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Como conservar com segurança minhas marcas atuais de metilação do DNA?


Eu li o artigo da Wikipedia sobre metilação de DNA

Digamos que eu queira extrair e estocar minhas marcas atuais de metilação do DNA em algum lugar para que possa usá-las com segurança 20 anos no futuro para um procedimento médico que ainda não existe.

Que método devo usar?


Para registrar o estado de metilação atual do seu DNA, você pode usar o sequenciamento de bissulfito. Basicamente, você pega metade da sua amostra de DNA e trata com bissulfito, que desamina as citosinas (C-> U), então elas são lidas como T em vez de C. As citosinas metiladas são protegidas, então ainda são lidas como C. Você executa duas reações de sequenciamento , um com bissulfito tratado e outro com DNA não tratado, então você pode dizer onde os verdadeiros Cs estão no genoma. Veja o diagrama abaixo:

Wikimedia commons

Observe que, se você está pensando em fazer isso do ponto de vista da longevidade, há padrões de metilação extremamente diferentes em diferentes tipos de células; Não tenho certeza de qual tipo de célula você deseja escolher. Além disso, a metilação não é a única modificação covalente do DNA que existe, há também a hidroximetilação, e aposto que há mais que ainda não descobrimos. Certamente existem em bactérias e fagos (glucosil-hidroximetilcitosina, por exemplo). O difícil de guardar coisas para o futuro é que realmente não entendemos o quadro completo do que está acontecendo agora epigeneticamente e, como tal, não temos ensaios para detectar coisas que não conhecemos.


Acredito que o DNA será tão estável na forma nativa quanto deveria ser após o tratamento com bissulfito. Você pode usar métodos comercialmente disponíveis para armazenar amostras de DNA e assumir com segurança que estará intacto em 20 anos.


Conservação e divergência na metilação do DNA eucariótico

A metilação da citosina é uma modificação comum do DNA encontrada na maioria dos organismos eucarióticos, incluindo plantas, animais e fungos (1, 2). A adição de um grupo metil aos nucleotídeos da citosina no DNA não altera a sequência primária do DNA, mas a modificação covalente do DNA por metilação pode impactar a expressão e a atividade do gene de maneira hereditária. Esse tipo de regulação epigenética por meio da metilação do DNA parece ser um processo crítico, em um sentido evolutivo, com enzimas altamente conservadas mediando o processo (3). Em humanos, a metilação aberrante do DNA tem sido associada a doenças, incluindo câncer (4). Para estudar os padrões de metilação da citosina em todo o genoma, os pesquisadores usaram a hibridização microarray ou sequenciamento direto do DNA tratado com bissulfito (5). No entanto, mapear a metilação de citosinas individuais em um determinado genoma tem sido uma tarefa desafiadora e, consequentemente, a análise comparativa dos padrões de metilação do genoma entre as espécies não foi realizada. Vários novos estudos abordaram essa lacuna em nossa compreensão da evolução da metilação da citosina (6, 7). Feng et al. em PNAS (7) usou o sequenciamento de próxima geração para investigar os padrões de metilação do DNA em oito espécies divergentes, incluindo algas verdes, plantas com flores, insetos e vertebrados. Seus dados permitiram uma comparação abrangente dos perfis de metilação do genoma total nos reinos vegetal e animal, revelando características conservadas e divergentes da metilação do DNA em eucariotos.

Embora a metilação do DNA pareça ser um mecanismo regulatório epigenético difundido, os genomas são metilados de diferentes maneiras em diversos organismos. Em animais, a metilação do DNA ocorre principalmente de forma simétrica (ambas as fitas) nas citosinas de um dinucleotídeo CG. A metilação do DNA em genomas de plantas pode ocorrer simetricamente em citosinas em contextos CG e CHG (H = A, T ou C), e também assimetricamente em um contexto de CHH, com o último dirigido e mantido por pequenos RNAs (1). Na planta modelo Arabidopsis thaliana, os níveis de metilação da citosina nos nucleotídeos CG, CHG e CHH são cerca de 24%, 6,7% e 1,7%, respectivamente (8, 9). Apesar dos diferentes contextos de sequência de metilação, a metilação da citosina é estabelecida e mantida por uma família de DNA metiltransferases conservadas (2, 3, 10). Não surpreendentemente, a ausência de metilação do DNA em alguns eucariotos, como levedura, lombriga e mosca da fruta, está associada à perda evolutiva de homólogos de DNA metiltransferase (3).

Nos últimos anos, abordagens foram desenvolvidas para analisar a metilação da citosina em um nível de genoma completo, e isso forneceu grandes insights sobre a biologia da metilação do DNA. As primeiras abordagens usaram enzimas de restrição sensíveis a sítios CG metilados (11, 12), o nível de metilação do DNA é determinado pela digestão enzimática do DNA metilado, seguido por hibridização para arranjos de oligonucleotídeos de alta densidade. Outra abordagem captura DNA genômico metilado usando imunoprecipitação por meio de um anticorpo que reconhece 5-metilcitosina, seguido por hibridização ou sequenciamento de array (13, 14). Essas abordagens foram capazes de determinar os níveis e padrões de metilação cromossômica, mas tinham grandes limitações em seu nível de resolução, viés de enzimas de restrição, dificuldade em caracterizar regiões do genoma ricas em repetições e, o mais importante, uma incapacidade de detectar metilação de DNA em um único resolução de nucleotídeos (5).

