Em formação

Que material preenche a fenda sináptica? É água?


A fenda sináptica é a lacuna entre os neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos, e os neurotransmissores são transferidos entre os neurônios dentro desta região. Que substância sai deste espaço, é água? Nesse caso, que força faz os neurotransmissores se moverem em direção aos receptores, apesar de colidirem com as moléculas de água?


Existem dois tipos de sinapses, nomeadamente Sinapse elétrica e Sinapse química. Na sinapse elétrica, há contato físico entre duas células por meio de junções comunicantes. Na sinapse química, há uma pequena lacuna entre duas células que é denominada como fenda sináptica.

As membranas pré-sináptica e pós-sináptica nas sinapses químicas são separadas por uma fenda sináptica que tem 20-50 nm de largura, 10 vezes a largura da separação nas junções comunicantes. A fenda é preenchida com uma matriz de proteína extracelular fibrosa. Uma função dessa matriz é servir como uma “cola” que une as membranas pré e pós-sinápticas.(referência 1)

A mesma referência também afirma A água é o ingrediente principal tanto do fluido dentro do neurônio, o fluido intracelular ou citosol, quanto do fluido externo que banha o neurônio, o fluido extracelular. Átomos carregados eletricamente, íons que são dissolvidos nesta água são responsáveis ​​pelos potenciais de repouso e ação.

A referência 2 menciona, A fenda sináptica não é simplesmente um espaço vazio, mas é o local de proteínas extracelulares que influenciam a difusão, ligação e degradação das moléculas, incluindo neurotransmissores e outros fatores, secretados pelo terminal pré-sináptico

Se pensarmos nessa direção, é claro que manter juntos dois neurônios na posição da sinapse é importante. Além disso, a presença de vários íons dissolvidos (na água) é necessária. Se você se lembrar, para a liberação de neurotransmissores na fenda sináptica, o influxo de íons Ca2 + através de canais iônicos dependentes de voltagem é essencial. Assim, acima de todos os pontos, podemos concluir que, o fluido extracelular na fenda sináptica é principalmente aquoso em sua composição com vários íons, neurotransmissores liberados e várias proteínas que constituem uma matriz.

Que força faz os neurotransmissores se moverem em direção aos receptores?

Um papel essencial dos astrócitos é regular o conteúdo químico desse espaço extracelular. Por exemplo, os astrócitos envolvem as junções sinápticas no cérebro, restringindo assim a propagação das moléculas de neurotransmissores que foram liberadas.(referência 1). Assim, ajuda a confinar os neurotransmissores na pequena região, aumentando assim a probabilidade de entrar em contato com o receptor alvo. Também, como a referência 2 diz, existem várias proteínas presentes na fenda sináptica que influenciam a difusão. Significa que o movimento do neurotransmissor é por difusão e vários fatores mencionados acima podem influenciar seu movimento em direção ao receptor de forma eficiente.

Referências:

  1. Bear et.al, Neuroscience, explorando o cérebro, 2015
  2. Neuroscience, livro de Dale Purves.

Os componentes do fluido intersticial dependerão de onde está a sinapse, embora sim, será aquosa. A difusão à moda antiga sobre um gradiente de concentração será responsável por garantir que um neurotransmissor suficiente alcance os receptores do outro lado da fenda sináptica. É difícil encontrar algo que você possa consultar on-line facilmente, de forma independente, para verificar minha resposta. Eu diria que haverá capítulos inteiros sobre isso em qualquer livro básico de farmacologia. Farmacologia de Rang e Dale é a mais facilmente encontrada em uma biblioteca universitária e legível sem muito conhecimento de biologia.


Tomografia crioeletrônica e transmissão sináptica no cérebro

O cérebro é de longe a mais complexa e uma das estruturas biológicas mais eficientes conhecidas pelo homem. Um cérebro humano consiste em aproximadamente 86 bilhões de células nervosas altamente interconectadas, ou neurônios. A capacidade dos organismos superiores de responder rapidamente a estímulos externos, de criar ferramentas e comportamentos organizados para a sobrevivência, bem como, nos humanos, de apoiar o pensamento abstrato e a consciência está crucialmente ligada à capacidade dos neurônios de trocar informações e criar curtos ou longos - caminhos de prazo para sua transferência entre diferentes áreas do cérebro. Ao contrário de dispositivos artificiais, como computadores, nos quais as informações são criadas e manipuladas na forma de correntes elétricas que fluem dentro de circuitos eletrônicos fortemente conectados, os neurônios no cérebro mantêm sua individualidade como células e, principalmente, se comunicam entre si por meio da troca de espécies químicas, conhecidas como neurotransmissores. Ao longo de centenas de milhões de anos de evolução, o processo pelo qual os neurotransmissores são trocados entre os neurônios foi otimizado para um nível incrível de eficiência e confiabilidade. Só recentemente, no entanto, fomos capazes de obter alguns insights sobre os complexos mecanismos bioquímicos que regulam esse processo.

Os neurônios se comunicam entre si transmitindo neurotransmissores por meio de pontos de contato, as chamadas sinapses neuronais. Designua / Shutterstock.com

Como os neurônios trocam informações
Os neurônios têm uma morfologia muito característica em comparação com outras células, e são caracterizados por uma estrutura longa e delgada, chamada axônio, projetando-se do corpo celular e terminando na forma de um grupo ramificado de ramos contendo terminais pré-sinápticos. As sinapses neuronais são pontos de contato entre os neurônios, onde a informação é transferida de uma célula pré-sináptica para uma pós-sináptica. Em um neurônio excitado, a chegada de um sinal elétrico do corpo celular às sinapses pode causar a fusão de pequenas vesículas cheias de moléculas de neurotransmissores com a membrana sináptica e liberar seu conteúdo para o espaço extracelular entre os dois neurônios, conhecido como fenda sináptica. . A ligação do neurotransmissor ao receptor pós-sináptico desencadeia processos químicos que resultam na criação de sinais elétricos nos neurônios pós-sinápticos, completando assim a transferência de informações.

A transferência de informações entre neurônios individuais no cérebro ocorre por meio de uma liberação cuidadosamente regulada de substâncias químicas
neurotransmissores.

A liberação do neurotransmissor é um processo muito rápido e complexo, que requer uma coordenação espaço-temporal precisa dos processos bioquímicos envolvendo proteínas pré-sinápticas. Nem todas as vesículas sinápticas podem ser liberadas: outros processos bioquímicos estão envolvidos na preparação de algumas das vesículas para liberação, para formar o chamado pool de liberação imediata. Esses processos são realizados principalmente por complexos de proteínas macromoleculares, que, em muitos casos, existem em forma transitória e sobrevivem apenas o tempo necessário para exercer sua função.

No crio-EM, as amostras são resfriadas tão rápido que as moléculas de água não têm tempo para se transformar em um estado cristalino. PolakPhoto / Shutterstock.com

Liberação de neurotransmissor de imagem
A microscopia eletrônica (EM) pode ser usada para obter imagens de amostras biológicas, de maneira semelhante à microscopia óptica convencional. No EM, o uso de um feixe de elétrons, em vez de luz visível, torna possível atingir um nível de resolução muito mais alto do que a microscopia padrão. Durante a observação EM, no entanto, as amostras devem ser mantidas no vácuo. Este é um grande problema no caso de sistemas biológicos, porque a água, que constitui um grande componente da amostra, evapora no vácuo, causando danos irreparáveis ​​à amostra. A fixação química seguida de desidratação controlada pode ser usada para resolver parcialmente esse problema, o que torna o EM adequado no estudo da estrutura e função das organelas celulares. No entanto, essa técnica ainda causa alterações na amostra que impossibilitam o estudo de processos celulares em nível molecular.

Tomografia crioeletron
No crio-EM, as amostras são resfriadas tão rápido que as moléculas de água não têm tempo suficiente para se reorientar e formar cristais de gelo, o que as leva a uma forma sólida semelhante a vidro, chamada de estado vítreo. O Dr. Vladan Lučić, do Instituto Max Planck de Bioquímica, é um especialista no uso de crio-EM em combinação com tomografia, um método no qual várias imagens de uma amostra com diferentes orientações são combinadas para formar uma imagem tridimensional (tomograma). Essa abordagem produz imagens tridimensionais de alta resolução de amostras celulares vitrificadas e totalmente hidratadas, preservadas em seu ambiente e estado nativo. Usando este método, o Dr. Lučić e seus colaboradores conseguiram, pela primeira vez, criar imagens de complexos de proteínas e vesículas, tanto nas extremidades sinápticas, prontas para liberar neurotransmissores, quanto em processo de transporte ao longo de um axônio. Este é um resultado importante, pois confirma que as vesículas e os complexos de proteínas envolvidos nas liberações dos neurotransmissores são provavelmente sintetizados no corpo celular e, em seguida, transportados através do axônio para as sinapses, e fornece uma visão simultânea de ambos os carga de proteínas e as membranas lipídicas envolvidas no transporte.

Vesículas sinápticas e atividade neural
Experimentos de tomografia crioeletrônica realizados em sinapses isoladas bioquimicamente de cérebros de roedores mostram que, na zona ativa, que é uma área sináptica onde os neurotransmissores estão prontos para serem liberados, as vesículas sinápticas são mantidas presas à membrana sináptica por diferentes tipos de filamentos , que, juntamente com os filamentos que interligam as vesículas, atuam como os principais elementos estruturais organizadores das vesículas. Para entender a função e o papel desses filamentos no processo de liberação de neurotransmissores, o Dr. Lučić e seus colaboradores desenvolveram procedimentos de software automatizados que tornam possível analisar a morfologia, localização precisa e inter-relação desses complexos em sinapses capturadas em diferentes estados relevantes de liberação . Eles descobriram que esses filamentos são estruturas dinâmicas que respondem à estimulação sináptica e regulam o agrupamento das vesículas sinápticas, limitando a dispersão das vesículas em repouso e permitindo que as vesículas se mobilizem para liberação durante a atividade sináptica.

A tomografia crioeletrônica tem o potencial de fornecer uma imagem molecular detalhada do mecanismo de liberação de neurotransmissores em
membranas sinápticas.

Com base nessas descobertas, o Dr. Lučić propôs um modelo estrutural de liberação de neurotransmissores, no qual as vesículas sinápticas são inicialmente ligadas à membrana sináptica por meio de amarras longas e podem adquirir várias amarras mais curtas nas etapas subsequentes. Essa mudança em sua organização estrutural torna as vesículas preparadas para a liberação de neurotransmissores na fenda sináptica.

Visão tridimensional de uma sinapse: A indica a área analisada. B mostra a segmentação 3D de vesículas sinápticas (amarelo), conectores de vesículas sinápticas (vermelho) e amarras de vesículas sinápticas (azul). C e D mostram um conector de vesícula sináptica (C) e uma corda (D). Copright © 2010 Fernández-Busnadiego et al.

Rumo a um modelo molecular de liberação de neurotransmissores
Apesar do nível sem precedentes de compreensão do mecanismo de atividade sináptica possibilitado pela tomografia crioeletrônica, uma série de questões técnicas dificultam a aplicação deste método para desvendar totalmente a complexidade do priming da vesícula e liberação do neurotransmissor nas membranas sinápticas. Uma das vantagens intrínsecas da tomografia crioeletrônica é que todos os componentes de uma determinada amostra são visualizados ao mesmo tempo. Em contraste, a microscopia óptica pode ser usada para obter imagens apenas das espécies moleculares que são artificialmente marcadas e tornadas fluorescentes. Esse fato complica enormemente a identificação de moléculas e seus complexos na tomografia crioeletrônica, exceto no caso de complexos muito grandes de formas distintas.

Para lidar com essa limitação da tomografia crio-elétron, o Dr. Lučić e seus colaboradores estão atualmente buscando duas abordagens. Um deles consiste em analisar sinapses onde uma proteína é removida geneticamente. Isso fornece dicas sobre a identidade molecular das estruturas que estão faltando em comparação com as sinapses não modificadas. A segunda abordagem baseia-se no desenvolvimento de software livre de modelo para a detecção e classificação de complexos ligados à membrana em tomografia celular de crioeletron que contêm grande número de proteínas diferentes. Algumas das classes de proteínas obtidas com este método são suficientemente homogêneas para permitir a média usando os procedimentos disponíveis.

