a questão da capacidade dos diagnósticos moleculares usados ​​atualmente para identificar com segurança futuras infecções por SARS-CoV-2. Ambas as variantes preocupantes têm mutações na proteína spike, incluindo a posição N501Y em ambos e Δ69 / 70 em B.1.1.7. O FDA já emitiu avisos de falhas potenciais do alvo nos seguintes testes: o TaqPath COVID-19 Combo Kit da Thermo Fisher Scientific, o teste Accula SARS-CoV-2 da Mesa Biotech e o kit Linea COVID-19 Assay da Accula.

Devido à diversidade e amplitude dos testes disponíveis atualmente, a maioria dos testes de diagnóstico ainda pode ser usada de forma confiável para diagnosticar as cepas variantes. Com base nos dados disponíveis publicamente e no rastreamento dos 246 diagnósticos moleculares que têm a Autorização de Uso de Emergência do FDA (EUA), a maioria (85,4%) dos testes de diagnóstico têm alvos outro que não seja o gene spike, portanto, eles ainda devem ser eficazes para essas variantes e não produziriam um teste “falho” se a infecção for causada por uma variante com mutações no gene spike. Dos restantes 14,6% dos testes, 7,3% têm vários alvos no genoma SARS-CoV-2, além do gene spike, como os genes ORF1ab e N, portanto, eles devem continuar a produzir resultados precisos. Além disso, a maioria (90,1%) dos testes rápidos de antígeno com EUA detectam a proteína do nucleocapsídeo, em vez da proteína spike, portanto, eles não devem ser afetados. Deve-se notar que 5,7% dos testes não têm um alvo genômico claramente definido, mas podem ter isso armazenado como informação proprietária. Dos 4 testes que têm como alvo o gene S sozinho, ainda não está claro se esses testes identificariam um indivíduo infectado com uma variante de sequências de primer devem ser comparadas com as sequências de variantes pelo fabricante para rastrear a sensibilidade analítica. & # 160 Seguindo em frente, será vital observar os avisos do FDA sobre a eficácia dos testes de diagnóstico da EUA e acompanhar as falhas dos testes para investigar os impactos das variantes em potencial. Os organizadores dos centros de testes COVID-19 devem permanecer informados sobre quaisquer alterações potenciais para testar a eficácia que possam afetar suas operações ou acordos de compra.

The current diversity of molecular diagnostics targets bodes well for the ability to identify SARS-CoV-2 infections of future variants, but also underscores the importance of widespread, regular sequencing of clinical samples. CDC is increasing surveillance of SARS-CoV-2 samples to understand the spread of the current variants as well as future variants. Test target failure or negative results with clinical symptoms should be accompanied by sequencing to understand if failures are due to sequence divergence. Cataloguing the genomic targets of SARS-CoV-2 diagnostics will be important to understand testing limitations now, as well as in the future should new variants arise.  

After vaccination, will the accuracy of diagnostic and serology tests change?

Vaccination against SARS-CoV-2 will not result in a positive diagnostic test. The Moderna and Pfizer/BioNTech vaccines consist of non-replicating mRNA, so the maximum level of SARS-CoV-2 specific mRNA a vaccine recipient will have is the small amount present in the vaccine. In a SARS-CoV-2 infection, the virus replicates so that mRNA levels increase to much higher levels and persist for weeks. In addition, both EUA vaccines contain mRNA specific to the spike gene of the SARS-CoV-2 virus. The majority of diagnostics target multiple genes other than spike, if they target spike protein at all. Therefore, vaccination with an mRNA vaccine will not result in a positive diagnostic test.

People who have been vaccinated may be interested in getting a serology test, to see if the vaccine “worked,” but a vaccinated person is very likely to get a negative result from a serology test, even if the vaccine was successful and protective. Serology tests are typically used to determine whether a person has been exposed to SARS-CoV-2 in the past and developed antibodies against the virus. Different serology tests detect antibodies to different parts of the virus, but after vaccination with Pfizer and Moderna vaccines, the antibodies formed will only be to one part of the virus: the spike protein. Some serology tests do not detect antibodies specific to spike protein at all, while others are specific for antibodies that target regions within the spike protein (like the receptor binding domain, or RBD). For example, the Roche Elecsys Anti-SARS-CoV-2 S assay detects antibodies to spike RBD, while the the Platelia SARS-CoV-2 Total Ab assay from Bio-Rad detects antibodies to the nucleocapsid protein. Commercially available serology tests should not be used to seek a positive antibody result after vaccination given the differences in vaccine targets, and current EUAs do not authorize individual serology testing for measuring vaccine efficacy. Therefore, a negative serology test after vaccination does not necessarily mean the vaccine failed and reinforces that serology tests should not be used for this purpose. To understand if vaccination stimulated an antibody response, a test specifically designed for the antibodies of interest would need to be used.

