Em formação

A família TGF beta pode induzir todas as células-tronco somáticas?


Eu acho que isso não é possível. Conclusão sobre este artigo de visualização TGF - sinalização da família $ beta $ em células-tronco:

Enquanto a sinalização da família TGF-$ beta $ regula a condição de tronco de células-tronco normais e cancerosas, seus efeitos são diversos e dependem dos tipos de células e do estado fisiológico das células.

O TGF - $ beta $ pode induzir todas as células-tronco somáticas?


A sinalização na via do TGFβ normalmente freia o progresso das células ao longo do ciclo celular - ela neutraliza a ação do myc, por exemplo, parcialmente regulando a expressão do myc. No linfoma de Burkitt, o myc escapa dessa regulação por causa de uma translocação cromossômica, derrubando o equilíbrio regulatório para o crescimento celular descontrolado.

Essa ação antiproliferativa da sinalização de TGFβ é tão crítica que você pode esperar que seja onipresente nas células, e a entrada do atlas de expressão para o receptor de TGFβ é consistente com isso.


Fator transformador de crescimento beta

Fator transformador de crescimento beta (TGF-β) é uma citocina multifuncional pertencente à superfamília do fator de crescimento transformador que inclui três [1] diferentes isoformas de mamíferos (TGF-β 1 a 3, símbolos HGNC TGFB1, TGFB2, TGFB3) e muitas outras proteínas de sinalização. As proteínas TGFB são produzidas por todas as linhagens de glóbulos brancos.

O TGF-β ativado se confunde com outros fatores para formar um complexo serina / treonina quinase que se liga aos receptores de TGF-β. Os receptores de TGF-β são compostos de subunidades de receptor de tipo 1 e tipo 2. Após a ligação do TGF-β, o receptor quinase tipo 2 fosforila e ativa o receptor quinase tipo 1 que ativa uma cascata de sinalização. [2] Isso leva à ativação de diferentes substratos e proteínas regulatórias, induzindo a transcrição de diferentes genes-alvo que atuam na diferenciação, quimiotaxia, proliferação e ativação de muitas células do sistema imunológico. [2] [3]

O TGF-β é secretado por muitos tipos de células, incluindo macrófagos, em uma forma latente na qual é complexado com dois outros polipeptídeos, a proteína de ligação a TGF-beta latente (LTBP) e o peptídeo associado à latência (LAP). As proteinases séricas, como a plasmina, catalisam a liberação de TGF-β ativo do complexo. Isso geralmente ocorre na superfície dos macrófagos, onde o complexo TGF-β latente está ligado ao CD36 por meio de seu ligante, a trombospondina-1 (TSP-1). Estímulos inflamatórios que ativam macrófagos aumentam a liberação de TGF-β ativo, promovendo a ativação da plasmina. Os macrófagos também podem endocitar os complexos TGF-β latentes ligados a IgG que são secretados pelas células plasmáticas e, então, liberar o TGF-β ativo no fluido extracelular. [4] Entre suas principais funções está a regulação dos processos inflamatórios, particularmente no intestino. [5] O TGF-β também desempenha um papel crucial na diferenciação de células-tronco, bem como na regulação e diferenciação de células T. [6] [7]

Devido ao seu papel na regulação e diferenciação imune e de células-tronco, é uma citocina altamente pesquisada nas áreas de câncer, doenças autoimunes e doenças infecciosas.

A superfamília TGF-β inclui proteínas inibidoras do crescimento endógeno, um aumento na expressão de TGF-β frequentemente se correlaciona com a malignidade de muitos cânceres e um defeito na resposta de inibição do crescimento celular ao TGF-β. Suas funções imunossupressoras passam então a dominar, contribuindo para a oncogênese. [8] A desregulação de suas funções imunossupressoras também está implicada na patogênese de doenças autoimunes, embora seu efeito seja mediado pelo ambiente de outras citocinas presentes. [5]


Células da granulosa como alvos hormonais: o papel do hormônio folículo-estimulador biologicamente ativo na reprodução

4 TGFβ e as proteínas relacionadas com a inibina

TGF- β é um 25.000 Mr molécula homodimérica que, na redução, produz duas cadeias polipeptídicas idênticas contendo 112 aminoácidos (Massague, 1985). Apenas o dímero é biologicamente ativo. TGF β compartilha homologia de sequência com o β cadeia de inibina e a substância inibidora do ducto de Muller, acredita-se que essas moléculas sejam produtos da mesma família de genes (Sporn et al, 1986). Outros peptídeos, como um inibidor de crescimento isolado de células de rim de macaco e uma substância indutora de cartilagem isolada de osso bovino, também mostraram ter homologia de sequência com TGF β. O TGF β receptor foi encontrado em muitas células e é uma grande molécula composta de duas subunidades. Ao contrário dos receptores para a maioria dos outros fatores de crescimento, o TGF β receptor parece não ter atividade de tirosina quinase.

A secreção de FSH por células hipofisárias cultivadas é regulada diferencialmente por inibina, ativina e TGF β. A potencial regulação da atividade da aromatase em células da granulosa por esses peptídeos também foi investigada. A secreção basal de estrogênio pelas células da granulosa não é afetada pelo tratamento com TGF β ou inibina sozinha, enquanto o acúmulo de estrogênio e progesterona estimulado por FSH é aumentado de forma dependente da dose pelo TGF β (Adashi e Resnick, 1986 Dahl et al, 1987) e suprimida pela inibina (Ying et al, 1986). Em contraste, a inibina aumenta, mas a ativina suprime, a produção de andrógenos por células teco-intersticiais ovarianas cultivadas e explantes das paredes do folículo (Hsueh et al, 1987). Além disso, a indução de FSH de receptores de LH em células da granulosa também é aumentada por TGF β (Dodson e Schomberg, 1987).

Células da teca em cultura produzem TGF β, conforme determinado por ensaio de radioreceptor e RIAs (Skinner et al, 1987a), e o TGF β gene é expresso no ovário do roedor (Hernandez et al, 1987). Estes dados sugerem que TGF β é um regulador parácrino da produção de esteróides nas células da granulosa.

É evidente que vários fatores de crescimento desempenham papéis importantes na modulação da indução da aromatase das células da granulosa por FSH. Essas ações parácrinas e autócrinas estão resumidas na Fig. 4. EGF (ou TGF α) e TGF β são presumivelmente de origem teca e exercem regulação díspar da atividade da aromatase das células da granulosa por meio de mecanismos parácrinos. Em contraste, o IGF-I pode ser produzido por células da granulosa e pode aumentar a atividade da aromatase por meio de mecanismos autócrinos. Além disso, o FGF (um dos fatores angiogênicos) inibe a atividade da aromatase da célula da granulosa, enquanto a inibina de origem da célula da granulosa aumenta a biossíntese de andrógenos das células da teca por meio de mecanismos parácrinos.

FIGO. 4 Funções regulatórias parácrinas e autócrinas de vários fatores de crescimento no ovário. O IGF-I produzido pelas células da granulosa pode exercer a regulação autócrina da diferenciação das células da granulosa, enquanto o TGF α (ou EGF) e TGF β de origem nas células da teca exercem efeitos inibitórios e estimuladores sobre a atividade da aromatase das células da granulosa, respectivamente. O FGF, um fator angiogênico de origem nas células luteais, inibe a atividade da aromatase das células da granulosa. Em contraste, a inibina de origem nas células da granulosa aumenta a biossíntese de andrógenos nas células da teca.