Este trabalho já levou a uma tentativa de identificação de alguns complexos de proteínas, com base em suas estruturas médias e localização celular, e é o primeiro passo para a aplicação da tomografia crioeletrônica para a detecção direta, localização e identificação de complexos de proteínas envolvidos na transmissão sináptica dentro de seu ambiente celular nativo.

ktsdesign / Shutterstock.com

Resposta pessoal

Em que campos, além de nossa compreensão fundamental da função cerebral, seu trabalho terá o maior impacto?

Embora este trabalho seja orientado por nosso interesse na transmissão sináptica, o método que desenvolvemos é mais geral. Pode ser aplicado a outros alvos celulares onde as vesículas desempenham um papel proeminente, como o transporte vesicular e o sistema secretor. Além disso, já estendemos nosso procedimento para analisar os complexos moleculares que fazem a ponte da fenda sináptica, ampliando assim a aplicabilidade a outros tipos de junções celulares, como as que se destacam na resposta imune e no desenvolvimento.


E.3a Comportamento Inato e Aprendido

Materiais de leitura: AA-SG 135 e AA-CC 306

Comportamento inato: comportamentos que são geneticamente programados e se desenvolvem independentemente do contexto ambiental. Por exemplo, movimento de Planaria flatworms em direção à comida é um comportamento inato.

Questão baseada em dados: quimiotaxia em piolhos

1. Um método para estimular o piolho a se mover para fora da seringa e para um dos braços é puxar o ar com cheiro de comida para um dos braços e puxar o ar sem cheiro para o outro braço. Os piolhos são atraídos pelo cheiro da comida e passam da seringa para o braço com ar perfumado. Outro método que testa outros sentidos do piolho é puxar ar aquecido em um braço e ar frio no outro.

2. Para todas as três espécies, a maioria dos invertebrados moveu-se para o braço com ar perfumado. O número de invertebrados coletados no braço com ar perfumado é quase o dobro do número de invertebrados coletados no braço com ar sem cheiro para as três espécies. No entanto, nem todos os invertebrados moviam-se para o braço com ar perfumado. Ainda há alguma proporção de invertebrados movendo-se para o braço sem cheiro.

3. Como o piolho da madeira respondeu ao cheiro, ele deve ter quimiorreceptor, um receptor que detecta o cheiro ligando-se a moléculas específicas.

4. a. Muitos piolhos foram atraídos para o braço perfumado do aparelho para se reproduzir. Para reproduzir as crias com sucesso, os piolhos precisam ir a locais onde possam encontrar a mesma espécie.

b. Tanto quanto a reprodução, a alimentação também é importante para os piolhos. Para diminuir a competição por comida, parte do piolho ia para o braço sem cheiro do aparelho. Além disso, alguns piolhos querem colocar os ovos em locais seguros, por isso podem ter evitado o braço perfumado.


6.5 - Nervos, hormônios e homeostase

o nervoso somático sistema inclui neurônios motores ligados aos músculos esqueléticos e os neurônios sensoriais ligados aos órgãos sensoriais receptores.

o sistema nervoso autónomo inclui os nervos dos receptores internos e os nervos ligados ao músculo liso.

6.5.2 & # 8211 Desenhe e rotule um diagrama da estrutura de um neurônio motor

6.5.3 & # 8211 Afirmam que os impulsos nervosos são conduzidos de receptores para o SNC por neurônios sensoriais, dentro do SNC por neurônios de retransmissão e do SNC para efetores por neurônios motores

O corpo contém muitos receptores que detectam específicos estímulos e convertê-los em um impulso nervoso. O sistema nervoso central conduz os impulsos nervosos dos nervos sensoriais ao longo dos neurônios sensoriais. Esse impulso é então passado para os neurônios de retransmissão que o passam pelo cérebro e pela espinha, depois para um neurônio motor e um efetor (como os músculos), onde a resposta é produzida.

6.5.4 & # 8211 Definir potencial de repouso e potencial de ação (despolarização e repolarização)

Potencial de repouso - Um potencial elétrico através de uma membrana celular quando não está conduzindo um impulso. Potencial de ação - A reversão localizada, ou despolarização, e então restauração, ou

Potencial de acção - A reversão localizada, ou despolarização e, em seguida, a restauração, ou repolarização, do potencial elétrico entre o interior e o exterior de um neurônio conforme o impulso se move ao longo dele

6.5.5 & # 8211 Explique como um impulso nervoso passa ao longo de um neurônio não mielinizado

Os impulsos nervosos se movem ao longo do axônio usando um efeito dominó, com um potencial de ação causando um na parte adjacente. Os íons sódio e potássio se movem através da membrana plasmática via transporte ativo para alterar a concentração e causar um potencial de ação e então retornar ao potencial de repouso.

Íons Na + são concentrado fora a membrana do axônio, enquanto os íons K + são concentrado dentro a membrana. Os canais de íons Na + e K + são fechado. Para que um potencial de ação seja criado, ele deve se elevar acima de um certo limiar antes que o potencial de ação seja criado.

Na + pressa para dentro a membrana e K + íon rush lá fora para reverter as concentrações. Os canais de íons Na + se abrem e se fecham quando os canais de íons K + se abrem. O interior agora tem uma carga líquida positiva, enquanto o exterior tem uma carga líquida negativa.

As bombas de íons usadas para criar o potencial de ação devem usar transporte Ativo enquanto eles estão movendo os íons contra o gradiente de concentração. Esse requer ATP para energia. A polarização da membrana muda durante este processo de -70mV no potencial de repouso para + 30mV no potencial de ação. Ele é restaurado para -70mV quando os canais de íons K + se abrem.

Depois que o neurônio é repolarizado, há um breve período em que essa seção do axônio não pode ter um potencial de ação, chamado de período refratário.

o lei tudo ou nada é que um impulso nervoso só será transmitido se atingir o limite de -55mV. Caso contrário, nenhum potencial de ação será criado. Se isso acontecer, será enviado um potencial de ação com a mesma voltagem de qualquer outro potencial de ação. Em um gráfico, todos os potenciais de ação parecem iguais, cada um aumentando para +35 mV.

6.5.6 & # 8211 Explicar os princípios da transmissão sináptica

o sinapse é a junção entre dois neurônios - o neurônio pré-sináptico passando o sinal para o neurônio pós-sináptico. A fenda sináptica é o espaço cheio de fluido entre um terminal de axônio e o final de um dendrito. Eles são o local de comunicação entre neurônios e glândulas ou músculos. Eles passam sinais elétricos ou químicos para suas células-alvo. Quando um potencial de ação atinge o final do neurônio, os canais de íons Ca + se abrem para permitir que o Ca + flua para dentro. exocitose de um neurotransmissor na fenda sináptica.

O neurotransmissor se difunde pela fenda sináptica e se liga a um receptor pós-sináptico. A membrana pós-sináptica torna-se polarizada, fazendo com que os canais de íons Na + se abram. Um potencial de ação é criado no neurônio pós-sináptico. A membrana pós-sináptica torna-se então despolarizado. Os canais de íons K + se abrem imediatamente para causar hiperpolarização da membrana pós-sináptica.

Um enzima liga-se ao neurotransmissor para hidrolisá-lo e prevenir funções futuras. É reciclado no corpo.

6.5.7 - Afirmar que o sistema endócrino consiste em glândulas que liberam hormônios que são transportados no sangue

O sistema endócrino também é chamado de sistema hormonal. Isso ocorre porque ele consiste em glândulas que liberam hormônios para nossas células para ajudar no funcionamento do organismo. Eles auxiliam na regulação do humor, crescimento e desenvolvimento, função dos tecidos, metabolismo, função sexual e processos reprodutivos. Enquanto o sistema nervoso controla os processos que acontecem rapidamente, como respiração e movimento, o sistema endócrino controla os processos mais lentos, como o crescimento celular.

Os hormônios, como mensageiros químicos do corpo, transferem informações circulando pela corrente sanguínea. As glândulas secretam hormônios que são transportados para outra parte do corpo. Os hormônios vão direto das glândulas para a corrente sanguínea e podem viajar para qualquer parte do corpo. No entanto, eles transmitirão mensagens apenas para as células a que se destinam.

6.5.8 - Afirmar que a homeostase envolve a manutenção do ambiente interno entre os limites, incluindo pH do sangue, concentração de dióxido de carbono, concentração de glicose no sangue, temperatura corporal e equilíbrio da água

A homeostase controla as variáveis ​​em nossos corpos para manter a saúde. O resultado de interromper isso é chamado de estresse, que levará à doença se não for corrigido. Essas variáveis ​​incluem concentração de glicose no sangue, pH do sangue, temperatura corporal, concentração de CO2 e balanço hídrico. Esses níveis são mantidos em níveis constantes dentro de limites estreitos.

6.5.9 - Explique que a homeostase envolve monitorar níveis de variáveis ​​e corrigir mudanças nos níveis por mecanismos de feedback negativo

Para todas as variáveis ​​controladas na homeostase, existe um ponto de ajuste em torno da qual o corpo flutua dentro de uma certa faixa. O feedback negativo é usado para retornar a variável ao seu ponto de ajuste.

O corpo tem muitos sensores que detectam e sinalizam quando a variável flutua a partir do ponto de ajuste. Esta informação é passada para o centro de controle para direcionar a ação que deve ser tomada para corrigir isso. o efetores são o mecanismo para retornar a variável ao seu ponto de ajuste, e eles ligam ou desligam sob a direção do centro de controle. o resposta é produzido pelo efetor.

As variáveis ​​mantidas pela homeostase incluem pH sanguíneo, concentração de CO2, concentração de glicose no sangue, temperatura corporal e balanço hídrico. O feedback negativo depende dos sistemas nervoso ou endócrino. Tem o efeito oposto de tentar estabilizar a variável de volta ao ponto de ajuste. No entanto, o feedback negativo só é acionado quando há um desvio significativo do ponto de ajuste.

6.5.10 - Explicar o controle da temperatura corporal, incluindo a transferência de calor no sangue, e as funções do hipotálamo, glândulas sudoríparas, arteríolas da pele e tremores

o hipotálamo, localizado no cérebro, e o córtex cerebral mantém a homeostase. O hipotálamo envia sinais para o glândula pituitária na forma de hormônios. A glândula pituitária então secreta o hormônio estimulante na corrente sanguínea para a glândula alvo, que por sua vez secreta seus hormônios. O hipotálamo e a glândula pituitária podem regular os níveis de hormônios no sangue. O processo usado para regular a temperatura é chamado de feedback negativo.

Em humanos, o ponto de ajuste da temperatura corporal é 37 ° C. O corpo detecta se o corpo vai acima ou abaixo disso usando sensores como o hipotálamo, receptores de calor da pele e receptores de frio da pele.

Resposta abaixo do ponto de ajuste:

Se a temperatura for inferior a 37 ° C, o sistema nervoso simpático tem uma resposta involuntária:

  • vasoconstrição para diminuir o fluxo sanguíneo para a pele para diminuir a perda de calor
  • metabolismo aumentado para aumentar a produção de calor
  • tremendo para aumentar a produção de calor
  • piloereção, ou arrepio, para diminuir a perda de calor

Além disso, o córtex cerebral direciona as seguintes respostas voluntárias:

  • descanso para diminuir a perda de calor
  • respostas comportamentais como roupas mais quentes, atividade muscular, bebida quente, enrolar-se e comer

Os efetores aumentarão a produção de calor e diminuirão a perda de calor até a temperatura atingir 37 ° C.

