Em formação

Funcionamento do BRCA2


Eu sei que BRCA2 interage com RAD51 para reparar danos no DNA.

Mas como exatamente funciona? Quais são as outras proteínas que interagem com ele?


Estou apenas dando uma olhada nele agora, mas esta revisão de 2011 na Nature Reviews Cancer parece que tem tudo que você poderia querer saber sobre a via BRCA1 / BRCA2. Se você não tiver acesso ao periódico, a primeira página desta busca no Google deve ter um link em PDF para Researchgate na parte inferior, ou você pode tentar este link direto.

Peço desculpas pela resposta "somente link", mas há uma tonelada de informações no papel e seria bastante difícil resumi-las em apenas alguns parágrafos. Esta é uma questão bastante ampla, então talvez você possa ler a revisão e as referências e, se ainda tiver perguntas específicas sobre os caminhos ou interações, pode fazer outra pergunta.


Aqui está uma imagem orientada para BRCA2 e RAD51. (Eu produzi isso usando PyMOL!)

A parte cor de chocolate é algumas repetições BRCA. Você pode ver como as repetições BRCA e RAD51 são orientadas. Aqui, a associação é mostrada apenas para uma das 7 subunidades de RAD51

O mecanismo exato em resumo:.

  1. BRCA2 liga-se a subunidades RAD51 dentro do anel através do mimetismo de repetição BRC do motivo de polimerização RAD51.

2. O BRC repete desmonta o anel.

3. O complemento RAD51: BRCA2 é recrutado para uma quebra de fita dupla de DNA.

4.BRCA2 ajuda a deslocar uma proteína protetora, proteína de replicação A-RPA, e se liga ao substrato de ssDNA primário por suas dobras B.

5. Carrega RAD51 no DNA. A reação de transferência pode ser facilitada pela atração de DNA pelos arcos helicoidais de repetição BRC carregados positivamente. (3) ou em trans para o dsDNA que mais tarde serve como molde de DNA homólogo (6) e o arco carregado positivamente também pode ajudar a atrair o molde de dsDNA.

Fonte: Yang et al. 2002, Shin et al 2003

Agradeço a Nicholas Provert por me ensinar noções básicas de PyMOL no Coursera.


O BRCA1 e BRCA2 Genes

Os genes mais comumente afetados no câncer hereditário de mama e ovário são os câncer de mama 1 (BRCA1) e câncer de mama 2 (BRCA2) genes. Cerca de 3% dos cânceres de mama (cerca de 7.500 mulheres por ano) e 10% dos cânceres de ovário (cerca de 2.000 mulheres por ano) resultam de mutações hereditárias no BRCA1 e BRCA2 genes.

Normalmente, o BRCA1 e BRCA2 os genes protegem você de contrair certos tipos de câncer. Mas algumas mutações no BRCA1 e BRCA2 os genes os impedem de funcionar corretamente, de modo que, se você herdar uma dessas mutações, terá maior probabilidade de ter câncer de mama, ovário e outros tipos de câncer. No entanto, nem todo mundo que herda um BRCA1 ou BRCA2 mutação causará câncer de mama ou de ovário.

Todo mundo tem duas cópias do BRCA1 e BRCA2 genes, uma cópia herdada de sua mãe e uma de seu pai. Mesmo que uma pessoa herde um BRCA1 ou BRCA2 mutação de um dos pais, eles ainda têm a cópia normal do BRCA1 ou BRCA2 gene do outro progenitor. O câncer ocorre quando ocorre uma segunda mutação que afeta a cópia normal do gene, de modo que a pessoa não tem mais uma BRCA1 ou BRCA2 gene que funciona corretamente. Ao contrário do herdado BRCA1 ou BRCA2 mutação, a segunda mutação não estaria presente em todo o corpo da pessoa, mas apenas no tecido canceroso.

O câncer de mama e de ovário também pode ser causado por mutações herdadas em outros genes que não BRCA1 e BRCA2. Isso significa que em algumas famílias com histórico de câncer de mama e ovário, os membros da família não terão mutações em BRCA1 ou BRCA2, mas pode ter mutações em um desses outros genes. Essas mutações podem ser identificadas por meio de testes genéticos usando painéis multigênicos, que procuram mutações em vários genes diferentes ao mesmo tempo.

Você e seus familiares são mais propensos a ter um BRCA1 ou BRCA2 mutação se sua família tem um forte histórico de câncer de mama ou de ovário. Membros da família que herdam BRCA1 e BRCA2 mutações geralmente compartilham a mesma mutação. Se um de seus familiares tem um conhecido BRCA1 ou BRCA2 mutação, outros membros da família que fazem o teste genético devem ser verificados para essa mutação.

Se você está preocupado com a possibilidade de ter um BRCA1, BRCA2, ou outra mutação relacionada ao câncer de mama e de ovário, o primeiro passo é coletar seu histórico de saúde familiar de câncer de mama e de ovário e compartilhar essas informações com seu médico.


Conteúdo

Embora as estruturas dos genes BRCA1 e BRCA2 sejam muito diferentes, pelo menos algumas funções estão inter-relacionadas. As proteínas feitas por ambos os genes são essenciais para reparar o DNA danificado (ver Figura das etapas de reparo recombinacional). BRCA2 se liga ao DNA de fita simples e interage diretamente com a recombinase RAD51 para estimular [27] e manter [28] a invasão da fita, uma etapa vital da recombinação homóloga. A localização de RAD51 na quebra da fita dupla de DNA requer a formação do complexo BRCA1-PALB2-BRCA2. PALB2 (parceiro e localizador de BRCA2) [29] pode funcionar sinergicamente com uma quimera BRCA2 (denominada piccolo ou piBRCA2) para promover ainda mais a invasão da fita. [30] Essas quebras podem ser causadas por radiação natural e médica ou outras exposições ambientais, mas também ocorrem quando os cromossomos trocam material genético durante um tipo especial de divisão celular que cria espermatozoides e óvulos (meiose). Quebras de fita dupla também são geradas durante o reparo de ligações cruzadas de DNA. Ao reparar o DNA, essas proteínas desempenham um papel na manutenção da estabilidade do genoma humano e na prevenção de rearranjos de genes perigosos que podem levar a cânceres hematológicos e outros.

BRCA2 demonstrou possuir um papel crucial na proteção contra a degradação nucleolítica dependente de MRE11 das forquilhas invertidas que estão se formando durante a replicação do DNA em bifurcação (causada por obstáculos como mutações, agentes intercalantes, etc.). [31]

Como o BRCA1, o BRCA2 provavelmente regula a atividade de outros genes e desempenha um papel crítico no desenvolvimento do embrião.

Certas variações do gene BRCA2 aumentam os riscos de câncer de mama como parte de uma síndrome hereditária de câncer de mama-ovário. Os pesquisadores identificaram centenas de mutações no gene BRCA2, muitas das quais causam um risco aumentado de câncer. Mutações BRCA2 são geralmente inserções ou deleções de um pequeno número de pares de bases de DNA no gene. Como resultado dessas mutações, o produto proteico do gene BRCA2 é anormal e não funciona adequadamente. Os pesquisadores acreditam que a proteína BRCA2 defeituosa é incapaz de consertar os danos ao DNA que ocorrem em todo o genoma. Como resultado, há um aumento nas mutações devido à síntese de translesão propensa a erros após danos não reparados ao DNA, e algumas dessas mutações podem fazer com que as células se dividam de forma descontrolada e formem um tumor.