Estudos sobre o papel de vários fatores de crescimento também fornecem a base para a formulação de condições de mídia para aumentar a capacidade de resposta das células da granulosa em cultura ao FSH. Nas seções a seguir, o desenvolvimento histórico da medição da bioatividade do FSH usando vários bioensaios e a justificativa para o desenvolvimento de um em vitro bioensaios de aromatase em células da granulosa para FSH são discutidos.


Células-tronco adultas / somáticas

As células-tronco adultas são células indiferenciadas que residem entre células diferenciadas em um tecido ou órgão. Eles têm a capacidade de se renovar e se diferenciar em tipos de células especializadas. Ao contrário das células-tronco embrionárias que podem se tornar todos os tipos de células, as células-tronco adultas são limitadas a se diferenciar em tipos distintos de células de seu tecido de origem e, portanto, são células-tronco multipotentes ou unipotentes. As funções principais das células-tronco adultas são manter e reparar o tecido em que residem. As células-tronco adultas são raras e geralmente em número pequeno, mas podem ser encontradas em vários tecidos do organismo adulto.

As mais estudadas são as populações de células-tronco presentes na medula óssea (hematopoiéticas e MSCs), intestino e pele, mas existem populações distintas que residem em muitos outros órgãos, como sistema nervoso central, fígado, glândula mamária ou tecidos dentários. As diversas populações de células-tronco adultas exibem marcadores distintos e são afetadas por várias vias de sinalização (Wnt, Notch, Shh, etc.) As células-tronco em tecidos individuais são influenciadas não apenas por sua própria atividade de sinalização, mas também reagem ao ambiente específico criado por células vizinhas, chamado de nicho.

Tipos de células-tronco adultas / somáticas

    Células-tronco hematopoéticas

As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são células raras de origem mesodérmica que residem na medula óssea de mamíferos adultos que se situam no topo de uma hierarquia de progenitores que se tornam progressivamente restritos a várias linhagens ou linhagens únicas. HSCs verdadeiros permanecem principalmente no estado quiescente no tecido adulto e dão origem a HSCs de curto prazo que têm capacidade de auto-renovação limitada (6-8 semanas). Quando o HSC de curto prazo deixa o estado de auto-renovação indiferenciado, ele pode se tornar um progenitor mieloide comum (CMP) ou um progenitor linfoide comum (CLP). A linhagem mieloide também dá origem a eritrócitos, monócitos e macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, megacariócitos / plaquetas e células den-dríticas. Os osteoclastos também surgem de células hemopoiéticas da linhagem de monócitos / neutrófilos. A linhagem linfóide produz linfócitos T e B e células Natural Killer.

Figura 1. Diagrama simplificado de diferenciação de células-tronco hematopoéticas

A maioria das células-tronco mesenquimais (MSCs) reside no estroma da medula óssea. As CTMs da medula óssea possuem a capacidade natural de se diferenciar em tecidos mesodérmicos, como linhagens de músculos, tendões, adipócitos, osteócitos e condrócitos. As CTMs foram encontradas no tecido adiposo, estroma intestinal, estroma do limbo ocular, traqueia e polpa dentária. Nestes tecidos, as CTMs estão localizadas principalmente em nichos localizados na área do pericito dos capilares. Outra importante fonte médica de MSCs são os tecidos neonatais, como placenta, sangue do cordão umbilical e geleia de Wharton. As CTMs são incorporadas nos processos regenerativos dos tecidos adultos, por exemplo, no coração após o infarto. As CTMs podem se diferenciar diretamente em células específicas de tecidos danificados e também servir como reguladores parácrinos dos processos de cura.

As células-tronco intestinais (ISCs) são células-tronco multipotentes que podem gerar todos os tipos de células diferenciadas do intestino delgado e do cólon (incluindo os enterócitos predominantes (as células absortivas), as células caliciformes secretoras de muco, o hormônio peptídico secretor enteroendócrino células e as células de Paneth.).

As células-tronco neurais ou células progenitoras neurais estão localizadas em duas regiões distintas do cérebro. Uma população está localizada na zona ventricular-subventricular nos ventrículos laterais. O modelo do rato sugeriu que esta população é principalmente responsável pela renovação dos neurônios no bulbo olfatório. A segunda população está situada na interface do hilo e giro denteado do hipocampo.

A pele é dividida em derme e epiderme. A epiderme possui células-tronco responsáveis ​​pelo reparo e manutenção da barreira epitelial, que gira a cada 2-4 semanas. A derme consiste em tecido conjuntivo e é a localização das folhas de cabelo, glândulas sudoríparas e vasos sanguíneos.

Células-tronco epidérmicas

A epiderme começa na camada mais basal da derme, denominada estrato basal. Essa camada contém células-tronco epidérmicas que dão origem ao resto da epiderme, que se diferenciam à medida que se movem para cima, afastando-se da derme. A renovação contínua da epiderme é mediada por unidades proliferativas epidérmicas, que consistem em uma célula-tronco no estrato basal e várias células amplificadoras de trânsito.

Células-tronco do folículo capilar

O folículo capilar produz a haste do cabelo durante a fase de crescimento, denominado anágeno, seguido por um período de apoptose denominado catágeno, e permanece quiescente durante a fase de repouso, denominado telógeno. Esses processos são realizados por várias células-tronco do folículo capilar (HFSC).

Células-tronco da glândula sebácea

As células da proteína 1 de maturação induzida por linfócitos B (Blimp1) + são células-tronco unipotentes que dão origem à glândula sebácea.

Papila dérmica

A papila dérmica é uma população de células mesenquimais que residem logo abaixo do folículo piloso. Vários estudos sugeriram que durante o crescimento do cabelo, as células-tronco do folículo piloso estão em estreita proximidade com a papila dérmica e moléculas de sinalização incluindo Wnts, BMPs, noggin e FGFs da papila dérmica ativam os HFSCs para começar a proliferar.

6. Outras populações de células-tronco adultas

O fígado tem uma notável capacidade regenerativa. Após lesão hepática aguda, a massa de tecido é restaurada pela divisão mitótica dos hepatócitos maduros. No entanto, durante lesão maciça ou crônica, a proliferação de hepatócitos fica comprometida e os progenitores hepáticos facultativos são ativados. Essas células são bipotentes e podem originar hepatócitos e epitélios biliares.

A glândula mamária é composta de células epiteliais e células mesenquimais, incluindo fibroblastos, adipócitos, células dos vasos sanguíneos e células do sistema imunológico. As células da glândula mamária têm a capacidade de se expandir clonalmente durante a morfogênese e a vida adulta, bem como de sofrer expansão maciça durante vários ciclos da gravidez.

O tecido dentário humano não possui capacidade de auto-renovação, entretanto, existem várias espécies cujos dentes podem crescer continuamente ou são constantemente substituídos durante a vida adulta. Em mamíferos, vários exemplos podem ser encontrados dentro da ordem dos roedores, por exemplo, em camundongos, os incisivos adultos contêm um nicho de células-tronco e, portanto, podem crescer indefinidamente, e em outros, como ratos, as células-tronco residem não apenas no incisivo, mas também nos molares. As células-tronco dentárias de roedores são amplamente estudadas porque representam uma entrada potencial na medicina regenerativa dental.