O tratamento com bissulfito de sódio converte a citosina não metilada em uracila, que é substituída por timina após a amplificação por PCR, enquanto a 5-metilcitosina permanece inalterada. Portanto, resíduos de citosina não metilada ou metilada no DNA podem ser diferenciados por tratamento com bissulfito, sequenciamento de DNA e comparações com uma sequência de referência (15). Ao combinar o tratamento com bissulfito e o sequenciamento de alto rendimento (Illumina ou SBS, 454, SOLiD, etc.), um mapa de metilação pode ser gerado para uma resolução de par de base única em todo o genoma. Conforme relatado recentemente por Arabidopsis dados de sequenciamento de bissulfito de todo o genoma (BS-seq) (8, 9, 14), a metilação da citosina ocorre não apenas em & gt90% das sequências repetitivas e transposons, mas também dentro do corpo de -20% dos genes expressos que codificam proteínas. Embora CG, CHG e metilação de CHH sejam todos encontrados em heterocromatina pericentromérica rica em repetições, a metilação do corpo gênico contém quase exclusivamente metilação de CG. Esses estudos também revelaram uma relação parabólica interessante entre a metilação do corpo do gene e os níveis de transcrição. Enquanto os genes modestamente expressos têm maior probabilidade de serem metilados, os genes expressos nos dois extremos (níveis mais baixo e mais alto) são geralmente menos metilados.

Feng et al. aplicou BS-seq mais amplamente do que a maioria, traçando padrões de metilação de DNA em oito eucariotos diversos (Fig. 1). além do mais Arabidopsis, os autores analisaram arroz, algas verdes e camundongos, nos quais os perfis de metilação do DNA foram previamente investigados em vários graus. Eles adicionaram perfis de choupo (uma árvore), abelha, squirt e peixe-zebra, representando uma coleção de espécies que abrangem a árvore da vida de eucariotos unicelulares a vertebrados multicelulares. Em geral, os perfis de metilação de plantas com flores (Arabidopsis, arroz e choupo) mostraram padrões semelhantes, com todos os três contextos (CG, CHG e CHH) altamente enriquecidos em DNA repetitivo, transposons e regiões pericentroméricas. A metilação ocorreu quase exclusivamente em um contexto de CG em todo o genoma dos vertebrados, exceto para as "ilhas CpG" não metiladas perto dos locais de início da transcrição de genes ativos. O mais interessante é que a metilação de CG em genes que codificam proteínas concentrou-se preferencialmente nos exons, o que parece ser uma característica conservada em todos os eucariotos examinados. A metilação do corpo do gene permanece aparente no genoma da abelha, embora o nível geral de metilação do genoma seja muito baixo (∼1% de metilação do CG). Tomados em conjunto, embora a função da metilação gênica não seja totalmente compreendida, esse padrão de metilação conservado é provavelmente uma característica antiga, preservada ao longo da evolução.

Padrões de metilação de DNA conservados em eucariotos. Embora diferentes contextos de metilação sejam encontrados em animais (CG) e plantas (CG, CHG, CHH), a metilação do corpo do gene é conservada entre os eucariotos. Os elementos transponíveis (TEs) são metilados em plantas com flores em contextos de CG, CHG e CHH, bem como em um contexto de CG nos genomas de algas verdes e de borras-do-mar. Em algas verdes, a metilação não-CG é mais enriquecida em exons de genes em comparação com TEs e repetições (7). Os fungos, não mostrados na figura, têm genomas geralmente não metilados em genes ativos, mas fortemente metilados em TEs e repetições (6).

Coincidindo com o estudo de Feng et al., O laboratório de Daniel Zilberman também relatou seus dados do perfil de metilação comparativo do DNA por BS-seq de 17 eucariotos diversos, incluindo plantas, animais e fungos (6). Eles também conduziram o perfil transcricional por sequenciamento de RNA para investigar a relação funcional entre a metilação do DNA e a expressão gênica. Por último, eles analisaram a presença de uma variante da histona (H2A.Z) cujo padrão de distribuição se mostrou exatamente oposto ao da metilação do DNA. Seus dados concordam com observações anteriores de que a metilação do corpo do gene e o esgotamento de H2A.Z do DNA metilado são características antigas do reino eucariótico evolutivamente conservadas, anteriores à divergência de plantas e animais (6). No entanto, a metilação em transposons e sequências repetitivas é menos consistentemente encontrada entre as espécies: Altos níveis de metilação de transposons são encontrados em plantas terrestres e vertebrados, mas a metilação de transposons não é aparente em invertebrados como a traça da seda e anêmona. Esses resultados sugerem que o uso da metilação do DNA para reprimir transposons deletérios em genomas pode ter evoluído de forma independente em plantas e vertebrados, enquanto essa função foi perdida na linhagem de invertebrados (6).

Altos níveis de metilação do transposon são encontrados em plantas terrestres e vertebrados.