Pessoas com duas cópias mutadas do gene BRCA2 têm um tipo de anemia de Fanconi. Essa condição é causada por níveis extremamente reduzidos da proteína BRCA2 nas células, o que permite o acúmulo de DNA danificado. Pacientes com anemia de Fanconi são propensos a vários tipos de leucemia (um tipo de câncer de células do sangue), tumores sólidos, principalmente de cabeça, pescoço, pele e órgãos reprodutivos e supressão da medula óssea (redução da produção de células do sangue que leva à anemia). Mulheres que herdaram um gene BRCA1 ou BRCA2 defeituoso têm riscos de câncer de mama e de ovário tão altos e parecem tão seletivos que muitos portadores da mutação optam por uma cirurgia profilática. Tem havido muitas conjecturas para explicar essa especificidade de tecido aparentemente notável. Os principais determinantes de onde ocorrem os cânceres hereditários associados ao BRCA1 e BRCA2 estão relacionados à especificidade do tecido do patógeno do câncer, o agente que causa a inflamação crônica ou o carcinógeno. O tecido-alvo pode ter receptores para o patógeno, tornar-se seletivamente exposto a agentes cancerígenos e a um processo infeccioso. Um déficit genômico inato prejudica as respostas normais e exacerba a suscetibilidade a doenças em órgãos-alvo. Esta teoria também se encaixa nos dados de vários supressores de tumor além de BRCA1 ou BRCA2. Uma grande vantagem desse modelo é que ele sugere que existem algumas opções além da cirurgia profilática. [32]

Além do câncer de mama em homens e mulheres, as mutações no BRCA2 também aumentam o risco de câncer de ovário, trompa de Falópio, próstata e pancreático. Em alguns estudos, as mutações na parte central do gene foram associadas a um risco maior de câncer de ovário e a um risco menor de câncer de próstata do que as mutações em outras partes do gene. Vários outros tipos de câncer também foram observados em certas famílias com mutações BRCA2.

Em geral, mutações genéticas fortemente herdadas (incluindo mutações em BRCA2) são responsáveis ​​por apenas 5-10% dos casos de câncer de mama. O risco específico de desenvolver câncer de mama ou outro tipo de câncer para qualquer pessoa portadora de uma mutação BRCA2 depende de muitos fatores. [33]

O gene foi clonado pela primeira vez por cientistas da Myriad Genetics, Endo Recherche, Inc., HSC Research & amp Development Limited Partnership e da Universidade da Pensilvânia. [36]

Métodos para diagnosticar a probabilidade de um paciente com mutações em BRCA1 e BRCA2 contrair câncer foram cobertos por patentes pertencentes ou controladas pela Myriad Genetics. [37] [38] O modelo de negócios da Myriad de oferecer exclusivamente o teste de diagnóstico levou desde o início da Myriad como uma startup em 1994 até ser uma empresa de capital aberto com 1200 funcionários e cerca de US $ 500 milhões em receita anual em 2012 [39], também levou a polêmica sobre os altos preços dos testes e a indisponibilidade de segundas opiniões de outros laboratórios de diagnóstico, o que por sua vez levou ao marco Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics ação judicial. [40]


BRCA1 em complexo com BARD1 é uma ubiquitina ligase E3 crítica para a integridade do genoma

O gene 1 de suscetibilidade ao câncer de mama (BRCA1) é um gene supressor de tumor, cujas mutações da linha germinativa estão ligadas a cânceres de mama e ovário familiares (Hall et al., 1990 Futreal et al., 1994 Godwin et al., 1994 Miki et al., 1994). Mais de duas décadas de pesquisa implicou a função BRCA1 em várias vias celulares, incluindo regulação da transcrição, sinalização de danos no DNA, pontos de verificação do ciclo celular, regulação do centrossoma e no reparo de DSBs de DNA por meio de HR (Moynahan et al., 1999 Xu et al., 1999 Deng, 2002, 2006 Yarden et al., 2002 Caestecker e Van de Walle, 2013 Hill et al., 2014 Hatchi et al., 2015). De importância crítica, seu papel na promoção de RH está diretamente ligado à manutenção da integridade do genoma (Roy et al., 2011 Prakash et al., 2015).

Em humanos, a proteína BRCA1 de 1.863 aminoácidos tem um domínio RING N-terminal (R eally Interesting New G ene) que coordena dois cátions de zinco em um arranjo cruzado, uma região central amplamente não estruturada codificada pelo exon11, seguido por um domínio da bobina enrolada e duas repetições de BRCT C-terminal (Figura 1). Os domínios RING criam uma plataforma de ligação às enzimas de conjugação da ubiquitina E2 e facilitam a transferência da ubiquitina do E2 para os substratos, especificando assim a atividade da ubiquitina ligase E3 (Deshaies e Joazeiro, 2009). As repetições BRCT são módulos de interação de fosfopeptídeos para ligação a proteínas fosforiladas (Manke et al., 2003 Rodriguez et al., 2003 Yu et al., 2003). BRCA1 forma um heterodímero com seu parceiro de ligação obrigatório BARD1 (B RCA1- A ssociated R ING D omain proteína 1) através de suas regiões N-terminais e o heterodímero exibe eficiente atividade de transferência de ubiquitina (Wu et al., 1996 Meza et al., 1999 Brzovic et al., 2001 Hashizume et al., 2001 Baer e Ludwig, 2002). A proteína BARD1 tem 777 aminoácidos de comprimento e é semelhante a BRCA1, contém um domínio RING em seu terminal N e duas repetições de BRCT em seu terminal C (Figura 1). Além disso, quatro repetições de anquirina envolvidas no reconhecimento da cromatina de cromátides irmãs recentemente replicadas estão presentes no meio da proteína (Fox III, Le Trong et al., 2008 Nakamura et al., 2019). A maioria dos estudos indica que BARD1 é indispensável para a função de BRCA1 e a depleção de BARD1 leva a fenótipos altamente semelhantes aos observados para mutantes de BRCA1. Mutações no BARD1 foram identificadas em pacientes com câncer de mama, ovário e outros tipos de câncer, embora em uma frequência menor do que as mutações no BRCA1 (Thai et al., 1998 Ghimenti et al., 2002). Além disso, como com BRCA1, a perda de BARD1 resulta em letalidade embrionária em camundongos, bem como defeitos em HR levando à instabilidade cromossômica (McCarthy et al., 2003).

Estrutura do domínio das proteínas BRCA1 e BARD1. BRCA1 humano contém um domínio RING N-terminal, uma região central não estruturada codificada pelo grande exon11 seguido por um domínio em espiral (CC) e duas repetições BRCA1 C-terminal (BRCT). Tanto o humano quanto o camundongo expressam uma variante de splicing alternativo BRCA1 & # x0039411 que contém o domínio RING do terminal N e as repetições do BRCT do terminal C, mas não possui a região central não estruturada (Thakur et al., 1997 Huber et al., 2001). Esta proteína truncada é expressa na forma hipomórfica Brca1 & # x0039411/ & # x0039411 mouse. C. elegans BRC-1 é estruturalmente semelhante à variante de splicing BRCA1 & # x0039411 com a presença de um domínio RING N-terminal e duas repetições BRCT em seu terminal C. A. thaliana codifica um ortólogo BRCA1 de estrutura semelhante que tem um RING N-terminal e duas repetições BRCT C-terminal. BARD1 humano e C. elegans BRD-1 são semelhantes em tamanho e estrutura de domínio, contendo um domínio RING N-terminal, repetições de anquirina no meio e duas repetições BRCT C-terminal. A. thaliana BARD-1 tem uma estrutura de domínio semelhante, mas parece não ter repetições de anquirina, que não foram previstas pelo alinhamento de sequência. BRCA1 interage com BARD1 por meio de seus domínios RING para formar um heterodímero com atividade de ubiquitina ligase E3.