While the diagnostic testing news is good for now-- infections by current SARS-CoV-2 variants are likely to be detected by  tests on the market-- it is important to increase surveillance and monitor the emergence of future variants, which may be more problematic. Thankfully, the Biden administration’s plan includes expansion of testing and increased genomic surveillance--two goals that can work hand in hand to monitor SARS-CoV-2 spread and inform public health interventions. It will be vital to implement surveillance and test performance monitoring quickly, so that emerging variants that may impact therapeutics and vaccines are detected and addressed in real time.

Rachel West, PhD, is a post-doctoral associate with the Center for Health Security and the Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health Department of Molecular Microbiology and Immunology.

Gigi Kwik Gronvall, PhD is a senior scholar and associate professor with the Center for Health Security and the Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health Department of Environmental Health and Engineering.

Amanda Kobokovich, MPH is a senior analyst and research associate with the  Center for Health Security and the Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health Department of Environmental Health and Engineering.


The Science of SARS-CoV-2 Testing: What Tests Are Available and What This May Mean for You

COVID-19 testing equips individuals with the information they need to protect themselves and others, and arms public health professionals with data that can inform response efforts.

Recently, leadership across NIH articulated why widespread testing is necessary, important, and achievable. Equally important is understanding the different types of testing available. As a leader and pioneer in the development of clinical data standards, NLM supports the electronic exchange of clinical health information data, including those related to COVID-19 testing, for approved purposes and with appropriate privacy protections.

Three types of testing are available to identify COVID-19 (the disease caused by the SARS-CoV-2 virus).

1) Nucleic acid amplification tests (NAAT), also called molecular tests, detect the virus’s genetic material

2) Antigen tests detect parts of specific proteins produced by the virus and

3) Antibody tests detect COVID-19 antibodies in the blood (serum) that infected people develop to fight off the virus.

NAAT tests are dependent upon a method used to multiply the relatively few copies of viral nucleic acid that might be present in a specimen into a very large number of copies — making it much easier detect the virus. At present, most NAAT tests use an amplification method called polymerase chain reaction (PCR).

PCR uses small segments of DNA, called primers, to pick out the DNA that it needs to multiply. The PCR instruments process the sample in repeated cycles of heating and cooling. During each cycle, the number of copies of the targeted nucleic acid doubles. From a few original copies, it can generate up to a billion new copies to make the virus easier to Vejo in the final detection step.

The FDA recently authorized a different NAAT test method called loop-mediated isothermal amplification (LAMP). This test method warms the sample to a constant temperature and uses six different primers to drive the replication of different segments of the novel coronavirus’s genome. It does not require multiple cycles of heating and cooling. By many accounts, this method is faster and easier to use than real-time PCR. Other methods of COVID-19 detection are under development.

Different SARS-CoV-2 NAAT testing products target different parts of the virus, use different primers to start the PCR reaction, apply to different specimens, and differ in the ability to detect the virus.

The primary methods for collecting a sample are through nasal, throat, and saliva (spit). Nasopharyngeal (NP) samples are believed to be the most sensitive for detecting the virus, but pushing the swab through the nostril into the nasopharynx at the base of the skull can be uncomfortable. The collection of other samples from nasal swabs and saliva can be easier on the person being tested and are becoming increasingly accessible.

The spread of SARS-CoV-2 is particularly challenging to manage because people can be contagious and spread the infection to others, even before they begin to show symptoms. NAAT tests can sometimes detect the virus in early stages before symptoms appear, but not always, and do not necessarily turn positive immediately with the onset of symptoms.

One strategy with NAAT tests involves the use of pooled samples. Pooled sampling involves mixing several samples together in a batch, or pooled sample, then analyzing the pooled sample with a diagnostic test. If the test on the pooled specimen is negative, then all the individuals who contributed to the pool are considered negative for COVID-19. If the pooled sample is positive, the lab must run separate tests on each of the samples to determine who is positive and who is negative. When the prevalence of COVID-19 in a population is low (in the 1-2% range), the total number of tests needed is reduced, and an organization’s testing capacity increases.