Embora esses estudos mais recentes tenham aumentado muito nossa compreensão sobre as adaptações evolutivas e a conservação da metilação do DNA, inevitavelmente as questões permanecem sem resposta. Por exemplo, a função da metilação gênica conservada ainda não está clara, embora tenha sido proposto suprimir a transcrição aberrante de promotores crípticos dentro dos genes (14). Além disso, ainda não entendemos o mecanismo pelo qual a metilação do DNA impacta os níveis de transcrição dos genes, especialmente no que diz respeito ao fenômeno da metilação mais pesada de genes modestamente transcritos do que aqueles expressos nos extremos. Foi sugerido que as taxas de transcrição extremas podem afetar o equilíbrio entre a interrupção da cromatina e a associação da polimerase, ambas as quais podem prevenir a geração de transcritos aberrantes que podem conduzir a metilação através de uma pequena via dependente de RNA (14). Zilberman et al. também sugerem que modificações epigenéticas, como metilação de DNA e modificações de histonas, podem impactar as associações de nucleossomos, interferindo subsequentemente na ligação da polimerase e na iniciação da transcrição. Curiosamente, essa suposição está de acordo com a periodicidade das citosinas metiladas no DNA descrita em Cokus et al. (8), em que um padrão de 10 ou 167 nucleotídeos foi observado, este correlacionado com o comprimento de uma rotação helicoidal do DNA e o comprimento médio do DNA enrolado em torno de um nucleossomo da planta, respectivamente. Estudos mais abrangentes em uma ampla gama de genomas provavelmente fornecerão mais informações sobre a função e a evolução da metilação do DNA.


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Índice (19 capítulos)

Mecanismos e funções biológicas de metiltransferases de DNA e metilação de DNA: de realizações passadas a desafios futuros

Alquilação de nucleobase de pirimidina de DNA e RNA na posição de carbono-5

Metilação de DNA bacteriano e metilomas

Estrutura de domínio das metiltransferases de DNA Dnmt1, Dnmt3a e Dnmt3b

Enzimologia das metiltransferases de DNA de mamíferos

Estudos genéticos em metiltransferases de DNA de mamíferos

O papel da metilação do DNA no câncer

Lakshminarasimhan, Ranjani (et al.)

Estrutura e mecanismo das metiltransferases de DNA vegetal

Metilação de DNA e regulação gênica em abelhas: de análises de todo o genoma a epialelos obrigatórios

N6-Metiladenina: Uma Marca de DNA Conservada e Dinâmica

O'Brown, Zach Klapholz (et al.)

Vias de desmetilação do DNA

Estrutura e função das enzimas TET

Proteínas que leem a metilação do DNA

Lançamento da base do DNA: um mecanismo geral para escrever, ler e apagar as modificações do DNA

Tecnologias atuais e emergentes para a análise dos padrões de metilação do DNA em todo o genoma e específicos de locus

Inibidores de DNA metiltransferase: desenvolvimento e aplicações

Reescrevendo assinaturas de metilação de DNA à vontade: o genoma curável ao alcance?


Como conservar com segurança minhas marcas atuais de metilação do DNA? - Biologia

O DNA derivado de células epiteliais da mama pode ser identificado por metilação do DNA.

O DNA derivado da mama é elevado na circulação de indivíduos com câncer de mama.

Os níveis de DNA circulante derivado da mama refletem a resposta ao tratamento.

A presença de DNA circulante derivado da mama é indicativa de doença residual após o tratamento.

Fundo

O DNA livre de células circulantes derivado de tumor (cfDNA) está presente no plasma de indivíduos com câncer. Ensaios destinados a detectar mutações comuns de câncer em cfDNA estão sendo desenvolvidos para a detecção de vários tipos de câncer. No câncer de mama, entretanto, tais ensaios não conseguiram detectar a doença em uma sensibilidade relevante para uso clínico, em parte devido à ausência de múltiplas mutações comuns que podem ser co-detectadas no plasma. Ao contrário das mutações individuais que existem apenas em um subconjunto de tumores, padrões únicos de metilação do DNA estão universalmente presentes em células de um tipo comum e, portanto, podem ser biomarcadores ideais. Aqui nós descrevemos a detecção e quantificação de cfDNA derivado da mama usando uma assinatura de metilação de DNA específica da mama.

Pacientes e métodos

Coletamos plasma de pacientes com câncer de mama localizado antes e durante o tratamento com quimioterapia neoadjuvante e cirurgia (N = 235 amostras).

Resultados

O cfDNA da mama pré-tratamento foi detectado em pacientes com doença localizada, com sensibilidade de 80% e especificidade de 97%. Níveis elevados de cfDNA de mama foram associados a perfis tumorais moleculares agressivos e atividade metabólica da doença. Durante a quimioterapia neoadjuvante, os níveis de cfDNA da mama diminuíram dramaticamente. É importante ressaltar que a presença de cfDNA da mama no final do regime de quimioterapia refletia a existência de doença residual.

Conclusão

Propomos que o cfDNA específico da mama seja um marcador universal e poderoso para a detecção e monitoramento do câncer de mama.


Sequenciamento de nanopore identifica marcas de metilação com ajuda de novos métodos estatísticos

NOVA YORK (GenomeWeb) - Dois grupos de pesquisa desenvolveram independentemente métodos para usar o sequenciador MinIon nanopore da Oxford Nanopore Technologies para identificar as bases de citosina metiladas.

Em dois artigos recentemente postados no servidor de pré-impressão BioRxiv - por uma equipe do Ontario Institute for Cancer Research e da Johns Hopkins University e outro grupo da University of California, Santa Cruz - os pesquisadores demonstraram que modelos estatísticos aplicados à corrente iônica gerada a partir de a passagem do DNA pelo nanoporo MinIon poderia distinguir certas marcas de metilação sem a necessidade de qualquer tratamento químico do DNA. [IP na verdade não é um tratamento químico - ele apenas puxa o DNA com um anticorpo].