Os mecanismos pelos quais BRCA1-BARD1 promove HR durante o reparo DSB envolvem várias etapas. Em primeiro lugar, BRCA1 promove a ressecção da extremidade do DNA antagonizando 53BP1, uma proteína de resposta ao dano do DNA que promove a junção da extremidade não homóloga propensa a erros (NHEJ) (Bunting et al., 2010 Daley e Sung, 2014). Dois, BRCA1 regula o complexo MRE11-RAD50-NBS1-CtIP essencial para o processamento final do DNA (Cruz-Garcia et al., 2014 Aparicio et al., 2016). Também há evidências de que BRCA1 remove uma barreira de cromatina para ressecção de DNA por meio da ubiquitilação da histona H2A (Densham et al., 2016). Além de promover a ressecção, BRCA1-BARD1 se liga ao DNA e interage com RAD51 diretamente, aumentando a atividade de RAD51 recombinase ao promover a invasão da fita homóloga e a formação do complexo sináptico (Zhao et al., 2017). No entanto, se BRCA1 funciona por mecanismos semelhantes para promover HR durante a meiose para o reparo de DSBs induzidos por SPO11, permaneceu indefinido.


Interação funcional de FANCD2 monoubiquitinado e BRCA2 / FANCD1 em cromatina

FIGO. 1 Colocalização, cofracionamento e coimunoprecipitação de FANCD2 e BRCA2 monoubiquitinados em cromatina. (A) Colocalização de FANCD2 e BRCA2 em focos induzíveis por danos ao DNA. As células HeLa foram não tratadas, expostas a IR (2 ou 15 Gy) ou tratadas com MMC (80 ng / ml), conforme indicado. As células HeLa foram duplamente coradas com anticorpos policlonais anti-FANCD2 (E35) (vermelho) e monoclonais anti-BRCA2 (Ab-1) (verde) após o tempo de tratamento indicado. Ampliação, × 630. (B) Protocolo utilizado para o fracionamento nuclear de células. O citoplasma e o nucleoplasma foram extraídos por permeabilização com detergente, os núcleos resultantes foram digeridos com DNase I e a cromatina foi extraída com sulfato de amônio (NH2TÃO4) (C) Células U2OS, não tratadas ou expostas a IR (15 Gy) ou MMC (170 ng / ml), foram fracionadas 15 h após o início do dano ao DNA. Os sobrenadantes (S) e os pellets (P) foram submetidos a análise de Western blot com os anticorpos indicados: E35 para FANCD2 e Ab-1 para BRCA2. A presença de cromatina na fração S4 foi confirmada por blotting com anticorpo anti-histona H4. (D) As frações S2 (proteínas nucleares solúveis) e S4 (cromatina) de células U2OS foram submetidas a imunoprecipitação com anticorpo monoclonal de camundongo anti-BRCA2 (Ab-1) ou um anticorpo de camundongo de controle (mIgG) e então imunotransferidas com anti- BRCA2 (Ab-2) ou anticorpos anti-FANCD2 (E35). IgG de cadeia pesada foi usado como um controle de carregamento. (E) As células HeLa foram transfectadas com um cDNA que codifica HA-ubiquitina, conforme indicado. Após a transfecção, as células foram tratadas com a dose indicada de IR ou MMC. As frações S2 (proteínas nucleares solúveis) e S4 (cromatina) de células HeLa foram imunoprecipitadas (IP) com um anticorpo policlonal (E35) para FANCD2, conforme indicado. Os imunocomplexos foram executados em SDS-PAGE e imunotransferidos com anticorpos monoclonais anti-FANCD2 (FI-17) ou anti-HA (HA.11). WCE, extrato de célula inteira. FIGO. 2 FANCD2 monoubiquitinado promove montagem induzida por IR de focos BRCA2. (A) Extratos de células inteiras de fibroblastos PD20 (FA-D2) expressando de forma estável o vetor vazio (PD20F + Vec) e fibroblastos PD20 corrigidos com FANCD2 (PD20F + FANCD2) foram submetidos a imunoprecipitação com anti-BRCA2 monoclonal de camundongo (Ab-1) ou um anticorpo de controle de camundongo (mIgG) e então imunotransferido com anticorpos anti-FANCD2 (E35) ou anti-BRCA2 (Ab-2). IgG de cadeia pesada foi usado como um controle de carregamento. (B) Formação de focos FANCD2 e BRCA2 subnucleares em resposta ao tratamento IR. Fibroblastos PD20 (FA-D2), expressando de forma estável o vetor vazio sozinho (painel superior) ou cDNA de FANCD2 de comprimento total (painel inferior), foram não tratados ou tratados com IR (15 Gy) e fixados 4 h depois. As células foram duplamente coradas com anticorpos policlonais anti-FANCD2 (E35) (vermelho) e monoclonais anti-BRCA2 (Ab-1) (verde) e analisadas por microscopia de imunofluorescência. Ampliação, × 630. (C) Quantificação de focos BRCA2. Fibroblastos PD20 (FA-D2) expressando de forma estável o vetor vazio sozinho (PD20F + Vec), FANCD2 (PD20F + FANCD2) ou mutante FANCD2-K561R (PD20F + K561R), fibroblastos GM6914 (FA-A) e fibroblastos corrigidos GM6914 expressando FANCA de forma estável (GM6914 + FANCA), linfoblastos EUFA130 (FA-E) e linfoblastos EUFA130 corrigidos (EUFA130 + HA-FANCE) e células HeLa não foram tratadas ou foram tratadas com IR (15 Gy) e fixadas 4 h depois. Células com mais de quatro focos distintos foram contadas como positivas. Um total de 200 células / amostra foi analisado. Os valores apresentados são a média ± desvio padrão de três experiências separadas. FIGO. 3 Os focos FANCD2 e BRCA2 não conseguem se associar em células FA-D1 (BRCA2 - / -). (A) Diagrama esquemático da proteína BRCA2 humana, indicando mutações em células EUFA 423 (FA-D1). As posições dos epítopos para os anticorpos anti-BRCA2 Ab-1 e Ab-2 são mostradas. (B) Fibroblastos EUFA423 (FA-D1) e células corrigidas estavelmente transfectadas com o cromossomo 13 humano (EUFA423 + BRCA2) foram expostos a IR, em diferentes doses (esquerda) ou por diferentes períodos de tempo (direita). O Western blotting foi realizado com anticorpos anti-BRCA2 (Ab-1 ou Ab-2) ou anti-FANCD2 (E35). (C) A localização imunofluorescente de BRCA2 e FANCD2 após o tratamento com IR (15 Gy) foi examinada em fibroblastos EUFA423 (FA-D1), fibroblastos EUFA423 transitoriamente transfectados com pcDNA3 HA-BRCA2 (EUFA423 + HA-BRCA2) e fibroblastos EUFA 423 estavelmente transfectado com o cromossoma humano 13 (EUFA423 + BRCA2). As células foram duplamente coradas com os anticorpos indicados e analisadas por microscopia de imunofluorescência. Ampliação, × 630. (D e E) Quantificação da porcentagem de células com focos FANCD2 (D) e a porcentagem de células com co-localização de focos FANCD2 e BRCA2 (E) em células HeLa, fibroblastos EUFA423, fibroblastos EUFA423 que expressam transitoriamente HA-BRCA2 (EUFA423 + HA -BRCA2), e fibroblastos EUFA423 que expressam de forma estável o cromossomo 13 humano (EUFA423 + BRCA2). As células não foram tratadas ou foram tratadas com IR (15 Gy) e fixadas 4 h depois para microscopia de imunofluorescência. Células com mais de quatro focos distintos foram contadas como positivas. Duzentas e 100 células / amostra foram analisadas nos painéis D e E, respectivamente. Os valores apresentados são a média ± desvio padrão de três experiências separadas. As frações (F) S2 (proteínas nucleares solúveis) e S4 (cromatina) de células EUFA423 irradiadas e células EUFA423 que expressam estavelmente o cromossomo humano 13 (EUFA423 + BRCA2) foram submetidas a imunoprecipitação com anticorpo policlonal de coelho anti-FANCD2 (E35) ou um controle não imunizado soro de coelho (Pre-imm) e então imunotransferido com anticorpos monoclonais anti-BRCA2 (Ab-1) ou anti-FANCD2 (FI-17). IgG de cadeia pesada foi usado como um controle de carregamento. WCE, extrato de célula inteira. FIGO. 4 As células FA-D1 e FA-D2 são defeituosas na montagem de focos RAD51 indutíveis por IV. (A) Quantificação de focos RAD51 em fibroblastos EUFA423 (FA-D1), fibroblastos EUFA423 estavelmente transfectados com o cromossomo humano 13 (EUFA423 + BRCA2) e células HeLa. As células não foram tratadas ou foram tratadas com IR (2 ou 15 Gy) e fixadas 15 h depois. As células foram coradas com anticorpo monoclonal anti-RAD51 e analisadas por microscopia de imunofluorescência. As células com mais de quatro focos distintos foram contadas como positivas. Duzentas células / amostra foram analisadas. Os valores apresentados são a média ± desvio padrão de três experiências separadas. (B) Quantificação de focos RAD51 em fibroblastos PD20 (FA-D2) expressando de forma estável o vetor vazio sozinho (PD20F + Vec), cDNA de FANCD2 de comprimento total (PD20F + FANCD2) ou o mutante FANCD2 K561R (PD20F + K561R) e HeLa células. As células não foram tratadas ou foram tratadas com IR (2 ou 15 Gy) e fixadas 8 h mais tarde. Microscopia de imunofluorescência e contagens foram realizadas conforme descrito acima para o painel A. FIGO. 5 A monoubiquitinação de FANCD2 promove o acúmulo indutível de IR de BRCA2 na cromatina. (A) As frações S2 (proteínas nucleares solúveis) e S4 (cromatina) foram preparadas a partir de células U2OS e FA, que não foram tratadas ou foram tratadas com IR (15 Gy, fracionado após 15 h). As frações foram submetidas a análise de Western blot com anticorpos anti-FANCD2 (E35) ou anti-BRCA2 (Ab-1). A extração da cromatina na fração S4 foi confirmada por blotting com anticorpo anti-histona H4, conforme indicado. As células FA são representadas por fibroblastos GM6914 (FA-A), fibroblastos EUFA423 (FA-D1) e linfoblastos HSC230 (FA-B). (B) As frações S2 (proteínas nucleares solúveis) e S4 (cromatina) foram preparadas a partir de fibroblastos PD20 (FA-D2) expressando de forma estável o vetor vazio sozinho (PD20F + HA-PMMP), HA-FANCD2 (PD20F + HA-FANCD2), ou FANCD2-HA-K561R mutante (PD20F + HA-K561R), que não foram tratados ou tratados com IR (15 Gy, fracionado após 6 h). As frações foram submetidas a análise de Western blot com anticorpos anti-FANCD2 (E35) ou anti-BRCA2 (Ab-1). A extração da cromatina na fração S4 foi confirmada por blotting com anticorpo anti-histona H4. FIGO. 6 O ATM é necessário para a fosforilação ativada por IR de BRCA2 na cromatina. (A) BRCA2 imunoprecipitado (Ab-1) de frações de cromatina foi tratado com ou sem λ-fosfatase e inibidores de fosfatase, como indicado. As frações da cromatina foram derivadas de células U2OS não tratadas ou 15 h após o tratamento IR (15 Gy). A mudança de mobilidade de BRCA2 é mostrada nas faixas 4 e 6. WCE, extrato de célula inteira. (B) BRCA2 derivado da fração de cromatina de fibroblastos corrigidos AT (AT + ATM) em pontos de tempo após o tratamento com IR (15 Gy) sofre uma mudança de mobilidade, enquanto BRCA2 da fração de cromatina de fibroblastos AT (ATM - / -) sofre não. As frações da cromatina foram imunotransferidas com anticorpos anti-BRCA2 (Ab-1), anti-ATM ou anti-FANCD2 (E35). (C) Células EUFA423 (FA-D1) e PD20 (FA-D2) estão com defeito em um ponto de verificação de fase S induzível por IR. O RDS foi avaliado 30 min após a entrega de IR às linhas celulares indicadas. FIGO. 7 Interação do FANCE e BRCA2. (A) Extratos de células inteiras (WCE) de células HeLa, não tratadas ou expostas a IR (15 Gy, colhido 15 h depois) ou MMC (40 ng / ml, colhido 24 h depois), foram submetidos a imunoprecipitação com monoclonal de camundongo anticorpo anti-BRCA2 (Ab-1) ou um anticorpo controle de camundongo (mIgG). IgG de cadeia pesada foi usado como um controle de carregamento. (B) Extratos de células inteiras de EUFA130 não irradiado ou irradiado (FA-E) e células EUFA130 que expressam estavelmente HA-FANCE (EUFA130 + HA-FANCE), foram submetidos a imunoprecipitação com anticorpo policlonal anti-BRCA2 (H-300) ou um anticorpo de controle de coelho (rIgG) e, em seguida, imunotransferido com anticorpos anti-BRCA2 (Ab-1) ou anti-HA. IgG de cadeia pesada foi usado como um controle de carregamento. (C) Linfoblastos EUFA130 (FA-E) e células EUFA130 que expressam estavelmente HA-FANCE (EUFA130 + HA-FANCE) não foram tratados ou foram expostos a IR em diferentes doses, conforme indicado, e colhidos após 4 h. O Western blotting foi realizado com anticorpos anti-BRCA2 (Ab-1), anti-FANCD2 (E35) ou anti-HA. (D) Coimunoprecipitação recíproca de FANCD2 e BRCA2 com outros anticorpos. As frações indicadas (S2 e S4), preparadas a partir de células U2OS irradiadas, foram imunoprecipitadas com anticorpo para FANCD2 (E35), FANCE ou um soro de coelho não imunizado de controle (Pré-imm), e os complexos imunes foram imunotransferidos com anti-BRCA2 ( Ab-1) ou anticorpos anti-FANCD2 (FI-17). IgG de cadeia pesada foi usado como um controle de carregamento. (E) Modelo esquemático da resposta de dano ao DNA mediada por ATM-BRCA2-FANCD2. IR ativa ATM, resultando na fosforilação de BRCA2, FANCD2 e vários outros substratos de proteína. BRCA2 ativado é então recrutado para cromatina por FANCD2, que é ativado por monoubiquitinação. A interação de BRCA2 e FANCD2 requer o terminal C da monoubiquitinação de BRCA2 e FANCD2. Após seu carregamento na cromatina, o BRCA2 funciona a jusante do FANCD2 monubiquitinado.