Resposta acima do ponto de ajuste:

Se a temperatura for superior a 37 ° C, o sistema nervoso simpático tem uma resposta involuntária para tentar aumentar a perda de calor:

  • metabolismo diminuído para diminuir a produção de calor
  • suando para aumentar a perda de calor
  • letargia para diminuir a produção de calor
  • pele arteríolas aumentam de diâmetro para aumentar a perda de calor
  • músculos esqueléticos relaxados para diminuir a produção de calor

Nossos corpos também têm algumas respostas voluntárias controladas pelo córtex cerebral:

  • descanso para diminuir a produção de calor
  • respostas comportamentais como bebidas geladas, roupas bacanas e abanar

Os efetores tentarão diminuir a produção de calor e aumentar a perda de calor até que a temperatura alcance 37 ° C

6.5.11 - Explicar o controle da concentração de glicose no sangue, incluindo as funções do glucagon, insulina e células aeb nas ilhotas pancreáticas

A concentração de glicose no sangue flutua ao longo do dia, geralmente de cerca de 4 a 8 milimoles dm-3. Usando feedback negativo, o corpo pode alterar a taxa na qual a glicose é absorvida pelo sangue. O ponto de ajuste para as concentrações de glicose no sangue é de cerca de 90 mg / 100 mL. O centro de controle para isso são as ilhotas pancreáticas.

As células beta nas ilhotas pancreáticas produzem insulina, a substância química que estimula a captação de glicose do sangue para a conversão em glicogênio ou para a respiração. Isso reduz a concentração de glicose no sangue.

A insulina se liga a receptores no músculo e nas células do fígado para permitir que a glicose passe do sangue para as células. A glicose é metabolizada ou armazenada. Isso continua até que a concentração esteja no ponto de ajuste.

As células alfa nas ilhotas pancreáticas produzem o glucagon químico, estimulando as células do fígado a converter glicogênio em glicose. Como resultado, a concentração de glicose no sangue aumenta.

O glucagon se liga aos receptores das células do fígado para ativar enzimas que transformam o glicogênio em glicose. A glicose passa para o sangue até que a concentração esteja no ponto definido.

6.5.12 - Distinguir entre diabetes tipo I e tipo II

Pessoas com diabetes apresentam níveis de glicose no sangue muito altos. A glicose não consegue passar do sangue às células para fornecer energia.


Discussão

As sinapses excitatórias do SNC são centrais para as funções cerebrais, mas sua estrutura ainda não é bem conhecida. Sua fenda é mais frequentemente considerada um espaço extracelular aquoso não estruturado. Muitas observações mostraram que a realidade é bem diferente, mas nenhum consenso ainda foi alcançado sobre a estrutura dos vários elementos sinápticos. Na fenda, observou-se uma placa central densa, fibrilas paralelas às membranas e fibras transsinápticas desorganizadas ou periodicamente dispostas, dependendo das condições de preparo (2, 9-11).

Em nosso estudo, as sinapses estão em melhor estado de preservação: vitrificamos fatias organotípicas vivas do hipocampo de ratos e as observamos hidratadas e sem coloração. A agregação molecular é minimizada e a densidade óptica observada da imagem se correlaciona diretamente com a densidade da matéria na amostra (7). Idealmente, o tecido nervoso deve ser criofixado sem qualquer crioprotetor, como tem sido feito para a cartilagem e a pele (26-28, 33). Infelizmente, esse processo ainda não foi possível. No entanto, mostramos por microscopia eletrônica convencional que a estrutura da sinapse não é visivelmente afetada por uma breve incubação em 20% de dextrano osmoticamente não ativo, suplementado com a quantidade mínima de 5% de sacarose. Além disso, os registros da atividade sináptica evocada não mostram modificações duradouras após o tratamento com o crioprotetor, demonstrando que as fatias organotípicas do hipocampo permanecem vivas e as sinapses permanecem funcionais. Também devemos ter em mente que, mesmo que a vitrificação seja ordens de magnitude mais rápida do que a fixação química, leva em torno de 10 ms para imobilizar a amostra (27). Esta duração não é desprezível em comparação com eventos sinápticos. Além disso, a aplicação repentina de alta pressão pode influenciar as estruturas sinápticas.

As sinapses excitatórias e inibitórias diferem em vários aspectos, em particular, as primeiras são maiores que as últimas (2). Com base nesse critério, todas as sinapses mostradas no presente estudo são provavelmente do tipo excitatório. A característica mais notável que observamos é a organização periódica de 8,2 nm dos complexos de fenda. Como esperado, ele é observado apenas em uma minoria das sinapses porque deve ter a orientação correta, mas nossa observação é compatível com sua presença em todas as sinapses. Como as micrografias do CEMOVIS são feitas pela sobreposição de recursos acima de 70 nm, é difícil interpretar a organização 3D dos complexos periódicos. O motivo repetido pode ser uma única camada ou vários filamentos sobrepostos. Em qualquer caso, eles devem ser organizados regularmente. Embora a identidade dos complexos não possa ser declarada, vários dados sugerem que eles podem ser feitos de uma variedade de moléculas de adesão, que são amplamente expressas na sinapse (3). A partir do mapa atômico de duas moléculas de adesão homofílicas, N-caderina (4) e molécula de adesão de células neurais (5), uma organização de zíper mantendo as membranas pré e pós-sinápticas alinhadas foi hipotetizada (4, 5). O período esperado é de ± 7,5 nm para N-caderina e ± 8 nm para a molécula de adesão de células neurais. Nossas observações são compatíveis com este modelo. Além disso, o centro da fenda é mais denso, sugerindo que as moléculas provenientes de ambas as membranas plasmáticas se sobrepõem para fechar o zíper. Recentemente, Lucic et al. (34) observaram sinaptossomas isolados em fina camada vitrificada. Um modelo 3D da fenda foi reconstruído e revela uma rede molecular mais complexa e altamente conectada. Danos estruturais ou perda de material associados à preparação dos sinaptossomas podem explicar a diferença com nossas observações.

A estrutura do desmossomo da pele, uma junção célula-célula baseada na caderina, foi recentemente revelada pelo CEMOVIS (26). Seu componente extracelular é caracterizado por uma estrutura transversal reta periódica de 5 nm, que parece mais regular do que os complexos de fenda sináptica. Essa diferença é consistente com a menor diversidade de proteínas desmossomais e com o fato de que as sinapses não só têm propriedades adesivas para manter os elementos pré-sinápticos e pós-sinápticos alinhados, mas também possuem funções mais elaboradas e dinâmicas. Assim, podemos conceber modificações sutis da estrutura da fenda sináptica, em relação à plasticidade sináptica. Outra questão importante é o destino da estrutura da fenda organizada em relação à fusão da VS com a membrana plasmática pré-sináptica. Dependendo do modelo considerado (kiss-and-run ou fusão completa), esse evento pode gerar uma movimentação considerável de fosfolipídios, que devem ser acomodados com a estrutura na fenda.

O CEMOVIS torna possível determinar a densidade real até mesmo dos menores compartimentos de células. Revela que a concentração de material na fenda é maior do que no citoplasma. Essa observação definitivamente torna obsoleta a concepção difundida de um simples prolongamento do espaço extracelular. Consequentemente, os neurotransmissores podem não ser capazes de se difundir tão livremente como se pensava anteriormente, e modelos baseados em simulação de computador terão que incorporar esses dados (35-37). Da mesma forma, a difusão do receptor do neurotransmissor pós-sináptico, que está implícita na plasticidade sináptica (38), pode ser afetada pelos complexos organizados.

Grânulos ou fibras pré-sinápticas são freqüentemente observados próximos aos VSs e à membrana plasmática. Eles poderiam fazer parte da matriz citoesquelética montada na zona ativa de liberação do neurotransmissor (39). Em imagens 2D, é difícil caracterizar essas estruturas com mais precisão, mas nossos dados comprovam que essas estruturas existem e aumentam a esperança de que a tomografia de seções vítreas permitirá sua caracterização detalhada. Atualmente, problemas técnicos ainda impedem o uso rotineiro da tomografia de cortes vítreos, mas resultados animadores já foram publicados por Lucic. et al. (34) e Hsieh et al. (40).

As densidades pós-sinápticas podem ser classificadas em duas categorias. O primeiro é representado por um desbotamento da densidade ao longo de algumas dezenas de nanômetros. Corresponde à densidade pós-sináptica descrita com microscopia eletrônica convencional (Figs. 3 e 4, refs. 2 e 13). A segunda categoria é formada por uma folha de 5 nm de espessura (Fig. 5 F e G ) É necessária mais investigação para definir a natureza e o papel desta ficha. Dosemeci et al. (41) mostraram que a atividade sináptica leva a um espessamento transitório da densidade pós-sináptica. Conseqüentemente, podemos especular que as duas formas observadas podem corresponder a dois estados funcionais diferentes. Alternativamente, eles podem representar duas classes distintas de sinapses.

As dimensões de vários recursos parecem maiores com o CEMOVIS do que com a microscopia eletrônica convencional. Por exemplo, o diâmetro médio de SVs é de 37,7 nm no estado hidratado, enquanto em seções desidratadas convencionais está entre 30,4 e 35,2 nm (42, 43). Da mesma forma, a largura da fenda das sinapses excitatórias é de ≈20 nm nas seções convencionais (2, 43), enquanto nas criosseções é de 23,8 nm. Este resultado é consistente com a fenda de 24,2 nm de largura de sinapses isoladas estudadas por tomografia crioeletrônica (34). As dimensões obtidas com os criométodos devem ser consideradas mais próximas da realidade, pois, ao contrário dos métodos convencionais, não requerem desidratação, de forma que a agregação molecular e posterior retração sejam minimizadas (6, 7, 16).

No futuro, esperamos que as melhorias no congelamento de alta pressão e nas técnicas mais refinadas de biópsia tornem possível vitrificar pequenos pedaços de tecido nervoso sem a necessidade de qualquer crioprotetor. Além disso, a tomografia de seções vítreas, associada ao processamento computadorizado de imagens, como docking de proteínas de estruturas atômicas conhecidas nos tomogramas, levará a um mapa molecular de ciclos bioquímicos sinápticos e vias de sinalização e capturará complexos transitórios que não puderam ser revelados por qualquer outra média (44).


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101 S. Hanley Rd, Suíte 300
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Parte 2: Reciclagem de vesículas sinápticas: endocitose ultrarrápida