Tipos especiais de células-tronco residem no organismo adulto, mas não cobrem todos os atributos clássicos das células-tronco adultas, incluindo as células-tronco germinativas encontradas no epitélio ovariano e nos testículos. As células germinativas masculinas são uma população de células progenitoras (conhecidas como células progenitoras espermatogoniais ou SPCs) que são necessárias para a produção ao longo da vida de células germinativas diferenciadoras e espermatozóides. Essas células germinativas podem ser convertidas em células-tronco pluripotentes, conhecidas como células-tronco plu-ripotentes derivadas da linha germinativa (gPS) ou células-tronco adultas multipotentes (maGSCs). As propriedades dos maGSCs são semelhantes às dos ESCs. Eles são capazes de se diferenciar espontaneamente em células formando todas as três camadas germinativas e células germinativas, contribuindo para o desenvolvimento de vários órgãos quando injetados em um blastocisto inicial.

Importância clínica de células-tronco adultas

Doenças do Sangue

As células-tronco adultas têm sido usadas na clínica por décadas no tratamento de doenças do sangue. O transplante de células-tronco hematopoéticas é uma terapia estabelecida, incluindo transplantes de medula óssea, sangue periférico e sangue do cordão umbilical. As células-tronco são obtidas tipicamente da parte ilíaca do osso pélvico com uma seringa. Essa abordagem agora está sendo substituída pelo uso de sangue periférico como fonte. Apenas um pequeno número de células-tronco e progenitoras circulam na corrente sanguínea normalmente, mas um número maior pode ser obtido ao se injetar no doador um fator de crescimento hematopoiético, como fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), que resulta em muito menos procedimento invasivo para o doador. O sangue do cordão é outra fonte alternativa de HSCs que pode ser obtida do cordão umbilical e da placenta após o nascimento.

Doenças Neurológicas

Outro tipo de célula-tronco adulta auspicioso para uso clínico é a célula-tronco neural. Estudos em animais revelaram o potencial das células-tronco neurais de agirem de forma protetora no tratamento da esclerose lateral amiotrófica (ALS, também conhecida como doença de Lou Gehrig), e esta aplicação está sendo testada clinicamente. As células-tronco neurais também são promissoras para lesões graves da medula espinhal, pois são capazes de apoiar a regeneração funcional da medula espinhal. O transplante de células-tronco neurais também está sendo considerado para uso clínico futuro como uma estratégia regenerativa após acidente vascular cerebral para substituir neurônios perdidos. A combinação de células-tronco neurais com células-tronco hematopoéticas pode melhorar o resultado funcional após lesões cerebrais isquêmicas.

DM1, ataque cardíaco, doença pulmonar e doença oral

MSCs podem proteger ilhotas humanas, o que poderia ser uma terapia para diabetes mellitus tipo 1 (DM1). Possíveis aplicações para MSCs também incluem tratamentos para ataque cardíaco, bem como doenças pulmonares. Como as CTMs foram identificadas em diversos tecidos bucais e maxilofaciais, as CTMs representam uma fonte promissora no campo da odontologia. Essas descobertas apóiam a possibilidade de usar MSCs em tecnologias inovadoras para estratégias de engenharia de tecidos para regenerar ou substituir tecidos orais danificados, doentes ou ausentes.

Pesquisa prospectiva de células-tronco adultas

As células-tronco adultas (ASCs) são encontradas em muitos dos principais órgãos adultos e são essenciais para a homeostase do tecido, bem como para a regeneração em resposta a lesões. ASCs parecem ser regulados por mecanismos intrínsecos e extrínsecos. ASCs são intrinsecamente distintos de sua progênie com base nos modos de regulação epigenética, transcricional e potencialmente metabólica. A desregulação desses fatores intrínsecos, como a introdução de mutações oncogênicas, pode resultar na iniciação do câncer. Além disso, o ambiente extrínseco em que os ASCs residem também regula sua identidade e atividade. Os ASCs vivem em nichos especializados, que interagem com os ASCs por meio do envio e recebimento de sinais, como sinalização do fator de crescimento, associação da matriz extracelular e regulação mecânica. Muitas dessas vias importantes para o ASC para a interferência de nicho são vias também reguladas de forma aberrante no câncer humano.

Resistência a droga

Alguns pesquisadores descobriram que o microambiente tumoral desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da resistência aos medicamentos. E eles demonstraram que as células do estroma no microambiente são importantes para modular uma resposta à quimioterapia e muitas vezes são um indicador de mau prognóstico de alguns tipos de tumores. Algumas vias de sinalização das células-tronco adultas estão relacionadas com a resistência aos medicamentos e a eficácia da quimioterapia.


Propriedades-chave de CSCs

As CSCs compartilham os mesmos mecanismos celulares e moleculares que regulam as SSCs, no entanto, as CSCs carecem do sistema de controle necessário para prevenir a proliferação descontrolada [43]. Embora a origem específica das CSCs ainda esteja em debate, as evidências sugerem que elas se originam de células-tronco que não conseguiram controlar a proliferação em circunstâncias anormais [44, 45]. Outras origens propostas sugerem que as CSCs podem surgir da fusão célula-célula entre células cancerosas e células-tronco adultas, transferência de genes entre células somáticas e cancerosas ou mutações em células-tronco [46]. Além disso, a transformação pode ocorrer durante o processo de regeneração do tecido em resposta à inflamação, infecção, exposição a toxinas e / ou processos metabólicos que podem causar mutações [47].

As CSCs foram identificadas em vários tumores sólidos com base na expressão de certos marcadores de superfície CSC. Até agora, as CSCs foram identificadas por marcadores de superfície que são comuns entre os diferentes tipos de câncer: CD24, CD29, CD44 CD90, CD133, aldeído desidrogenase 1 (ALDH1) e antígeno específico do epitélio (ESA) [48,49,50]. Dependendo do tipo de tecido do qual se originam, eles podem expressar uma variedade de marcadores para cada tipo de CSCs. Mais importante ainda, a expressão desses marcadores pode ser usada para direcionamento terapêutico específico de CSCs [51] (discutido posteriormente em seções posteriores).

Evidências de um experimento de xenotransplante de tumores cerebrais humanos em cérebros de camundongos com imunodeficiência combinada severa diabética não obeso (NOD / SCID) demonstraram a presença de CSCs na fração tumoral responsável pela regeneração tumoral [52]. Outros estudos também relatam que certos tipos de câncer, como o carcinoma hepatocelular (HCC), podem ser derivados de SSCs [53]. HSCs se originam de progenitores que se auto-renovam na medula óssea, onde residem principalmente, no entanto, também podem ser encontrados no sangue periférico. Evidências clínicas e genéticas sugerem que certos tipos de leucemia são causados ​​por mutação genética em HSCs. Essas mutações dão origem às células-tronco da leucemia, também chamadas de CSCs do sangue [54, 55]. Além disso, em um modelo murino NOD / SCID de leucemia, diferenças fenotípicas entre células-tronco de leucemia e HSCs foram mostradas em estudos separados [56, 57]. Esforços recentes descobriram marcadores de superfície que são exclusivos para células-tronco AML, como CD123, TIM3, CD47, CD96, CLL-1 e proteína acessória do receptor de IL-1. Por outro lado, as células-tronco AML raramente expressam CD90 e CD117 em sua superfície [58] e vários estudos relataram que CD123 foi predominantemente expresso em um subconjunto de células-tronco AML caracterizadas pelo fenótipo CD34 + / CD38− [56]. Essas diferenças básicas no fenótipo das CSCs podem ser essenciais para fornecer novos caminhos para o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas ao câncer.