Mutações do gene BRCA: risco de câncer e testes genéticos

BRCA1 (Gene 1 de BReast CAncer) e BRCA2 (BReast CAncer gene 2) são genes que produzem proteínas que ajudam a reparar o DNA danificado. Todo mundo tem duas cópias de cada um desses genes - uma cópia herdada de cada pai. BRCA1 e BRCA2 às vezes são chamados de genes supressores de tumor porque, quando eles têm certas alterações, chamadas de variantes (ou mutações) prejudiciais (ou patogênicas), o câncer pode se desenvolver.

Pessoas que herdam variantes prejudiciais em um desses genes têm riscos aumentados de vários tipos de câncer - principalmente de mama e de ovário, mas também de vários outros tipos de câncer. Pessoas que herdaram uma variante prejudicial em BRCA1 e BRCA2 também tendem a desenvolver câncer em idades mais jovens do que as pessoas que não apresentam essa variante.

Uma variante prejudicial em BRCA1 ou BRCA2 pode ser herdado de qualquer um dos pais. Cada filho de um pai que carrega qualquer mutação em um desses genes tem 50% de chance (ou 1 chance em 2) de herdar a mutação. Mutações herdadas - também chamadas de mutações germinativas ou variantes - estão presentes desde o nascimento em todas as células do corpo.