Anteriormente, os pesquisadores demonstraram experimentalmente que o sequenciamento de nanopore poderia identificar modificações de base, mas atualmente, nenhum método está disponível para rotineiramente chamar marcas de metilação como parte do processo de chamada de base para sequenciamento no MinIon.

No estudo pré-impresso publicado pela equipe OICR / Johns Hopkins, os pesquisadores usaram um modelo de Markov oculto para calcular a probabilidade de uma citosina dentro do contexto de uma ilha CpG ser metilada.

A equipe primeiro validou seu algoritmo em amplicons de PCR de Escherichia coli cepas sem eventos de metilação, comparando seus resultados aos parâmetros de referência do Oxford Nanopore. Em seguida, eles induziram metilação no mesmo E. coli Os amplicons de PCR, convertendo a citosina em um contexto CpG em 5-metilcitosina, e validou que os locais foram de fato metilados usando o sequenciamento de bissulfito. Eles então sequenciaram os amplicons no MinIon e alinharam os dados com os parâmetros de referência. Por causa da metilação, havia muitos k-mers que diferiam significativamente dos modelos de referência.

A equipe então procurou desenvolver um algoritmo que fosse capaz de identificar essas diferenças. Eles fizeram isso criando um novo "alfabeto", no qual a chamada de base identificou não apenas A, C, G e T, mas também 5-metilcitosina dentro das ilhas CpG, que eles classificaram como M.

Finalmente, o grupo testou seu modelo em uma linha de células de linfoblastos humanos com metilação conhecida junto com dois controles - um negativo para metilação e um positivo para metilação.

Embora o modelo tenha sido capaz de detectar 5-mC no contexto de CpGs, ele não foi capaz de detectar metilação fora desse contexto ou identificar k-mers que tinham uma mistura de CpGs metilados e não metilados.

Para determinar a precisão, os pesquisadores amostraram aleatoriamente 100.000 sítios singleton dos conjuntos de dados de controle positivo e negativo, determinando que seus resultados tinham uma precisão de 82 por cento. Ao aumentar o rigor para fazer uma chamada, eles conseguiram aumentar a precisão dessas chamadas para 95 por cento, mas fizeram menos chamadas no total.

Da mesma forma, a equipe da UCSC também usou um modelo de Markov oculto (HMM) para detectar metilação, mas combinou-o com um modelo de mistura de processo de Dirichlet hierárquico (HDM) - um método que "compartilha força estatística para estimar de forma robusta um conjunto de distribuições complexas", o autores escreveram. Eles descobriram que a incorporação de HDM "aumenta a capacidade do HMM de detectar variantes da citosina". Além disso, eles desenvolveram sua ferramenta para ser capaz de distinguir a 5-metilcitosina e a 5-hidroximetilcitosina.

Para testar seu modelo, a equipe da UCSC gerou fitas de DNA sintéticas compostas de citosina, 5-mC ou 5-hmC. Após o sequenciamento, eles alinharam as fitas modelo e complementar a uma sequência de referência e, em seguida, usaram seu modelo HMM-HDM para classificar cada fita. Ao comparar os três, eles foram capazes de classificar as citosinas com uma precisão média de 76 por cento para as fitas do molde e 70 por cento para a do complemento. Quando apenas chamando citosinas metiladas versus não metiladas, a precisão média aumentou para 83 por cento e 78 por cento para o molde e as fitas complementares, respectivamente.

Ambos os grupos descobriram que a precisão variava com base no contexto da sequência. A equipe OICR / Johns Hopkins descobriu que a metilação era mais provável de ser detectada quando ocorria na quinta ou sexta posição no 6-mer, em vez da primeira posição. A equipe da UCSC também observou que "algumas citosinas modificadas são prontamente capturadas, enquanto outras não são discerníveis".

Ambos os grupos também escreveram que seus métodos poderiam ser estendidos para identificar outras bases modificadas. "Parece provável que a tendência geral de detecção via modulação da corrente de nanopore se manterá verdadeira em qualquer tipo de sequenciamento baseado em poros", escreveram os autores do estudo OICR / Johns Hopkins. Além disso, "modelos gerais de outros danos ao DNA, resultantes de metais pesados, oxidação, danos UV ou outras alterações podem ser detectados no DNA natural com este método", escreveram eles.


Discussão

Aqui nós relatamos alterações na metilação do DNA de espermatozoides associadas com a idade. Curiosamente, nossos dados estão em contraste com relatórios anteriores de alterações de metilação associadas à idade em células somáticas. A literatura recente sugere hipometilação global associada à idade com hipermetilação regional (associada ao gene) no tecido somático [20], [21]. Em contraste, nossos dados revelam hipermetilação associada à idade globalmente com um forte viés em direção à hipometilação regional. Isso é menos surpreendente quando levamos em consideração o fato de que os espermatozoides são conhecidos por ter outras modificações associadas à idade que desafiam as convenções (ou seja, o comprimento dos telômeros) [26] - [28]. Curiosamente, embora as alterações de metilação relatadas aqui sejam relativamente sutis, elas são surpreendentemente significativas e são comuns entre indivíduos em várias idades e intervalos entre as coleções, sugerindo que essas regiões são alteradas consistentemente ao longo do tempo de forma linear. É importante ressaltar que parece que muitas regiões significativamente alteradas estão em loci que podem contribuir para várias doenças conhecidas por terem maior incidência na prole de pais mais velhos. O acoplamento destes com nossos dados demonstrando que nenhum termo ou via de GO é regulado para cima ou para baixo no esperma, como resultado do processo de envelhecimento, sugere que as alterações que observamos são o resultado da suscetibilidade genômica regional à alteração de metilação e não a ativação ou inibição de qualquer programa celular. Esta hipótese também se coaduna bem com a natureza linear das alterações que observamos na maioria dos loci. Embora a natureza dessa suscetibilidade seja difícil de elucidar, ela pode estar relacionada à arquitetura da cromatina.