As CSCs são comumente confundidas com células iniciadoras de câncer por causa de suas propriedades semelhantes às células-tronco, onde ambas são caracterizadas pela expressão elevada do marcador de superfície da célula-tronco CD133 [59]. Quando as células que iniciam o câncer recebem a primeira mutação causadora do câncer, supõe-se que sejam diferentes das SSCs, no entanto, elas mostram várias semelhanças, como baixas taxas de proliferação, alta auto-renovação e resistência à quimioterapia e radiação [60]. Atualmente, não está claro se as CSCs se originam de células que iniciam o câncer ou se ambos os tipos de células têm a mesma origem. No entanto, ambas as células suportam a iniciação e propagação do tumor.

Meio ambiental e inflamação crônica suportam CSCs

O microambiente celular é fundamental para o crescimento celular, destino e interação com outras células em resposta a um estímulo específico. Estudos recentes confirmaram que o microambiente pode suportar a geração e o crescimento de tumores sólidos [61], e é possível que alterações nos sinais parácrinos de células de nicho possam iniciar ou aumentar a formação de tumor a partir de SSCs. Esses sinais funcionam como um estímulo para induzir ativação, diferenciação, proliferação e / ou morte celular [62]. Além disso, esses estímulos ambientais fazem parte de uma estrutura maior chamada “nicho de células-tronco”. Este nicho se refere a um microambiente específico dentro de uma localização anatômica discreta onde SSCs são encontrados em um estado indiferenciado e auto-renovável [63]. Esses nichos foram observados em diferentes tecidos epiteliais de mamíferos, no trato gastrointestinal e no sistema neural e hematopoiético, onde regulam o destino das células-tronco, direcionando a interação célula-célula e fatores de secreção [64]. Fatores solúveis secretados de tumores primários podem estimular o recrutamento de células para o nicho. Fatores de crescimento como VEGF, TGF-β e TNF-α foram identificados como os principais fatores secretados por tumores primários que promovem a angiogênese [65, 66].

Fatores solúveis liberados no microambiente influenciam fortemente o crescimento de um tumor primário, onde seu crescimento é intensificado por mudanças no ambiente de nicho [64]. Os CSCs residem nesses nichos que são responsáveis ​​por manter a capacidade de auto-renovação e o estado indiferenciado dos CSCs [67]. Esses nichos mantêm as propriedades principais das CSCs preservando sua plasticidade fenotípica, protegendo as células contra o sistema imunológico e baixa disponibilidade de nutrientes, resistindo ao estresse oxidativo, desintoxicando drogas por meio de transportadores de cassetes de ligação de ATP e promovendo metástases [68]. Esses nichos também favorecem o recrutamento de mais células para induzir a inflamação por fatores secretores (citocinas e quimiocinas). Os fatores secretados facilitam a formação de tumores secundários e terciários [69], onde as CSCs se disseminam através do estroma para a corrente sanguínea e induzem metástases [70].

Outro fator ambiental importante que impulsiona a progressão do tumor é a inflamação crônica. Esta condição é considerada um dos principais fatores na expansão das CSCs e na disseminação do tumor [71]. Essa resposta inflamatória pode ser iniciada pela ativação de receptores toll-like (TLRs), estimulados por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) de micróbios carcinogênicos ou por produtos liberados de células cancerosas. Consequentemente, o fator nuclear kappa B (NF-κB) é ativado induzindo uma resposta inflamatória que poderia aumentar a atividade de auto-renovação nas células cancerosas [72]. Foi demonstrado que em CSCs epiteliais de ovário CD44 + / MyD88 +, a sinalização TLR2 / MyD88 / NF-κB pode suportar seu crescimento e auto-renovação pela regulação positiva de genes associados à stemness [73]. Outro TLR que parece promover a expressão de genes associados à stemness é o TRL3. Por exemplo, Jia et al. mostraram que poli (I: C) aumenta a stemness em células cancerosas pela ativação mútua da β-catenina e da via de sinalização de NF-κB. Eles demonstraram in vitro e in vivo que as CSCs de mama, caracterizadas pela expressão de marcadores CD44high / CD24− / low, possuem propriedades semelhantes às de células-tronco e capacidade de iniciação de tumor. Eles também estabeleceram que a ativação de TLR3 em células de câncer de mama contribui para um enriquecimento de um subconjunto de células com o fenótipo CSC [74].

Outras evidências que apóiam o papel da inflamação na progressão do câncer decorrem de observações de que os tumores malignos freqüentemente se desenvolvem em locais de inflamação crônica e lesão tecidual [75]. Hepatite viral crônica [76], inflamação gástrica geral [77], gastrite causada por Helicobacter pylori [78], doença inflamatória intestinal e várias outras condições inflamatórias crônicas também aumentam o risco de desenvolvimento de câncer [79] e a indução de CSCs [80]. O estroma tumoral também contém fibroblastos ativados, células inflamatórias e capilares sanguíneos nascentes. A formação de tais microambientes facilita a indução de uma resposta inflamatória que causa migração celular e proliferação de células epiteliais. Isso resulta em reparo de tecido que pode ocasionalmente se transformar em proliferação e disseminação celular descontrolada [81, 82]. O'Brien et al. mostraram que a capacidade das células cancerosas de funcionar como CSCs depende de como elas respondem aos sinais de auto-renovação liberados no meio ambiente [83]. Foi sugerido que mudanças no meio ambiente podem levar à reprogramação de SSCs, transformando-as em células-tronco cancerosas após inflamação prolongada, infecção, exposição a toxinas ou doenças autoimunes [84]. Alguns relatórios mostraram que o meio ambiental do tumor fornece os estímulos necessários para a transformação de SSCs pela secreção de TGF-β [85]. Esta citocina aumentará a transição de SSCs para CSCs induzindo a expressão do fator de transcrição homeobox1 de ligação de E-box de dedo de zinco (ZEB1). ZEB1 contribui para a disseminação do câncer e a ativação da transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo que tem sido associado à metástase do câncer. Evidências adicionais sugerem que ZEB1 é responsável pela manutenção de fenótipos semelhantes a CSC [86, 87]. Outro exemplo de condições inflamatórias que afetam o desenvolvimento de CSC são as células cancerígenas progenitoras hepatocelulares (HcPCs), que foram observadas após inflamação crônica no fígado. As HcPCs mostram um perfil transcriptômico semelhante às SSCs no fígado, mas essas células não geram tumores. No entanto, sob inflamação crônica, a secreção de interleucina-6 (IL-6) estimula o crescimento de HcPC in vivo e facilita a progressão do tumor [88]. O papel que a inflamação crônica desempenha na indução de diferentes tipos de CSCs ainda está sob investigação, mas as citocinas secretadas por células imunes associadas a tumores parecem ativar as vias necessárias exigidas pelas células cancerosas para se tornarem células-tronco cancerígenas.