Mesmo que alguém tenha herdado uma variante prejudicial em BRCA1 ou BRCA2 de um dos pais, eles teriam herdado uma cópia normal desse gene do outro pai (isso porque, na maioria dos casos, os embriões com uma variante prejudicial de cada um dos pais não podem se desenvolver). Mas a cópia normal pode ser perdida ou alterada em algumas células do corpo durante a vida dessa pessoa. Essa mudança é chamada de alteração somática. As células que não têm nenhuma proteína BRCA1 ou BRCA2 em funcionamento podem crescer descontroladamente e se tornar câncer.

Quanto uma variante prejudicial herdada em BRCA1 ou BRCA2 aumenta o risco de câncer de mama e ovário em uma mulher?

O risco ao longo da vida de uma mulher de desenvolver câncer de mama e / ou ovário aumenta significativamente se ela herda uma variante prejudicial em BRCA1 ou BRCA2, mas o grau de aumento varia dependendo da mutação.

Câncer de mama: Cerca de 13% das mulheres na população em geral desenvolverão câncer de mama em algum momento de suas vidas (1). Por outro lado, 55% - 72% das mulheres que herdam um nocivo BRCA1 variante e 45% - 69% das mulheres que herdam um BRCA2 a variante desenvolverá câncer de mama por volta dos 70–80 anos de idade (2–4). O risco para qualquer mulher depende de vários fatores, alguns dos quais não foram totalmente caracterizados.

Como as mulheres com câncer de mama em geral, aquelas com câncer BRCA1 ou BRCA2 as variantes também apresentam um risco aumentado de desenvolver câncer na mama oposta (contralateral) nos anos seguintes ao diagnóstico de câncer de mama (2). O risco de câncer de mama contralateral aumenta com o tempo desde o primeiro câncer de mama, chegando a 20% –30% em 10 anos de acompanhamento e 40% –50% em 20 anos, dependendo do gene envolvido.

Cancro do ovário: Cerca de 1,2% das mulheres na população em geral desenvolverão câncer de ovário em algum momento de suas vidas (1). Em contraste, 39% -44% das mulheres que herdam um BRCA1 variante e 11% -17% das mulheres que herdam um BRCA2 a variante desenvolverá câncer de ovário por volta dos 70–80 anos de idade (2–4).

Quais outros cânceres estão ligados a variantes prejudiciais em BRCA1 e BRCA2?

Variantes prejudiciais em BRCA1 e BRCA2 aumentam o risco de vários tipos de câncer adicionais. Nas mulheres, isso inclui o câncer das trompas de falópio (5, 6) e o câncer peritoneal primário (7), ambos começando nas mesmas células do tipo mais comum de câncer de ovário. Homens com BRCA2 variantes, e em menor grau BRCA1 variantes, também estão em maior risco de câncer de mama (8) e câncer de próstata (9-11). Homens e mulheres com danos BRCA1 ou BRCA2 as variantes apresentam risco aumentado de câncer de pâncreas, embora o aumento do risco seja baixo (12–14).

Além disso, certas variantes em BRCA1 e BRCA2 pode causar subtipos de anemia de Fanconi, uma síndrome rara que está associada a tumores sólidos na infância e ao desenvolvimento de leucemia mieloide aguda (15–17). As mutações que causam esses subtipos de anemia de Fanconi têm um efeito mais brando na função das proteínas do que as mutações que causam câncer de mama e de ovário. As crianças que herdam uma dessas variantes de cada um dos pais desenvolverão anemia de Fanconi.

São variantes prejudiciais em BRCA1 e BRCA2 mais comum em certas populações raciais / étnicas do que outras?

sim. A probabilidade de carregar uma mutação herdada em BRCA1 ou BRCA2 (a prevalência) varia entre grupos específicos da população. Embora a prevalência na população em geral seja de cerca de 0,2% -0,3% (ou cerca de 1 em 400), cerca de 2,0% das pessoas de ascendência judaica Ashkenazi carregam uma variante prejudicial em um desses dois genes e as variantes são geralmente um dos três específicos variantes, chamadas de mutações fundadoras. Outras populações, como noruegueses, holandeses e islandeses, também têm mutações fundadoras (18).

Diferentes populações raciais / étnicas e geográficas também tendem a carregar diferentes variantes nesses genes. Por exemplo, os afro-americanos têm BRCA1 variantes que não são vistas em outros grupos raciais / étnicos nos Estados Unidos (19–21). A maioria das pessoas de ascendência judia Ashkenazi nos Estados Unidos que carregam uma variante BRCA tem uma das três variantes específicas (duas em BRCA1 e um em BRCA2) Na população islandesa, uma variante diferente em BRCA1 é comum entre aqueles que herdam uma mutação em BRCA1.

Quem deve considerar o aconselhamento genético e testes para BRCA1 e BRCA2 variantes?

Qualquer pessoa que esteja preocupada com a possibilidade de ter uma variante prejudicial no BRCA1 ou BRCA2 gene deve discutir suas preocupações com seu provedor de cuidados de saúde ou um conselheiro genético.

Os testes estão disponíveis para ver se alguém herdou uma variante prejudicial em BRCA1 e BRCA2. No entanto, o teste não é recomendado para o público em geral. Em vez disso, grupos de especialistas recomendam que o teste seja focado naqueles que têm maior probabilidade de carregar um BRCA1 ou BRCA2 variante, como aqueles que têm histórico familiar de certos tipos de câncer. O teste pode ser apropriado tanto para pessoas sem câncer quanto para pessoas que foram diagnosticadas com câncer. Se alguém souber que tem uma mutação em um desses genes, pode tomar medidas para reduzir o risco ou detectar o câncer precocemente. E se eles têm câncer, as informações sobre sua mutação podem ser importantes para a seleção do tratamento.

Before testing is done, a person will usually have a risk assessment, in which they meet with a genetic counselor or other health care provider to review factors such as which of their relatives had cancer, what cancers they had, and at what ages they were diagnosed. If this assessment suggests that someone has an increased risk of carrying a harmful BRCA1 ou BRCA2 gene variant, their genetic counselor can discuss the benefits and harms of testing with them and order the appropriate genetic test, if the individual decides to have genetic testing (22).

Some people may choose to have genetic testing via direct-to-consumer (DTC) testing. Genetic counseling is recommended for those people as well to help them understand the test results and to make sure the most appropriate test was done. People should be aware that DTC tests may not be comprehensive, in that some tests do not test for all of the harmful mutations in the two genes. So receiving a negative result with a DTC test may not mean that they don’t have a harmful variant in BRCA1 ou BRCA2.

The United States Preventive Services Task Force recommends risk assessment for women who have a personal or family history of breast, ovarian, fallopian tube, or peritoneal cancer or whose ancestry is associated with having harmful BRCA1 e BRCA2 variants, as well as follow-up genetic counseling as appropriate.

The National Comprehensive Cancer Network (NCCN) has criteria for genetic testing of BRCA1 e BRCA2 as well as for several other genes (including CDH1, PALB2, PTEN, e TP53) that are associated with increased risk of breast and/or ovarian cancer (23). NCCN recommends risk assessment for people who have a blood relative with a known or likely harmful variant in any of these genes who have certain personal and/or family histories of cancer (cancer diagnosed at a younger age, certain types of cancer, people with two or more cancer diagnoses, or families with multiple cases of cancer) or who have certain inherited cancer predisposition disorders, such as Cowden syndrome, Peutz-Jeghers syndrome, Li-Fraumeni syndrome, or Fanconi anemia.

The American Society of Clinical Oncology recommends that all women diagnosed with epithelial ovarian cancer be offered genetic testing for inherited variants in BRCA1, BRCA2, and other ovarian cancer susceptibility genes, regardless of the clinical features of their disease or their family history (24).

Professional societies do not recommend that children under age 18 undergo genetic testing for BRCA1 e BRCA2 variants. This is because there are no risk-reduction strategies that are specifically meant for children, and children are very unlikely to develop a cancer related to an inherited BRCA variant.