Deve-se notar que embora tenhamos identificado muitas alterações intrigantes no metiloma do esperma, elas provavelmente não representam todas as regiões consistentemente alteradas que ocorrem no esperma ao longo do tempo. Nossa abordagem foi identificar alterações com o uso de uma “matriz de promotor” que possui vieses inerentes. Especificamente, a matriz é ladrilhada com uma densidade mais alta de sondas no promotor ou nas regiões densas do gene. Juntamente com o uso de um tamanho de janela restrito (1000 bps) para pesquisar o genoma, isso resulta em uma tendência para a identificação de regiões que estão bem cobertas na matriz. Embora esse viés seja real, ele não invalida as regiões que identificamos, mas sugere que mais regiões podem ser afetadas com cobertura insuficiente na matriz. Além disso, existem preocupações inerentes com a coleta de tecidos ao longo do tempo. Uma dessas preocupações é a diferença nos métodos de congelamento ao longo dos anos e o papel que isso pode desempenhar nos perfis de metilação. Embora seja improvável que isso por si só possa afetar os perfis de metilação, as variações ao longo do tempo ainda devem ser relatadas. O protocolo de nosso laboratório para congelamento de amostras tem sido consistente para os tempos de coleta de todas as amostras incluídas neste estudo. Temos usado o mesmo criomédio, tampão de gema de teste, ao longo desses anos. É improvável, então, que os padrões de metilação nessas amostras sejam afetados com base em qualquer uma dessas variáveis ​​e, portanto, as perturbações aqui identificadas representam uma verdadeira mudança biológica para o epigenoma do esperma. Isso é apoiado por nosso conjunto de dados de replicação, no qual amostras de jovens e idosos foram coletadas simultaneamente.

Localização de regiões alteradas

Para investigar os atributos das regiões que determinamos serem mais suscetíveis às alterações de metilação, avaliamos a co-localização de loci significativamente alterados em nosso estudo com regiões de retenção de nucleossomos no esperma maduro. Parece que os eventos de hipometilação são mais comumente associados a locais de retenção de nucleossomos. Deve-se notar que nossos critérios para locais de retenção de nucleossomos são simplesmente que nossos locais de alteração ocorrem dentro de 1 kb de locais de retenção conhecidos e, portanto, pode haver um grau maior de complexidade nos locais reais de alteração de metilação do que identificamos. A natureza real dos padrões de metilação em uma resolução mais alta nessas regiões (se as regiões afetadas são flanqueadoras ou diretamente associadas com histonas) é difícil de elucidar devido à natureza do agrupamento em muitos dos loci que identificamos. Curiosamente, esta mesma co-localização não foi observada com eventos de hipermetilação. Embora os padrões de colocalização sejam significativamente diferentes entre os eventos de hipometilação e hipermetilação, deve-se notar que o tamanho da amostra é muito pequeno no grupo de hipermetilação (8 janelas significativas). Também deve ser observado que, embora a co-localização de histonas e os eventos de hipometilação que observamos em nosso estudo sejam significativos, as marcas de metilação observadas são provavelmente estabelecidas mais cedo na espermatogênese e, portanto, podem não ser afetadas pela arquitetura do nucleossomo no espermatozóide totalmente amadurecido . Além disso, as alterações identificadas neste estudo não estão localizadas em todos os lugares em que as histonas são retidas, portanto, a retenção do nucleossomo por si só não pode ser a força motriz independente da suscetibilidade regional às alterações de metilação. Deve-se notar ainda que nossa abordagem não foi direcionada para observar mudanças nos padrões de colocalização da cromatina e, como tal, isso representa uma análise secundária desses padrões com o uso de uma "matriz de promotor". Como resultado da observação de apenas uma parte selecionada do genoma, existem vieses claros que são introduzidos que devem ser levados em consideração ao considerar essas descobertas.

A literatura recente sugere uma hipótese interessante de “seleção espermatogonial egoísta” que também pode ter aplicação neste estudo [29]. Resumidamente, a hipótese afirma que algumas mutações genéticas que são causadoras de anormalidades na prole são benéficas para a espermatogênese e tornam-se enriquecidas ao longo do processo de envelhecimento em células-tronco espermatogônias. Assim, os espermatozoides portadores dessas mutações tornam-se mais frequentes na população em detrimento da prole. Da mesma forma, é possível que as alterações de metilação associadas à idade que identificamos possam estar em regiões que são importantes para a espermatogênese e, portanto, seriam selecionadas. Embora os genes aqui identificados não sejam pontos de acesso de espermatogênese bem conhecidos, eles podem estar próximos de outros genes que são importantes no desenvolvimento e, portanto, podem estar sujeitos a um estado de cromatina mais solto, deixando esses genes mais suscetíveis a perturbações de metilação.