Antigen tests for COVID-19 detect the presence of a protein that is part of the SARS-CoV-2 virus. Today, the NP and mid-nasal samples are the primary sampling methods used for antigen testing, but the development of antigen tests for saliva are underway.

Antigen tests are relatively inexpensive and provide results almost immediately. These tests perform best in the early days after an infection begins. While they are not as sensitive as NAAT tests, some have suggested that repeated testing with a fast, although less sensitive test, may do more to help end the epidemic more quickly than perfect tests done infrequently.

Antibody SARS-CoV-2 tests detect the antibodies, or the “virus fighting proteins”, that a person’s immune system produces to fight infection. Antibody testing is generally done on the serum component of a blood sample. Antibodies may appear just a week or so after symptoms of SARS-CoV-2 infection appear. Antibody tests are not used to diagnose an active COVID-19 infection however, they are useful for detecting whether someone has had a past infection.

Two different kinds of antibodies can be measured: IgM (immunoglobulin M) and IgG (immunoglobulin G). IgM antibodies appear early after infection (usually after the first week or so). Somewhat later, IgG antibodies, a more durable antibody, is produced. Today, there is no clear advantage of IGM or IgG antibody testing and not everyone will develop antibodies after a known COVID-19 infection. Importantly, scientists do not know how well or for how long antibody levels might protect someone against a future infection.

All three types of tests can be evaluated locally with a point-of-care (POC) machine or sent to laboratory for processing (in-lab testing). POC tests are carried out in close proximity to a patient and typically take 5-15 minutes, but only one or a handful of samples can be processed at a time. Not all POC machines have the capability to communicate electronically to public health and other reporting systems. In-lab testing machines can process hundreds of samples at time and, with the right safeguards, can deliver results electronically to patients, providers and public health reporting systems. However, in-lab testing has built-in delays due to its batch testing nature and the time it can take to deliver samples to laboratories.

There are many opportunities for innovation in testing methods to improve upon the efficiency, specificity, and scalability of currently available tests. Having a good set of well performing tests for SARS-CoV-2 is very important, but we also need to be able to deliver the results of such tests accurately and quickly (electronically) to the responsible care providers and to public health authorities.

To facilitate electronic delivery of such content, NLM has long supported the development of formal health care terminologies including LOINC (Logical Observation Identifiers Names and Codes), RxNorm, along with SNOMED CT, and more recently, communication structures such as HL7 FHIR (R) . These capabilities are especially important during this time of COVID-19. In the last six months, the FDA has authorized more than 80 SARS-CoV-2 test products for emergency use, the CDC has defined a COVID-19 Case Report Form, and the Centers for Medicare & Medicaid Services has specified content that should accompany every SARS-CoV-2 test. NLM-supported LOINC codes have been defined for all of this content, as well as SNOMED CT codes for coded test values. The FDA, CDC, and industry have produced a compendium of the all SARS-CoV-2 tests and their standard codes. The use of standardized test codes for test results is essential to smooth delivery of test results into electronic health records and for the aggregation of test results for research and public health purposes.

Testing for COVID-19 is important, safe, and easy. Getting tested early and often and following best practices, such as wearing a mask, washing hands often, and limiting social contact will help get us back to normal.

Did you learn something new about testing methods? How else can NLM help support testing activities?

Clem McDonald, MD, is the Chief Health Data Standards Officer at NLM. In this role, he coordinates standards efforts across NLM and NIH, including the FHIR interoperability standard and vocabularies specific to clinical care (LOINC, SNOMED CT, and RxNorm). Dr. McDonald developed one of the nation’s first electronic medical record systems and the first community-wide clinical data repository, the Indiana Network for Patient Care. Dr. McDonald previously served 12 years as Director of the Lister Hill National Center for Biomedical Communications and as scientific director of its intramural research program.


Monitoring of emergent strains

The mutations that accumulate in the SARS-CoV-2 genome can alter the viral phenotype and confer a selective advantage that gives rise to new strains. Genomic epidemiology showed that one strain, distinguished by a non-synonymous D614G mutation in the spike protein, first emerged in Europe before expanding to become the predominant strain worldwide 79 owing to a selective fitness advantage conferred by the mutation that increased viral transmissibility 80 .