Regulação transcricional de EMT

Consistente com os papéis importantes de Smads, a perda de marcadores epiteliais e aquisição de características mesenquimais são alcançadas por meio de um programa de transcrição bem orquestrado que envolve três famílias de fatores de transcrição, as famílias Snail, ZEB e bHLH (Figura 2). Sua expressão é induzida em resposta ao TGF-β, por meio de um mecanismo dependente de Smad (no caso das proteínas Snail) ou indiretamente por meio da ativação de outros fatores de transcrição ou alívio da repressão. Após a ativação, esses fatores de transcrição, por sua vez, reprimem a expressão do gene marcador epitelial e, concomitantemente, ativam a expressão do gene mesenquimal. Além disso, esses fatores elaboram funções específicas de tecido ou de estágio de desenvolvimento associadas a seus perfis de expressão distintos 26.

Fatores de transcrição da família do caracol

Os fatores de transcrição Snail compartilham extensa similaridade estrutural, contendo um domínio C-terminal característico com quatro a seis dedos de zinco que medeia a ligação de DNA específico de sequência a elementos E-box C / A (CAGGTG) 67. Três proteínas da família Snail foram identificadas em vertebrados: Snail1 (primeiro descrito como Snail), Snail2 (também conhecido como Slug) e um Snail3 mais recentemente caracterizado. As proteínas do caracol funcionam como repressores da transcrição e suas atividades dependem do domínio de dedo de zinco e de um domínio SNAG N-terminal (Snail / Gfi).

A indução da expressão de Snail1 foi observada em todos os processos de EMT que foram estudados 67, 68, e os níveis aumentados de Snail1 foram correlacionados com tipos de tumor mais invasivos 15, 69. Snail2 é mais amplamente expresso do que Snail1, e sua expressão aparece em alguns casos não relacionada a EMT 68, 70. Ambos os genes são induzidos em resposta a TGF-β em células que sofrem EMT induzida por TGF-β. Além disso, o TGF-β induz a expressão de Snail1 na pele 71 e no desenvolvimento do palato 72, em células mesoteliais durante a fibrose patológica 73, em hepatócitos em cultura 59 e em múltiplas linhas de células epiteliais 74, bem como durante o desenvolvimento do coração 75. A indução da expressão de Snail1 em resposta a TGF-β é mediada por Smad3 Smad3 se liga ao promotor Snail1 e ativa sua transcrição 55, 76. As células epiteliais tubulares renais deficientes na expressão de Smad3 falham em ativar a expressão de Snail1 após o tratamento com TGF-β 53, e a interferência com a expressão de Smad4 atenua a expressão de Snail1 induzida por TGF-β1 em linhas de células epiteliais 22, 58, 59. Smad3 também medeia a expressão induzida por TGF-β de Snail2 em células MDCK, em que Smad3 forma um complexo com fatores de transcrição relacionados à miocardina e se liga ao promotor Snail2 para ativar a transcrição 77.

A indução de EMT pelo fator de crescimento de hepatócitos (HGF) 78, fator de crescimento de fibroblastos (FGF) ou fator de crescimento epidérmico (EGF), que agem através da via Ras-MAPK ou PI3K-Akt, também resulta na indução da expressão de caracol 68 . Além disso, a via de TGF-β-Smad também coopera com a sinalização Ras, Notch e Wnt na indução da expressão de Snail no desenvolvimento e na metástase tumoral 68. Additionally, post-translational modification defines Snail subcellular localization, stability and transcription activity 26, 68 .

Several lines of evidence highlight the key roles of Snail transcription factors in the execution of the EMT program 15, 69 . Ectopic expression of Snail1 or Snail2 suppresses E-cadherin and plakoglobin expression and enhances vimentin and fibronectin expression, leading to a full EMT phenotype, whereas silencing of Snail expression reverses this process 15, 69, 79, 80, 81 . Snail1-deficient mouse embryos are unable to complete the EMT process and form a defective mesodermal layer that maintains E-cadherin expression, causing the mutant embryos to die at gastrulation 82 . Silencing of Snail2 expression in chick embryos results in mesodermal malformation and neural crest emigration failure 83 .

Substantial efforts have gone into defining the targets of the Snail transcription factors. Snail1 and 2 both repress the expression of the epithelial marker gene CDH1 that encodes E-cadherin. At the E-cadherin promoter, Snail1 binds to E-box elements, recruits a complex consisting of HDAC1, HDAC2 and mSin3A, and thus represses gene transcription 15, 69, 81 . Snail2 similarly represses E-cadherin through binding to the same E-box elements, but recruits a different combination of co-repressors, i.e. HDAC1/3 and CTBP 70, 80, 81 . The expression of Snail proteins appears to inversely correlate with E-cadherin expression, and silencing of the Snail1 gene can restore E-cadherin levels 69, 81 . However, forced expression of E-cadherin is unable to counteract Snail1-induced EMT 11, 12 , suggesting an involvement of additional Snail target genes in the elaboration of EMT. In fact, Snail proteins repress a spectrum of genes involved in maintaining epithelial structure and function, including genes encoding claudins and occludin, major transmembrane components of tight junctions. Snail1 represses the expression of claudin-3, -4 and -7 at their promoters 11, 84 , whereas Snail1 and Snail2 both repress the expression of claudin-1 and occludin 84, 85, 86 . In contrast, Snail1 expression does not dramatically decrease the levels of cytoplasmic components of tight junctions, such as ZO-1 and p120, but their distribution is altered from peripheral localization to a diffused cytoplasmic pattern 84 . Snail proteins regulate the expression of desmosome proteins as well. Ectopic expression of Snail1 results in decreased desmoplakin and plakophilin levels, and causes disorganized plakoglobin distribution 11, 15, 16, 87 . Furthermore, Snail1 disrupts epithelial polarity by repressing the expression of Crumbs3, which in complex with two other proteins, PALS1 and PATJ, is required for the maintenance of apical-basal polarity. Snail1 binds to the E-box element in the Crumbs3 promoter and inhibits Crumbs3 expression, leading to disassembly of the Crumbs complex 88 . However, Snail1 expression does not affect the Par complex, another important polarity complex 88 . Snail1 expression also results in decreased expression of a subset of cytokeratins, i.e. cytokeratin 17, 18, 19 and 20, thus affecting the epithelial cytoskeletal organization. Cytokeratins 17 and 18 have been identified as direct targets of Snail1 by chromatin immunoprecipitation 11, 84, 89 . Recent microarray analyses have unveiled additional genes encoding epithelial or basal lamina proteins that are downregulated by Snail1, suggesting an even broader range of regulation of the epithelial program by Snail proteins 90 .

Other Snail target genes show a more tissue-restricted distribution and are hence associated with tissue-specific EMT processes. One such target of Snail1 is HNF-1β, a transcription factor that is expressed in kidney epithelial cells and activates the expression of the kidney-specific epithelial marker cadherin-16. Through direct repression of HNF-1β transcription, Snail1 suppresses cadherin-16 expression and induces EMT in cell culture, reminiscent of the development of kidney fibrosis na Vivo 91, 92 . In hepatocytes, Snail1 represses another HNF transcription factor, HNF-4α, resulting in loss of epithelial markers and expression of mesenchymal proteins 93 . Snail proteins also repress the expression of mucin-1, a transmembrane protein on the apical surface of pulmonary airway epithelium that serves to hydrate, lubricate and protect the epithelium 94 .