00: 00: 0722 Oi. Sou Erik Jorgensen, da Universidade de Utah.
00: 00: 1112 Bem-vindo à parte 2 da reciclagem de vesículas sinápticas.
00: 00: 1604 E então, o que eu gostaria de falar sobre hoje é sobre
00: 00: 1803 a descoberta da endocitose ultrarrápida.
00: 00: 2100 Então, no último vídeo,
00: 00: 2308 falamos sobre a descoberta de
00: 00: 2509 exocitose da vesícula sináptica,
00: 00: 2801 que foi proposto por Bernard Katz,
00: 00: 2909 e foi então realmente comprovado
00: 00: 3024 pelo trabalho de Heuser e Reese,
00: 00: 3224 usando microscopia eletrônica.
00: 00: 3511 E então John Heuser e Tom Reese
00: 00: 3707 continuou esses experimentos
00: 00: 3817 e descobri que havia
00: 00: 4214 reciclagem de vesículas sinápticas por meio de endocitose na sinapse.
00: 00: 4514 E as conclusões a que chegaram foi que
00: 00: 4811 este é um processo mediado por clatrina
00: 00: 4924 e levou cerca de 30 segundos,
00: 00: 5120 por isso foi um processo relativamente lento.
00: 00: 5407 Mas as imagens eram lindas
00: 00: 5522 e é inquestionável que este
00: 00: 5901 ocorre nas sinapses.
00: 01: 0010 o que eu gostaria de falar sobre hoje,
00: 01: 0121 na segunda parte,
00: 01: 0308 é que existe outro mecanismo
00: 01: 0515 que está atuando nas sinapses,
00: 01: 0715 e que isso está agindo em uma escala de tempo muito rápida,
00: 01: 1005 entre 30-50 milissegundos,
00: 01: 1207 então cerca de 1000 vezes mais rápido
00: 01: 1410 do que o que foi visto por meio de endocitose mediada por clatrina.
00: 01: 1711 E então vou falar sobre
00: 01: 2005 nossos experimentos em vermes e em camundongos,
00: 01: 2122 e então, no final,
00: 01: 2308 Vou conciliar o trabalho de Heuser e Reese
00: 01: 2521 com endocitose ultrarrápida.
00: 01: 2813 Então, o que escolhemos fazer foi
00: 01: 3200 faça nossos estudos em um nematóide,
00: 01: 3322 uma pequena lombriga, chamada C. elegans.
00: 01: 3604 E a vantagem disso é que
00: 01: 3800 há muitos mutantes disponíveis,
00: 01: 3913 para que você possa estudar os processos
00: 01: 4102 e causar defeitos neles,
00: 01: 4214 e veja como os mecanismos moleculares
00: 01: 4410 trabalham para reciclar vesículas sinápticas,
00: 01: 4722 mas o que é importante para os experimentos
00: 01: 4913 Vou falar sobre hoje
00: 01: 5024 é que o nematóide é transparente.
00: 01: 5303 então, você. uma luz.
00: 01: 5519 é perfeitamente transparente à luz,
00: 01: 5716 e isso é importante porque
00: 01: 5914 vamos usar estimulação optogenética
00: 02: 0110 do sistema nervoso.
00: 02: 0223 E assim, voltamos à cena do crime.
00: 02: 0525 falamos sobre alguns desses experimentos
00: 02: 0725 de Heuser e Reese
00: 02: 0905 foi feito no Laboratório Biológico Marinho
00: 02: 1108 em Woods Hole,
00: 02: 1318 em 1973. a partir de 1973,
00: 02: 1506 e os experimentos que vou falar sobre
00: 02: 1711 começou em 2008
00: 02: 1903 do nosso trabalho, Shigeki Watanabe
00: 02: 2208 e meu trabalho na MBL.
00: 02: 2603 Então, o que queríamos fazer era estimular,
00: 02: 2726 mas não queríamos usar estimulação elétrica
00: 02: 2911 porque queríamos fazer isso em um animal inteiro,
00: 02: 3110 em um animal que não foi dissecado
00: 02: 3405 e não tivemos que remover os nervos
00: 02: 3522 e prenda-os a fios estimulantes.
00: 02: 3719 Então, a maneira de fazer isso é usar
00: 02: 3922 canais de íons ativados por luz.
00: 02: 4127 Então, há uma alga unicelular
00: 02: 4418 chamada Chlamydomonas
00: 02: 4523 e tem fototaxia,
00: 02: 4800 o que significa que nada para uma fonte de luz.
00: 02: 4919 E a razão de fazer isso é
00: 02: 5210 tem um canal de íons ativado por luz,
00: 02: 5320 então você pisca com luz
00: 02: 5526 e isso abre um canal iônico
00: 02: 5719 e isso, porque é DNA
00: 03: 0008 e o código é universal,
00: 03: 0112 podemos cortar o DNA de Chlamydomonas
00: 03: 0514 e coloque-o em um nematóide.
00: 03: 0704 E isso é mostrado aqui.
00: 03: 0816 Então, o que fizemos foi
00: 03: 1015 colocar o canal rodopsina no
00: 03: 1218 neurônios motores de acetilcolina
00: 03: 1414 que impulsiona a contração dos músculos,
00: 03: 1621 e aqui temos. o canal rodopsina é mostrado,
00: 03: 2005 e aqui está um neurônio colinérgico
00: 03: 2202 que expressa o canal rodopsina.
00: 03: 2425 Então agora, o que podemos fazer é
00: 03: 2626 podemos remendar um músculo
00: 03: 2829 e registre a atividade do músculo.
00: 03: 3107 Isso significa que estamos gravando
00: 03: 3326 atividade pós-sináptica
00: 03: 3509 que vem do neurônio motor.
00: 03: 3624 Então, sempre que o neurotransmissor é liberado,
00: 03: 3817 que causará uma despolarização
00: 03: 4123 ou uma corrente nesses músculos.
00: 03: 4500 Então, agora o que podemos fazer é piscar uma luz,
00: 03: 4800 e quando aquela luz ativa esse neurônio motor,
00: 03: 4929 então vemos [neurotransmissores]
00: 03: 5216 sendo lançado aqui na sinapse,
00: 03: 5229 e então podemos registrar essa atividade
00: 03: 5513 usando esta pipeta de patch.
00: 03: 5702 E esses resultados são mostrados aqui.
00: 03: 5903 E isso é realmente lindo,
00: 04: 0110 porque quando estávamos usando estimulação elétrica
00: 04: 0301 em preparações dissecadas,
00: 04: 0407 descobrimos que os neurônios muitas vezes morriam,
00: 04: 0622, mas eles podem responder a
00: 04: 0826 trens de estímulos luminosos muito robustos.
00: 04: 1017 Então, aqui, estamos usando
00: 04: 1214 um trem de 30 segundos de estímulo de luz de 10 Hz,
00: 04: 1511 e você pode ver que o celular está respondendo
00: 04: 1819 muito bem para isso
00: 04: 2009 - isso significa que o neurônio motor está liberando neurotransmissor
00: 04: 2211 toda vez que vê um pulso de luz.
00: 04: 2606 Então, isso é ótimo,
00: 04: 2800 podemos estimular um animal inteiro
00: 04: 3006 e liberar neurotransmissor,
00: 04: 3206 mas como vamos capturar esse evento?
00: 04: 3506 E então estamos pegando emprestada uma página
00: 04: 3723 de Heuser e Reese,
00: 04: 3907 e vamos congelar essa amostra
00: 04: 4103 o mais rápido que podemos
00: 04: 4226 após o início de uma transmissão sináptica,
00: 04: 4607 e por isso um freezer de alta pressão.
00: 04: 4719 E estes dispositivos são realmente maravilhosos.
00: 04: 5002 Eles vão de 1 a 2.000 atmosferas em 15 milissegundos,
00: 04: 5408 e o que isso faz é isso. moléculas de água,
00: 04: 5720 se você esfriar algo lentamente,
00: 05: 0018 irá reorganizar e, em seguida, formar cristais de gelo,
00: 05: 0224 e esses cristais de gelo vão quebrar uma célula
00: 05: 0522 ou eles criarão.
00: 05: 0710 eles vão excluir solutos e sais,
00: 05: 1117 e isso criará regiões hipertônicas,
00: 05: 1321 e assim a água fluirá para a região hipertônica
00: 05: 1612 e também explodir a célula.
00: 05: 1902 Então, durante o congelamento lento,
00: 05: 2028 há muitos danos nos tecidos.
00: 05: 2422 Mas se você pudesse fazer isso sob alta pressão atmosférica,
00: 05: 2800 as moléculas de água não têm tempo para se reorganizar
00: 05: 3025 - eles são lentos -
00: 05: 3029 e você baixa a temperatura,
00: 05: 3601 e as moléculas de água simplesmente param no lugar.
00: 05: 3804 Isso é chamado de gelo vítreo, porque não é organizado em
00: 05: 4000 uma forma cristalina.
00: 05: 4300 Então, o que isso nos permite fazer. então, vamos do ambiente.
00: 05: 4421 então, da temperatura ambiente, 22 graus,
00: 05: 4722 a -50 graus centígrados
00: 05: 4920 em 10 milissegundos,
00: 05: 5029 e isso nos permite
00: 05: 5228 para congelar até 200 mícrons de profundidade
00: 05: 5503 sem formação de cristais de gelo
00: 05: 5628 e sem qualquer destruição do tecido.
00: 05: 5913 Então, o que fazemos depois disso é
00: 06: 0207 colocamos aquela amostra que está a -90 graus,
00: 06: 0407 que é o que fazemos,
00: 06: 0522 e colocamos em fixador, em acetona.
00: 06: 0726 E então as moléculas de água
00: 06: 0918 saia devagar
00: 06: 1023 e são trocados por acetona,
00: 06: 1218 e transportando com a acetona são
00: 06: 1618 fixadores, como ósmio.
00: 06: 1816 Então, como fizemos essa estimulação de luz funcionar
00: 06: 2217 é mostrado aqui.
00: 06: 2323 Então, normalmente, é.
00: 06: 2615 mostrado aqui em amarelo, é o porta-amostra,
00: 06: 2818 o copo de amostra,
00: 06: 3004 e assim nossos vermes serão mantidos neste pequeno local aqui.
00: 06: 3301 E a pressão vem deste êmbolo,
00: 06: 3616 aqui mesmo,
00: 06: 3808 que bate na amostra
00: 06: 4009 contra uma bigorna de diamante negro,
00: 06: 4126 e é assim que criamos pressão.
00: 06: 4326 Mas, nessas circunstâncias
00: 06: 4526 não há caminho de luz para a amostra,
00: 06: 4713 então o que fizemos foi substituir aquela bigorna de diamante negro
00: 06: 5012 com uma bigorna safira, mostrada aqui,
00: 06: 5217 perfuramos aquele parafuso de montagem, mostrado aqui,
00: 06: 5510 e nós perfuramos aquela baioneta, aqui,
00: 06: 5719 e então montamos um LED
00: 07: 0010 diretamente atrás daquela bigorna safira,
00: 07: 0300 então agora tínhamos um caminho claro para o copo de amostra.
00: 07: 0701 Então, agora podemos estimular essa amostra
00: 07: 0925 em qualquer ponto antes de congelá-los.
00: 07: 1313 E então, isso é mostrado aqui.
00: 07: 1514 então, meu aluno de graduação, Shigeki Watanabe,
00: 07: 1700 montou a amostra,
00: 07: 1808 e aqui está o porta-espécime bem ali,
00: 07: 2006 aqui está a baioneta
00: 07: 2212 e você pode ver o fio que sai,
00: 07: 2323 e esse fio vai para um computador, aqui,
00: 07: 2522 que controlará quando estimulamos o LED,
00: 07: 3016 pouco antes do congelamento.
00: 07: 3125 Então, o que você verá é que
00: 07: 3313 Shigeki vai montar isso em um trenó
00: 07: 3523 e aquele trenó irá correr por um trilho
00: 07: 3717 para a câmara de alta pressão, aqui, no final.
00: 07: 3921 E então, neste caso
00: 07: 4125 vamos estimular antes de atirar para baixo,
00: 07: 4406 mas você pode estimulá-lo a qualquer momento
00: 07: 4520 que está passando ao longo do trilho
00: 07: 4712 para a câmara de alta pressão.
00: 07: 4821 Então, vamos apenas assistir a este vídeo.
00: 07: 5124 Então, Shigeki montou o pod
00: 07: 5416 que mantém a amostra no copo de amostra na baioneta,
00: 07: 5721 e a baioneta está aqui no trenó.
00: 08: 0019 então, o que vai acontecer agora é
00: 08: 0321 ele vai ativar o computador,
00: 08: 0516 e você verá piscando, bem aqui - está vendo isso piscando?
00: 08: 0900 Agora, ele vai derrubar o trilho,
00: 08: 1026 boom e, em seguida, para a câmara de alta pressão.
00: 08: 1227 sshppoosstt.
00: 08: 1413 certo, então 2.000 atmosferas,
00: 08: 1528, a amostra está congelada,
00: 08: 1719 e cai em nitrogênio líquido, aqui.
00: 08: 1904 Então, agora podemos remover essa amostra
00: 08: 2023 do nitrogênio líquido
00: 08: 2211 e podemos colocá-lo nesta fixação de substituição congelada.
00: 08: 2712 Então, o que gostaríamos de fazer primeiro
00: 08: 2916 é determinar onde e quando
00: 08: 3122 exocitose ocorre,
00: 08: 3302 então, nestes experimentos
00: 08: 3504 o que estamos fazendo é mostrar a vocês
00: 08: 3618 uma corrente causada por uma estimulação elétrica
00: 08: 3823 do neurônio motor,
00: 08: 4011 e aqui está o nosso estímulo de luz,
00: 08: 4322 e então o que vamos fazer é congelar 20 milissegundos depois,
00: 08: 4619 enquanto ainda houver essa transmissão sináptica em andamento.