Os eventos de hipometilação que identificamos podem ocorrer como resultado de desmetilação ativa ou passiva. Por exemplo, a atividade de transcrição regional em loci importantes na espermatogênese provavelmente seria acompanhada por uma estrutura de cromatina relaxada que poderia resultar em aumento da frequência de danos ao DNA ao longo do tempo. Marcas de metilação estabelecidas localizadas nesta região podem ser removidas passivamente por meio de mecanismos de reparo no espermatozóide em desenvolvimento. Se a remoção dessa marca for benéfica ou não tiver efeito sobre a espermatogênese, ela persistirá e, com o tempo, marcas semelhantes podem se acumular em CpGs próximos, levando ao perfil que identificamos em nosso estudo. Também deve ser observado que o acúmulo de mutações de novo pode levar a um perfil semelhante. É claro que o número de mutações no esperma aumenta com a idade, e se essas mutações envolverem a desaminação de resíduos de citosina, a sequência resultante pode aparecer como uma perda de metilação com as tecnologias aqui utilizadas. No entanto, a carga de mutação e, especificamente, essas transições de C para T, nos espermatozoides são de natureza estocástica e, portanto, não podem ser o principal fator de condução para os hotspots genômicos de hipometilação associada à idade vistos em virtualmente todos os indivíduos examinados [30]. Alternativamente, a remoção enzimática ativa de marcas de metilação no esperma pode levar a alterações de metilação associadas à idade. Para que isso seja mecanicamente plausível, teríamos que assumir que a hipometilação nas janelas que identificamos é sempre benéfica para a espermatogênese. Embora qualquer um desses mecanismos seja plausível, é provável que os efeitos que identificamos envolvam alguma combinação de ambos.

A mecânica dos eventos de hipermetilação com a idade são mais difíceis de elucidar, pois isso, por definição, tem que ser um processo direcionado ativo envolvendo enzimas metiltransferases. No entanto, algumas evidências deste estudo indicam que a sequência de DNA pode ser um importante fator de hipermetilação relacionada à idade. Das 7 janelas que identificamos com hipermetilação associada ao gene com a idade, 4 estão associadas à família FAM86 de genes que são categorizados não pela função da proteína ou localização genômica, mas sim pela similaridade de sequência. Isso sugere fortemente que, pelo menos em parte, os eventos de hipermetilação associados à idade em loci específicos são direcionados, direta ou indiretamente, pela sequência de DNA. Curiosamente, esta família de genes (FAM86) com função desconhecida foi recentemente categorizada com uma família maior de genes de metiltransferase, embora não esteja claro quais são os alvos FAM86 (DNA, histona, outras proteínas, etc.). É importante notar que, além desses eventos regionais de hipermetalação, globalmente a metilação do DNA também está acentuadamente aumentada. O possível papel das modificações da cromatina (modificações da cauda da histona, etc.) neste processo também é importante observar, pois o que identificamos pode estar relacionado à metilação regional das histonas, acetilação, etc. Essas modificações das histonas podem refletir alterações transcricionais subjacentes durante a espermatogênese. Tomados em conjunto, os mecanismos que conduzem as alterações de metilação relacionadas à idade nos espermatozoides permanecem elusivos, mas provavelmente envolvem modificações de metilação ativa e passiva.

Significado biológico

É importante considerar duas questões na determinação dos impactos biológicos das mudanças de metilação identificadas neste estudo. Em primeiro lugar, as alterações de metilação aqui descritas são capazes de alterações transcricionais? Em segundo lugar, essas mudanças de metilação são capazes de evitar a reprogramação da metilação embrionária? Independentemente do mecanismo pelo qual essas marcas de metilação são alteradas no espermatozóide ao longo do tempo, é impressionante que essas mudanças ocorram com tal consistência entre os indivíduos e tenham uma associação tão estreita com a idade que foi observada tanto na análise de doador pareado quanto na coorte independente análise. Isso contrasta fortemente com a estabilidade relativa do metiloma do esperma, visto ao longo do tempo em cada indivíduo na maior parte do genoma. Uma limitação desses achados, entretanto, é a magnitude das alterações que descobrimos. Conforme descrito anteriormente, a alteração média da metilação da fração por ano foi de aproximadamente uma mudança de 0,281%. Embora pareça relativamente pequeno, quando expandido para incluir os possíveis anos reprodutivos razoáveis ​​em um homem, a mudança seria de 10–12%. O aumento da magnitude da mudança com o aumento da idade é fortemente apoiado por nosso estudo de coorte independente, onde um aumento na diferença de idade entre dois grupos foi diretamente correlacionado com um aumento na magnitude das alterações de metilação em virtualmente todos os locus selecionados de uma maneira relativamente linear. É importante ressaltar que, com base em nossa análise de sequências de nucleotídeos completas de nossos dados de sequenciamento, parece que esta diminuição de 10-12% reflete mudanças em CpGs aleatórios dentro de janelas de suscetibilidade em todos os espermatozoides, que se manifestariam em um espermatozóide individual como uma região metilada mosaicamente. A mudança resultante de 10-12% na metilação dentro de cada espermatozóide individual (efetivamente 1 em cada 10 CpGs são desmetilados) sugere que cada espermatozóide carrega alterações semelhantes, mais sutis, dentro dessas regiões, em média.