While repressing epithelial gene expression, Snail proteins activate the expression of the mesenchymal proteins fibronectin 15, 79 , vitronectin 15, 79 and N-cadherin 90 , the extracellular matrix proteins collagen type III and V 90 , and proteins involved in migration and invasion, such as RhoB, plasminogen activator inhibitor-1 and matrix metalloproteinases 68, 79 . These effects of Snail may be indirect and involve other transcription factors, such as Ets-1 which has been proposed to mediate the induction of MMP-2 expression 95 or Sp-1 and Ets-1 which are thought to be partially responsible for the upregulation of MMP-9 expression 96 . Snail1 also regulates the expression of multiple actin-modulating proteins to facilitate the rearrangement of actin filaments from cortical distribution to stress fibers anchored to focal adhesions 11 . Consistent with the indirect induction of gene expression by Snails, Snail transcription factors induce the expression of other EMT-related transcription factors, such as Twist and Ids in MDCK cells 90 , and ZEB1 and ZEB2 in squamous carcinoma cell lines 89, 95 .

In addition to regulating the expression of epithelial or mesenchymal genes, Snail also regulates genes required for cell survival 68 , which are frequently intertwined with EMT during embryonic development or in pathological conditions. Finally, in some cases Snail1 and Snail2 cooperate in the control of the transcription network that regulates EMT. For example, in breast tumors, Snail1 expression correlates with mesenchymal transition and metastasis, and Snail2 expression associates with the repression of tumor suppressor gene BRCA2 68 .

ZEB family transcription factors

Two ZEB family transcription factors are known in vertebrates: ZEB1, also known as δEF1 or AREB6, and ZEB2, also known as Smad-interacting protein 1 (SIP1). They have two zinc-finger clusters at each end, whose simultaneous binding to bipartite E-boxes mediates the interaction with regulatory DNA sequences. The central region contains a Smad-interaction domain, a homeodomain and a CTBP binding domain. Repression of gene transcription by ZEB1 or ZEB2 is mediated by repressor motifs in the central homeodomain and through recruitment of CTBP as a co-repressor. However, interaction of ZEB1 with co-activators PCAF and p300 switches ZEB1 function from repression to activation 26, 97 . ZEB proteins are expressed during development in various tissues, including the central nervous system, the heart, skeletal muscle and haematopoietic cells. They partially compensate for each other in these tissues, although in other cases, such as during neural crest emigration, and in lymphocytes, ZEB proteins exhibit distinct expression patterns and do not functionally compensate 26 .

TGF-β signaling induces the expression of ZEB proteins during EMT through an indirect mechanism mediated in part by Ets-1 21 . ZEB proteins then interact with Smad3 and directly repress the expression of epithelial marker genes, possibly by recruiting the co-repressor CTBP 97, 98 . ZEB1 is also induced by TGF-β during smooth muscle differentiation, in which it synergistically interacts with Smad3 and SRF to transactivate the genes encoding smooth muscle α-actin and smooth muscle myosin heavy chain 99 . As is in the case of the Snails, the expression of ZEB proteins is not only activated by TGF-β but also by other growth factors that activate Ras-MAPK signaling and by Wnt/β-catenin signaling 26 . The expression of ZEB factors is also post-transcriptionally repressed by microRNAs, miR-200 family and miR-205 100, 101, 102 . This group of microRNAs is dramatically downregulated in cells undergoing EMT, allowing expression of ZEB transcription factors. Thus, forced expression of miR-200 family is sufficient to block TGF-β-induced EMT 100, 101, 102 . In addition, ZEB2 is subject to post-translational regulation, whereby Pc2-mediated sumoylation impairs its repressor activity 103 .

The induction of ZEB proteins is necessary for the downregulation of E-cadherin expression and promotion of cell migration 21, 104, 105, 106 . ZEB proteins directly repress E-cadherin expression independently of the Snail transcription factors in mouse mammary epithelial cells 21, 106 . Concomitantly, they confer a delocalization of β-catenin in a cell context-dependent manner and promote cell migration 104, 107 . Besides its effects on adherens junctions, ZEB2 directly represses the expression of the tight junction proteins claudin-4 and ZO-3 107 . ZEB2 also suppresses the expression of the desmosome protein plakophilin-2 107 and induces the expression of the mesenchymal proteins vimentin 108 , N-cadherin 107 and matrix metalloproteinase-2 95 through as yet unknown mechanism(s). Both ZEB proteins promote cell migration and induce invasion 104, 107, 109 . ZEB1 has also been implicated in the downregulation of epithelial polarity through the direct repression of Crumbs3 expression depletion of ZEB1 restores the expression of Crumbs3 and PATJ, major components of the Crumbs3 polarity complex 109, 110 . ZEB1 also directly represses the expression of mucin-1 89 .

Helix-loop-helix family factors

The HLH family is a large family of transcription factors controlling a wide array of developmental and pathological processes. The basic structure of HLH family members includes two parallel α-helices linked by a loop required for dimerization. HLH factors are divided into seven categories based on their tissue distribution, dimerization capability and DNA-binding specificity 111 . Among these, the class I proteins E12 and E47, class II proteins Twists and class V proteins Ids are involved in the elaboration of EMT. The class I proteins E12 and E47 form homodimers or heterodimers with class II proteins, and the class II proteins Twists (Twist1 and Twist2) always heterodimerize with class I proteins. In contrast to these, the class V Id proteins (Id1, Id2, Id3 and Id4) lack the basic domain and thus are incapable of DNA binding. They function as dominant negative inhibitors through high affinity binding to class I proteins 26, 111 .

E12 and E47 are encoded by alternative splicing products of the E2A gene 26, 111 . They directly repress E-cadherin expression through DNA binding at the E-box element in the proximal promoter. Ectopic expression of E12 or E47 represses E-cadherin and plakoglobin expression, induces vimentin and fibronectin expression, and promotes migration and invasion 80, 112, 113 . It remains unclear whether E12 and E47 form homodimers or heterodimerize with other HLH factors for E-cadherin repression. However, their repression of E-cadherin transcription can be antagonized by Id factors, which interact with E2A proteins 113 . The expression of Id1, Id2 and Id3 is repressed in response to TGF-β, which in the case of Id1, occurs through the rapid activation of expression of the transcription repressor ATF3 by TGF-β and the subsequent binding of an ATF3/Smad3/Smad4 complex to the Id1 promoter 114, 115 . Consequently, loss of Id protein expression correlates with a decrease in E-cadherin expression, and ectopic expression of Id2 or Id3 dose-dependently blocks TGF-β-induced repression of E-cadherin expression, inhibits TGF-β-induced ZO-1 delocalization and represses TGF-β-induced smooth muscle actin expression 113, 114 . Besides E-cadherin, E47 also represses desmoplakin expression and induces the expression of N-cadherin, SPARC and α5-integrin 90 .

The HLH protein Twist1 is a major regulator of mesoderm formation in Drosófila and neural tube closure in mice, suggesting its involvement in developmental EMT 116 . Mutation of the gene encoding Twist1 in human has been associated with Saethre-Chotzen syndrome, which is characterized by cleft palate and possibly caused by an inhibition of EMT 117, 118 . Conversely, both Twist1 and Twist2 expression are upregulated in a large fraction of human tumors 119 . Ectopic expression of Twist1 or Twist2 decreases E-cadherin, occludin and claudin-7 expression, increases vimentin and N-cadherin expression, and enhances migration and invasion 9, 10 . In addition, Twist1 and Twist2 both synergize with H-Ras to induce a full EMT 10 .