The integration of genome sequencing within population-scale testing can enable monitoring of the viral strains circulating within a population. Numerous countries have mandated that a proportion of positive samples is subjected to whole-genome sequencing, thereby providing ongoing surveillance of emerging and circulating variants. This sequencing information can identify emergent SARS-CoV-2 variants with differing transmission or pathogenicity, with resistance to antiviral treatment or that are at risk of vaccine escape 81 . In late December 2020, a new SARS-CoV-2 strain known as B.1.1.7 rapidly increased in prevalence throughout the UK, apparently outcompeting existing variants and prompting the rapid imposition of restrictions on travel to other countries 82 . Additional variants that might increase transmissibility and pathogenicity or reduce the efficacy of vaccines have similarly arisen in South Africa (B.1.351) 83 and Brazil (P.1) 84 . As the effect of these variants on the viral phenotype has become apparent, authorities have recognized that global testing will be increasingly needed to monitor the emergence and circulation of new variant SARS-CoV-2 strains.

Variant diversification identified by genomic surveillance is also important to assess the influence of new mutations on the ongoing performance of molecular diagnostic tests 85,86 . The emergent B.1.1.7 strain harbours a large number of mutations that might prevent the binding of some primers to the spike gene and thereby reduce the sensitivity of RT–qPCR tests 87 (Box 1). In response, numerous variant-specific primers have been developed, illustrating that strain diversification will require ongoing updates and validation of testing reagents.


TESTING COSTS AND PRIORITIZATION

A new law mandates that Medicare, Medicaid, other government health care and insurance plans, and most private plans cover COVID-19 testing in the United States without copays or deductibles. On 5 March 2020, the Centers for Medicare and Medicaid Services (CMS) announced new Healthcare Common Procedure Coding System (HCPCS) codes for health care providers and laboratories to test patients for SARS-CoV-2. Starting in April, laboratories performing the test could bill Medicare and other health insurers for services, using a newly created HCPCS code (U0001). This code applies to all tests that were developed by the CDC. Laboratories performing non-CDC laboratory tests for SARS-CoV-2 can bill for them using a different HCPCS code (U0002). Current test prices are $35.91 for U0001 and $51.31 for U0002. The overall costs should take into context how a diagnostic test is used in practice. For example, if a test is restricted to very sick patients, the cost is small compared to the overall medical care. Conversely, if a test is used for broad screening, the cost per positive result could be high depending on prevalence.

There are different indications for diagnostic testing for individuals with a proven or suspected case of COVID-19. Given the limited testing capacity in the United States, priority lists have been established. Priority 1 includes hospitalized patients and symptomatic health care workers. Priority 2 includes symptomatic patients in health care facilities, >65-year-old patients with underlying conditions, and first responders. Priority 3 includes symptomatic patients, including critical infrastructure workers. Individuals without symptoms are currently not prioritized for any testing (28) Specific use cases for different tests have also been laid out (29), but they are likely to change as more testing capabilities become available and societal needs change, such as identification of infectious individuals versus seropositive individuals returning to work.

When carried out broadly and repeatedly, NAT results have consequences for individuals, communities, and the entire population. These tests not only permit the identification, isolation, and treatment of infected individuals but also diagnose presymptomatic and asymptomatic carriers and thus more accurately define the infection rates across populations. Serological testing should be used in parallel with NATs to determine which individuals have acquired immunity and how long it lasts. Serosurveys may also help efforts to develop vaccines. By extension, serological testing that is performed frequently and on a wide scale should help determine what fraction of the population may be immune to COVID-19 and which individuals may rejoin the workforce. The lack of longitudinal testing is problematic because it inhibits our ability to understand the evolution of the disease.

Containing COVID-19 will likely require combinations and concomitant use of the different types of diagnostic tests discussed above. Excitingly, more sensitive and specific kits have become available from major vendors. To be successful, these assays will need to be deployed in such a way that broad and repeated testing becomes routine. Last, there is a need to develop test kits that simplify lengthy purification steps and yield results in much shorter time frames than is currently available. A variety of new approaches are currently being tested experimentally to achieve such results.


Assista o vídeo: Zrobiłem TEST NA COVID-19 z BIEDRONKI (Novembro 2021).