It is important to note that because we only investigated a portion of the regions of interest in our sequencing run (used for confirmation of array results) and the amplicons we probed made up only a portion of the regions of interest, we can not make a definitive overarching statement about the dynamics of methylation profile population shifts in sperm as a result of age. Despite this, the consistency of population shifts in the regions we were able to observe suggests that other regions of interest would likely follow similar patterns. Regardless, the resultant age-associated epigenetic landscape alterations may contribute to disease susceptibility in the offspring despite the small degree of change though the increased risk to the offspring may be relatively small. Figure 7 illustrates the alterations seen at two representative loci from our analysis, Dopamine receptor D4 (DRD4 ENSG00000170956) and tenascin XB (TNXB ENSG00000168477).


Если ваш хронологический возраст составляет 50 лет, а биологический – 35, отлично! Вам повезло!

Но если ваш хронологический возраст составляет 35 лет, а биологический – 50, это уже тревожный признак того, что нужно изменить образ жизни. Ускоренное старение связано с возможностью повышенного риска серьезной болезни.

Эпигенетика может и не быть Источником Молодости, но ее точно можно назвать Источником Жизни.

Так узнайте сколько же Вам лет на самом деле!

Наш биологический возраст – лучший параметр нашего здоровья и продолжительности жизни по сравнению с нашим хронологическим возрастом.

Но как мы узнаем наш “биологический возраст”?

Считалось, что если мы сможем определить истинный “биологический возраст”, то сможем протестировать и разработать меры, которые замедлят темпы биологического старения. В течение последних десятилетий были приложены огромные усилия для определения различных параметров, которые могли бы предсказать “биологическое старение” и продолжительность жизни, таких как показатели хрупкости, поседения волос, старения кожи, уровни различных видов лейкоцитов. Однако большинство из этих маркеров не дают никаких преимуществ по сравнению со знанием вашего хронологического возраста.

Эпигенетика открывает новые подходы к определению истинного возраста. В связи с этим возникают два важных вопроса: что такое ДНК и почему она важна?

Более 99% нашей ДНК идентична ДНК других людей. Тем не менее, небольшая часть ДНК, которая отличается у разных людей, делает нас уникальными.

После обширного анализа данных мы обнаружили одну область метилирования цитозина, достаточную для точного прогнозирования биологического возраста с использованием слюны.

Хотя до сих пор не ясно, как можно замедлить старение путем изменений образа жизни, рекомендованных большинством национальных медицинских ассоциаций, возможно, это только начало. Пожилой возраст – это “красный флаг”, который говорит о том, что, возможно, пришло время внести некоторые изменения в образ жизни.


Algumas descobertas recentes

  • Review - Germline epigenetic inheritance: Challenges and opportunities for linking human paternal experience with offspring biology and healthΒ] "Recently, novel experimental approaches and molecular techniques have demonstrated that a male's experiences can be transmitted through his germline via epigenetic processes. These findings suggest that paternal exposures influence phenotypic variation in unexposed progeny-a proposal that runs counter to canonical ideas about inheritance developed during the 20th century. Nevertheless, support for paternal germline epigenetic inheritance (GEI) in nonhuman mammals continues to grow and the mechanisms underlying this phenomenon are becoming clearer. To what extent do similar processes operate in humans, and if so, what are their implications for understanding human phenotypic variation, health, and evolution? Here, we review evidence for GEI in human and nonhuman mammals and evaluate these findings in relation to historical conceptions of heredity."
  • DNA methylation in Schwann cells and in oligodendrocytesΓ] "DNA methylation is one of many epigenetics marks, which directly modifies base residues, usually cytosines, in a multiple-step cycle. It has been linked to the regulation of gene expression and alternative splicing in several cell types, including during cell lineage specification and differentiation processes. DNA methylation changes have also been observed during aging, and aberrant methylation patterns have been reported in several neurological diseases. We here review the role of DNA methylation in Schwann cells and oligodendrocytes, the myelin-forming glia of the peripheral and central nervous systems, respectively. We first address how methylation and demethylation are regulating myelinating cells' differentiation during development and repair. We then mention how DNA methylation dysregulation in diseases and cancers could explain their pathogenesis by directly influencing myelinating cells' proliferation and differentiation capacities."
  • The role and mechanisms of DNA methylation in the oocyteΔ] "Epigenetic information in the mammalian oocyte has the potential to be transmitted to the next generation and influence gene expression this occurs naturally in the case of imprinted genes. Therefore, it is important to understand how epigenetic information is patterned during oocyte development and growth. Here, we review the current state of knowledge of de novo DNA methylation mechanisms in the oocyte: how a distinctive gene-body methylation pattern is created, and the extent to which the DNA methylation machinery reads chromatin states. Recent epigenomic studies building on advances in ultra-low input chromatin profiling methods, coupled with genetic studies, have started to allow a detailed interrogation of the interplay between DNA methylation establishment and chromatin states however, a full mechanistic description awaits."
  • Review - Reevaluation of FMR1 Hypermethylation Timing in Fragile X Syndromeΐ] "Fragile X syndrome (FXS) is one of the most common heritable forms of cognitive impairment. It results from a fragile X mental retardation protein (FMRP) protein deficiency caused by a CGG repeat expansion in the 5'-UTR of the X-linked FMR1 gene. Whereas in most individuals the number of CGGs is steady and ranges between 5 and 44 units, in patients it becomes extensively unstable and expands to a length exceeding 200 repeats (full mutation). Interestingly, this disease is exclusively transmitted by mothers who carry a premutation allele (55-200 CGG repeats). When the CGGs reach the FM range, they trigger the spread of abnormal DNA methylation, which coincides with a switch from active to repressive histone modifications. This results in epigenetic gene silencing of FMR1 presumably by a multi-stage, developmentally regulated process. The timing of FMR1 hypermethylation and transcription silencing is still hotly debated. There is evidence that hypermethylation varies considerably between and within the tissues of patients as well as during fetal development, thus supporting the view that FMR1 silencing is a post-zygotic event that is developmentally structured. On the other hand, it may be established in the female germ line and transmitted to the fetus as an integral part of the mutation. This short review summarizes the data collected to date concerning the timing of FMR1 epigenetic gene silencing and reassess the evidence in favor of the theory that gene inactivation takes place by a developmentally regulated process around the 10th week of gestation." Fragile X
  • Maintenance of Mest imprinted methylation in blastocyst-stage mouse embryos is less stable than other imprinted loci following superovulation or embryo cultureΕ] "Assisted reproductive technologies are fertility treatments used by subfertile couples to conceive their biological child. Although generally considered safe, these pregnancies have been linked to genomic imprinting disorders, including Beckwith-Wiedemann and Silver-Russell Syndromes. Silver-Russell Syndrome is a growth disorder characterized by pre- and post-natal growth retardation. The Mest imprinted domain is one candidate region on chromosome 7 implicated in Silver-Russell Syndrome. We have previously shown that maintenance of imprinted methylation was disrupted by superovulation or embryo culture during pre-implantation mouse development. For superovulation, this disruption did not originate in oogenesis as a methylation acquisition defect. However, in comparison to other genes, Mest exhibits late methylation acquisition kinetics, possibly making Mest more vulnerable to perturbation by environmental insult. In this study, we present a comprehensive evaluation of the effects of superovulation and in vitro culture on genomic imprinting at the Mest gene. Superovulation resulted in disruption of imprinted methylation at the maternal Mest allele in blastocysts with an equal frequency of embryos having methylation errors following low or high hormone treatment. This disruption was not due to a failure of imprinted methylation acquisition at Mest in oocytes. For cultured embryos, both the Fast and Slow culture groups experienced a significant loss of maternal Mest methylation compared to in vivo-derived controls. This loss of methylation was independent of development rates in culture. These results indicate that Mest is more susceptible to imprinted methylation maintenance errors compared to other imprinted genes." Chromosome 7