HMGA2

HMGA2 (high mobility group A2) is another downstream effector of TGF-β during EMT. HMGA2 belongs to a group of transcription factors that bind AT-rich DNA sequences to form nucleoprotein complexes. HMGA2 is expressed at high levels during embryogenesis and at low levels in adulthood, and is expressed aberrantly in some transformed cells or cancer tissues. TGF-β induces a drastic increase in HMGA2 expression through a Smad3/Smad4-dependent mechanism, and ectopic HMGA2 expression is able to induce the expression of Snail1/2 and Twist1 120 .


Can TGF beta family induce all somatic stem cells? - Biologia

The continuous and steady supply of transient cell types such as skin, blood and gut depends crucially on the controlled proliferation of stem cells and their transit amplifying progeny. Although it is thought that signaling to and from support cells might play a key role in these processes, few signals that might mediate this interaction have been identified. During spermatogenesis in Drosófila, the asymmetric division of each germ line stem cell results in its self-renewal and the production of a committed progenitor that undergoes four mitotic divisions before differentiating while remaining in intimate contact with somatic support cells [1]. Previous data have suggested that TGF-β signaling pathway components punt e schnurri are required in the somatic support cells to restrict germ cell proliferation [2]. Here, by contrast, we show that the maintenance and proliferation of germ line stem cells and their progeny depends upon their ability to transduce the activity of a somatically expressed TGF-β ligand, the BMP5/8 ortholog Glass Bottom Boat. We further demonstrate that TGF-β signaling represses the expression of the Bam protein, which is both necessary and sufficient for germ cell differentiation, thereby maintaining germ line stem cells and spermatogonia in their proliferative state.


Materiais e métodos

Cells culture and reagents

HDLECs were purchased from Lonza (Basel, Switzerland). The cells were maintained in EBM TM -2MV Bullet Kit (cc-3202, Lonza) and used for study after extensive characterization. HEK-Blue TM TGF-β cells (HEK293 cell-derived TGF-β responsive reporter cells) were purchased from InvivoGen (San Diego, CA, USA) and maintained in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Nacalai Tesque: Kyoto, Japan) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS, SIGMA: St. Louis, MO, USA), 100 units/mL Penicillin-100 μg/mL Streptomycin (Nacalai Tesque). TGF-β2, TNF-α, and Activin A were purchased from Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Follistatin was purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). SB431542 and Y27632 were obtained from WAKO Chemicals (Saitama, Japan). Concentrations of TGF-β2 used were determined empirically, based on their ability to alter expression of various endothelial and mesenchymal markers.

Interferência de RNA

The siRNAs for human SMAD2 (#A: 5’- CAAGUACUCCUUGCUGGAUTT -3’ , #B: 5’- GUCCCAUGAAAAGACUUAATT -3’ ) and human MRTF-A (#A: 5’- GUGUCUUGGUGUAGUGUAATT -3’ , #B: 5’-CAGGUGAACUAUCCCAAAGUATT -3’ ) were synthesized by Hokkaido System Science (Sapporo, Japan). The target sequences for SMAD2 were designed as previously described [25]. Negative control was purchased from QIAGEN (Hilden, Germany). All siRNAs were introduced into the cells using Lipofectamine RNAi Max reagent (Invitrogen: Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Briefly, 8.0×10 4 cells were mixed with siRNA-Lipofectamine complexes and seeded into 6-well plates. Medium was refreshed 6 h later and cells were allowed to grow for an indicated period.

RNA isolation and quantitative RT-PCR

Total RNA was prepared with Nucleospin RNA (TaKaRa Bio: Otsu, Japan) according to the protocol suggested by the manufacturer and reverse-transcribed by random priming using a PrimeScript II Kit (TaKaRa Bio). The quantitative RT-PCR (qRT-PCR) analysis was performed using StepOne Plus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). All expression data were normalized to that of β-actin. The primer sequences are available in Table 1.

Smad2/3-responsive reporter assay

Activation of Smad2/3 signals by TGF-β family members including TGF-β1, 2, 3, and Activin A was determined using reporter assay which employs HEK-Blue TM TGF-β cells allowing direct quantification of soluble alkaline phosphatase (SEAP) expressed under control of Smad3/4-inducible elements. HDLECs were treated with TGF-β2 or SB431542 for 48 h. The culture medium was then replaced with EGM-2MV medium with 0.5% FBS and HDLECs were incubated for additional 6 h. The conditioned medium was then collected and added to the pre-seeded HEK-Blue TM TGF-β reporter cells, followed by incubation for 24 h. Fraction of the medium obtained from incubation with HEK-Blue cells was then mixed with QUANTI-Blue substrate (InvivoGen) and incubated for 30 min. The released SEAP was quantified at 640 nm using spectrophotometer.

Chamber migration assay

The modified Boyden chamber migration assay was used for the measurements of migration of HDLECs. Briefly, the chambers were pre-coated with Cellmatrix Type I-C (Nitta Gelatin: Yao, Japan). HDLECs were cultured in the absence or presence of TGF-β2 for 72 h, harvested and suspended in EGM-2MV medium. The cells were then seeded (1.0×10 4 cells/chamber) in the upper chamber of a 24-well Transwell filter (8 μm pore filter, Merck Millipore) and allowed to migrate for 6 h. After indicated period, the filters were stained with DiffQuik (Sysmex: Kobe, Japan) followed by removal of non-migrated cells with a cotton swab. Migrated cells adhering to the bottom side of the filter were examined, photographed using a light microscope (BZ-X710, Keyence: Osaka, Japan) and counted.

Tube formation assay

A 12-well plate was pre-coated with Matrigel (BD Biosciences, San Jose, USA) (0.4 mL/well). After polymerization of Matrigel at 37°C for 1 h, HDLECs were seeded in each well at a density of 1.75×10 5 cells/400 μL/well. After 7 h of incubation in EGM-2MV medium supplemented with 5% FBS, tube-like structures were photographed under phase-contrast microscopy (BZ-X710, KEYENCE) with 10× objective lenses. Tube length was quantified using ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Immunocytochemistry

HDLECs were seeded on the cover glass pre-coated with Cellmatrix Type I-C (Nitta Gelatin) and cultured in the absence or presence of TGF-β2 and/or TNF-α for 72 h. The cells were then fixed with 4% paraformaldehyde, treated with 0.1% Triton X-100, blocked and incubated with primary anti-SM22α (ab14106, Abcam) and anti-Prox1 (AF2727, R&D systems) antibodies, followed by treatment with Alexa 488- and Alexa 594-conjugated secondary antibodies, respectively and Hoechst33342 for staining of the nuclei. Images were taken with All-in-One fluorescent microscope, BZ-X710 (Keyence).