Testing for inherited BRCA1 e BRCA2 variants may be done using a blood sample or a saliva sample. That is because blood cells and cells that are present in saliva, like every cell in the body, contain the BRCA1 e BRCA2 genes. Sometimes people with cancer find out that they have a BRCA1 ou BRCA2 mutation when their tumor is tested to see if they are a candidate for treatment with a particular targeted therapy. Because harmful BRCA variants reported in the tumor may be of somatic or germline origin, someone with such a variant in their tumor should consider having a germline genetic (blood) test to determine if the variant was inherited.

When a family history suggests the possibility that someone without cancer may have inherited a harmful variant in BRCA1 ou BRCA2, it is best for a family member who has already been diagnosed with cancer to be tested, if such a person is alive and willing to get tested. If such testing reveals a known harmful variant, then testing the individual for that variant will provide a clear indication of whether they also carry it. If all family members with cancer are deceased or are unwilling or unable to have genetic testing, testing family members who have not been diagnosed with cancer may still be of value and provide good information.

Does health insurance cover the cost of genetic testing for BRCA1 e BRCA2 variants?

People considering BRCA1 e BRCA2 variant testing may want to confirm their insurance coverage for genetic counseling and testing. Genetic counselors can often help answer questions about insurance coverage for genetic testing.

Some genetic testing companies may offer testing for inherited BRCA1 e BRCA2 variants at no charge to patients who lack insurance and meet specific financial and medical criteria.

What do BRCA1 e BRCA2 genetic test results mean?

BRCA1 e BRCA2 mutation testing can give several possible results: a positive result, a negative result, or a variant of uncertain significance (VUS) result.

Positive result. A positive test result indicates that a person has inherited a known harmful variant in BRCA1 ou BRCA2 (these are typically called “pathogenic” or “likely pathogenic” variants on laboratory test reports) and has an increased risk of developing certain cancers. However, a positive test result cannot tell whether or when the tested individual will develop cancer. Some people who inherit a harmful BRCA1 ou BRCA2 variant never develop cancer.

A positive test result may also have important implications for family members, including future generations.

  • Both men and women who inherit a harmful BRCA1 ou BRCA2 variant, whether or not they develop cancer themselves, may pass the variant to their children. Each child has a 50% chance of inheriting a parent’s variant.
  • All blood relatives of a person who has inherited a harmful BRCA1 ou BRCA2 variant are at some increased risk of having the variant themselves. For example, each of that person’s full siblings has a 50% chance of having inherited the variant as well.
  • Very rarely, an individual may test positive for a harmful variant not inherited from either parent. Isso é chamado de de novo (or “new”) variant. Such a variant is one that arose in a germ cell (sperm or egg) of one of the parents and is present in all the cells of the person who grew from that cell. The children of someone with a de novo variant (but not his or her siblings) are at risk of inheriting the variant.

Negative result. A negative test result can have several meanings, depending on the personal and family medical history of the person who is tested and whether or not a harmful mutation has already been identified in the family. If a close blood relative of the tested person is known to carry a harmful BRCA1 ou BRCA2 variant, a negative test result is clear: it means the tested person did not inherit the harmful variant that is present in the family and cannot pass it to their children. A person with such a test result, called a true negative, has a risk of cancer that is similar to that of someone in the general population. However, there are other factors besides genetic factors that may increase the risk of cancer, such as radiation exposures at an early age, and those factors should be considered in assessing their risk of cancer.

If the tested person has no personal history of cancer and their family isn’t known to carry a harmful variant, then in this case, a negative test result is considered to be “uninformative.” There are several possible reasons why someone could have an uninformative negative test result:

  • Without testing family members who have had cancer, it is uncertain whether the negative test means that the person did not inherit a BRCA1 ou BRCA2 mutation that is present in the family or whether the family history might be due to a mutation in another gene that was not tested or to other, nongenetic risk factors.
  • The individual may have a harmful variant that is not detectable by current testing technologies.
  • Rarely, there could be an error in the testing, either because inappropriate tests were recommended or ordered, genetic variants were interpreted incorrectly, or the wrong results were relayed to patients (25).

Variant of Uncertain Significance (VUS) result. Sometimes, a genetic test finds a change in BRCA1 ou BRCA2 that has not been previously associated with cancer and is uncommon in the general population. This type of test result is called “a variant of uncertain significance,” or VUS, because it isn’t known whether this specific genetic change is harmful.

As more research is conducted and more people are tested for BRCA1 e BRCA2 variants, scientists will learn more about uncertain changes and cancer risk. Clinicians and scientists are actively working to share information on these mutations so that they can be reclassified as either clearly harmful or clearly not harmful (26, 27).

Genetic counseling can help a person understand what a VUS in BRCA1 ou BRCA2 may mean in terms of their cancer risk. Until the interpretation of the variant is clarified, management of risk should be based on family history and other risk factors. However, it is important that a person who has a VUS test result regularly obtains updated information from the testing provider in case that VUS is reclassified as a harmful or likely harmful variant. Testing providers have different policies about notifying a tested person of a change in the interpretation of a VUS test result. Some will contact the tested person directly, whereas others place the responsibility on the tested person to check back in on a regular basis to learn of updates to the interpretation of their VUS test result.

How can a person who has inherited a harmful BRCA1 ou BRCA2 gene variant reduce their risk of cancer?

Several options are available for reducing cancer risk in individuals who have inherited a harmful BRCA1 ou BRCA2 variante. These include enhanced screening, risk-reducing surgery (sometimes referred to as prophylactic surgery), and chemoprevention.

Enhanced screening. Some women who test positive for harmful BRCA1 e BRCA2 variants may choose to start breast cancer screening at younger ages, have more frequent screening than is recommended for women with an average risk of breast cancer, or have screening with magnetic resonance imaging (MRI) in addition to mammography.

No effective ovarian cancer screening methods are known. Some groups recommend transvaginal ultrasound, blood tests for the CA-125 antigen (which can be present at higher-than-normal levels in women with ovarian cancer), and clinical examinations for ovarian cancer screening in women with harmful BRCA1 ou BRCA2 variants. However, none of these methods appear to detect ovarian tumors at an early enough stage to improve long-term survival (28).

The benefits of screening men who carry harmful variants in BRCA1 ou BRCA2 for breast and other cancers are not known. Some expert groups recommend that such men undergo regular annual clinical breast exams starting at age 35 (23). The National Comprehensive Cancer Network (NCCN) guidelines recommend that men with harmful germline variants in BRCA1 ou BRCA2 consider having a discussion with their doctor about prostate-specific antigen (PSA) testing for prostate cancer screening starting at age 40 (29).

Some experts recommend the use of ultrasound or MRI/magnetic retrograde cholangiopancreatography to screen for pancreatic cancer in people who are known to carry a harmful BRCA1 ou BRCA2 variant and who have a close blood relative with pancreatic cancer (30). However, it is not yet clear whether pancreatic cancer screening and early pancreatic cancer detection reduces the overall risk of dying from a pancreatic cancer.

All of these screening approaches have potential harms as well as possible benefits. For example, MRI is more likely than mammography to result in false-positive findings. And there is some concern that women who have a harmful BRCA variant might be particularly sensitive to the DNA-damaging effects of tests that involve radiation (such as mammography) because they already have a defect in DNA repair (31).

Risk-reducing surgery. Risk-reducing, or prophylactic, surgery involves removing as much of the "at-risk" tissue as possible. Women may choose to have both breasts removed (bilateral risk-reducing mastectomy) to reduce their risk of breast cancer. Surgery to remove a woman's ovaries and fallopian tubes (bilateral risk-reducing salpingo-oophorectomy) can help reduce her risk of ovarian cancer. (Ovarian cancers often originate in the fallopian tubes, so it is essential that they be removed along with the ovaries.) Removing the ovaries may also reduce the risk of breast cancer in premenopausal women by eliminating a source of hormones that can fuel the growth of some types of breast cancer.

These surgeries are irreversible, and each has potential complications or harms. These include bleeding or infection, anxiety and concerns about body image (bilateral risk-reducing mastectomy), and early menopause in premenopausal women (bilateral risk-reducing salpingo-oophorectomy).