00: 08: 5123 Então, o que vemos?
00: 08: 5415 Então, primeiro, uma pequena lição de anatomia.
00: 08: 5527 Então, o que você tem aqui é
00: 08: 5802 uma micrografia eletrônica de uma junção neuromuscular de C. elegans,
00: 09: 0015 e mostrado em vermelho, aqui,
00: 09: 0229 é a projeção densa.
00: 09: 0408 Isso marca o centro da sinapse
00: 09: 0606 e é onde estão os canais de cálcio.
00: 09: 0814 Então, quando a sinapse é animada,
00: 09: 1010 cálcio fluirá através desta projeção densa
00: 09: 1303 e pode ativar,
00: 09: 1429 ou causar a fusão de vesículas que estão próximas.
00: 09: 1707 Então, a outra estrutura que você pode notar
00: 09: 2016 são as junções aderentes,
00: 09: 2200 então, aqui está uma junção aderente aqui e aqui,
00: 09: 2402 e marcam as bordas da zona ativa.
00: 09: 2722 A zona ativa define onde as vesículas se fundem,
00: 09: 3102 para que você possa ver as vesículas encaixadas
00: 09: 3224 que agora estão destacados em azul,
00: 09: 3425 e vesículas que são capazes de fusão
00: 09: 3713 são mostrados ao longo de toda a superfície,
00: 09: 4017 então, em qualquer lugar entre a junção aderente
00: 09: 4301 e a projeção densa,
00: 09: 4412 essas vesículas podem fundir quando são estimuladas.
00: 09: 4703 Deixe-me mostrar algumas dessas imagens.
00: 09: 4922 Então, aqui você vê vesículas que foram.
00: 09: 5126 estão em processo de fusão com a membrana
00: 09: 5423 e colapsando na membrana plasmática.
00: 09: 5705 Então, mostrado aqui
00: 09: 5909 é uma daquelas vesículas
00: 10: 0023 que não se fundiu ou achatou muito,
00: 10: 0228 aqui está um que está achatando,
00: 10: 0402 e aqui está um.
00: 10: 0614 ali mesmo.
00: 10: 0726 e apenas este veja que este acabou de achatar
00: 10: 1005 quase completamente na membrana.
00: 10: 1115 Então, são 20 milissegundos após a estimulação.
00: 10: 1413 Então, o que queríamos saber é
00: 10: 1609 onde ocorre a endocitose,
00: 10: 1711 e quão logo após a estimulação.
00: 10: 1925 Então, o que descobrimos é que
00: 10: 2204 existem dois lugares
00: 10: 2408, onde ocorre a endocitose da vesícula sináptica.
00: 10: 2518 Ocorre nas bordas da zona ativa,
00: 10: 2723, portanto, não dentro da zona ativa.
00: 10: 2922 Então, ocorre, aqui,
00: 10: 3110 na borda da projeção densa,
00: 10: 3229 ou ocorre aqui e aqui,
00: 10: 3518 nas junções aderentes,
00: 10: 3819 então, nas bordas das junções aderentes.
00: 10: 4009 E esses são mostrados aqui.
00: 10: 4115 Então, estou apenas mostrando a endocitose
00: 10: 4326 que está ocorrendo na projeção densa, aqui,
00: 10: 4626 e por isso foi apenas ligeiramente manchado com esta cor vermelha.
00: 10: 4914 E você pode ver aqui que há
00: 10: 5206 uma invaginação rasa,
00: 10: 5313 e então este,
00: 10: 5425 esta vesícula endocítica já foi cortada
00: 10: 5618 da membrana,
00: 10: 5811 e então, eventualmente,
00: 11: 0004 o que essas vesículas fazem é que
00: 11: 0201 eles irão migrar para o interior do botão sináptico,
00: 11: 0423 longe do local de lançamento.
00: 11: 0729 Então, aí estão as nossas vesículas
00: 11: 1006 que foram endocitados.
00: 11: 1317 Então, o importante, aqui, é que
00: 11: 1603 o local de [endocitose] não é o local de fusão,
00: 11: 1829 que a endocitose está ocorrendo nas bordas laterais
00: 11: 2027 da zona ativa.
00: 11: 2308 Então, o problema é, com que rapidez isso ocorre?
00: 11: 2515 E ocorre de forma extremamente rápida
00: 11: 2726 após esse estímulo.
00: 11: 2913 Então, aqui, aquela invaginação superficial
00: 11: 3121 foi de 20 milissegundos após a estimulação,
00: 11: 3427 esta grande vesícula tem 50 milissegundos
00: 11: 3710 após a estimulação,
00: 11: 3818 e então aqui vemos que as vesículas
00: 11: 4016 estão começando a translocar
00: 11: 4201 no centro do [botão sináptico]
00: 11: 4403 100 milissegundos após a estimulação.
00: 11: 4628 Então, aqui está a quantificação disso,
00: 11: 4913 e isso é importante porque temos boa resolução temporal
00: 11: 5125 para demonstrar que este é um produto,
00: 11: 5425 uma relação precursor-produto
00: 11: 5624 entre cada uma dessas etapas.
00: 11: 5825 Então, nós vemos esses poços,
00: 12: 0018 eles atingem o pico em 20 milissegundos.
00: 12: 0227 Vemos que existem essas vesículas grandes,
00: 12: 0618 eles atingem o pico em 50 milissegundos.
00: 12: 0827 E então vemos essas vesículas
00: 12: 1016 que estão começando a translocar
00: 12: 1215 no centro do [botão],
00: 12: 1400 e esse pico em 300 milissegundos.
00: 12: 1520 Então, sabemos que este é o processo
00: 12: 1724 através do qual a membrana está passando.
00: 12: 2105 Vemos que as primeiras vesículas grandes
00: 12: 2305 aparecem em 30 milissegundos,
00: 12: 2415 então é quando a endocitose,
00: 12: 2602 a membrana está realmente sendo clivada,
00: 12: 2718 e os últimos poços acabaram em 50 milissegundos.
00: 12: 3116 Então, o período de tempo durante o qual a endocitose
00: 12: 3324 está realmente acontecendo
00: 12: 3604 é 30-50 milissegundos.
00: 12: 4025 Então, esse processo está demorando cerca de 1000 vezes.
00: 12: 4328 está [indo] cerca de 1000 vezes mais rápido
00: 12: 4619 do que a endocitose mediada por clatrina.
00: 12: 4927 Então, em vez de 30 segundos para endocitose mediada por clatrina,
00: 12: 5212 vemos 30-50 milissegundos
00: 12: 5605 para endocitose ultrarrápida.
00: 12: 5726 Então, parece haver um mecanismo muito rápido
00: 12: 5914 que também funciona nas sinapses.
00: 13: 0227 Então, isso demonstrou
00: 13: 0529 que este processo funciona no nematóide,
00: 13: 0725 e agora gostaria de falar sobre
00: 13: 0915 algum trabalho que demonstra
00: 13: 1103 que este processo também ocorre
00: 13: 1315 nas sinapses do mouse.
00: 13: 1429 Então, fizemos nosso trabalho no nematóide, C. elegans,
00: 13: 1804 e é possível que este seja um organismo incomum,
00: 13: 2207 que talvez tenha uma forma acelerada de endocitose
00: 13: 2601 que não é conservado entre outros organismos.
00: 13: 2923 E então, para testar isso,
00: 13: 3108 precisávamos olhar para outro organismo,
00: 13: 3224 aquele que é mais comumente usado
00: 13: 3523 como um organismo de laboratório
00: 13: 3818 que replica o que pode estar acontecendo nas sinapses humanas,
00: 13: 4101 e esse é o mouse.
00: 13: 4213 E para fazer este trabalho,
00: 13: 4414 trabalhamos com Christian Rosenmund
00: 13: 4524 no Charité em Berlim,
00: 13: 4726 e eu tenho que fazer uma grande chamada,
00: 13: 4924 um grito para Christian,
00: 13: 5126 esta foi a ideia dele.
00: 13: 5310 Christian disse, por que você não vem para Berlim
00: 13: 5515 e traga suas amostras e seu dispositivo
00: 13: 5816 e faremos os experimentos
00: 14: 0027 nos neurônios do hipocampo
00: 14: 0316 que foram cultivados em pratos.
00: 14: 0607 E então eu trouxe meu aluno de pós-graduação,
00: 14: 0811 Shigeki Watanabe,
00: 14: 0924 e então o que ele fez foi realizar uma morfometria
00: 14: 1220 em mais de 10.000 sinapses,
00: 14: 1426 e então a razão pela qual precisávamos fazer isso
00: 14: 1716 foi para obter diferenças estatísticas
00: 14: 1925 em cada um desses pontos de tempo,
00: 14: 2117 e deixe-me mostrar esses dados.
00: 14: 2420 Então, mais uma vez, estamos estimulando
00: 14: 2618 com canal-rodopsina.
00: 14: 2721 E para que possamos levar nosso
00: 14: 3119 neurônios do hipocampo em cultura do cérebro de camundongo
00: 14: 3329 e depois infectá-los com um vírus
00: 14: 3613 que expressa o gene channelrodopsina,
00: 14: 3927 e então podemos fazer a proteína,
00: 14: 4229 e agora podemos estimular com luz.
00: 14: 4521 E aqui está um neurônio do hipocampo em uma placa,
00: 14: 4627 está expressando canal-rodopsina,
00: 14: 4809 nós o estimulamos,
00: 14: 4913 e a estimulação de luz é mostrada aqui em azul, certo?
00: 14: 5329 Então, esta é a estimulação de 10 milissegundos,
00: 14: 5608 e nesta imagem você pode ver que
00: 14: 5822 havia dois potenciais de ação
00: 15: 0010 que foram causados ​​por esta estimulação de luz.
00: 15: 0325 E isso ocorre muito rapidamente
00: 15: 0610 após o início da estimulação luminosa,
00: 15: 0724 apenas 5 milissegundos,
00: 15: 0924 e é altamente robusto.
00: 15: 1125 Então, apenas 12% das vezes vemos
00: 15: 1406 uma falha de um potencial de ação.
00: 15: 1515 Portanto, gostaríamos de demonstrar agora
00: 15: 1800 que isso realmente causa a transmissão sináptica,
00: 15: 2122 e para isso temos uma célula que é
00: 15: 2326 não expressando canal-rodopsina,
00: 15: 2612 então não haverá resposta de luz nessa célula.
00: 15: 2808 A única resposta leve que terá
00: 15: 3204 virá da célula pré-sináptica
00: 15: 3405 expressando canal-rodopsina.
00: 15: 3513 Então, agora podemos piscar a luz,
00: 15: 3624 que ativa essa célula pré-sináptica,
00: 15: 3904 e então vemos essas correntes pós-sinápticas
00: 15: 4213 nesta célula, aqui.
00: 15: 4424 Então, você pode ver que, neste caso,
00: 15: 4615 aqui está o estímulo de luz, mostrado em azul,
00: 15: 4919 e, mais uma vez, havia dois potenciais de ação
00: 15: 5212 nesta amostra.
00: 15: 5402 E esta é uma corrente pós-sináptica, mostrada aqui,
00: 15: 5523 e sabemos que esta é uma corrente sináptica
00: 15: 5708 porque podemos bloqueá-lo com um medicamento chamado TTX,
00: 16: 0026 e o ​​TTX bloqueia os potenciais de ação.
00: 16: 0312 Então, se você bloquear o potencial de ação nesta célula pré-sináptica,
00: 16: 0610 você não tem transmissão sináptica.
00: 16: 1115 E se você bloquear os receptores
00: 16: 1309 para os neurotransmissores
00: 16: 1501 na célula pós-sináptica, bem aqui,
00: 16: 1705, também não vemos resposta.
00: 16: 1826 Então, isso demonstra que estes são
00: 16: 2121 eventos sinápticos genuínos.
00: 16: 2501 Então, mais uma vez, o que gostaríamos de fazer
00: 16: 2714 é determinar a velocidade de exocitose
00: 16: 2919 e a velocidade da endocitose.
00: 16: 3205 Então, nós estimulamos com luz,
00: 16: 3418 novamente, mostrado em azul,
00: 16: 3525 e então podemos congelar em 15 milissegundos,
00: 16: 3808 30 milissegundos,
00: 16: 3915 50 milissegundos,
00: 16: 4025 100 milissegundos,
00: 16: 4209 e assim por diante.
00: 16: 4318 E assim, para cada um desses experimentos,
00: 16: 4506 analisamos 200 sinapses
00: 16: 4706 para ver se poderíamos ver os eventos.
00: 16: 4926 Então, deixe-me apenas dar-lhe, de novo,
00: 16: 5111 uma lição de anatomia sobre o
00: 16: 5404 sinapse do hipocampo de camundongo,
00: 16: 5525 e então o que você pode ver aqui é uma piscina de vesículas
00: 16: 5900 que representa o reservatório de vesículas.
00: 17: 0312 E então há vesículas que são
00: 17: 0518 ancorado na membrana, mostrado aqui,
00: 17: 0806 e eles podem liberar ao longo de todo o rosto,
00: 17: 0922 então aquele rosto, aquela região,
00: 17: 1113 é chamada de zona ativa.
00: 17: 1229 É uma zona que está ativa, certo? as vesículas se fundem.
00: 17: 1605 Do outro lado está a densidade pós-sináptica,
00: 17: 1915 e o que é essa densidade pós-sináptica.
00: 17: 2220 o posicionamento dos canais iônicos,
00: 17: 2427 canais de íons controlados por ligante,
00: 17: 2710 que irá responder ao neurotransmissor sendo liberado.
00: 17: 3001 Neste caso, é glutamato,
00: 17: 3122 então, o glutamato é o neurotransmissor