Microvasculature preparation and permeability assay

The description and fabrication method of polydimethylsiloxane (PDMS)-based chips were previously reported [26]. Briefly, the PDMS chip (25 mm × 25 mm × 5 mm: width × length × height) comprised a central rectangular chamber framed on its left and right sides by two wells and crossed by a φ 300-μm PDMS channel. For building the micro-lymphatic vessels (micro-LVs), the PDMS chips were first treated with O2 plasma. For each chip, a φ 200-μm needle (acupuncture needle, No.02, 0.20 mm x 30 mm, J type, from Seirin: Shizuoka, Japan) was coated with PBS, 1% BSA. The chips and needles were then sterilized by UV-light exposure under a cell culture hood. A neutralized collagen solution was prepared by mixing on ice in a 8:1:1 volume ratio: Cellmatrix Type I-A collagen solution (3 mg/mL, pH 3, from Nitta Gelatin), 10× Hank’s buffer, and 10× collagen buffer (262 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 0.05N NaOH). Ice-cold collagen solution was introduced into the wells and rectangular chamber and the BSA-coated needle was inserted through the PDMS channel. After removal of the excessive collagen from the wells, the collagen was allowed to solidify by incubating the device in a cell culture incubator for one hour (37°C, 5% CO2) Withdrawal of the needle left a hollow channel within the collagen gel that served as a scaffold for building a tubular lymphatic endothelium. HDLECs, treated for 24 h with normal EBM TM -2MV or with EBM TM -2MV containing 5 μM SB431542 or 10 ng/mL TGF-β2, were harvested and resuspended in same media at a density of 1×10 7 cells/mL. 20,000 cells were loaded at each opening of the collagen tubular scaffold and allowed to attach for 15 minutes. Finally, 1 mL of drug-containing media was added and the micro-LVs were cultured in a cell culture incubator (37°C, 5% CO2) with media renewal every other day. Six days after micro-LVs fabrication, micro-LVs were imaged using a microscope Observer Z1 (Carl Zeiss: GmbH, Oberkochen, Germany) and permeability assay was performed as previously described [26] with minor changes. Briefly, the chips were set-up on a confocal microscope LSM700 (CLSM, Carl Zeiss, Jena, Germany). Medium was removed and 15 μL of a 100 μg/mL FITC-dextran (70 kDa) in EBM TM -2MV solution were introduced in both wells. The fluorescence of FITC was imaged with a 488-nm-wavelength laser and an optical section of 77.8 μm. For quantifying the microvessel permeability, CLSM images taken one minute after introduction of FITC-dextran were processed with the ZEN 2012 SP1 black edition software (version 8.1.0.484, 64 bit, Carl Zeiss). The mean fluorescence intensity of FITC detected in collagen gel was given by the Zen software for two regions of interest (50 μm × 2500 μm) drew close and aligned to each edge of a microvessel. The obtained values were averaged and considered as representative of a micro-LV’s permeability to 70 kDa molecules. The experiment was performed three times with five micro-LVs. After permeability assay, total RNA was extracted from three micro-LVs and processed for qRT-PCR analyses.

Imunohistoquímica

Human skin samples were obtained from the eyelids of 16 healthy volunteers aged 20–80 years old and were snap-frozen. Skin samples were divided into 2 groups according to age of the donor: Group 1: 12–40 (N = 8) and Group 2: over 40 (N = 10). Double immunofluorescence staining for LYVE1 and SM22α was performed as previously described [27, 28]. Frozen skin sections were fixed with 4% PFA at 4ºC for 10 min and blocked with a blocking solution for 30 min. The sections were then incubated overnight with goat anti-LYVE1 IgG (AF2089, R&D systems) and rabbit anti-SM22α IgG (ab14106, abcam: Cambridge, UK). The next day the samples were incubated with Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-goat IgG (Invitrogen) diluted to 1:200 for 1 h. The pictures were captured under LSM 510 META microscope (Carl Zeiss). Images were analyzed using IP-Lab software (Scanalytics: Fairfax, VA, USA). Briefly, the relative area occupied by SM22α + LYVE1 + vessels to the one occupied by LYVE1 + vessels (total lymphatic vessel area) was defined as EndMT ratio. The analyzed areas were determined in the dermis, in an area within 500 μm distance from the epidermal-dermal junction. Then the ratio of SM22α + / LYVE1 + was calculated by dividing the area of SM22α + LYVE1 + vessels by that of LYVE1 + vessels per area unit (mm 2 ).

Análise estatística

Values are presented as mean ± standard deviation (S.D.) or standard error of the mean (S.E.M.). Significant differences between means were determined using two-tailed unpaired Student's t-test or one/two-way ANOVA followed by Bonferroni multiple comparison post hoc analysis using EZR software [29]. Differences between means were considered statistically significant at *P < 0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001 N.S., not significant.

Ethical standards

All the experiments were approved by “the Safety Control Committee for Experiments Using Genetically Modified Organisms, Etc.” and done according to the guideline of “Safety Control Regulations for Experiments Using Genetically Modified Organisms, Etc., Tokyo Medical and Dental University” (approved number: G2018-047C). Human skin samples were obtained by the Gakugeidai-Nishiguchi Clinic (Tokyo, Japan). All procedures involving human subjects were approved by the Institutional Review Board of the Shiseido Global Innovation Center, and all subjects provided written informed consent. Ethics Review Committee of Faculty of Dentistry at Tokyo Medical and Dental University (TMDU) has waived the requirement for this approval.


Conclusões

Advances in the TGFβ signaling field continue to expand the number of processes in which it is recognized as required, and clarify the mechanisms that underlie the exquisitely finely tuned transduction of its signals. As we consolidate our understanding of the flexibility within the pathway and of the interplay between TGFβ family signaling and other pathways, it has become clear that there are astounding similarities between its roles in different processes and organisms. Despite progress in the field, further insights into the context-dependent nature of the pathway will depend on continued in vivo studies in developmental and disease systems. Definitive measurements of the molecular properties that govern the expression, presentation and turnover of signaling components are needed to make full use of modeling and systems approaches that are aimed towards the successful development of therapeutics for the treatment of syndromes and diseases arising from the dysregulation of TGFβ family signaling. Much work remains to be done. The convergence of cell biologists, developmental biologists, biochemists and geneticists at future TGFβ FASEB meetings will continue to ensure success in these endeavors.


TGF-beta in neural stem cells and in tumors of the central nervous system

Mechanisms that regulate neural stem cell activity in the adult brain are tightly coordinated. They provide new neurons and glia in regions associated with high cellular and functional plasticity, after injury, or during neurodegeneration. Because of the proliferative and plastic potential of neural stem cells, they are currently thought to escape their physiological control mechanisms and transform to cancer stem cells. Signals provided by proteins of the transforming growth factor (TGF)-beta family might represent a system by which neural stem cells are controlled under physiological conditions but released from this control after transformation to cancer stem cells. TGF-beta is a multifunctional cytokine involved in various physiological and patho-physiological processes of the brain. It is induced in the adult brain after injury or hypoxia and during neurodegeneration when it modulates and dampens inflammatory responses. After injury, although TGF-beta is neuroprotective, it may limit the self-repair of the brain by inhibiting neural stem cell proliferation. Similar to its effect on neural stem cells, TGF-beta reveals anti-proliferative control on most cell types however, paradoxically, many brain tumors escape from TGF-beta control. Moreover, brain tumors develop mechanisms that change the anti-proliferative influence of TGF-beta into oncogenic cues, mainly by orchestrating a multitude of TGF-beta-mediated effects upon matrix, migration and invasion, angiogenesis, and, most importantly, immune escape mechanisms. Thus, TGF-beta is involved in tumor progression. This review focuses on TGF-beta and its role in the regulation and control of neural and of brain-cancer stem cells.

Esta é uma prévia do conteúdo da assinatura, acesso através de sua instituição.


Assista o vídeo: Aula 6- Células tronco - Reprogramação celular e células induzidas à pluripotência. (Dezembro 2021).