Risk-reducing surgery does not guarantee that cancer will not develop because not all at-risk tissue can be removed by these procedures. That is why these surgical procedures are described as “risk-reducing” rather than “preventive.” Some women have developed breast cancer, ovarian cancer, or primary peritoneal carcinomatosis (a type of cancer similar to ovarian cancer) even after risk-reducing surgery. Nevertheless, these surgical procedures greatly reduce risk. For example, in several studies women who underwent bilateral salpingo-oophorectomy had a nearly 80% reduction in risk of dying from ovarian cancer, a 56% reduction in risk of dying from breast cancer (32), and a 77% reduction in risk of dying from any cause during the studies’ follow-up periods (33).

The reduction in breast and ovarian cancer risk from removal of the ovaries and fallopian tubes appears to be similar for carriers of BRCA1 e BRCA2 variants (33).

Chemoprevention. Chemoprevention is the use of medicines to reduce the risk of cancer. Two chemopreventive drugs (tamoxifen [Nolvadex] and raloxifene [Evista]) have been approved by the Food and Drug Administration (FDA) to reduce the risk of breast cancer in women at increased risk, but the role of these drugs in women with harmful BRCA1 ou BRCA2 variants is not yet clear. Data from three studies suggest that tamoxifen may be able to help lower the risk of breast cancer in women who carry harmful variants in BRCA2 (34) and of cancer in the opposite breast among BRCA1 e BRCA2 variant carriers previously diagnosed with breast cancer (35, 36). Studies have not examined the effectiveness of raloxifene in BRCA1 e BRCA2 variant carriers specifically.

However, these medications may be an option for women who choose not to, or who cannot, undergo surgery. The potential harms of these drugs include menopausal symptoms, blood clots, stroke, increased risk of endometrial cancer (tamoxifen), and allergic reactions (raloxifene).

Both women in the general population, as well as those with harmful BRCA1 ou BRCA2 variants, who have ever used oral contraceptives (birth control pills) have about a 50% lower risk of ovarian cancer than women who have never used oral contraceptives (37). Potential harms of oral contraceptives include increased risk of breast cancer, increased risk that a human papillomavirus (HPV) infection will become cervical cancer, and possible cardiovascular effects among older reproductive-age women.

What are the benefits of genetic testing for BRCA1 e BRCA2 variants?

There can be benefits to genetic testing, regardless of whether a person receives a positive or a negative result.

The potential benefits of a true negative result include a sense of relief regarding the future risk of cancer, learning that one's children are not at risk of inheriting the family's cancer susceptibility, and the possibility that special check-ups, tests, or risk-reducing surgeries may not be needed.

A positive test result may allow people to make informed decisions about their future health care, including taking steps to reduce their cancer risk.

What are the possible harms of genetic testing for BRCA1 e BRCA2 variants?

The direct medical harms of genetic testing are minimal, but knowledge of test results, whether positive or negative, may have harmful effects on a person’s emotions, social relationships, finances, and medical choices.

Dealing with uncertainty of an uninformative negative or a VUS test result is another potential harm. For this reason, it is important to have genetic counseling before undergoing genetic testing.

Results of genetic tests are normally included in a person’s medical records, particularly if a doctor or other health care provider has ordered the test or has been consulted about the test results. Therefore, people considering genetic testing must understand that their results may become known to other people or organizations that have legitimate, legal access to their medical records, such as their insurance company or employer, if their employer provides the patient’s health insurance as a benefit.

What are the treatment implications of having a harmful BRCA1 ou BRCA2 variant for patients who have already developed cancer?

Porque o BRCA1 e BRCA2 genes are involved in DNA repair, tumors with alterations in either gene are particularly sensitive to anticancer agents that act by damaging DNA, such as cisplatin (38).

A class of drugs called PARP inhibitors, which block the repair of DNA damage, have been found to arrest the growth of cancer cells that have harmful BRCA1 ou BRCA2 variants. Four PARP inhibitors—olaparib [Lynparza], rucaparib [Rubraca], niraparib [Zejula], and talazoparib [Talzenna]—are approved by the FDA to treat certain cancers bearing harmful variants in BRCA1 ou BRCA2. (In some cases, these are used whether or not a BRCA1 ou BRCA2 mutation is present.)

Breast cancers with harmful BRCA1 variants are more likely to be "triple-negative cancers" (that is, the breast cancer cells do not have estrogen receptors, progesterone receptors, or large amounts of HER2/neu protein) than sporadic breast cancers or breast cancers with harmful BRCA2 variants. Triple-negative cancers are harder to treat and have a poorer prognosis than other types of breast cancers.

If someone has tumor genetic testing that reveals the presence of a harmful BRCA1 ou BRCA2 variant in the tumor, they should consider having a germline genetic (blood) test to determine if the variant was inherited. Knowing if the variant was inherited is important for that individual to understand their risks to potentially develop other cancers in the future. It can also determine if other family members may be at risk of inheriting the harmful variant.

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Memorial Sloan-Kettering scientists uncover function of BRCA2 protein

BRCA2 was already known to be a tumor suppressor -- a protective protein that prevents the development of cancer -- but exactly how the protein does its job was not understood. Now MSKCC scientists have been able to map out the structure of the protein, showing that it interacts directly with DNA and helps to repair genetic damage. An inability to correct genetic damage leads to unstable chromosomes and often to cancer.

"If BRCA2 is altered or missing, it leads to a dangerous accumulation of genetic errors," said the study's senior author Nikola P. Pavletich, PhD, head of MSKCC's Laboratory of Structural Biology of Oncogenes and Tumor Suppressors and an investigator in the Howard Hughes Medical Institute. "By studying the normal function of BRCA2, we can understand how changes in the protein contribute to the development of cancer."

BRCA2 is an unusually large molecule, which has made it difficult for researchers to study. But Dr. Pavletich's team, including first author Haijuan Yang, found a way around that problem and was able to crystallize the protein. Those crystals were then bombarded with high-energy X-rays, a process called X-ray crystallography, and the diffraction patterns created by the X-rays were used to calculate the three-dimensional picture of the protein. This picture revealed that BRCA2 is similar in structure to other proteins known to bind DNA. The researchers then took the work a step further, showing that BRCA2 does indeed bind to DNA in special regions that are commonly found around broken DNA strands.

Researchers showed that BRCA2 participates in the repair of "double-strand" breaks: These breaks are a particularly lethal type of damage because if both strands of the DNA double helix break at the same time, cells can permanently lose genetic information. The structure revealed that BRCA2 binds the broken strands and enables the recovery of lost information via a process called homologous recombination -- in which the missing DNA is copied from another part of the cell.

"We are now a step closer to understanding this particular type of inherited breast and ovarian cancers," Dr. Pavletich said.

Mutations in the BRCA2 gene have been implicated in hereditary breast and ovarian cancers since 1995. The other gene commonly linked to hereditary breast and ovarian cancers is called BRCA1.

Researchers from the University of Texas Health Science Center in San Antonio also contributed to the study, which was funded by the National Institutes of Health, the Howard Hughes Medical Institute, the Dewitt Wallace Foundation, the Samuel and May Rudin Foundation, and the Arthur and Rochelle Belfer Foundation.

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How Do BRCA Mutations Cause Cancer?

Genes are the body’s sets of genetic instructions. Mutations within BRCA genes cause them to not work as well as they should. “When BRCA genes are mutated or altered, cells are unable to repair themselves, causing an increased risk to develop specific types of cancer,” says Clayback.

Mutations in the two kinds of BRCA genes will affect patients’ risk differently.