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  • The DNA methylation landscape of human early embryosΖ] "DNA methylation is a crucial element in the epigenetic regulation of mammalian embryonic development.We show that the major wave of genome-wide demethylation is complete at the 2-cell stage, contrary to previous observations in mice. Moreover, the demethylation of the paternal genome is much faster than that of the maternal genome, and by the end of the zygotic stage the genome-wide methylation level in male pronuclei is already lower than that in female pronuclei.
  • DNA methylation dynamics of the human preimplantation embryoΗ] "In mammals, cytosine methylation is predominantly restricted to CpG dinucleotides and stably distributed across the genome, with local, cell-type-specific regulation directed by DNA binding factors. . We present genome-scale DNA methylation maps of human preimplantation development and embryonic stem cell derivation, confirming a transient state of global hypomethylation that includes most CpGs, while sites of residual maintenance are primarily restricted to gene bodies. Together, our data confirm that paternal genome demethylation is a general attribute of early mammalian development that is characterized by distinct modes of epigenetic regulation."
  • Materno genome-wide DNA methylation patterns and congenital heart defects⎖] "The majority of congenital heart defects (CHDs) are thought to result from the interaction between multiple genetic, epigenetic, environmental, and lifestyle factors. Epigenetic mechanisms are attractive targets in the study of complex diseases because they may be altered by environmental factors and dietary interventions. . We present preliminary evidence that alterations in maternal DNA methylation may be associated with CHDs. Our results suggest that further studies involving maternal epigenetic patterns and CHDs are warranted. Multiple candidate processes and pathways for future study have been identified."
  • Epigenetics 2010⎗] "This collection brings together twenty Research Articles published in five PLoS journals in the area of epigenetics during 2010, along with a Research in Translation article and two Primers. They reflect a range of model systems and organisms, and variously offer phenotypic, mechanistic, and chromatin-based insights."
  • Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.⎘] "Our data indicate that nuclear transfer is more effective at establishing the ground state of pluripotency than factor-based reprogramming, which can leave an epigenetic memory of the tissue of origin that may influence efforts at directed differentiation for applications in disease modelling or treatment." (More? Stem Cells)

Programming of DNA Methylation Patterns

DNA methylation represents a form of genome annotation that mediates gene repression by serving as a maintainable mark that can be used to reconstruct silent chromatin following each round of replication. During development, germline DNA methylation is erased in the blastocyst, and a bimodal pattern is established anew at the time of implantation when the entire genome gets methylated while CpG islands are protected. This brings about global repression and allows housekeeping genes to be expressed in all cells of the body. Postimplantation development is characterized by stage- and tissue-specific changes in methylation that ultimately mold the epigenetic patterns that define each individual cell type. This is directed by sequence information in DNA and represents a secondary event that provides long-term expression stability. Abnormal methylation changes play a role in diseases, such as cancer or fragile X syndrome, and may also occur as a function of aging or as a result of environmental influences.


Assista o vídeo: O que é DNA? Como funciona e quais as suas funções (Novembro 2021).