00: 17: 3318 que abrirá canais de íons controlados por ligante,
00: 17: 3601 e então haverá uma corrente nessa célula pós-sináptica.
00: 17: 3819 Então, eles são facilmente identificáveis
00: 17: 4109 nessas micrografias eletrônicas,
00: 17: 4320 e estas são imagens tão requintadas.
00: 17: 4601 olhe para isso.
00: 17: 4726 Você pode ver que, 15 milissegundos após o início da luz,
00: 17: 5007 você pode ver que uma dessas vesículas
00: 17: 5227 fundiu e formou o que é chamado
00: 17: 5419 uma figura ômega, certo?
00: 17: 5600 E essa é uma vesícula que está começando a
00: 17: 5809 colapso na membrana.
00: 17: 5917 E então, aqui, você pode ver
00: 18: 0123 em 30 milissegundos uma vesícula que é quase
00: 18: 0404 totalmente colapsado na membrana.
00: 18: 0515 E isso é sempre diretamente do outro lado
00: 18: 0800 da densidade pós-sináptica, certo?
00: 18: 0918 Então, isso mostra que é onde estão os receptores.
00: 18: 1202 Portanto, zona ativa, mostrada em amarelo,
00: 18: 1500 densidade pós-sináptica, mostrada em vermelho.
00: 18: 1629 Então, onde estão as vesículas recicladas
00: 18: 2013 em relação a onde as vesículas se fundem?
00: 18: 2220 E mais uma vez vemos que a endocitose,
00: 18: 2605 a reciclagem de vesículas,
00: 18: 2725 ocorre nas bordas da sinapse.
00: 18: 3002 Então, aqui podemos ver.
00: 18: 3203 o amarelo é a borda da zona ativa,
00: 18: 3413 você pode ver que as vesículas estão ancoradas lá,
00: 18: 3613 e você já pode ver que há esse recuo,
00: 18: 3823 esta invaginação da membrana.
00: 18: 4025 E então aqui você vê uma invaginação mais profunda
00: 18: 4415 e aqui está uma vesícula que está sendo
00: 18: 4627 realmente clivado da membrana,
00: 18: 4821 e, em seguida, nesta última imagem.
00: 18: 5016 deixe-me recuar.
00: 18: 5129 você pode ver que há uma vesícula
00: 18: 5325 que é liberado da membrana,
00: 18: 5515 e isso agora está se translocando
00: 18: 5716 no centro do botão.
00: 18: 5917 Então, o processo que vimos em C. elegans
00: 19: 0204 também está ocorrendo em neurônios do hipocampo.
00: 19: 0520 Então, com que rapidez as vesículas são recicladas?
00: 19: 0813 Novamente, o processo é muito rápido.
00: 19: 1014 Então, em 50 milissegundos, vemos essas invaginações superficiais,
00: 19: 1309 100 milissegundos vemos estes
00: 19: 1518 invaginações profundas que estão sendo clivadas,
00: 19: 1624 e então, finalmente, em 300 milissegundos
00: 19: 1911 vemos que essas vesículas estão começando
00: 19: 2104 para translocar para o [botão].
00: 19: 2402 Então, o processo está demorando cerca de
00: 19: 2607 50-100 milissegundos.
00: 19: 2825 Este é um tomograma, então é uma imagem 3D
00: 19: 3106 de uma micrografia eletrônica,
00: 19: 3303 e porque isso é importante é porque
00: 19: 3505 mostra que, enquanto a exocitose está ocorrendo,
00: 19: 3804 a endocitose já começou.
00: 19: 4015 Então, isso é mostrado aqui.
00: 19: 4200 Você pode ver que essas são três vesículas que estão se fundindo,
00: 19: 4412 e você já vê essas invaginações
00: 19: 4611 que estão ocorrendo.
00: 19: 4715 Isto é em 50 milissegundos,
00: 19: 4905 então as vesículas estão se fundindo e colapsando na membrana,
00: 19: 5214 e a membrana já está sendo retirada
00: 19: 5404 por endocitose ultrarrápida.
00: 19: 5520 E então, aqui você pode ver isso de novo.
00: 19: 5711 Você pode ver que uma vesícula.
00: 20: 0000 ou, uma cova endocítica, está aqui,
00: 20: 0319 e aqui você pode ver que há uma vesícula
00: 20: 0603 que está completamente formado
00: 20: 0725 e está sendo cortado da membrana.
00: 20: 0905 Então, o que isso nos diz é que
00: 20: 1027 as proteínas e as membranas
00: 20: 1327 que estavam na vesícula sináptica
00: 20: 1527 não são os mesmos que estão sendo endocitados.
00: 20: 1824 Então, o processo está ocorrendo ao mesmo tempo,
00: 20: 2100 as vesículas estão se fundindo,
00: 20: 2221 membrana está sendo recolhida.
00: 20: 2610 Portanto, temos um temporal.
00: 20: 3013 temos dados que mostram o processamento temporal disso,
00: 20: 3311 e o que vemos, em primeiro lugar,
00: 20: 3520 é que não há cavidades revestidas na membrana plasmática.
00: 20: 3928 Não vemos aqueles lindos poços revestidos
00: 20: 4217 que Heuser e Reese viram durante a endocitose.
00: 20: 4422 Em vez disso, vemos esses poços
00: 20: 4907 que se formam rapidamente,
00: 20: 5100 e atingem um pico de cerca de 100 milissegundos -
00: 20: 5301 eles não têm casacos.
00: 20: 5416 Vemos grandes vesículas endocíticas,
00: 20: 5601 eles também atingem o pico em 100 milissegundos.
00: 20: 5729 E podemos ver que as primeiras vesículas
00: 21: 0112 são vistos em 50 milissegundos
00: 21: 0518 e os últimos são vistos em 300 milissegundos.
00: 21: 0811 E agora sabemos que endocitose
00: 21: 1100 - esse é realmente o processo em que a membrana é cortada
00: 21: 1221 e removido da superfície -
00: 21: 1411 está ocorrendo entre 50-300 milissegundos.
00: 21: 1917 Então, agora temos vesículas, 100 milissegundos,
00: 21: 2205 temos essas vesículas
00: 21: 2322 que estão no botão pré-sináptico.
00: 21: 2517 Bem, o que acontece com eles, certo?
00: 21: 2722 Eles voltam à superfície,
00: 21: 2929 porque este é apenas um pedaço de membrana superficial,
00: 21: 3321 é uma forma de recuperar, talvez,
00: 21: 3619 a tensão da membrana na zona ativa?
00: 21: 3929 Ou este é um processo pelo qual
00: 21: 4210 vesículas sinápticas são regeneradas?
00: 21: 4404 Então, para fazer isso, tínhamos que ser capazes de
00: 21: 4626 segue esta membrana para dentro da célula,
00: 21: 4816 e para isso precisávamos de um marcador de fase fluida,
00: 21: 5114 algo que poderíamos ver por microscopia eletrônica,
00: 21: 5319 que seria assumido por endocitose.
00: 21: 5717 Então, a ferritina faz uma partícula de 12 nanômetros,
00: 22: 0018 é basicamente uma esfera oca,
00: 22: 0209 e essa esfera oca pode conter
00: 22: 0429 4000 moléculas de ferro,
00: 22: 0719 e isso fica muito escuro nas micrografias eletrônicas.
00: 22: 1220 E isso é mostrado aqui,
00: 22: 1417 então o que você vê são sinapses do hipocampo
00: 22: 1802 que foram incubados com ferritina antecipadamente,
00: 22: 2201 e então são estimulados.
00: 22: 2323 E então você pode ver essas moléculas escuras de ferritina, aqui,
00: 22: 2621 e após a estimulação,
00: 22: 2811 há 100 milissegundos após a estimulação,
00: 22: 3008 você pode ver um poço raso se formando,
00: 22: 3215 há endocitose já ocorrendo.
00: 22: 3414 E aqui você pode ver essas moléculas de ferritina
00: 22: 3624 estão entrando em uma profunda invaginação.
00: 22: 3828 E esta é a imagem mais importante, aqui.
00: 22: 4027 Neste caso, você pode ver que
00: 22: 4325 as moléculas de ferritina se moveram para uma vesícula endocítica.
00: 22: 4722 Isso prova que este processo está indo para dentro,
00: 22: 5112 que estes são pedaços de membrana
00: 22: 5418 que estão agarrando algumas das partículas de ferritina
00: 22: 5728 dentro da fenda sináptica
00: 22: 5909 e levando-os para o [botão sináptico].
00: 23: 0224 Então, o que eu gostaria que você fizesse é lembrar desta imagem.
00: 23: 0610 Então, isso vai voltar
00: 23: 0812 no final da palestra,
00: 23: 1013 e é uma imagem que será muito semelhante.
00: 23: 1320 então, a presença de ferritina
00: 23: 1506 indo para essas estruturas endocíticas.
00: 23: 1822 O que acontece depois disso?
00: 23: 2125 Então, isso, novamente, é o que vimos antes,
00: 23: 2303 esta endocitose rápida,
00: 23: 2412 e se seguirmos isso no tempo
00: 23: 2618 vemos que após 3 segundos,
00: 23: 2816 vemos que a ferritina
00: 23: 3118 mudou para um endossomo,
00: 23: 3224 um endossomo sináptico,
00: 23: 3329 e 10 segundos depois, vemos que eles.
00: 23: 3620 moléculas de ferritina estão em vesículas sinápticas.
00: 23: 3907 é um pouco difícil de ver isso,
00: 23: 4117 então se estimularmos mais intensamente.
00: 23: 4309 mais uma vez, aos 3 segundos
00: 23: 4505 você pode ver a ferritina dentro desses endossomos sinápticos,
00: 23: 4821 e aqui, isso é após 10 estímulos.
00: 23: 5117 em 10 segundos,
00: 23: 5317 você pode ver que existem vesículas sinápticas, várias delas,
00: 23: 5523 que têm essas moléculas de ferritina,
00: 23: 5727 então isso realmente demonstra que este é um processo
00: 24: 0108 para regenerar vesículas sinápticas.
00: 24: 0508 Como esse endossomo sináptico é resolvido?
00: 24: 0801 E o que você pode ver aqui é que,
00: 24: 0923 agora, vemos estes casacos,
00: 24: 1115 exatamente como o que Heuser e Reese viram,
00: 24: 1429 vimos evidências de casacos de clatrina.
00: 24: 1626 E então, aqui está o que, novamente,
00: 24: 1922 uma fossa normal revestida de clatrina parece,
00: 24: 2402 e que ocorre no corpo celular,
00: 24: 2529 e aqui está um desses botões revestidos
00: 24: 2821 no endossomo,
00: 24: 3004 e veja como eles são familiares ou semelhantes.
00: 24: 3124 Então, aqui está o processo,
00: 24: 3323 aqui está uma dessas rodadas,
00: 24: 3614 endossomos sinápticos esféricos
00: 24: 3827 em 1 segundo e, em seguida, em 1 segundo, aqui,
00: 24: 4028 vemos que os botões estão se formando,
00: 24: 4209 e aqui está outro exemplo, em 3 segundos,
00: 24: 4427 de um botão se formando.
00: 24: 4715 E então este é um. Eu amo essa imagem
00: 24: 4828 aqui está um desses endossomos sinápticos
00: 24: 5017 que está sendo dilacerado por cães selvagens, certo?
00: 24: 5218 Quer dizer, há um botão.
00: 24: 5500 quatro botões diferentes neste processo,
00: 24: 5616 está destruindo completamente o endossomo sináptico,
00: 24: 5911 e basicamente se torna invisível para nós
00: 25: 0126 em micrografias eletrônicas depois disso.
00: 25: 0516 Então, se olharmos agora para a velocidade deste processo,
00: 25: 0829 vemos que esses poços profundos
00: 25: 1127 formaram-se entre 50-100 milissegundos,
00: 25: 1403 estes então formam grandes vesículas endocíticas
00: 25: 1702 - têm cerca de 80 nanômetros de diâmetro -
00: 25: 1915 e aqueles se formam em 100 milissegundos,
00: 25: 2219 eles atingem o pico em 100 milissegundos.
00: 25: 2500 Esses endossomos sinápticos atingem o pico em 1 segundo,
00: 25: 2704 em seguida, as vesículas revestidas de clatrina atingem o pico em 3 segundos,
00: 25: 3127 e, em seguida, ver os endossomos sinápticos.
00: 25: 3412 desculpe, vesículas sinápticas,
00: 25: 3620 e atingem o pico em 10 segundos,
00: 25: 3905 e pensamos que o t1 / 2,
00: 25: 4119 ou seja, o intervalo para criar essas vesículas sinápticas,
00: 25: 4509 é de apenas 5 segundos,
00: 25: 4700 então o processo é muito rápido.
00: 25: 4905 Então, o que agora temos que concluir é que
00: 25: 5229 há outro processo, esta endocitose ultrarrápida,
00: 25: 5628 que ocorre 600 vezes mais rápido
00: 25: 5911 do que a endocitose mediada por clatrina, aqui.
00: 26: 0112 Então, isso leva 30 segundos,
00: 26: 0300 e o que vimos é que
00: 26: 0429 endocitose ultrarrápida está ocorrendo
00: 26: 0716 a uma velocidade de 50 milissegundos,
00: 26: 0827 então, 600 vezes mais rápido.
00: 26: 1125 Então, agora temos um conflito, certo?
00: 26: 1423 Heuser e Reese veem endocitose mediada por clatrina,
00: 26: 1815 leva 30 segundos.
00: 26: 1920 Vemos endocitose ultrarrápida,
00: 26: 2129 que leva cerca de 50 milissegundos.
00: 26: 2406 Então, os dados discordam.