BRCA1 mutations are associated with an increased risk for:

  • Breast cancer, including an aggressive form called Triple Negative Breast Cancer
  • Ovarian cancer
  • Câncer de pâncreas
  • Câncer de próstata

BRCA2 mutations are associated with an increased risk for:

  • Câncer de mama
  • Ovarian cancer
  • Melanoma
  • Câncer de pâncreas
  • Câncer de próstata

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Panel A shows the pedigree of the family the arrow indicates the proband. Circles indicate female family members, and squares male family members the number 3 inside the square and circle indicates the numbers of brothers and sisters, respectively. The current ages are shown below the circles or squares. The slash denotes a deceased family member. Asterisks indicate the family members who were enrolled in the study, from whom the samples were obtained. Solid circles indicate the two sisters who had a normal female karyotype (46,XX), ovarian dysgenesis, microcephaly (head circumferences of 48.7 cm in family member III-2 when she was 19 years of age and 47.5 cm in family member III-4 when she was 14 years of age), and café au lait spots. The older sister (III-2) also had received a diagnosis of leukemia at 5 years of age. The half-solid square indicates the brother who died from acute promyelocytic leukemia at 13 years of age. The gray circle indicates fetal death. V1 denotes the BRCA2 c.7579delG variant, V2 the BRCA2 c.9693delA variant, and N normal. Panel B is a depiction of the BRCA2 protein. The RAD51-binding domain includes eight repeated motifs called BRC repeats (blue). The DNA-binding domain contains a helical domain (H, green), three oligonucleotide binding folds (OB, purple), and a tower domain (T, orange). The nuclear localization signal (NLS) is near the C-terminal of the protein (red). The red arrow indicates the position of V1 and the blue arrow the position of V2 on the BRCA2 protein. BRCA2 p.V2527X is predicted to lack most of the DNA-binding domain and the NLS. BRCA2 p.S3231fs16*, with a predicted truncation of 171 residues, retains these domains. Panel C shows chromosomal breakage in the peripheral lymphocytes obtained from the proband (III-2 [V1/V2]), the mother (II-1 [V1/N]), and an unrelated control (N/N). Representative chromosomal breaks (Br) are marked by red arrows. Triradial (Tra), quadriradial (Qra), and complex rearrangements (cRa) are marked by dashed red arrows. Panel D shows the effect of increasing exposure to mitomycin C on chromosomal breaks in the cells of the two affected sisters (III-2 and III-4), the mother (II-1), a healthy sister (III-3), and an unrelated control (N/N). Chromosomes were first exposed to mitomycin C at increasing concentrations of 0 nM, 150 nM, and 300 nM according to a standard protocol. Because of the large number of chromosomal breaks observed at the 150 nM and 300 nM concentrations, the chromosomes were also exposed to mitomycin C at concentrations of 50 nM and 100 nM. Asterisks indicate more than 100 breaks per cell. The P values in the bottom row are comparisons between the affected sisters and V1/N persons (the mother and a healthy sister), and the P values in the top row are comparisons between the affected sisters and a control (Table S3 in the Supplementary Appendix).

Panel A shows the results of the quantitative real-time reverse-transcriptase–polymerase-chain-reaction (RT-PCR) assays of BRCA2 transcrições. The bars represent the mean levels of BRCA2 RNA expression (shown as the percentage of wild-type) for each genotype from six RT-PCR assays performed in each person T bars indicate the standard deviations. The results show that BRCA2 expression was significantly lower in the cells of the affected sisters (III-2 and III-4 [V1/V2]) than in those of their unaffected relatives (II-1 and III-3 [V1/N] and II-2 and III-5 [V2/N]) and of unrelated controls (N/N). NS denotes not significant. Panel B shows the quantification of Western blots of BRCA2 protein, with the use of the ImageJ image processing program from the National Institutes of Health representative images are shown in Fig. S2 in the Supplementary Appendix. Lysates were obtained from lymphoblasts of all the enrolled family members and unrelated controls. The bars represent the mean levels of BRCA2 protein expression (shown as the percentage of wild-type) from six Western blot analyses performed for each person T bars indicate the standard deviations. The results show that the levels of BRCA2 protein expression differed significantly among the compound heterozygotes (V1/V2), the heterozygotes (V1/N and V2/N), and the unrelated controls (N/N). The levels of BRCA2 protein expression in the samples from the compound heterozygotes were lower — by a factor of more than seven — than those in the samples from the controls who had no BRCA2 mutação. Panel C shows the effect of DNA damage induction by exposure to neocarzinostatin. Fibroblasts from an unrelated control (i though iv), from the mother (v through viii), and from the proband (ix through xii) were stained by immunofluorescence. Nuclei were stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blue [i, v, and ix]). γ-H2AX was detected with anti-phospho-Histone H2A.X (JBW301, Millipore) (green [ii, vi, and x]). RAD51 was detected with anti-RAD51 (N1C2, GeneTex) (red [iii, vii, and xi]). Merged staining of DAPI, γ-H2AX, and RAD51 is shown in iv, viii, and xii. Cells were visualized with the use of an Olympus fluorescent microscope with a ×60 objective lens. Panel D shows quantification of RAD51 foci formation after neocarzinostatin exposure (shown in Panel C). Bars represent the proportion of RAD51-positive γ-H2AX foci in mutant and nonmutant cells. T bars indicate the standard deviations. Foci were counted by a person who was unaware of the cellular genotype. The number of RAD51-positive foci was lower in the compound heterozygote cells (V1/V2) than in the cells from a carrier (V1/N) and in normal cells (N/N) by a factor of at least six.

Panel A shows that homozygous deletion of the drosophila orthologue of BRCA2 leads to sterility in female and male flies. Female and male Dmbrca2 −/− flies were crossed with wild-type controls to evaluate egg and progeny production. The results are presented as the mean daily number of eggs and progeny produced by each of the crosses indicated below the x axis (as averaged across three to five replicates per cross) T bars indicate the standard deviations. Eggs and progeny were counted daily for 3 days. The mean daily number of eggs laid by Dmbrca2-null female flies (−/− female) crossed with wild-type control male flies (yw male) was lower than the mean daily number of eggs laid by wild-type female flies (yw female) crossed with wild-type male flies (yw male) by a factor of 19.5 (mean daily number, 22 vs. 428, P=0.001). In comparison with the mean daily number of eggs hatched when wild-type female flies were crossed with wild-type male flies (388 of 428 eggs hatched [91%]), only 1 of a total of 214 eggs hatched among the Dmbrca2-null female flies that were crossed with wild-type male flies and 1 of a total of 2116 eggs hatched among the Dmbrca2-null male flies that were crossed with wild-type female flies. Panel B shows the percentages of abnormal ovary and testes phenotypes in Dmbrca2-null flies. Among 62 female flies tested, most ovarioles (69%) were severely dysgenic, 27% were moderately abnormal, and 4% were mildly abnormal. Among 59 male flies tested, nearly all testes (92%) were severely or moderately abnormal 8% were mildly abnormal. Panel C shows the morphologic features and immunostaining of the drosophila ovaries and testes. The panels on the left for the wild-type control flies show normal, healthy morphologic features of both the ovaries and testes, as compared with the panels on the left for the Dmbrca2-null flies that show shrunken, underdeveloped ovaries and testes. The panels on the right for both the wild-type control flies and the Dmbrca2-null flies show the results of immunostaining. Nuclear DNA is green, actin is blue, and cleaved caspase-3 (indicating apoptosis) is red. Dmbrca2 +/− (Fig. S4 in the Supplementary Appendix) and wild-type control flies had normal ovarioles, with normal nuclear DNA and actin and no staining of cleaved caspase-3. Dmbrca2-null flies had ovarioles with disintegrated egg chambers, as indicated by nuclear DNA condensation, disappearance of actin structures, and marked staining of cleaved caspase-3. Dmbrca2 +/− (Fig. S4 in the Supplementary Appendix) and wild-type control flies had normal testes, with normal appearance of cleaved caspase-3 in differentiating spermatids. Dmbrca2-null flies had abnormal testes without differentiation of spermatids and with abnormal appearance of cleaved caspase-3.


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