00: 26: 2600 Então, podemos reconciliar esses resultados conflitantes?
00: 26: 3011 E acho que podemos.
00: 26: 3212 Então, a questão, então, é, por que nossos resultados
00: 26: 3627 diferem de estudos anteriores sobre neurônios do hipocampo?
00: 26: 3816 Estes foram estudados por muitos, muitos anos,
00: 26: 3929 e sempre foi observado que
00: 26: 4223 existem estruturas endocíticas mediadas por clatrina.
00: 26: 4725 E achamos que sabemos o motivo.
00: 26: 4916 Porque quando Shigeki estava fazendo seus experimentos,
00: 26: 5221 ele estava fazendo isso sempre
00: 26: 5423 uma temperatura fisiológica, de 34 graus ou 37 graus,
00: 26: 5805 essa é a temperatura a que um rato vive normalmente,
00: 27: 0014 e nesta imagem 3 segundos após a estimulação,
00: 27: 0405 você vê a formação de
00: 27: 0529 ou uma grande vesícula endocítica
00: 27: 0710 ou um desses endossomos sinápticos,
00: 27: 0901 e isso, novamente, estava a 34 graus.
00: 27: 1121 vemos endocitose ultrarrápida.
00: 27: 1326 Shigeki então, a partir da leitura da literatura,
00: 27: 1621 percebi que todo mundo estava fazendo seus experimentos
00: 27: 1905 à temperatura ambiente, a 22 graus,
00: 27: 2107 então ele fez seus experimentos a 22 graus,
00: 27: 2325 congelou em 3 segundos, e olhe o que você vê.
00: 27: 2604 Aqui está uma vesícula revestida de clatrina bem aqui,
00: 27: 2907 uma bela vesícula revestida de clatrina,
00: 27: 3014 e aqui está uma ampliação nesta inserção.
00: 27: 3209 Mais uma vez, olhe para aquele lindo
00: 27: 3427 fosso revestido com clatrina.
00: 27: 3604 Então, agora pensamos que o que está acontecendo é que
00: 27: 3903 se você fizer seus experimentos a 37 graus ou 34 graus,
00: 27: 4413 você verá endocitose ultrarrápida,
00: 27: 4613, mas a 22 graus
00: 27: 4812 endocitose mediada por clatrina predomina.
00: 27: 5101 E isso é mostrado aqui.
00: 27: 5317 Se você fizer seus experimentos a 34 graus,
00: 27: 5512 basicamente não vemos poços revestidos
00: 27: 5807 na membrana plasmática,
00: 27: 5923 que é endocitose mediada por clatrina,
00: 28: 0211 mas vemos esses endossomos,
00: 28: 0408 que tipificam endocitose ultrarrápida.
00: 28: 0614 A 22 graus, agora vemos que
00: 28: 1105 existem esses poços revestidos aparecendo na membrana,
00: 28: 1219 mostrado aqui,
00: 28: 1407 e isso é evidência de endocitose mediada por clatrina.
00: 28: 1524 No entanto, não vemos nenhum desses endossomos,
00: 28: 1821 novamente, a assinatura da endocitose ultrarrápida.
00: 28: 2206 Então, achamos que isso explica
00: 28: 2411 a diferença entre nossos experimentos
00: 28: 2606 e os de outros laboratórios.
00: 28: 2909 Então, como vamos colocar essas coisas juntas?
00: 28: 3110 Bem, o que achamos que está acontecendo é que
00: 28: 3409 normalmente o que acontece é que
00: 28: 3618 endocitose ultrarrápida está respondendo
00: 28: 3907 para estímulos normais, estímulos únicos normais.
00: 28: 4300 Todos os nossos experimentos estão concluídos
00: 28: 4515 com um ou dez estímulos, não muitos.
00: 28: 4724 Mas, o que pode acontecer é que quando uma sinapse é
00: 28: 5101 submetido a uma estimulação extrema de alta frequência,
00: 28: 5518 ou demandas superiores,
00: 28: 5729 que você precisa para ativar outro mecanismo, que é a endocitose mediada por clatrina,
00: 29: 0024 e está atuando como um sistema de backup de emergência
00: 29: 0303 quando a endocitose ultrarrápida falha.
00: 29: 0616 Mais experimentos precisam ser feitos
00: 29: 0808 para testar esta hipótese,
00: 29: 1010 mas é pelo menos uma maneira de pensar sobre
00: 29: 1214 esses resultados diferentes.
00: 29: 1419 Então, isso não vai acontecer.
00: 29: 1704 que explica por que esses experimentos diferiram
00: 29: 1820 de outras pessoas estudando sinapses do hipocampo.
00: 29: 2127 Realmente não esclarece
00: 29: 2420 porque Heuser e Reese obtiveram resultados diferentes.
00: 29: 2803 E então eu quero voltar para a literatura
00: 29: 2925 e mostrar que eu acho
00: 29: 3215 até mesmo esses resultados podem ser reconciliados.
00: 29: 3507 Então, esses experimentos estavam sendo feitos
00: 29: 3706 na junção neuromuscular da rã,
00: 29: 3820 e queremos saber por que esses resultados são diferentes.
00: 29: 4207 E então as imagens que mostrei para vocês para cronometrar
00: 29: 4515 foram essas imagens de fratura congelada.
00: 29: 4714 E então este é um caso em que isso é estimulado.
00: 29: 5015 5 milissegundos vemos exocitose, vemos fusão.
00: 29: 5319 30 segundos depois, vemos endocitose,
00: 29: 5629 vemos que as vesículas estão sendo recicladas.
00: 29: 5920 Mas o problema é,
00: 30: 0206 onde estão as seções transversais? Direito?
00: 30: 0415 Normalmente, você não estaria perseguindo este
00: 30: 0820 através desta fratura congelada.
00: 30: 1012 Estas são belas imagens,
00: 30: 1211 mas adoraríamos saber o que estava acontecendo na membrana
00: 30: 1500 neste caso.
00: 30: 1700 Essas vesículas endocíticas realmente mediadas por clatrina?
00: 30: 2215 E então eu olhei todos os seus papéis
00: 30: 2408 e eu nunca fui capaz de encontrar
00: 30: 2615 aquelas seções transversais,
00: 30: 2800 mas tenho certeza que eles teriam feito isso, certo?
00: 30: 2924 Então, finalmente, entrei em contato
00: 30: 3203 um negociante de livros antiquários,
00: 30: 3308 porque este foi um artigo que não consegui encontrar,
00: 30: 3501 Não consegui obter uma cópia de,
00: 30: 3617 e foi este capítulo neste livro
00: 30: 3916 chamado "Neurocsiences" pela MIT Press, em 1979.
00: 30: 4314 E então o negociante de livros antiquários
00: 30: 4725 me vendeu aquele livro
00: 30: 4916 e eu olhei para aquele capítulo
00: 30: 5107 e havia aquelas seções transversais.
00: 30: 5218 Esta é apenas uma bela história de investigação, aqui.
00: 30: 5612 Aqui está uma junção neuromuscular
00: 30: 5905 que foi estimulado a 10 Hz por 5 minutos,
00: 31: 0120 então, estimulação de alta frequência.
00: 31: 0401 E você pode ver essas lindas,
00: 31: 0628 fossos requintados revestidos de clatrina.
00: 31: 0807 Aqui está aquele em que a camada de clatrina se formou,
00: 31: 1102 e aqui está outra onde a vesícula
00: 31: 1300 está sendo espremido, prestes a ser cortado.
00: 31: 1506 Então, isso foi depois de uma estimulação intensa.
00: 31: 1917 Mas no artigo de Miller e Heuser,
00: 31: 2129 também havia imagens de fratura congelada
00: 31: 2504 que mostrou algo misterioso,
00: 31: 2617 que notaram após apenas 1 segundo
00: 31: 2924 após a estimulação.
00: 31: 3106 E esses são mostrados aqui.
00: 31: 3218 então, aqui, mostrado em vermelho,
00: 31: 3421 Eu circulei essas outras indentações
00: 31: 3816 que parecem que podem ser eventos endocíticos,
00: 31: 4014 e observe que há esta estrutura branca aqui,
00: 31: 4219 estrutura branca aqui.
00: 31: 4500 Esse é o gelo que está sendo cortado
00: 31: 4616 no colo daquela vesícula endocítica,
00: 31: 5100 sugerindo que, se pudéssemos olhar dentro disso em uma seção transversal,
00: 31: 5320 seríamos capazes de ver as estruturas endocíticas.
00: 31: 5505 Então, onde estão essas seções transversais?
00: 31: 5714 Lá estão eles.
00: 31: 5916 Então, esta é uma das imagens
00: 32: 0129 retirado desse capítulo do livro,
00: 32: 0307 eles estavam usando ferritina para rastrear a formação dessas vesículas,
00: 32: 0526 e é por isso que eu disse,
00: 32: 0714 "lembre-se desta imagem",
00: 32: 0907 porque parece muito semelhante
00: 32: 1109 às imagens que mostrei.
00: 32: 1215 Então, aqui está a ferritina sendo
00: 32: 1519 retomado nessas invaginações.
00: 32: 1716 Aqui está outro.
00: 32: 1909 Algumas dessas invaginações são bastante grandes,
00: 32: 2104 mostrado aqui,
00: 32: 2214 e então aqui está uma vesícula
00: 32: 2409 que foi clivado da membrana
00: 32: 2520 que contém ferritina,
00: 32: 2705 demonstrando que esses eventos realmente são endocíticos.
00: 32: 3005 Observe que esta foi uma sinapse que foi estimulada
00: 32: 3305 uma vez
00: 32: 3419 e congelado 1 segundo depois.
00: 32: 3614 Então, em vez de alta estimulação,
00: 32: 3802 eles são estimulantes apenas uma vez.
00: 32: 4103 muito mais semelhante ao tipo de experimentos que descrevi.
00: 32: 4410 Então, eu acho que Heuser e Reese
00: 32: 4802 viu tudo, eles tinham os dados,
00: 32: 5008 eles tinham as imagens,
00: 32: 5208 e a única coisa que acho que pode ter sido invertida
00: 32: 5508 é descrito em sua discussão.
00: 32: 5717 Então, aqui, eles dizem,
00: 32: 5919 ao olhar para essas cisternas rápidas,
00: 33: 0305 estes que acabei de mostrar com ferritina,
00: 33: 0604 eles dizem: "Quase todos os poços não revestidos se formaram
00: 33: 0909 durante os primeiros segundos
00: 33: 1105 após exocitose ".
00: 33: 1225 "Os poços não revestidos podem nem ocorrer
00: 33: 1509 durante o funcionamento normal da sinapse. "
00: 33: 1800 Então eles falam sobre esses poços revestidos lentos,
00: 33: 2008 aqui, e eles dizem,
00: 33: 2120 "Outra [membrana] é recuperada
00: 33: 2323 nos próximos 90 segundos
00: 33: 2600 por meio de poços revestidos ".
00: 33: 2811 "O caminho dos poços revestidos é.
00: 33: 2914 fisiologicamente mais significativo. "
00: 33: 3129 Então, eu acho que ambos ocorrem,
00: 33: 3403 Eu acho que sob estimulação de baixa frequência
00: 33: 3612 vemos este mecanismo ultrarrápido,
00: 33: 3810 e então, sob estimulação de alta frequência,
00: 33: 4121 talvez esse mecanismo revestido de clatrina predomine.
00: 33: 4701 Então, em resumo,
00: 33: 4917 o que mostrei neste segundo vídeo
00: 33: 5203 é que existe um mecanismo chamado endocitose ultrarrápida
00: 33: 5512 que funciona nas sinapses
00: 33: 5703 para recuperar as vesículas sinápticas.
00: 33: 5927 Leva cerca de 30-300 milissegundos
00: 34: 0304 para recuperar a membrana
00: 34: 0428 fora da superfície da membrana plasmática.
00: 34: 0716 Esses endossomos sinápticos formam
00: 34: 1017 após cerca de um segundo.
00: 34: 1218 clatrina. estes são então resolvidos por brotamento de clatrina
00: 34: 1417 após 3 segundos,
00: 34: 1606 e então vemos a formação de vesículas sinápticas
00: 34: 1806 após 5 segundos.
00: 34: 2104 Então, isso está em paralelo
00: 34: 2404 para este outro mecanismo,
00: 34: 2521 a endocitose mediada por clatrina clássica,
00: 34: 2720 que reforma vesículas, vesículas completas,
00: 34: 3101 direto da membrana,
00: 34: 3309 para que eles simplesmente precisem ser não revestidos
00: 34: 3415 para regenerar uma vesícula sináptica nascente,
00: 34: 3710 que pode ser recarregado e reutilizado.
00: 34: 4115 Então, gostaria de encerrar reconhecendo
00: 34: 4318 as pessoas que fizeram este trabalho.
00: 34: 4429 A microscopia eletrônica foi feita
00: 34: 4700 por Shigeki Watanabe,
00: 34: 4826 que agora é professor na Johns Hopkins.
00: 34: 5122 Toda a instrumentação foi feita por Wayne Davis, no meu laboratório.
00: 34: 5415 E então eu realmente preciso agradecer
00: 34: 5617 Christian Rosenmund e os pós-doutorandos em seu laboratório
00: 35: 0022 por ter nos hospedado e permitido fazer esses experimentos
00: 35: 0316 em seu laboratório,
00: 35: 0420 e eles conduziram toda a fisiologia,
00: 35: 0619 eletrofisiologia, que foi feito nessas células.
00: 35: 0916 Então, obrigado por ouvir.
00: 35: 1113 Erik Jorgensen, da Universidade de Utah.

  • Parte 1: transmissão sináptica

Funções das Vesículas

Como visto a partir dos vários tipos de vesículas, elas podem estar envolvidas na flutuabilidade e otimização da fotossíntese (vesículas gasosas), sinalização intercelular e troca de materiais (exossomos), digestão intracelular (lisossomas), transporte e secreção (vesículas oriundas da rede de Golgi). Eles podem transportar todo tipo de carga, desde grandes bolhas apoptóticas e patógenos a biopolímeros, bem como resíduos. Eles são necessários para a formação e manutenção da membrana plasmática, da matriz extracelular e da estrutura citoplasmática interna. As vesículas também são cruciais para o funcionamento das células envolvidas na digestão extracelular, como as que revestem os órgãos digestivos, como as glândulas salivares. Finalmente, um organismo mantém a homeostase coordenando as ações de diferentes órgãos por meio de seus sistemas nervoso e endócrino. Ambos os sistemas orgânicos precisam do funcionamento adequado da rede vesicular para realizar suas tarefas.


A Biologia Celular da Delaminação Celular da Crista Neural e EMT

Lisa A. Taneyhill, Rangarajan Padmanabhan, em Neural Crest Cells, 2014

Repartição da lâmina basal

A lâmina basal é uma matriz proteica fibrosa que envolve o tubo neural e também está localizada na superfície basal do ectoderma. O principal constituinte da lâmina basal nos níveis cranial e axial do tronco é a laminina, além da fibronectina, colágeno I e colágeno IV [111-113]. Inicialmente, a lâmina basal é contínua com o ectoderma. Durante a neurulação, a placa neural se invagina e as dobras neurais se elevam para formar o NCC na região de dobradiça entre o ectoderma neural e não neural, interrompendo assim a lâmina basal contínua. Após a formação do tubo neural, a lâmina basal se fecha novamente em torno do tubo neural e do ectoderma, exceto no tubo neural dorsal onde reside o NCC pré-migratório. É importante ressaltar que a lâmina basal não é completamente reconstituída na cabeça até que todos os NCC tenham emigrado [9,73]. Foi sugerido inicialmente que a lâmina basal poderia servir como uma barreira física para a migração, com sua quebra necessária para a emigração [114]. Isso foi substanciado pela observação de que a lâmina basal é impenetrável à emigração do NCC [115]. Martins-Green e Erickson [116], entretanto, mostraram posteriormente que a ausência de lâmina basal é uma necessidade, mas a lâmina basal em si não constitui uma barreira física para a emigração do NCC. O exame microscópico de elétrons de embriões de camundongo, frango, salamandra e peixe-zebra mostrou que a lâmina basal não está presente na região que se sobrepõe ao NCC, pelo menos 10 horas antes da EMT no tronco e logo antes da EMT na região craniana [5,117-121 ] No entanto, na cabeça, a emigração do NCC e a perda da lâmina basal parecem estar diretamente correlacionadas, embora estudos detalhados sejam necessários para delinear a relação exata entre esses dois processos. Curiosamente, a emigração do NCC e a degradação da lâmina basal são independentes, pois a expressão de Ets-1 fosforilável estimula a delaminação e a emigração do NCC e está associada à degradação da lâmina basal, enquanto a expressão de um Ets-1 não fosforilável resulta apenas na emigração do NCC [13]. A degradação da lâmina basal no tronco, entretanto, não está correlacionada com NCC EMT [116], possivelmente porque a delaminação sustentada do NCC ocorre neste nível axial. Dado que Ets-1 não for detectado no tronco, é tentador especular que a função Ets-1 poderia explicar a diferença no papel da lâmina basal na EMT do NCC na cabeça e no tronco.

O NCC pode secretar uma variedade de proteases para degradar potencialmente a lâmina basal. NCC cranial e de tronco de pintinho sintetizam o ativador do plasminogênio durante a migração em vitro [122-124], que por sua vez pode degradar várias proteínas da superfície celular e componentes da matriz extracelular (ECM) encontrados durante a migração (revisado em [125]). Recentemente, descobriu-se que várias metaloproteases de matriz (MMPs) e ADAMs desempenham papéis importantes na migração de NCC. MMP-2 e seu inibidor natural, TIMP-2, são expressos durante a migração de NCC cardíaco aviário [126-128]. Experimentos recentes revelam que o líder que migra NCC craniano expresso Mmp-2 enquanto as células posteriores não [129]. MMP-2 é crucial para NCC EMT normal, pois os inibidores de MMP-2 (BB-94 [128], KB8301 [127]) causam migração aberrante de NCC cardíaco e de tronco, respectivamente. Da mesma forma, o knockdown de MMP-2 perturba a EMT do NCC da galinha, mas não tem efeitos na migração do NCC que já se separou do tubo neural [128]. A MMP-9 é outra protease expressa na delaminação e migração de NCC em ambos os níveis cranial e de tronco [130]. O bloqueio de MMP-9 reduz quimicamente a delaminação e migração de NCC sem perturbar a especificação ou sobrevivência, sugerindo um papel para MMP-9 no descolamento de NCC do tubo neural, bem como em sua migração. Por outro lado, a superexpressão de MMP-9 ou adição de mídia condicionada de MMP-9 aumenta a migração de NCC e estimula a emigração precoce em vitro e na Vivo. Os substratos para MMP-9 incluem laminina e, em menor extensão, N-caderina [130]. Considerando que Ets-1 demonstrou regular positivamente várias MMPs em vitro e na Vivo (revisado em [131]), e que é expresso na cabeça do pintinho [13], é possível que o Ets-1 possa estimular a delaminação de NCC craniana do pintinho pela regulação positiva da expressão de MMPs.

ADAM13 é um dos ADAMs mais bem caracterizados no contexto de NCC EMT e desempenha várias funções além da clivagem da Caderina-11, pois a depleção da caderina-11 não é suficiente para resgatar o knockdown de ADAM13 [132]. ADAM13 é processado pela γ-secretase para liberar um fragmento citoplasmático que se transloca para o núcleo [133], e este fragmento regula a expressão de múltiplos genes no NCC craniano [133]. Consistente com isso, a expressão de um ADAM13 mutante sem seu domínio citoplasmático não pode resgatar o fenótipo de knockdown de ADAM13 (inibição da migração de NCC craniana), sugerindo que a translocação nuclear do domínio citoplasmático é crucial para promover a EMT de NCC craniana na Vivo. Além disso, ADAM13 pode ligar, clivar e remodelar um substrato de fibronectina na Vivo, promovendo assim a migração de NCC [134], e é necessária uma célula autonomamente [132]. Curiosamente, ADAM13 pode executar suas funções através da cooperação com ADAM19, uma vez que o knockdown duplo ADAM13 e ADAM19 inibe mais fortemente a migração de NCC do que os knockdowns simples, e o domínio citoplasmático ADAM19 resgata o fenótipo de embriões knockdown de ADAM13 [133]. ADAM19 também foi identificado para desempenhar um papel na indução Xenopus NCC cranial [135], mas seu papel no NCC EMT não é claro. Na cabeça do pintinho, ADAM19 e a γ-secretase são expressas em NCC pré-migratório e migratório, e ADAM10 é expresso apenas por NCC pré-migratório. Ambos os ADAMs funcionam para processar Cad6B (nossos dados não publicados).


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